CN102021129A

CN102021129A - 一种球状节杆菌cna9及其应用

Info

Publication number: CN102021129A
Application number: CN 201010512191
Authority: CN
Inventors: 郭岩彬; 吴文良; 位婉; 孟凡乔; 周华宁; 焦子伟; 牟成香; 袁超磊
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: Middle wisdom road (Beijing) biological science and Technology Co., Ltd.
Priority date: 2010-10-19
Filing date: 2010-10-19
Publication date: 2011-04-20
Anticipated expiration: 2030-10-19
Also published as: CN102021129B

Abstract

本发明提供了一株节杆菌属球状节杆菌(Arthrobacterglobiformis)CNA9，从小麦实验田中分离得到，该菌株保藏编号为CGMCC No.4217。该菌株具有稳定的产IAA的能力，在提供前体物质色氨酸的培养基中培养时最高产IAA量可达109g/mL。温室和大田检测试验结果表明，CNA9对植物具有显著的促生效果，本发明可为微生物菌肥的研发提供一株新型优良菌株。

Description

一种球状节杆菌CNA9及其应用

技术领域

本发明微生物领域，具体涉及一种球状节杆菌及其应用。

背景技术

由于传统农业生产中粗放的种植模式下化学农药，杀虫剂，生长调节剂的过量使用，使环境背负了巨大压力，继而引起的水土流失，土壤退化，农产品安全等问题也严重影响到人们的生产和生活。同时随着经济社会的发展，人们对高安全高品质农产品需求的增加，使得在农业生产中高环境亲和力的生物源制剂的需求越趋旺盛，特别是对微生物肥料和微生物源药剂的需求巨大。

目前，国际上的生物源制剂一般分为：动物，植物，微生物。但是在我国农业实际应用中，可以进行大规模工业化生产的植物源农药、微生物源农药和微生物源肥料。微生物生长调节剂是介于微生物源农药和肥料间的一种，是利用微生物的生理活性物质等来调节植物的生长发育，有益于植物生长和产量。这类微生物通常是附生于根际中的菌，称为植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)。

产IAA菌作为植物根际促生菌(PGPR)中的一种，附着在植物根系或叶表面，利用植物代谢产生分泌物的同时产生IAA和少量GA等植物激素来影响植物的生理过程和形态变化。具体表现为可直接促进根的伸长，从而增大了与土壤中营养物质接触的机会；可提高植物体内内源IAA的含量；诱导植物防卫基因的表达，提高植物体抗病，抗旱等抗逆性。目前，国际上研究较多的是固氮螺菌(Azospirillumbrasilense)，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)。2008年Spaepen通过实验证明巴西固氮螺菌有改变根形态的作用，表现为该菌产生的IAA显著促进了小麦根毛的形成。恶臭假单胞菌不仅在兰花种子共生萌发中起到了促进作用，而且可以在温室条件下显著促进番茄的产量。2009年B.Ali等从植物根际，叶际中分离出的五种产IAA菌，它们可使小麦幼苗上株高提高29.16％，分蘖数可提高97.35％，穗长提高25.2％，种子重量提高13.7％。已有报道中其它对植株有直接促生效果的产IAA菌还有：嗜麦芽黄单胞菌，蜡状芽胞杆菌，深绿木霉，埃希式菌属，微球菌属，葡萄球菌属等。本发明中提到的球状节杆菌种在1962年由Katznelson等人在Nature上发表文章指出其产IAA和GA特性，但有关该菌属菌种在农作物上的研究应用未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一株球状节杆菌新菌株及其应用。

本发明菌株CNA9是从山东省桓台县小麦实验田中分离得到，已于2010年10月11号在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为球状节杆菌CNA9，保藏号为CGMCCNo.4217。

CNA9菌株具体的可通过如下方法分离得到：

从小麦实验田中采集土样，取5g的土溶解到在45ml无菌生理盐水的三角瓶中，28℃、120rpm振荡15min后静止1min，取100μl的上清液加入到装有900μl生理盐水的Eppendorf管中，进行连续梯度稀释，即稀释成10^-2，10^-3，10^-4倍。分别取以上土壤悬浮液和10^-2，10^-3，10^-4倍土壤悬浮液稀释液100μl在NA培养基(牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)平板上均匀涂板，超净工作台内吹干，每个浓度重复3次，28℃温箱内培养36h，无菌牙签挑取细菌单菌落划线纯化后，接种到含有150mlDF+Trp培养基的500ml容积三角瓶中(蛋白胨5.0g/L，酵母抽提物1.5g/L，牛肉膏1.5g/L， NaCl 5.0g/L，色氨酸0.5g/L)的试管中28℃培养7天后，12000rpm离心5min，取1ml上清液于试管中，加入50μl Solution I(10mM磷酸)及2ml Solution II(1ml 0.5M FeCl₃溶于50ml 35％HClO₄)，混匀后于室温中反应25min，显示红色为产IAA菌株。根据颜色深浅对菌株进行分级，“+++”颜色最深，“++”次之，“+”再次。根据颜色的深浅对产IAA菌进行了初步筛选，对获得的菌株再进行温室促生效果的初步检查，最终筛选出促生性状良好且产IAA量高的菌株CNA9。

CNA9具有如下特性：

其为需氧细菌，硝酸还原、葡萄糖利用、果糖利用、甘露糖利用、淀粉水解、脲酶、明胶液化反应为阳性，蔗糖利用、酒石酸盐利用、酯酶和H₂S反应为阴性。

本发明的CNA9菌株的16S rDNA序列与目前发表的节杆菌属(Arthrobacter Sp.W17)16S rDNA(GenBanK登录号：EU596424.1)相似度最高，同源性达100％。综合生理生化特征鉴定与16S rDNA序列鉴定CNA9为球状节杆菌(Arthrobacter globiformis)。

促生试验表明该产IAA菌株CNA9具有稳定的促生能力，可显著提高玉米植株的生物量和黄瓜、小麦和玉米产量。

本发明还提供含有CNA9菌株的菌剂。

温室检测试验中，分别以玉米和黄瓜做为指示植物检测了该菌株的促生效果，结果表明CNA9均表现出显著的促生效果，其中玉米和黄瓜的干鲜重分别增加了32.53％，32.86％和75.76％，210％；大田检测试验中，大豆，小麦和玉米产量的增产效果分别为8～12％，10～15％和10～13％。本发明可为微生物菌肥的研发提供一株新型优良菌株。

附图说明

图1为CNA9菌群数量的日变化。

图2为CNA9产IAA量的日变化。

图3为温室条件下CNA9对玉米的促生效果。

图4为温室条件下CNA9对黄瓜的促生效果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1CNA9菌株的鉴定

1.1生理生化测定

将分离到的菌株(保藏号为CGMCC No.4217)进行鉴定，生理生化测定的方法按照标准方法(中国科学院微生物研究所细菌分类组，1978；东秀珠、蔡妙英等，2001)，鉴定指标参考了Yi-Guang Chenet al.(2009)、Dorothy Jones and Ronald M.Keddie(2006)、G.S.N.Reddyet al.(2002)等的文献报道。如表1(部分生理生化性状)中所示。

表1菌株生理生化鉴定

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性，“W”表示弱，“NA”表示为获得数据。

1.216S rDNA序列分析

将菌株CNA9接种于液体LB培养基中摇培24h后，取1mL菌液于1.5mL离心管中，12000r/min离心3min后收集菌体；

将菌体加567μL TE缓冲液震荡充分悬浮细胞；加入30μL 10％的SDS，3μL 20mg/mL蛋白酶K倒管并充分混匀，37℃水浴1h，每隔20min颠倒混匀一次；

加100μL 5M的NaCl混匀，加80μL CTAB/NaCl(10％/0.7M)溶液轻混，65℃水浴20min，每隔4分钟颠倒混匀一次；

加入750μL的氯仿/异戊醇(24∶1)，混匀后12000rpm离心5min；

取上清加入750μL的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，混匀后12000rpm离心5min；

取上清加入750μL的氯仿/异戊醇(24∶1)，混匀后12000rpm离心5min；将水相转移到新的离心管，加0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，13000rpm离心15min；

去上清，加1mL无水乙醇，轻混，12000rpm离心5min；

去上清，超净工作台吹干，加200μL TE溶液溶解沉淀(可在50℃水浴条件下助溶)；

加1μL 20mg/mL的RNaseA，37℃水浴2h；加入200μL的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀后12000rpm离心5min；

取水相，加200μl的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，12000r/min离心5min；取水相，加20μL 3M的NaAc(pH5.2)，混匀，加二倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，13000rpm离心15min；

去上清，加1mL70％乙醇，轻混，12000rpm离心5min；去上清，超净工作台吹干，加50μL TE溶液溶解沉淀获得CNA9基因组DNA。

PCR扩增获得CNA916S rDNA。其中，引物序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。

50μL反应体系为：双蒸灭菌水41.2μL，10×PCR缓冲液5.0μL，10mM dNTP 2μL，上、下游引物(10μmol/L)各0.5μL，Taq酶1U，模板1μL；PCR反应条件：94℃预变性10min；主循环94℃40s，56℃40s，72℃1min，循环34次；终延伸72℃10min；4℃保存。

PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分析，将所获得的PCR产物用Gel Extraction Kit(OMEGA)回收后由北京诺塞基因组研究中心有限公司测序，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。测序结果用DNAman处理后，在NCBI上比对，同源性最高的为节杆菌属(Arthrobacter Sp.W17)，(GenBanK登录号：EU596424.1)。

实施例2CNA9菌株产IAA量和菌株生长情况检测

2.1菌株的培养：

将在LB培养基上活化后的菌株接种于IAA检测培养基DF+Trp中，于28℃，170r/min摇陪8天。每天从中取定量菌液测菌群数和产IAA的量。

2.1.1菌群数测定：

取菌液原液于分光光度计600nm下检测吸光度，菌群数随着培养天数的增多而增多，需要稀释原液到一定倍数，使600nm下的吸光度值在0.1-1之间，保证其准确性，结果如图1所示。

结果表明，菌群数量在第2天达到最高，达10⁹CFU/mL，随着时间的增长，数量依次降低，在第8天时基本已降至刚接种时的水平，认为菌群基本完成一个生命周期。

2.1.2产IAA量的测定：

取DF+Trp菌液原液1.5mL于离心管中，12000rpm离心5min，取1mL上清液于试管中，加入50μL Solution I及2mL Solution II反应液，混匀后于室温中反应25min，检测530nm处吸光度，在标准曲线上比对并计算IAA产量，结果如图2所示。

结果表明，产IAA量在第2天骤然增多，认为是菌株达到对数期后开始大量合成分泌IAA，以后随着时间的增长，IAA积累量变化不大，最高的IAA产量达109g/mL。

其中，标准曲线的制作：称取0.01g IAA纯品(Sigma)溶于1mL无水乙醇中，混匀后吸取100μl加去离子水稀释至1mL，混匀后再吸取100μl加去离子水稀释至1mL，得100μg/mL IAA母液。然后分别配制下列浓度梯度IAA水溶液：5，10，15，20，25，30μg/mL。以去离子水做空白对照。检测不同浓度IAA溶液在530nm处吸光值，绘制IAA含量标准曲线。

实施例3CNA9菌剂的制备

3.1菌种活化

使用LB培养基，培养基配方为：酵母提取物10g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0-7.2。将球状节杆菌(Arthrobacter globiformis)CNA9接种于LB固体培养基斜面上，28℃培养24小时。

3.2种子液的培养

种子培养用改良523培养基，培养基配方为：蔗糖10g/L，KH₂PO₄ 2.0g/L，酵母膏10g/L，CaCO₃ 5.0g/L，NaCl 0.2g/L，MgSO4.7H₂O 0.3g/L，pH7.0-7.2。挑取活化好的球状节杆菌(Arthrobacterglobiformis)CNA9单菌落用无菌生理盐水配制成10⁸CFU/mL的菌悬液，以1％的接种量接种于改良523液体培养基中，28℃摇床震荡培养，转速为150rpm，培养时间为28h。

3.3发酵罐发酵

发酵培养基组成为：葡萄糖8g/L，酵母膏3g/L，NaCl 1.5g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄.7H₂O 0.2g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，pH 7.0-7.2。把培养好的种子液以2％的接种量接入发酵罐中，28℃，搅拌速度为160rpm，通气量为1∶0.7-0.9(发酵液体积：每分钟通气量体积)、罐压1.2-1.8F/cm²。发酵54h，菌量达到5-10×10⁸CFU/mL得到球状节杆菌(Arthrobacter globiformis)CNA9菌株的菌剂。

实施例4CNA9菌株温室中对玉米的促生效果检测

将CNA9菌株在LB固体培养基上划线活化2天后，接种到含有150ml DF+Trp培养基的500ml容积的三角瓶中中摇培3天。在分光光度计上检测其IAA产量。

选取健全的玉米种子，浸入70％酒精中消毒30s，用无菌水冲洗3遍，将种子用两层纱布包好放入大培养皿中，清水浸湿，使纱布表面形成一层水膜。放入28℃培养箱中，培养18h左右待种子露白，选取发芽一致的种子备用。

取10⁷CFU/mL摇培3天的CNA9菌液拌到灭菌沙中，每盆装6kg灭菌沙，同时设清水对照。共两组处理，每组处理10个重复。温室培养，隔天浇水，一个周后每周浇一次Hoagland营养液，待四个周后收获植株，测量其株高，根长，干鲜重。其中，根长结果用根系扫描分析***(WinRHIZO50)进行了分级比较处理。

结果如图3和表3，4所示，株高增加16.56％；鲜重增加32.86％；干重增加32.53％；接种了CNA9菌株的玉米根系中，直径大于0.3cm的根的总长度比对照长增长了85.60％；0～0.3cm的根差别不显著，可能是由于这部分根太细，在操作过程中损失的部分不确定。

表3温室条件下CNA9菌株对玉米植株的促生效果

实施例5CNA9菌株温室中对黄瓜的促生效果检测

将黄瓜种子催芽到露白，方法同实施例4。选取发芽一致的种子，放入人工气候箱(光照12h，黑暗12h；26℃，相对湿度为80％)育苗，直到第一片子叶长出后，再选取长势一致的黄瓜幼苗移栽到温室的花盆中，每盆装900g灭菌沙和蛭石混合物。设清水对照和喷施菌液共两个处理，每个处理4个重复。其中菌液处理操作如下：待黄瓜苗长到第一片真叶长出后开始喷施一次CNA9菌液，以后每隔一周喷施菌液一次，每天等量浇水，期间两个处理都同时喷施等量杀虫剂，一个月后收获，分别测量黄瓜的株高，茎粗，叶片数，叶面积，干鲜重。株高增加138.90％，茎粗增加43.21％，叶片数增加70％，叶面积增加255.23％，鲜重增加210％，干重增加75.76％。如图4和表5所示。

表5温室条件下CNA9对黄瓜的促生效果

实施例6CNA9菌株中对小麦、玉米、大豆的促生效果检测

将培养3天的CNA9菌株发酵液稀释300倍后对小麦、玉米和大豆进行拌种，进行田间增长促生效果测定，每个作物设置四个重复，收获后测定产量，CNA9对大豆、小麦和玉米增产效果分别为8～12％，10～15％和10～13％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种球状节杆菌(Arthrobacter globiformis)新菌株CNA9，其保藏号为CGMCC No.4217，保藏日期为2010年10月11日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.含有权利要求1所述菌株的菌剂。

3.权利要求1所述菌株在IAA生产中的应用。

4.权利要求1所述菌株在促进植物生长中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物选自绿豆、玉米、黄瓜、大豆或小麦。