CN107586748B - 一种中华单孢菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种中华单孢菌及其应用,本发明属于微生物学领域。解决了现有中华单孢菌对植物的促进生长作用不显著的技术问题。本发明提供的中华单孢菌,菌株为Sinomonas sp.NEAU‑HV1,已于2017年5月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC),保藏地点为湖北省武汉市武汉大学,保藏号为CCTCC NO:M2017246,该菌株可以以组合物如菌剂或生物肥料的形式或以菌液的形式应用于促进植物生长,效果显著。

Description

一种中华单孢菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物学领域,具体涉及一种新的中华单孢菌及其应用。
背景技术
化肥在我国农业生产中发挥着重要的作用,但其长期大量或不恰当的使用可造成土壤的重金属污染、土壤中有机质和腐殖质的缺乏、土壤结构破坏、土壤板结贫瘠,还造成有害元素堆积,蔬菜水果中硝酸盐含量超标,农产品品质下降,对环境和人体健康造成了不利影响。在土壤中许多微生物通过其生理活动为植物生长提供所需的营养物质,增加作物产量、改善作物品质和提高植物对病原菌的抗性。因此,利用土壤中有益微生物开发成微生物肥料可作为化学肥料的补充或有潜力的替代品,在避免化学肥料的污染及对土壤破坏的同时,可提高作物的产量和品质。
植物根际促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria,简称PGPR)是寄居于植物根际、根表的微生物,具有固氮、溶解无机磷或有机磷、产生生长素等植物激素、产生其它可以促进植物生长的活性物质以及分泌抗生素等能力中一种或多种的根际细菌,它们能够直接或间接的促进植物的生长和发育。PGPR可增加植物的鲜重和干重、促进植株根系生长及株高的增加、增加叶面积及叶绿素含量、提高植株的氮含量、增加可蘖植物的分蘖数、提高作物的产量并可促进种子的萌发。现已发现20多个属种的根际细菌具有PGPR的促生特性,包括假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、农杆菌属(Agrobacterium)、欧文氏菌属(Eriwinia)、黄杆菌属(Flavobacterium)、沙雷氏菌属(Serratia)、肠杆菌属(Enterobacter)和克雷伯氏菌属(Klebsiella)等,其中以假单胞菌属和芽孢杆菌属细菌的效果较好,且被报道最多。
中华单孢菌(Sinomonas sp.)是微球菌科(Micrococcaceae)的革兰氏阳性菌,菌体形态为杆状、弧状或呈现杆-球生长循环,主要的细胞水解糖为半乳糖、甘露糖和核糖,细胞壁肽聚糖的肽桥为A3α型,主要的甲基萘醌为MK-9(H2),主要的磷酸类脂为双磷脂酰甘油、磷脂酰甘油和磷脂酰肌醇,主要脂肪酸为iso-C15:0、anteiso-C15:0和anteiso-C17:0。中华单孢菌于2009年被建立为微球菌科的新属,其模式菌种为黄质中华单孢菌Sinomonasflava,截至目前已有10株中华单孢菌从土壤、植物根际土和火山岩表面等环境被分离鉴定,但关于中华单孢菌的生物学功能研究却鲜有报道。2014年,蔡俊等人分离得到一株产黄曲霉毒素B1降解酶的中华单孢菌Sinomonas sp.HSD8,;2016年,中山大学李文均课题组首次发现Sinomonas mesophila具有合成银纳米颗粒的能力,该纳米颗粒可有效抑制多药耐药性金黄色葡萄球菌的生长;同年,日本筑波大学研究人员从土壤中分离得到一株芝麻素降解菌株Sinomonas sp.No.22,并从该菌株中克隆鉴定出第一个微生物来源的芝麻素降解酶;2017年,韩国研究小组从植物根际土壤中分离到一株同时具有促进西瓜生长和防治西瓜细菌性果斑病害的中华单孢菌Sinomonas atrocyanea NSB-27。国内外关于中华单孢菌作为PGPR菌株的研究尚处于起步阶段,且菌株对植物的促生长效果并不显著。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供一种中华单孢菌及其应用。
本发明提供的菌株Sinomonas sp.NEAU-HV1已于2017年5月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC),保藏地点为湖北省武汉市武汉大学,保藏号为CCTCC NO:M2017246。
Sinomonas sp.NEAU-HV1为革兰氏染色阳性,菌体呈现明显的杆状和球状周期变化,无鞭毛,不运动,最适生长温度28℃,最适pH7.0,其单菌落在NA培养基(牛肉膏5g/L,蛋白胨10g/L,氯化钠5g/L,琼脂15g/L)上为黄色,有光泽,扁平,呈圆形,表面及边缘光滑,边缘整齐,湿润黏腻,容易挑取;正反面,边缘与中央部位颜色一致。菌株Sinomonas sp.NEAU-HV1接触酶阳性,MR和VP试验阴性,淀粉水解阳性,明胶水解阳性,硝酸盐还原阳性,柠檬酸利用阴性。
本发明还提供中华单孢菌Sinomonas sp.NEAU-HV1在制备促进植物生长的组合物中的应用。
所述组合物为含有中华单孢菌Sinomonas sp.NEAU-HV1的菌剂或生物肥料。
另外本发明提供的中华单孢菌Sinomonas sp.NEAU-HV1还可以直接用于促进植物生长。
有益效果:
本发明提供的中华单孢菌Sinomonas sp.NEAU-HV1对植物生长具有显著的促进作用,能够促进作物的生长和产量提高,温室中,使小麦根伸长量增加39%,根鲜重量增加146.6%,苗鲜重量增加68.4%,根干重量增加142.1%,苗干重量增加52.9%,株高增加20.6%;使玉米的根伸长量增加43.5%,根鲜重量增加38.5%,苗鲜重量增加114.3%,根干重量增加36.5%,苗干重量增加92.5%,株高增加22.5%;使生菜的叶面积增加99.2%,地上部分鲜重增加117.4%。含有上述中华单孢菌的生物肥料对黄瓜、西红柿、大豆、康乃馨、葡萄树果实或花瓣的产量有明显的提高作用,产量提高可达5-27%(质量)。可见,本发明提供的中华单孢菌Sinomonas sp.NEAU-HV1对作物、蔬菜、水果、花卉或苗木等均具有显著的促进生长作用。本发明提供的菌株Sinomonas sp.NEAU-HV1及其菌剂在使用过程中无污染,无公害,可减少化学肥料的用量,可广泛应用于植物促生领域,具有较好的经济效益和社会效益。
附图说明:
图1为菌株NEAU-HV1的16S rDNA序列***发育地位。
图2为菌株NEAU-HV1对小麦的促生效果图。
图3为菌株NEAU-HV1对温室盆栽小麦的促生效果图。
图4为菌株NEAU-HV1对玉米的促生效果图。
图5为菌株NEAU-HV1对温室盆栽玉米的促生效果图。
图6为菌株NEAU-HV1对温室盆栽生菜的促生效果图。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步说明,但不用以限制本发明,凡在本发明精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1中华单孢菌Sinomonas sp.NEAU-HV1的培养和鉴定
1.菌株的分离和培养
土样采集于乍得共和国哈杰尔-拉密省的热带地区(13°0′N,15°44′E),将5g的土样溶解到45ml无菌生理盐水的三角瓶中(带玻璃珠),在180rpm转速下振荡30分钟,静置10分钟后,取上层液体稀释10倍后,吸取0.5ml的稀释液涂布于NA平板培养基上,置于28℃中培养2天,挑取单菌落接种到新鲜NA平板培养基,经反复转接得到纯化菌株,将纯化的菌株命名为NEAU-HV1,用20%甘油保存于-80℃超低温冰箱中。
2.菌株的鉴定
鉴定方法:通过形态学特征,生理生化实验,细胞化学组分和16S rDNA序列分析对该菌株进行鉴定。
菌体形态特征:革兰氏染色阳性,菌株NEAU-HV1培养过程中有明显杆状和球状周期变化。
生理生化特征:严格好氧,其明胶水解、七叶苷水解、纤维素分解、脲酶、VP试验、柠檬酸盐利用阳性,而H2S产生、吐温水解、淀粉水解、甲基红试验阴性(见表1);可以利用棉子糖、蔗糖、鼠李糖、核糖、***糖、木糖、麦芽糖、乳糖、甘露糖、果糖、半乳糖、山梨糖和吲哚乙酸等碳源,不能利用甘露醇、肌醇、葡萄糖、甜醇等碳源;可以利用天冬氨酸、酪氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸等氮源,不能利用甘氨酸。
表1NEAU-HV1与相似菌株的生理生化特性比较
注:“+”为阳性,“-”为阴性。
细胞化学组分分析:
甲基萘醌的主要类型为MK-8(H2)、MK-9(H2)和MK-10(H2),磷酸类脂主要类型为diphosphatidylglycerol、phosphatidylglycerol、phosphatidylinositol和glycolipid,全细胞水解糖包括半乳糖、鼠李糖和甘露糖,脂肪酸种类和含量如表2。
表2菌株HV1及其相似菌株的脂肪酸组成和含量
注:“-”为阴性。
16S rDNA基因扩增和序列分析:
中华单孢菌NEAU-HV1在NA培养基中28℃培养至对数期,以12000r/min离心5min收集菌体,采用天根生化科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒,提取细菌的基因组DNA,以提取的DNA产物为模板,用细菌16S rDNA扩增通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1541R(5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)从基因组DNA中扩增出16S rDNA基因片段。PCR产物送吉林省库美生物科技有限公司进行测序。16SrDNA序列如SEQ ID NO:1所示,该序列已登录NCBI,登录号为MF418645。通过BLAST程序在EzBioCloud中进行序列比对分析,并运用NEGA 4.0构建菌株***发育树。结果表明该菌株的16S rDNA序列与目前发表的中华单孢菌Sinomonas susongensis A31T相似性达99.24%,与其它中华单孢菌的相似性低于99%。
综合菌体形态、生理生化特性、细胞组分和16S rDNA基因序列,将分离的菌株鉴定为Sinomonas sp.NEAU-HV1,***发育树见图1。该菌株于2017年5月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC),保藏地点为湖北省武汉市武汉大学,保藏号为CCTCC NO:M2017246。
16S rDNA序列
AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGGACGATGAAGCCCTTCGGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGCCCTTGACTCTGGGATAAGCCTGGGAAGCTGGGTCTAATACCGGATACATCCTCCTGCCGCATGGTGGGGGGTGGAAAGCCTTGTGCGGTCTTGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCCCTTTCGGTGGGGAACAAGCCGCTTCGGTGGTGAGGGTACCCGCGGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCTGCTGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCCCGGGTCTGCAGTGGGTACGGGCAGGCTGGAGTGCAGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGCACTAGGTGTGGGGGGCATTCCACGTCCTCCGCGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATGGGCCGGACCGCTCCAGAGATGGGGCTTCCCTTCGGGGCCGGTTCACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCCATGTTGCCAGCACTTCGGGTGGGGACTCATGGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGCCTTGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGTTGCGATGCTGTGAGGTTGAGCCAATCCCAGAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGGGGGAGCCGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACTAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTT
实施例2中华单孢菌Sinomonas sp.NEAU-HV1对小麦的促生试验
1.小麦的催芽实验:
将菌株接种到在TSB液体培养基中(胰蛋白胨大豆肉汤3g/100ml),28度250rpm振荡培养,然后以1%接种量接种到新鲜TSB培养基培养24h,收集菌体,经PBS缓冲液洗涤后,分别稀释成1.0×105-1.0×109cfu/ml浓度备用。挑选饱满的小麦种子若干放在自来水中1-2分钟剔除掉漂浮的干瘪种子,然后依次用70%的酒精对小麦种子消毒3-5分钟,无菌水清洗3-5次,5%的次氯酸钠溶液消毒3-5分钟和无菌水清洗3-5次。将培养好的Sinomonas sp.
NEAU-HV1用无菌水稀释到105、106、107、108和109cfu/ml,然后将处理好的小麦种子放入以上浓度的菌悬液中浸泡8-12小时至小麦露白,对照组(CK)用同等体积的无菌水进行浸泡。将露白的小麦用镊子轻轻夹出,放在装有双层滤纸的平皿里(每个平皿滤纸上加入5ml以上浓度的菌液悬液,放置于28℃、湿度70%的人工气候箱中培养。7天后测量小麦的根长和芽长。结果见图2和表3。与对照相比,菌株Sinomonas sp.NEAU-HV1对小麦的发芽具有促进作用,当菌液的浓度为107cfu/ml时,促生效果最明显,芽长和根长分别增加32.2%和36%。
表3接种不同浓度的菌株NEAU-HV1菌液对小麦促生的影响
2.小麦盆栽实验:
按照以上方法配制菌体稀释溶液,并处理小麦种子,将露白的种子有秩序地摆放在盛有1kg土壤的盆中,每盆放置30粒种子,每个处理设置3次重复,以不含菌体的PBS作为对照(CK)。30天后,分别测量小麦的株高,根长,苗和根的鲜重和干重。结果见图3和表4。与对照相比,当菌株的浓度为1.0×108cfu/ml时,促生效果最明显,株高增加20.6%,根长增加26.7%,苗鲜重增加68.4%,苗干重增加52.9%,根鲜重增加146.7%,根干重增加60%。
表4接种不同浓度的菌株NEAU-HV1菌液对盆栽小麦促生的影响
实施例3中华单孢菌Sinomonas sp.NEAU-HV1对玉米的促生试验
1.玉米的催芽实验:
将菌株接种到在NA液体培养基中(具体成分),28度250rpm振荡培养,然后以1%接种量接种到新鲜TSB培养基培养24h,收集菌体,经PBS缓冲液洗涤后,分别稀释成1.0×107cfu/ml-1.0×108cfu/ml浓度备用。挑选饱满的玉米种子若干放在自来水中1-2分钟剔除掉漂浮的干瘪种子,然后依次用70%的酒精对小麦种子消毒3-5分钟,无菌水清洗3-5次,5%的次氯酸钠溶液消毒3-5分钟和无菌水清洗3-5次。将培养好的Sinomonas sp.NEAU-HV1用无菌水稀释到105、106、107、108和109cfu/ml,然后将处理好的玉米种子放入以上浓度的菌悬液中浸泡8-12小时至小麦露白,对照组(CK)用同等体积的无菌水进行浸泡。将露白的玉米种子用镊子轻轻夹出,放在装有双层滤纸的平皿里(每个平皿滤纸上加入5ml以上浓度的菌液悬液,放置于28℃、湿度70%的人工气候箱中培养。7天后测量玉米的根长和芽长。结果见图4和表5。与对照相比,菌株Sinomonas sp.NEAU-HV1对玉米的发芽具有促进作用,当菌液的浓度为1.0×108cfu/ml时,促生效果最明显,芽长和根长分别增加217.8%和57.5%。
表5接种不同浓度的菌株NEAU-HV1菌液对玉米促生的影响
2.玉米盆栽实验:
按照以上方法配制菌体稀释溶液,并处理玉米种子,将露白的种子有秩序地摆放在盛有1kg土壤的盆中,每盆放置30粒种子,每个处理设置3次重复,以不含菌体的PBS作为对照(CK)。30天后,分别测量玉米的株高,根长,苗和根的干重和鲜重。结果见图5和表6。与对照相比,当菌株的浓度为1.0×108cfu/m时,促生效果最明显,株高增长22.5%,根长增加45.4%,苗鲜重增加114.3%,苗干重增加36.2%,根鲜重增加92.5%,根干重增加14.3%。
表6接种不同浓度的菌株NEAU-HV1菌液对盆栽玉米促生的影响
实施例4中华单孢菌Sinomonas sp.NEAU-HV1对生菜的盆栽促生试验
生菜种子用蒸馏水浸泡2-4个小时(对种子进行湿润,缩短生菜的发芽时间)之后种到育苗盘里,大约两周的时间后,挑选长势一致的生菜进行移栽,将培养好的Sinomonassp.NEAU-HV1用无菌水稀释到105、106、107、108和109cfu/ml直接浇灌到生菜的根部,对照组浇灌等体积蒸馏水。28天后对生菜测产,结果见图6和表7。与对照(CK)相比,当菌液的浓度为106~107cfu/ml时,促生效果最明显,叶面积和地上部鲜重分别增加99.2%和117.4%
表7接种不同浓度的菌株NEAU-HV1菌液对盆栽生菜促生的影响
实施例4
将菌株Sinomonas sp.NEAU-HV1接种到在TSB液体培养基中(胰蛋白胨大豆肉汤3g/100ml),28℃250rpm振荡培养,然后以1%(v/v)接种量接种到新鲜TSB培养基种培养。按照质量比1:10—14的比例,将上述发酵液淋入固体培养基中,再加入适量的去离子水,使水分含量达到20-40%,然后搅拌混匀,并装入发酵槽中,自然堆积发酵4—5天,期间保持水分含量为20-40%,并通入无菌空气保持发酵槽内部温度低于40℃;发酵结束后,自然干燥至水分含量低于5%,得到发酵菌剂。其中固体培养基按照如下方法制得:将3重量的份棉粕、4重量份花生壳粉、2重量份麦麸、0.2重量份糖蜜、2重量份花生饼、2.5重量份干蚕沙、10重量份干燥的玉米秸秆粉、0.8重量份草木灰、2重量份鱼骨粉、4重量份干燥的甘蔗渣、0.006重量份纤维素酶、0.8重量份干燥鸡粪、0.1重量份氯化铵,混合均匀后粉碎过50目筛,然后130-140℃的高温水蒸气充分灭菌,即得到所述固体培养基。
按照1:20-50的质量比,将所述的中华单孢菌Sinomonas sp.NEAU-HV1的发酵液或发酵菌剂与有机质混合物进行充分混合,并进行堆肥发酵处理,后处理后即得到所述中华单孢菌Sinomonas sp.NEAU-HV1微生物肥料。其中,所述有机质混合物为所有可用来制备有机肥的任意有机质的任意比例混合物,例如可为干燥玉米秸秆、干燥小麦秸秆、麦麸、干燥甘蔗渣、酒糟、豆粕、棉粕、花生壳粉、干燥稻草秸秆、干燥猪粪、干燥鸡粪、各种骨粉等中任意多种以任意比例的混合物,但为了营养全面,优选其中的至少4种,并可优选加入适量的玉米粉、豆饼粉、花生饼粉、糖蜜、纤维素酶、淀粉酶等辅助发酵和分解营养物质。其中,所述后处理是指堆肥发酵完成后,将其干燥至水分含量低于10%,即得到所述的生物肥料。
实施例5
将上述实施例4制备的中华单孢菌Sinomonas sp.NEAU-HV1生物肥料在整地前施用并翻耕入土壤。应用试验共设2个处理:处理1为亩施生物肥料200kg,处理2为不做任何处理的对照。供试植物为黄瓜、西红柿、大豆、康乃馨、葡萄树。在收获期,采集供试植物的果实或花瓣,并测其重量。结果显示,与对照相比,施用中华单孢菌Sinomonas sp.NEAU-HV1微生物肥料后,果实成熟或花期提前,且果实或花瓣的产量有明显的提高,产量提高可达5-27%(重量)。以上研究表明,中华单孢菌Sinomonas sp.NEAU-HV1微生物肥料对作物、蔬菜、水果、花卉或苗木等均具有显著的促进生长作用。
SEQUENCE LISTING
<110> 东北农业大学
<120> 一种中华单孢菌及其应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 27F
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 1541R
<400> 2
aaggaggtga tccagcc 17
<210> 3
<211> 1518
<212> DNA
<213> 16S rDNA
<400> 3
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gatgaagccc ttcggggtgg attagtggcg aacgggtgag taacacgtga gcaacctgcc 120
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taatcgcaga tcagcaacgc tgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380
caagtcacga aagtcggtaa cacccgaagc cggtggccca accccttgtg ggggggagcc 1440
gtcgaaggtg ggactggcga ttgggactaa gtcgtaacaa ggtagccgta ccggaaggtg 1500
cggctggatc acctcctt 1518

Claims (4)

1.一种中华单孢菌,其特征在于:该菌株为Sinomonas sp.NEAU-HV1,已于2017年5月18日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地点为湖北省武汉市武汉大学,保藏号为CCTCCNO:M2017246。
2.权利要求1所述的中华单孢菌在制备促进植物生长的组合物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:所述组合物为含有中华单孢菌Sinomonassp.NEAU-HV1的菌剂或生物肥料。
4.权利要求1所述的中华单孢菌在促进植物生长中的应用。
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