CN102108421A - 快速检测柯萨奇病毒a16型的荧光定量pcr试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测柯萨奇病毒A16型的荧光定量PCR试剂盒，涉及一种引起人类多种疾病病原体基因检测技术，适用于柯萨奇病毒A16型定性定量检测。该试剂盒包括RNA提取液、荧光定量PCR反应液、CA16标准阳性模板PMD18-T-CA16和阴性质控标准品，所述的荧光定量PCR反应液含有柯萨奇病毒A16型特异性引物对和荧光探针。本发明定量准确；检测速度快；特异性好，灵敏度高；可鉴定区别检测柯萨奇病毒A16型；使用步骤简单，可重复性高。本试剂盒可对柯萨奇病毒A16型进行快速定性定量检测，并可替代一直沿用的传统的培养法。

Description

快速检测柯萨奇病毒A16型的荧光定量PCR试剂盒

技术领域

本发明涉及一种引起人类多种疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种快速检测柯萨奇病毒A16型荧光定量PCR试剂盒，适用于柯萨奇病毒A16型的定性定量检测。

背景技术

柯萨奇病毒(Coxsackievirus，CV)是一类肠道病毒，因1948年首次在美国纽约州柯萨奇村发现而被命名。该病毒属于小核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)病毒科(Picornavi ridae)，肠道病毒属(Enterovirus)，是多种人类疾病的致病病原，致病谱广，可引起呼吸道感染、结膜炎、发热性皮疹、手足口病(Hand，Foot and Mouth Disease，HFMD)、疱疹性咽峡炎、心肌炎、心肌病及无菌性脑膜炎、脑炎和急性弛缓性麻痹等疾病。

迄今为止，柯萨奇病毒共有30个血清型，分为A和B两组，已知A组有24型，B组有6型，其中，CV A组16型(CV Group A 16 Strain，CVA16)是引起儿童HFMD的主要病原之一。与另一种HFMD的致病原-----人肠道病毒71型(HumanEnterovirus 71Strain，HEV71)相比，CVA16所致HFMD症状相对较轻，一般不合并严重的并发症，疾病过程多为自限性，所以对其研究较少。但是由于近20多年HFMD在全球，尤其是亚洲太平洋地区周期性爆发，并且疫情较为严重，所以对该病的主要致病原CVA16和HEV71的研究越来越受到人们的重视。

近年来发展起来的荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR，FQ-PCR)技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析和定量检测(Eng Lee Tan，Vincent Tak Kwong Chow，Development of multiplex real-timehybridization probe reverse transcriptase polymerase chain reaction forspecific detection and differentiation of Enterovirus 71 andCoxsackievirus A16，Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 61(2008)294-301；Tsao KC，Chang PY，Ning HC，Sun CF，Lin TY，Chang LY，Huang YC，Shih SR(2002)Use of molecular assay in diagnosis of hand，footand mouth disease caused by enterovirus 71 or coxsackievirus A16.J VirolMethods 102：9-14；Chen TC，Chen GW，Hsiung CA，Yang JY，Shih SR，Lai YK，Juang JL(2006)Combining multiplex reverse transcription-PCR and adiagnostic microarray to detect and differentiate enterovirus 71 andcoxsackievirus A16.J Clin Micro 44：2212-2219.)等方面得到广泛应用，并且已经成为当前病毒核酸定量的主要方法，国内目前已有关于丙肝、乙肝、支原体、衣原体、艾滋病、结核定量检测的试剂盒上市。

临床检测上传统的培养法和血清学方法具有灵敏度低、特异性差、假阳性、耗时费力等缺点；常规PCR法虽然有简便、快速、灵敏的优势，但是有不能精确定量和PCR后处理产生污染导致的假阳性等问题；因此亟待开发精确、灵敏、快速、无污染的临床检验方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种快速检测柯萨奇病毒A16型的荧光定量PCR试剂盒。

本发明采用以下技术方案：

一、PCR试剂盒

该试剂盒包括：RNA提取液(即TRIZOL核酸抽提试剂)、荧光定量PCR反应液、CA16标准阳性模板PMD18-T-CA16和阴性质控标准品；

1、荧光定量PCR反应液含有柯萨奇病毒A16型特异性引物对和荧光探针

1)柯萨奇病毒A16型

正向引物为5′-TCARTTCYATGGCTACAGGTYAAGR-3′，

反向引物为5′-CTAGRCATTGCTYGTGATTCTG-3′，

其中正向引物可向5’和3’端方向各延伸10个碱基，反向引物可向5’和3’端方向各延伸10个碱基；

2)荧光探针序列为5′-TGCTCATCGCCTACACCY-3′，该荧光探针序列可向5’和3’端方向各延伸10个碱基，

荧光探针5′端标记报告荧光基团FAM，3′端标记不发光的淬灭基团标记Eclipse，可以大大减少背景噪音的干扰。

2、CA16标准阳性模板PMD18-T-CA16是含有柯萨奇病毒A16型VP1基因片段的85个碱基对的核苷酸片段构成的PMD18-T载体，该载体可在大肠杆菌DH5α中增殖。

3、阴性质控标准品

该阴性质控标准品为无菌双蒸水，用于阴性对照。

二、PCR试剂盒的制备和检测方法

PCR试剂盒的制备和检测方法包括下列步骤：

①配制RNA提取液；

②配制荧光定量PCR反应液；

③配制CA16标准阳性模板PMD18-T-CA16；

④配制阳性定量标准品；

⑤配制阴性质控标准品；

⑥判断未知样本的阴阳性。

用RNA提取液提取未知检测样本得到RNA，后再取CA16阳性定量标准品和阴性质控标准品分别加入装有荧光定量PCR反应液的PCR反应管中，然后置于PCR荧光定量仪中进行反应；其中，以阳性定量标准品反应曲线作为标准对照，阴性质控标准品反应曲线作为阴性对照，以阳性定量标准品反应曲线判断阳性样本的浓度。从而判断未知样本的阴阳性及浓度。

本试剂盒的工作原理：

在本发明提供的快速定量检测柯萨奇病毒A16型荧光定量PCR试剂盒中，有标记了荧光基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5′端报告基团产生的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3′端淬灭基团淬灭，故体系中没有荧光信号的变化。在PCR退火和延伸过程中，探针与模板特异性结合，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5′→3′外切活性对探针进行切割释放出报告基团，这样破坏了两基团之间的荧光共振能量转移(FRET)，报告基团所释放的荧光可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测，荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系。对柯萨奇病毒A16型的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，Threshold Cycle)相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环个数，Ct值与起始模数呈一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多，相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。

在本发明提供的检测柯萨奇病毒A16型荧光定量PCR试剂盒中，针对柯萨奇病毒A16型检测中的特殊性，对不同的靶片段进行反应体系，如引物和探针浓度、Mg²⁺浓度、退火温度等的优化，并将FQ-PCR技术(荧光定量PCR技术)和定量检测***相结合，将其用于柯萨奇病毒A16型定量检测。通过优化方案，反复实验，建立了检测柯萨奇病毒A16型荧光定量PCR方法，并研制出检测柯萨奇病毒A16型荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出10拷贝，可以满足快速诊断柯萨奇病毒A16型的要求。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

1、定量准确；

2、检测速度快，仅2小时，加上样品DNA的提取制备，共仅需2.5小时；

3、特异性好，灵敏度高；

4、可鉴定区别检测柯萨奇病毒A16型；

5、使用步骤简单，可重复性高。

本试剂盒可对柯萨奇病毒A16型进行快速定性定量检测，并可替代一直沿用的传统的培养法。

具体实施方式

下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。

应当理解，这些实施实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。

下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制造厂商所建议的条件。

一、关于制备和检测方法的实施例

1、试剂盒组成与配制

①配制RNA提取液

即TRIZOL核酸抽提试剂。

②配制荧光定量PCR反应液

a、荧光PCR 10×Buffer组成：

500mM KCl，100mM Tris-HCl，PH9.0，1.0％Triton X-100；

b、荧光定量PCR反应液：PCR 10×buffer 5.0μl，10μmol/L的正向引物和反向引物各1.0μl，5μmol/L的荧光探针1.0μl，25mmol/L的MgCl₂5μl，2.5μmol/L的dNTPs 2.0μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl，40U/μl的RNA酶抑制剂0.5μl，10U/μl的AMV逆转录酶1.0μl，RNase Free dH₂O 33μl。

③配制CA16标准阳性模板PMD18-T-CA16：浓度为10⁹拷贝/ml标准阳性模板PMD18-T-CA16。

④将阳性标准模板系列稀释为10⁸拷贝/ml、10⁷拷贝/ml、10⁶拷贝/ml、10⁵拷贝/ml、10⁴拷贝/ml、10³拷贝/ml。

⑤配制阴性质控标准品：

该阴性质控标准品为无菌双蒸水。

二、关于试剂盒的应用实施例

1、使用试剂盒快速检测柯萨奇病毒A16型

①RNA的提取：血清、疱疹液等液体样本各100μl，加入200μ1RNA裂解液及100μl氯仿，剧烈振荡混匀30s后在冰上静置4min；4℃12000rpm离心15min；取上清加入等量体积的异丙醇，混匀，室温放置15min；4℃12000rpm离心15min；用75％乙醇洗涤沉淀，室温12000rpm离心10min；室温晾干，备用(如需保存RNA，则加入DEPC处理水，-20℃保存)。

②分别取荧光定量PCR反应液各45μl，取第①步所得CA16RNA和第②步稀释的CA16阳性标准模板各5μl，并设阴性对照，分别加入不同的PCR反应管，在荧光定量检测仪上平行做PCR检测。循环条件为：42℃逆转录45min；95℃预变性3min；95℃20s，45℃25s，72℃30s扩增32个循环；72℃10min。把荧光检测的程序设置在每个循环的第二步结束时进行，所用荧光为FAM，其吸收波长494nm，发射波长522nm。

③通过比较待测样品和相应标准品的循环域值Ct值，对待测样品的起始拷贝数进行定量。

2、实验结果

荧光定量PCR反应结束后，运用仪器自带软件，读取待检样品拷贝数。结果为：CA16标准阳性模板10⁸拷贝/ml、10⁷拷贝/ml、10⁶拷贝/ml、10⁵拷贝/ml、10⁴拷贝/ml、10³拷贝/ml的Ct值分别为17.92，21.64，24.83，28.248，31.09，34.82；阴性对照为40；

反复重复试验3次，得到Ct值进行统计学分析P＞0.05，数据差异无显著意义，说明其不同批次之间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。

从上述实例可以说明，荧光定量PCR方法定量重复性好，定量准确，而且，荧光定量PCR检测试剂盒对样品的检测仅需2.5个小时就能完成，而传统的细胞培养法约需1周左右才能完成，因此，使用该试剂盒可以大大缩短检测时间。

序列表

<110>武汉百泰基因工程有限公司

<120>快速检测柯萨奇病毒A16型的荧光定量PCR试剂盒

<140>

<141>

<160>4

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>CA16正向引物

<400>

5′-TCARTTCYATGGCTACAGGTYAAGR-3′；

<211>2

<212>DNA

<213>CA16反向引物

<400>

5′-CTAGRCATTGCTYGTGATTCTG-3′；

<211>3

<212>DNA

<213>CA16荧光探针序列

<400>

5′-TGCTCATCGCCTACACCY-3′；

<211>4

<212>DNA

<213>CA16标准阳性模板PMD18-T-CA16包含的VP1基因片段的核苷酸序列

<400>

TCATTCATGGCTACAGGTAAGATGCTCATCGCCTACACCCCACCCGGGGGAAGTGTGCCTGCGGACAGAATCACAGCAATGCTAG。

Claims (4)

1.一种快速检测柯萨奇病毒A16型的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于包括：

RNA提取液、荧光定量PCR反应液、CA16标准阳性模板PMD18-T-CA16和阴性质控标准品；

所述的荧光定量PCR反应液含有柯萨奇病毒A16型特异性引物对和荧光探针；

正向引物为5′-TCARTTCYATGGCTACAGGTYAAGR-3′，

反向引物为5′-CTAGRCATTGCTYGTGATTCTG-3′，

其中正向引物可向5’和3’端方向各延伸10个碱基，反向引物可向5’和3’端方向各延伸10个碱基；

荧光探针序列为5′-TGCTCATCGCCTACACCY-3′，该荧光探针序列可向5’和3’端方向各延伸10个碱基，荧光探针5′端标记报告荧光基团FAM，3′端标记不发光的淬灭基团标记Eclipse，可以大大减少背景噪音的干扰，CA16标准阳性模板PMD18-T-CA16是含有柯萨奇病毒A16型VP1基因的85个碱基对的核苷酸片段构成的PMD18-T载体，该载体在大肠杆菌DH5α中增殖。

2.按权利要求1所述的PCR试剂盒，其特征在于CA16标准阳性模板PMD18-T-CA16包含的VP1基因片段的核苷酸序列为：

TCATTCATGGCTACAGGTAAGATGCTCATCGCCTACACCCCACCCGGGGGAAGTGTGCCTGCGGACAGAATCACAGCAATGCTAG。

3.按权利要求1所述的PCR试剂盒，其特征在于阴性质控标准品为：

无菌双蒸水。

4.按权利要求1所述的PCR试剂盒的制备和检测方法，其特征在于包括下列步骤：

①配制RNA提取液；

②配制荧光定量PCR反应液；

③配制CA16标准阳性模板PMD18-T-CA16；

④配制阳性定量标准品；

⑤配制阴性质控标准品；

⑥判断未知样本的阴阳性。