CN100352943C - 快速检测沙眼衣原体的荧光定量pcr试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测沙眼衣原体的荧光定量PCR试剂盒，涉及一种性传播疾病病原体基因检测技术，适用于沙眼衣原体定性定量检测。本发明由DNA裂解液、荧光定量PCR反应液、标准阳性模板、阴性质控标准品组成；荧光定量PCR反应液含有引物和荧光探针，引物分为正向引物和反向引物。本发明特异性好，灵敏度高，定量精确，快速简便，可重复性高，可对沙眼衣原体进行快速定性定量检测，并可替代一直沿用的传统的培养法和ELISA(酶联免疫吸附试验)诊断方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种性传播疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种快速检测沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，CT)的荧光定量PCR(聚合酶链式反应)试剂盒，适用于CT定性定量检测。
背景技术
CT是一种致病微生物，既不是细菌，也不是病毒。它可以引起尿道感染，是淋病菌以外，较为常见的性传播疾病。这种尿道炎的典型表现是尿道刺痒、尿痛和排尿困难。在女性，还可同时有***炎、***，甚至引起***。
女性感染此病还会导致***、***。孕妇患病，其新生儿经产道感染也可诱发眼结膜炎，或发生肺炎。沙眼衣原体感染可持续较长时间，需要及时而充分的治疗，否则容易迁延及复发。
近年来发展起来的荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR，FQ-PCR)技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析(Nellemann C，Vinggaard AM，Dalgaard M，et al.Quantification of Antiandrogen EffectDetermined by LightCycler Technology[J].Toxicology，2001，163：29-38)、病原体的定性(McGoldrick A，Lowings JP，Ibata G，et al.A Novel Approachto the Detection of Classical Swine Fever Virus by RT-PCR with aFluorogenic Probe(TaqMan)[J].J.Virol.Methods，1998，72：125-135.；Bhudevi B，Weinstock D.Fluorogenic RT-PCR assay(TaqMan)for Detectionand Classification of Bovine Viral Diarrhea Virus[J].Vet.Microbiol.，2001，83：1-10.)和定量检测(Desire N，Dehee A，Schneider V，et al.Quantification of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Proviral Load bya TaqMan Real-Time PCR Assay[J].J.Clin.Microbiol，2001，39：1303-1310.；Martell M，Gomez J，Esteban JI，et al.High-ThroughputReal-Time Reverse Transcription-PCR Quantitation of Hepatitis C Virus RNA[J].J.Clin.Microbiol，1999，37：327-332.；Kearns AM，Turner AJL，Eltringham GJA，et al.Rapid Detection and Quantification of CMV DNA inUrine using Lightcycler-based Real-time PCR[J].J.Clin.Virol，2002，24：131-134；Florence KP，Glaucia PB，Mireille S，et al.Quantitationof HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry[J].J.Virol.Methods，2001，95：111-119.)等方面得到广泛应用，并且已经成为当前病毒核酸定量的主要方法，国内目前已有关于丙肝、乙肝、支原体、艾滋病、结核定量检测的试剂盒上市。
临床检测上传统的培养法和血清学方法具有灵敏度低、特异性差、假阳性、耗时费力等缺点；常规PCR法虽然有简便、快速、灵敏的优势，但是有不能精确定量和PCR后处理产生污染导致的假阳性等问题；因此焏待开发精确、灵敏、快速、无污染的临床检验方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种快速检测沙眼衣原体的荧光定量PCR试剂盒。
本发明采用以下技术方案：
一、PCR试剂盒
该试剂盒包括该试剂盒包括：a)DNA裂解液，b)荧光定量PCR反应液，c)标准阳性模板，d)阴性质控标准品；
荧光定量PCR反应液含有引物和荧光探针，引物分为正向引物和反向引物；
正向引物为5′-ttcagttgggccagatcatg-3′；
反向引物为5′-ctcttcatcggtggctaatgtataaa-3′；
荧光探针序列为5′-aggctcgtcctgactcatgcatttcg-3′；
荧光探针5′端标记FAM，3′端标记TAMRA基团，标准阳性模板pU-CT是含有沙眼衣原体高度保守基因trp基因73个碱基对的核苷酸片段构成的pUCm-T载体，该载体可在大肠杆菌DH5α中增殖。
具体地说：
a)DNA裂解液
DNA裂解液包含：50mmol/L NaOH，10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，体积分数为1％Triton X-100，体积分数为1％NP-40，0.5mmol/L EDTA pH8.0。
b)荧光定量PCR反应液
荧光定量PCR反应液是由正向引物和反向引物，荧光探针，PCR 10×buffer溶液，MgCl2溶液，dNTPs溶液，Taq DNA聚合酶和无菌双蒸水组成；在本发明的一个具体方案中，荧光定量反应液由PCR 10×buffer 2μl，10μmol/L正向引物和反向的引物各1.0μl，5μmol/L荧光探针0.8μl，25 mmol/LMgCl2 2μl，10mmol/L dNTPs 0.4μl，2.5U/μl HOTSTART Taq DNA聚合酶0.4μl，无菌双蒸水10.4μl组成，反应液总体积18μl。其中荧光探针为所示的核苷酸序列，荧光探针5′端标记FAM，3′端标记TAMRA。
c)标准阳性模板
标准阳性模板pU-CT是含有沙眼衣原体trp基因73个核苷酸片段构成的pUCm-T载体，该载体可在大肠杆菌DH5α中增殖。贮存浓度为109拷贝/μl，使用前系列稀释。实验所用的标准品为含有目的扩增片段的质粒pU-CT，该质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A260定量并稀释至109拷贝/μl，-20℃保存。
d)阴性质控标准品
阴性质控标准品为无菌双蒸水。
本试剂盒的工作原理：
在本发明提供的快速定量检测沙眼衣原体荧光定量PCR试剂盒中，有一条两端标记有荧光基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5′端报告基团产生的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3′端淬灭基团淬灭，故体系中没有荧光信号的变化。在PCR退火和延伸过程中，探针与模板特异性结合，随着引物的延伸，HOTSTART Taq DNA聚合酶利用其5′→3′外切活性对探针进行切割释放出报告基团，这样破坏了两基团之间的荧光共振能量转移(FRET)，报告基团所释放的荧光可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测，荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系。对沙眼衣原体的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，Threshold Cycle)相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环个数，Ct值与起始模数呈一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多，相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。
在本发明提供的检测沙眼衣原体荧光定量PCR试剂盒中，针对沙眼衣原体检测中的特殊性，对不同的靶片段进行反应体系，如引物和探针浓度、Mg2+浓度、退火温度等的优化，并将FQ-PCR技术(荧光定量PCR技术)和定量检测***相结合，将其用于沙眼衣原体定量检测。通过优化方案，反复实验，建立了检测沙眼衣原体荧光定量PCR方法，并研制出检测沙眼衣原体荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出10拷贝，可以满足快速诊断沙眼衣原体的要求。
二、本发明的使用方法包括下列步骤：
a)对贮存浓度为109拷贝/μl标准阳性模板pU-CT进行系列稀释，制备阳性标准品，用紫外分光光度计测定A260对标准品定量；
b)用DNA裂解液从待测标本中提取DNA；
c)分别取b)步中的DNA和同样量的系列稀释的a)步中的阳性标准品加入到含HOTSTART Taq DNA聚合酶和荧光定量反应液的PCR反应体系中用荧光定量检测仪进行PGR检测；
d)通过比较待测样品和标准品的循环域值Ct值，对待测样品的起始拷贝数进行定量。
本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：
1、定量准确；
2、检测速度快，仅1小时，加上样品DNA的提取制备，共仅需2小时；
3、特异性好，灵敏度高；
4、步骤简单，可重复性高；
5、可同时进行高通量的样品检测。
在本发明中提供的快速定量检测沙眼衣原体荧光定量PCR试剂盒可对沙眼衣原体进行定量检测，并可替代一直沿用的传统的培养法和ELISA(酶联免疫吸附试验)诊断方法。
具体实施方式
下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制造厂商所建议的条件。
实施例1：沙眼衣原体荧光定量PCR试剂盒组成与配制
试剂组成：
a、DNA提取试剂(裂解液)
为自己配制，裂解液：50mmol/L NaOH，10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，体积分数为1％Triton X-100，体积分数为1％NP-40，0.5mmol/L EDTA pH8.0。
b、荧光PCR 10×Buffer组成：
500mM KCl、100mM Tris-HCl(PH9.0 25℃)、
1.0％ Triton X-100；
c、荧光定量PCR反应液：PCR 10×buffer 2μl，正向引物和反向引物各1.0μl(10μmol/L)，荧光探针0.8μl(5μmol/L)，MgCl22μl(25mmol/L)，dNTPs 0.4μl(10mmol/L)，HOTSTART Taq DNA聚合酶0.4μl(2.5U/μl)，无菌双蒸水10.4μl。荧光探针使用浓度为5μmol/L。
d、标准阳性模板贮存液：浓度为109拷贝/μl标准阳性模板pU-CT。
e、阴性质控标准品：为无菌双蒸水
实施实例2：用沙眼衣原体快速定量检测的荧光定量PCR试剂盒检测沙眼衣原体
a、在标本试管中加入1ml无菌生理盐水，充分震荡摇匀，转至1.5ml离心管中，10000g离心5min，再重复洗涤1次。沉淀直接加50μl DNA提取液充分混匀，沸水浴10min，10000g离心5min，取上清液2μl做PCR反应。
b、将阳性标准模板(试剂d)系列稀释为108拷贝/μl、107拷贝/μl、106拷贝/μl、105拷贝/μl、104拷贝/μl、103拷贝/μl。
c、分别取荧光定量PCP反应液(试剂c)各18μl，取第a)步所得DNA和第b)步稀释的阳性标准模板各2μl，并设阴性对照，分别加入不同的PCR反应管，在荧光定量检测仪上平行做PCR检测。循环条件为：95℃预变性400s；95℃10s，58℃ 40s，扩增40个循环。把荧光检测的程序设置在每个循环的第二步结束时进行，检测波长为510nm。
循环结束后，运用仪器自带软件，读取待检样品拷贝数。结果为：标准阳性模板108拷贝/μl、107拷贝/μl、106拷贝/μl、105拷贝/μl、104拷贝/μl、103拷贝/μl的Ct值分别为12.81，16.24，20.12，23.27，25.17，27.89，阴性对照为0；
反复重复试验3次，得到Ct值进行统计学分析P＞0.05，数据差异无显著意义，说明其不同批次之间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。
从上述实例可以说明，荧光定量PCR方法定量重复性好，定量准确，而且，荧光定量PCR检测试剂盒对样品的检测仅需2个小时就能完成，而传统的细胞培养法约需1周左右才能完成，因此，使用该试剂盒可以大大缩短检测时间。
该试剂盒的操作只需1人即可完成整个定量操作过程，一次可检测32-384个(由定量检测仪的型号决定)样品，这样也减少了人力资源的浪费。
序列表
<110>武汉大学
<120>一种快速检测沙眼衣原体的荧光定量PCR试剂盒
<140>200610018766.8
<141>2006-04-14
<160>1
<210>1
<211>73
<212>DNA
<213>沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)
<400>
ttcagttggg ccagatcatg ccgaaatgca tgagtcagga cgagcctttt atacattagc 60
caccgatgaa gag 73
Claims (3)
1、一种快速检测沙眼衣原体的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：
由DNA裂解液、荧光定量PCR反应液、标准阳性模板、阴性质控标准品组成；
荧光定量PCR反应液含有引物和荧光探针，引物分为正向引物和反向引物；
正向引物为5′-ttcagttgggccagatcatg-3′；
反向引物为5′-ctcttcatcggtggctaatgtataaa-3′；
荧光探针序列为5′-aggctcgtcctgactcatgcatttcg-3′；
荧光探针5′端标记FAM基团，3′端标记TAMRA基团，标准阳性模板pU-CT是含有沙眼衣原体高度保守基因trp基因73个碱基对的核苷酸片段构成的pUCm-T载体，该载体可在大肠杆菌DH5α中增殖；
所述的PCR即聚合酶链式反应，所述的CT即沙眼衣原体。
2、根据权利要求1所述的PCR试剂盒，其特征是：
荧光定量PCR反应液是由PCR10×buffer，10μmol/L的正向引物和反向引物，5μmol/L荧光探针，25mmol/L MgCl2，10mmol/L dNTPs和无菌双蒸水组成。
3、根据权利要求1所述的PCR试剂盒，其特征是标准阳性模板pU-CT包含的trp基因的核苷酸序列为：
ttcagttgggccagatcatgccgaaatgcatgagtcaggacgagccttttatacattagccaccgatgaagag。
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