CN101970674B

CN101970674B - 使用具有过水解活性的酶生产过酸

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Publication number: CN101970674B
Application number: CN200880125260.4A
Authority: CN
Inventors: R·迪科西莫; J·E·加瓦根; M·佩恩; F·B·库林三世
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2007-11-21
Filing date: 2008-06-20
Publication date: 2015-09-02
Anticipated expiration: 2028-06-20
Also published as: US20080176299A1; EP2574675A2; EP2574673A1; EP2574672A1; CN104988187B; EP2217713A1; WO2009067279A1; EP2574674A1; US8518675B2; CN104988187A; CN101970674A; EP2574675A3; JP2011504370A; JP5677091B2

Abstract

提供了用于由羧酸酯生产过氧羧酸的方法。更具体地讲，在具有过水解活性的酶催化剂存在下使羧酸酯与无机过氧化氢例如过氧化氢反应。基于保守结构特征，本发明过水解酶催化剂被归类为糖酯酶家族7(CE-7)的成员。此外，还提供了包含通过本发明所述方法产生的过酸的消毒制剂。

Description

使用具有过水解活性的酶生产过酸

对相关申请的交叉引用

本申请是2007年11月21日提交的美国专利申请号11/943872的部分继续申请，其全部内容通过引用的方式并入本文。本申请与2007年5月2日提交的美国专利申请号11/743354、2006年12月12日提交的美国专利申请号11/638,635、2005年12月13日提交的美国临时申请号60/750,092，和2006年10月20日提交的美国临时申请号60/853,065相关，上述每个申请的全部内容通过引用的方式并入本文。

技术领域

本发明涉及过酸生物合成和原位酶催化领域。具体而言，本发明提供了使用酶的过水解(perhydrolysis)活性产生过酸的方法，所述酶在结构上被鉴定为属于糖酯酶的CE-7家族，包括头孢菌素乙酰水解酶(CAHs；EC.3.1.1.41)和乙酰木聚糖酯酶(AXEs；E.C.3.1.1.72)。该酶促方法由羧酸酯底物产生过羧酸。此外，本发明还提供了包含通过本文所述方法产生的过酸的消毒制剂。

背景

过酸组合物已报道是有效的抗微生物剂。对硬质表面、肉制品、活植物组织和医疗器材进行抗微生物生长的清洁、消毒和/或卫生处理的方法已得到描述(美国专利6,545,047；美国专利6,183,807；美国专利6,518,307；美国专利申请公布20030026846；和美国专利5,683,724)。也已报道过酸在制备用于衣物洗涤剂应用的漂白组合物中是有用的(美国专利3,974,082；美国专利5,296,161；和美国专利5,364,554)。

过酸可以通过羧酸和过氧化氢的化学反应进行制备(参见“OrganicPeroxides”，Daniel Swern编辑，第1卷，第313-516页；Wiley Interscience，New York，1971)。该反应通常由强无机酸例如浓硫酸催化。过氧化氢与羧酸的反应是平衡反应，并且过酸的产生通过使用过量浓度的过氧化物和/或羧酸，或通过去除水而得到促进。关于用于过酸产生的化学反应存在几个缺点：a)用于促进过酸产生的高浓度羧酸在使用含过酸溶液时可以导致不希望有的气味，2)过酸随着时间的过去在溶液中时常是不稳定的，并且溶液中的过酸浓度在使用前的保存期间降低，和3)由于使用浓硫酸作为催化剂该制剂通常是强酸性的。

克服过酸化学生产的缺点的一种方法是使用酶催化剂代替强酸催化剂。酶催化剂的使用允许在使用和/或应用时快速产生过酸，从而避免了与过酸溶液保存和随着时间的过去过酸浓度变化相关的问题。一般用于经由与过氧化氢的直接化学反应来产生过酸的高浓度的羧酸不是过酸的酶促生产所需的，其中酶催化的反应可以使用浓度比化学反应中一般使用的浓度低得多的羧酸酯作为底物。酶反应可以跨越广泛范围的pH来进行，取决于在给定pH下的酶活性和稳定性，并且取决于在给定pH下对于过水解的底物特异性。

酯酶、脂肪酶和一些蛋白酶具有催化烷基酯水解以生成相应的羧酸的能力(式1)：

式1

某些酯酶、蛋白酶和脂肪酶还显示出过水解活性，催化从烷基酯合成过酸(式2)：

式2

O.Kirk等人(Biocatalysis，11：65-77(1994))研究了水解酶(脂肪酶、酯酶和蛋白酶)催化酰基底物与过氧化氢的过水解以形成过氧羧酸，并且报道过水解在含水***中以非常低的效率进行。此外，他们发现脂肪酶和酯酶使过羧酸降解成相应的羧酸和过氧化氢。他们还发现蛋白酶在水中既不降解羧酸酯也不催化羧酸酯的过水解。作者得出结论，酯酶、脂肪酶和蛋白酶一般不适于在含水环境中催化简单酯类例如辛酸甲酯和三辛酸甘油酯(trioctanoin)的过水解。

美国专利3,974,082描述了通过使待漂白的材料与水溶液接触来生产用于衣物洗涤剂应用的漂白组合物，所述水溶液包含释放氧的无机过氧化合物、酰基烷基酯和能够使该酯水解的酯酶或脂肪酶。

美国专利5,364,554描述了用于使用蛋白酶、过氧化氢来源和优选地在化学上不能过水解的酯底物在水溶液中原位生成过酸的活化氧化剂***。还公开了漂白方法和形成过酸的方法。

美国专利5,296,161描述了在包含一种或多种特异性酯酶和脂肪酶、过氧化氢来源和适于在漂白组合物中使用的官能化酯底物的水溶液中生产过酸。然而，产生的过酸浓度一般不足以用于在许多商业消毒应用中使用。

用于使用酶催化剂由相应的羧酸酯制备过酸的大部分已知方法不能产生和积聚浓度高至足以在各种应用中有效消毒的过酸。近期已报道，几种蛋白酶和脂肪酶组合原位产生浓度适于用作消毒剂和/或商业漂白剂的过酸(例如过乙酸)(参见共同拥有的美国专利申请11/413,246和11/588,523；引入本文作为参考)。然而，仍需要鉴定能够原位产生过酸的另外的过水解酶(perhydrolase)。

美国专利4,444,886描述了具有酯水解酶活性(描述为“甘油二乙酸酯酶(acetinase)”)的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株(ATCC31954^TM)，其具有用于水解具有含2-8个碳原子的酰基的甘油酯的高特异性。美国专利4,444,886没有描述、讨论或预测这种菌株的酯水解酶活性具有对于羧酸酯(包括甘油酯)的过水解酶活性。

待解决的问题是提供原位酶促生成浓度适于在各种消毒应用和/或漂白应用中使用的过酸的方法。优选地，用于生成过酸组合物的底物应当是相对无毒和价廉的，例如羧酸酯，特别是单酰基甘油、二酰基甘油和三酰基甘油，其中酰基具有1-8个碳原子，以及乙酰化糖，和C1-C6多元醇酯。

发明简述

所述问题已通过下述发现得到解决：属于CE-7酯酶结构家族的酶(例如头孢菌素C脱乙酰酶[CAHs]和乙酰木聚糖酯酶[AXEs])表现出用于将存在的羧酸酯(在过氧的无机来源例如过氧化氢存在下)转化成浓度足以用作消毒剂和/或漂白剂的过酸的显著过水解活性。该***通过产生高浓度过酸而又不需要高浓度过氧而实现效率。

过水解酶的具体实例例如来自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(ATCC 31954^TM)，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)BE1010(Payne andJackson，J.Bacteriol.173：2278-2282(1991))，枯草芽孢杆菌ATCC6633^TM(U.S.6,465,233)，枯草芽孢杆菌ATCC 29233^TM；地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)ATCC 14580^TM(Rey等人，genome Biol.，5(10)：article77(2004))，热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)ATCC27405^TM(Copeland等人，GENBANKZP_00504991，短小芽孢杆菌(B.pumilus)PS213(Degrassi等人，Microbiology，146：1585-1591(2000))，那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)(GENBANKAAB70869.1)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)KSM-K16(GENBANKYP_175265)，海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8(GENBANKNP_227893.1)，解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium saccharolyticum)(GENBANKS41858)，Thermotoga lettingae(GENBANKCP000812)，Thermotogapetrophila(GENBANKCP000702)，和栖热袍菌属物种(Thermotogasp.)RQ2(GENBANKCP000969)。

本文所描述的每一本发明过水解酶共有保守结构特征(即保守特征基序(signature Motif))以及与其他α/β-水解酶(例如可商购获得的脂肪酶；参见比较实施例26和28)相比具有优异的过水解活性，使得该独特的酶家族特别适于原位生成浓度足以用作消毒剂和/或漂白剂的过酸。适用于本发明方法的过水解酶可通过在糖酯酶CE-7家族内发现的保守特征基序来鉴定。

在本发明的一个方面，提供了用于由羧酸酯生产过氧羧酸的方法，所述方法包括：

a)提供一组反应成分，所述成分包括：

1)至少一种选自下组的底物：

i)具有以下结构的酯

[X]_mR₅

其中X＝式R₆-C(O)O的酯基团

R₆＝C1-C7线性、支链或环状烃基部分，其任选被羟基或C1-C4烷氧基取代，其中对于R₆＝C2-C7，R₆任选包含一个或多个醚键；

R₅＝C1-C6线性、支链或环状烃基部分，其任选被羟基取代；其中R₅中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基或不超过一个酯基团；其中R₅任选包含一个或多个醚键；

m＝1至R₅中的碳原子数；并且

其中所述酯在25℃下在水中具有至少5ppm的溶解度；

ii)具有以下结构的甘油酯

其中R₁＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R₃和R₄各自为H或R₁C(O)；以及

iii)选自乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多糖的乙酰化糖；

2)过氧源；以及

3)具有过水解活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂包括具有CE-7特征基序的酶，当使用CLUSTALW与参照序列SEQ ID NO：2比对时，所述特征基序包含：

i)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置118-120的RGQ基序；

ii)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置179-183的GXSQG基序；和

iii)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置298-299的HE基序；并且

其中所述酶包含与SEQ ID NO：2的至少30％的氨基酸同一性；以及

b)在合适的含水反应条件下将所述反应成分组合，由此产生过氧羧酸。

在另一实施方案中，合适的底物也包括下式的酯：

其中R₁＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R₂＝C1-C10直链或支链烷基、链烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH₂CH₂-O)_nH或(CH₂CH(CH₃)-O)_nH，并且n＝1-10。

在另一方面，提供了消毒表面或无生命物体的方法，除了上文的方法，所述方法包括以下步骤：

c)使表面或无生命物体与步骤(b)产生的过氧羧酸接触，从而消毒所述表面或所述无生命物体。

另一方面，提供了用酶促产生的过氧羧酸组合物消毒硬质表面或无生命物体的方法，所述方法包括：

a)在合适的含水反应条件下在所述硬质表面或无生命物体上将一组反应成分组合，所述反应成分包括：

1)至少一种选自下组的底物：

i)具有以下结构的酯

[X]_mR₅

其中X＝式R₆-C(O)O的酯基团

m＝1至R₅中的碳原子数；并且

其中所述酯在25℃下在水中具有至少5ppm的溶解度；

ii)具有以下结构的甘油酯

其中R₁＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，

并且R₃和R₄各自为H或R₁C(O)；以及

iii)选自乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多糖的乙酰化糖；

2)过氧源；以及

3)具有过水解活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂包含选自SEQID NO：82、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：106的氨基酸序列，或通过对所述氨基酸序列取代、去除或添加一个或多个氨基酸而衍生的具有过水解酶活性的基本上相似的酶，

由此产生过氧羧酸，从而消毒所述硬质表面或无生命物体。

在一些实施方案中，产生的过氧羧酸是稀释的。

在另一实施方案中，上述方法包括含有选自SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：106的氨基酸序列的酶催化剂，或通过对所述氨基酸序列取代、去除或添加一个或多个氨基酸而衍生的具有过水解酶活性的基本上相似的酶。

在另一实施方案中，具有过水解酶活性的基本上相似的酶与选自SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：106的一个或多个氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

在一个优选实施方案中，底物选自：甘油一乙酸酯；甘油二乙酸酯；甘油三乙酸酯；甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯；甘油三丙酸酯；甘油一丁酸酯；甘油二丁酸酯；甘油三丁酸酯；葡萄糖五乙酸酯；木糖四乙酸酯；乙酰化木聚糖；乙酰化木聚糖片段；β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯；三-O-乙酰基-D-半乳醛；三-O-乙酰基-己烯糖；1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、2，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，2-戊二醇、2，5-戊二醇、1，6-戊二醇、1，2-己二醇、2，5-己二醇、1，6-己二醇的一酯或二酯；及其混合物。

附图简述

图1(图片a-c)是本发明过水解酶的CLUSTALW比对。每一种过水解酶在结构上被归类为糖酯酶家族7(CE-7)的成员，并且共有一些保守域。已经鉴定了几个保守基序(加下划线)，它们一起形成CE-7糖酯酶的特征基序。另外的基序(LXD；SEQ ID NO：2的氨基酸残基267-269)也加了下划线，并且可用于进一步表征特征基序。

生物序列简述

下面的序列遵照37C.F.R.1.821-1.825(“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求-序列规则”)，并且符合世界知识产权组织(WIPO)ST.25标准(1998)以及欧洲专利公约(EPC)和专利合作条约(PCT)的序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis))以及行政指令的第208节和附录C。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式均遵照37C.F.R.§1.822中列出的规则。

SEQ ID NO：1是来自枯草芽孢杆菌ATCC 31954^TM的头孢菌素C脱乙酰酶(cah)编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：2是来自枯草芽孢杆菌ATCC 31954^TM的头孢菌素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：3和4是用于PCR扩增来自枯草芽孢杆菌物种的过水解酶基因以构建pSW186、pSW187、pSW188和pSW190的引物。

SEQ ID NO：5是来自枯草芽孢杆菌枯草亚种菌株168(B.subtilissubsp.subtilis str.168)的头孢菌素C脱乙酰酶编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：6是来自枯草芽孢杆菌枯草亚种菌株168(B.subtilissubsp.subtilis str.168)的头孢菌素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列，并且与来自枯草芽孢杆菌BE1010的头孢菌素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列相同。

SEQ ID NO：7是来自枯草芽孢杆菌ATCC 6633^TM的头孢菌素乙酰酯酶编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：8是来自枯草芽孢杆菌ATCC 6633^TM的头孢菌素乙酰酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：9是来自地衣芽孢杆菌ATCC 14580^TM的头孢菌素C脱乙酰酶编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：10是来自地衣芽孢杆菌ATCC 14580^TM的头孢菌素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：11是来自短小芽孢杆菌PS213的乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：12是来自短小芽孢杆菌PS213的乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：13是来自热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)ATCC27405^TM的乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：14是来自热纤维梭菌ATCC 27405^TM的乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：15是来自那不勒斯栖热袍菌的乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：16是来自那不勒斯栖热袍菌的乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：17是来自海栖热袍菌MSB8的乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：18是来自海栖热袍菌MSB8的乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：19是来自热厌氧芽孢杆菌属物种JW/SL YS485的乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：20是来自热厌氧芽孢杆菌属物种JW/SL YS485的乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：21是来自芽孢杆菌属物种NRRL B-14911的头孢菌素C脱乙酰酶编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：22是来自芽孢杆菌属物种NRRL B-14911的头孢菌素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：23是来自喜盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)C-125的头孢菌素C脱乙酰酶编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：24是来自喜盐芽孢杆菌C-125的头孢菌素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：25是来自克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)KSM-K16的头孢菌素C脱乙酰酶编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：26是来自克劳氏芽孢杆菌KSM-K16的头孢菌素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：27和28是用于PCR扩增来自枯草芽孢杆菌物种的过水解酶基因以构建pSW194和pSW189的引物。

SEQ ID NO：29是克隆到pSW194内的PCR产物的核酸序列。

SEQ ID NO：30是克隆到pSW189内的PCR产物的核酸序列。

SEQ ID NO：31是克隆到pSW190内的枯草芽孢杆菌ATCC 29233^TM头孢菌素C脱乙酰酶(cah)基因的核酸序列。

SEQ ID NO：32是枯草芽孢杆菌ATCC 29233^TM头孢菌素C脱乙酰酶(CAH)的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：33和34是用于PCR扩增地衣芽孢杆菌ATCC 14580^TM头孢菌素C脱乙酰酶基因以构建pSW191的引物，

SEQ ID NO：35和36是用于PCR扩增热纤维梭菌ATCC 27405^TM乙酰木聚糖酯酶基因以构建pSW193的引物。

SEQ ID NO：37和38是用于PCR扩增短小芽孢杆菌PS213乙酰木聚糖酯酶编码序列(GENBANKAJ249957)以构建pSW195的引物。

SEQ ID NO：39和40是用于PCR扩增那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶基因(GENBANK58632)以构建pSW196的引物。

SEQ ID NO：41是在质粒pSW196中的那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶基因的密码子最优化形式的核酸序列。

SEQ ID NO：42是卡那霉素抗性基因的核酸序列。

SEQ ID NO：43是质粒pKD13的核酸序列。

SEQ ID NO：44和45是用于产生编码卡那霉素基因的PCR产物的引物，所述卡那霉素基因的侧翼是与大肠杆菌(E.coli)MG1655中的katG过氧化氢酶基因具有同源性的区域。所述产物用于破坏内源性katG基因。

SEQ ID NO：46是编码卡那霉素抗性基因的PCR产物的核酸序列，所述卡那霉素抗性基因的侧翼是与大肠杆菌MG1655中的katG过氧化氢酶基因具有同源性的区域。所述产物用于破坏内源性katG基因。

SEQ ID NO：47是大肠杆菌MG1655中的katG过氧化氢酶基因的核酸序列。

SEQ ID NO：48是大肠杆菌MG1655中的katG过氧化氢酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：49是质粒pKD46的核酸序列。

SEQ ID NO：50和51是用于证实katG基因破坏的引物。

SEQ ID NO：52是质粒pCP20的核酸序列。

SEQ ID NO：53和54是用于产生编码卡那霉素基因的PCR产物的引物，所述卡那霉素基因的侧翼是与大肠杆菌MG1655中的katE过氧化氢酶基因具有同源性的区域。所述产物用于破坏内源性katE基因。

SEQ ID NO：55是编码卡那霉素抗性基因的PCR产物的核酸序列，所述卡那霉素抗性基因的侧翼是与大肠杆菌MG1655中的katE过氧化氢酶基因具有同源性的区域。所述产物用于破坏内源性katE基因。

SEQ ID NO：56是大肠杆菌MG1655中的katE过氧化氢酶基因的核酸序列。

SEQ ID NO：57是大肠杆菌MG1655中的katE过氧化氢酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：58和59是用于证实以下菌株中的katE基因破坏的引物：单敲除菌株大肠杆菌MG1655 ΔkatE，和双敲除菌株大肠杆菌MG1655 ΔkatG ΔkatE，其在本文中称为大肠杆菌KLP18。

SEQ ID NO：60是编码氨基酸序列SEQ ID NO：12的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)PS213的密码子最优化形式的核酸序列。

SEQ ID NO：61是包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基118-299的区域的氨基酸序列。

SEQ ID NOs：62和63是用于PCR扩增克劳氏芽孢杆菌KSM-K16头孢菌素-C脱乙酰酶的密码子最优化形式的引物的核酸序列。

SEQ ID NO：64是编码克劳氏芽孢杆菌KSM-K16头孢菌素-C脱乙酰酶编码序列的密码子最优化形式的PCR产物的核酸序列。

SEQ ID NO：65是密码子最优化的克劳氏芽孢杆菌KSM-K16头孢菌素-C脱乙酰酶编码序列的核酸序列。

SEQ ID NOs：66和67是用于PCR扩增解糖热厌氧杆菌乙酰木聚糖酯酶编码区(GENBANK登录号S41858)的密码子最优化形式的引物的核酸核酸。

SEQ ID NO：68是编码解糖热厌氧杆菌乙酰木聚糖酯酶编码序列的密码子最优化形式的PCR产物的核酸序列。

SEQ ID NO：69是解糖热厌氧杆菌乙酰木聚糖酯酶编码序列的密码子最优化形式的核酸序列。

SEQ ID NO：70是来自解糖热厌氧杆菌的乙酰木聚糖酯酶(GENBANK登录号S41858)的推导氨基酸序列。

SEQ ID NOs：71和72是用于PCR扩增海栖热袍菌MSB8(GENBANK登录号NP_227893.1)乙酰木聚糖酯酶编码序列的密码子最优化形式的引物的核酸序列。

SEQ ID NO：73是编码海栖热袍菌MSB8乙酰木聚糖酯酶编码序列的密码子最优化形式的PCR产物的核酸序列。

SEQ ID NO：74是海栖热袍菌MSB8乙酰木聚糖酯酶编码序列的密码子最优化形式的核酸序列。

SEQ ID NOs：75和76是用于PCR扩增Thermotoga lettingae(GENBANK登录号CP000812)乙酰木聚糖酯酶编码序列的密码子最优化形式的引物的核酸序列。

SEQ ID NO：77是编码Thermotoga lettingae乙酰木聚糖酯酶编码序列的密码子最优化形式的PCR产物的核酸序列。

SEQ ID NOs：78和79是用于PCR扩增Thermotoga lettingae(GENBANK登录号CP000812)乙酰木聚糖酯酶编码序列的密码子最优化形式的引物的核酸序列。

SEQ ID NO：80是编码Thermotoga lettingae乙酰木聚糖酯酶编码序列的密码子最优化形式的PCR产物的核酸序列。

SEQ ID NO：81是来自Thermotoga lettingae的乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：82是来自Thermotoga lettingae的乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NOs：83和84是用于PCR扩增Thermotoga petrophila(GENBANK登录号CP000702)乙酰木聚糖酯酶编码序列的密码子最优化形式的引物的核酸序列。

SEQ ID NO：85是编码Thermotoga petrophila乙酰木聚糖酯酶编码序列的密码子最优化形式的PCR产物的核酸序列。

SEQ ID NOs：86和87是用于PCR扩增Thermotoga petrophila(GENBANK登录号CP000702)乙酰木聚糖酯酶编码序列的密码子最优化形式的引物的核酸序列。

SEQ ID NO：88是编码Thermotoga petrophila乙酰木聚糖酯酶编码序列的密码子最优化形式的PCR产物的核酸序列。

SEQ ID NO：89是来自Thermotoga petrophila的乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：90是来自Thermotoga petrophila的乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NOs：91和92是用于PCR扩增热袍菌属物种RQ2“RQ2(a)”(GENBANK登录号CP000969)乙酰木聚糖酯酶编码序列的密码子最优化形式的引物的核酸序列。

SEQ ID NO：93是编码热袍菌属物种RQ2“RQ2(a)”乙酰木聚糖酯酶编码序列的密码子最优化形式的PCR产物的核酸序列。

SEQ ID NOs：94和95是用于PCR扩增热袍菌属物种RQ2“RQ2(a)”(GENBANK登录号CP000969)乙酰木聚糖酯酶编码序列的密码子最优化形式的引物的核酸序列。

SEQ ID NO：96是编码热袍菌属物种RQ2“RQ2(a)”乙酰木聚糖酯酶编码序列的密码子最优化形式的PCR产物的核酸序列。

SEQ ID NO：97是本文确定为“RQ2(a)”的来自热袍菌属物种RQ2的乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：98是本文确定为“RQ2(a)”的来自热袍菌属物种RQ2的乙酰木聚糖酯酶(GENBANK登录号ACB09222)的推导氨基酸序列。

SEQ ID NOs：99和100是用于PCR扩增热袍菌属物种RQ2“RQ2(b)”(GENBANK登录号CP000969)乙酰木聚糖酯酶编码序列的密码子最优化形式的引物的核酸序列。

SEQ ID NO：101是编码热袍菌属物种RQ2“RQ2(b)”乙酰木聚糖酯酶编码序列的密码子最优化形式的PCR产物的核酸序列。

SEQ ID NOs：102和103是用于PCR扩增热袍菌属物种RQ2“RQ2(b)”(GENBANK登录号CP000969)乙酰木聚糖酯酶编码序列的密码子最优化形式的引物的核酸序列。

SEQ ID NO：104是编码热袍菌属物种RQ2“RQ2(b)”乙酰木聚糖酯酶编码序列的密码子最优化形式的PCR产物的核酸序列。

SEQ ID NO：105是本文确定为“RQ2(b)”的来自热袍菌属物种RQ2的乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：106是本文确定为“RQ2(b)”的来自热袍菌属物种RQ2的乙酰木聚糖酯酶(GENBANK登录号ACB08860)的氨基酸序列。

作为说明的实施方案的详述

所述问题已通过下述发现得到解决：属于CE-7糖酯酶家族的酶表现出用于将羧酸酯底物转化成过酸的显著过水解活性。该家族的在结构上相关的酶可用于产生具有用于消毒和/或漂白应用的高效率的过酸浓度。

在本公开中，使用了大量术语和缩写。除非另有具体说明，应用下述定义。

如本文所使用，术语“包含”意指如权利要求中提及的所述特征、整数、步骤或成分的存在，但它不预先排除一种或多种其他特征、整数、步骤、成分或其组的存在或添加。

如本文所使用，修饰使用的成分或反应物的量的术语“约”是指可以通过例如以下方式而发生的用数字表示的量的变化：在真实世界中用于制备浓缩物或使用溶液的一般测量和液体处理操作；这些操作中非故意的误差；用于制备组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度的差异；等等。术语“约”还包括由于对于起因于特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。

如本文所使用，术语“过酸”与过氧酸(peroxyacid)、过氧羧酸(peroxycarboxylic acid)、过氧酸(peroxy acid)、过羧酸(percarboxylicacid)和过氧酸(peroxoic acid)同义。

如本文所使用，术语“过乙酸”缩写为“PAA”，并且与过氧乙酸、乙过氧酸(ethaneperoxoic acid)以及CAS登记号79-21-0的所有其他同义词同义。

如本文所使用，术语“甘油一乙酸酯”与甘油单乙酸酯、甘油一醋酸酯和甘油单醋酸酯同义。

如本文所使用，术语“甘油二乙酸酯”与二乙酸甘油酯；甘油二醋酸酯、二醋酸甘油酯以及CAS登记号25395-31-7的所有其他同义词同义。

如本文所使用，术语“甘油三乙酸酯”与三乙酸甘油酯；三醋酸甘油酯；甘油三醋酸酯；1，2，3-三乙酰氧基丙烷、1，2，3-丙三醇三乙酸酯以及CAS登记号102-76-1的所有其他同义词同义。

如本文所使用，术语“甘油一丁酸酯”与一丁酸甘油酯、甘油单丁酸酯和一丁酸甘油基酯同义。

如本文所使用，术语“甘油二丁酸酯”与二丁酸甘油酯和二丁酸甘油基酯同义。

如本文所使用，术语“甘油三丁酸酯”与三丁酸甘油酯、1，2，3-三丁酰基甘油以及CAS登记号60-01-5的所有其他同义词同义。

如本文所使用，术语“甘油一丙酸酯”与一丙酸甘油酯、甘油单丙酸酯和一丙酸甘油基酯同义。

如本文所使用，术语“甘油二丙酸酯”与二丙酸甘油酯和二丙酸甘油基酯同义。

如本文所使用，术语“甘油三丙酸酯”与三丙酸甘油基酯、三丙酸甘油酯、1，2，3-三丙酰基甘油以及CAS登记号139-45-7的所有其他同义词同义。

如本文所使用，术语“乙酸乙酯”与醋酸乙酯、乙酰氧基乙烷、乙酸乙基酯、醋酸乙基酯、乙基乙酸酯以及CAS登记号141-78-6的所有其他同义词同义。

如本文所使用，术语“乳酸乙酯”与乳酸乙基酯以及CAS登记号97-64-3的所有其他同义词同义。

如本文所使用，术语“乙酰化糖”和“乙酰化多糖”是指包含至少一个乙酰基的单糖、二糖和多糖。实例包括但不限于葡萄糖五乙酸酯、木糖四乙酸酯、乙酰化木聚糖、乙酰化木聚糖片段、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛和三-O-乙酰基-己烯糖。

如本文所使用，术语“烃基”、“烃基基团”或“烃基部分”表示通过单个、两个或三个碳-碳键和/或通过醚键连接的，并且因此用氢原子取代的直链、支链或环状排列的碳原子。所述烃基基团可以是脂族和/或芳族。烃基基团的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、环丙基、环丁基、戊基、环戊基、甲基环戊基、己基、环己基、苄基和苯基。在一个优实施方案中，烃基部分是通过单个碳-碳键和/或通过醚键连接，并且因此被氢原子取代的直链、支链或环状排列的碳原子。

如本文所使用，术语1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、2，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，2-戊二醇、2，5-戊二醇、1，6-戊二醇、1，2-己二醇、2，5-己二醇、1，6-己二醇的“一酯”和“二酯”是指包含至少一个式RC(O)O的酯基团的所述化合物，其中R是C1-C7线性烃基部分。

如本文所使用，术语“合适的酶促反应混合物”、“适于原位生产过酸的成分”、“合适的反应成分”和“合适的含水反应混合物”是指其中反应物和酶催化剂发生接触的材料和水。本文提供了合适的含水反应混合物的成分，并且本领域技术人员理解适于这种方法的成分变化范围。在一个实施方案中，合适的酶促反应混合物在反应成分组合后原位生产过酸。像这样，反应成分可以作为其中一种或多种反应成分保持分离直至使用的多成分***提供。用于使多种活性成分分离和组合的***和装置的设计是本领域已知的，并且一般将取决于单个反应成分的物理形式。例如，多重活性流体(液体-液体)***一般使用多室分配瓶或二相***(美国专利申请公开号2005/0139608；美国专利5,398,846；美国专利5,624,634；美国专利6,391,840；欧洲专利0807156B1；美国专利申请公开号2005/0008526；和PCT公开号WO 00/11713A1)，例如在其中所需漂白剂在使反应性流体混合后产生的某些漂白应用中发现的。用于产生过酸的其他形式的多成分***可以包括但不限于，设计用于一种或多种固体成分或固体-液体成分组合的那些，例如粉剂(例如，许多商购可得的漂白组合物，美国专利5,116,575)、多层片(美国专利6,210,639)、具有多个隔室的水溶性包(美国专利6,995,125)和在水添加后反应的固体凝聚物(美国专利6,319,888)。

在一个实施方案中，制剂是作为两个单独混合物提供，由此在将两个混合物组合后产生过氧羧酸消毒剂。

在另一个实施方案中，提供了制剂，所述制剂包含：

a)第一混合物，所述第一混合物包含：

i)具有过水解酶活性的酶催化剂，所述酶催化剂包含具有CE-7特征基序的酶；以及

ii)羧酸酯底物，所述第一混合物任选包含选自下组的成分：无机或有机缓冲剂、腐蚀抑制剂、润湿剂、以及它们的组合；以及

b)包含过氧源和水的第二混合物，所述第二混合物任选包含螯合剂。

在另一个相关实施方案中，制剂的第一混合物中的羧酸酯底物选自：

i)具有以下结构的酯

[X]_mR₅

其中X＝式R₆-C(O)O的酯基团

m＝1至R₅中的碳原子数；并且

其中所述酯在25℃下在水中具有至少5ppm的溶解度；

ii)具有以下结构的甘油酯

iii)选自乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多糖的乙酰化糖；

在另一个实施方案中，制剂的第一混合物中的羧酸酯底物由下式定义：

在一个优选实施方案中，R₆是任选被羟基或C1-C4烷氧基取代、任选包含一个或多个醚键的C1-C7线性烃基部分。在另一优选实施方案中，R₆是任选被羟基取代和/或任选包含一个或多个醚键的C2-C7线性烃基部分。

在另一个实施方案中，羧酸酯底物选自甘油一乙酸酯；甘油二乙酸酯；甘油三乙酸酯；甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯；甘油三丙酸酯；甘油一丁酸酯；甘油二丁酸酯；甘油三丁酸酯；葡萄糖五乙酸酯；木糖四乙酸酯；乙酰化木聚糖；乙酰化木聚糖片段；β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯；三-O-乙酰基-D-半乳醛；三-O-乙酰基-己烯糖；1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、2，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，2-戊二醇、2，5-戊二醇、1，6-戊二醇、1，2-己二醇、2，5-己二醇、1，6-己二醇的一酯或二酯；及其混合物。

在另一个实施方案中，羧酸酯选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯以及它们的组合。在另一个实施方案中，羧酸酯是乙酰化糖。在另一个实施方案中，底物是包含一个或多个酯基团的C1-C6多元醇。在一个优选实施方案中，C1-C6多元醇上的一个或多个羟基被一个或多个乙酰氧基取代(如1，3-丙二醇二乙酸酯、1，4-丁二醇二乙酸酯等)。在另一个实施方案中，酶催化剂是固体颗粒。在另一个实施方案中，上述第一混合物是固体片或粉末。

如本文所使用，术语“过水解”定义为所选底物与过氧化物形成过酸的反应。一般地，无机过氧化物与所选底物在催化剂存在下反应以生成过酸。如本文所使用，术语“化学过水解”包括其中底物(过酸前体)与过氧化氢来源组合的过水解反应，其中过酸在不存在酶催化剂的情况下形成。

如本文所使用，术语“过水解酶活性”是指每单位质量(例如毫克)蛋白、干细胞重量或固定的催化剂重量的催化剂活性。

如本文所使用，“一个酶活性单位”或“一个活性单位”或“U”定义为，在指定温度每分钟产生1μmol过酸产物所需的过水解酶活性的量。

如本文所使用，术语“酶催化剂”和“过水解酶催化剂”是指包含具有过水解活性的酶的催化剂，并且可以是完整微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物的一种或多种细胞成分、部分纯化的酶或纯化的酶的形式。酶催化剂还可以是化学修饰的(例如通过聚乙二醇化或者通过与交联试剂反应来修饰)。还可以使用本领域技术人员众所周知的方法将过水解酶催化剂固定在可溶性或不溶性载体上；参见例如“Immobilization of Enzymes and Cells”；Gordon F.Bickerstaff，Editor；Humana Press，Totowa，NJ，USA；1997。如本文所述，具有过水解活性的所有本发明酶在结构上都是酶的糖家族酯酶家族7(CE-7家族)的成员(参见Coutinho，P.M.，Henrissat，B.“Carbohydrate-active enzymes：anintegrated database approach”，“Recent Advances in CarbohydrateBioengineering”，H.J.gilbert，g.Davies，B.Henrissat and B.Svenssoneds.，(1999)The Royal Society of Chemistry，Cambridge，第3-12页)。

CE-7家族的成员包括头孢菌素C脱乙酰酶(CAHs；E.C.3.1.1.41)和乙酰木聚糖酯酶(AXEs；E.C.3.1.1.72)。CE-7酯酶家族的成员共有保守特征基序(Vincent等人，J.Mol.Biol.，330：593-606(2003))。包含CE-7特征基序和/或基本上相似结构的过水解酶都适用于本发明。用于鉴定基本上相似的生物分子的方法是本领域众所周知的(例如序列比对方案、核酸杂交、保守特征基序的存在等)。在一个方面，本发明方法中的酶催化剂包含与本文提供的序列具有至少30％、优选至少33％、更优选至少40％、更优选至少50％、甚至更优选至少60％，甚至更优选至少70％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％氨基酸同一性的基本上相似的酶。本发明还提供了编码本发明CE-7糖酯酶的核酸分子。在另一个实施方案中，用于本发明方法的过水解酶催化剂由在严格条件下与本发明核酸分子之一杂交的核酸分子编码。

如本文所使用，术语“头孢菌素C脱乙酰酶”和“头孢菌素C乙酰基水解酶”是指催化头孢菌素例如头孢菌素C和7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid)的脱乙酰作用的酶(E.C.3.1.1.41)(Mitsushima等人，同上)。如本文所述，提供了具有显著过水解活性的几种头孢菌素C脱乙酰酶。

如本文所使用，“乙酰木聚糖酯酶”是指催化乙酰化木聚糖以及其他乙酰化糖的脱乙酰作用的酶(E.C.3.11.72；AXEs)。如本文所述，提供了具有显著过水解酶活性的归类为乙酰木聚糖酯酶的几种酶。

如本文所使用，术语“枯草芽孢杆菌(ATCC 31954^TM)”是指具有国际保藏登记号ATCC 31954^TM的保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的细菌细胞。已报道枯草芽孢杆菌ATCC 31954^TM具有能够水解具有2-8个碳酰基的甘油酯，特别是甘油二乙酸酯的酯水解酶(“甘油二乙酸酯酶”)活性(美国专利4,444,886；全文引入本文以供参考)。如本文所描述的，已从枯草芽孢杆菌ATCC 31954^TM中分离出具有显著过水解酶活性的酶，并且作为SEQ ID NO：2提供。分离的酶的氨基酸序列与由GenBank登记号BAA01729.1提供的头孢菌素C脱乙酰酶具有100％的氨基酸同一性。

如本文所使用，术语“枯草芽孢杆菌BE1010”是指如由Payne和Jackson(J.Bacteriol.173：2278-2282(1991))报道的枯草芽孢杆菌菌株。枯草芽孢杆菌BE1010是在编码枯草杆菌蛋白酶和中性蛋白酶的基因中具有染色体缺失的衍生枯草芽孢杆菌枯草亚种菌株BR151(ATCC33677^TM)。如本文所述，已从枯草芽孢杆菌BE1010中分离出了具有显著过水解酶活性的酶，并且作为SEQ ID NO：6提供。分离的酶的氨基酸序列与由枯草芽孢杆菌枯草亚种菌株168中报道的头孢菌素C脱乙酰酶(Kunst等人，Nature 390：249-256(1997))具有100％的氨基酸同一性。

如本文所使用，术语“枯草芽孢杆菌ATCC 29233^TM”是指具有国际保藏登记号ATCC 29233^TM的保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的枯草芽孢杆菌菌株。如本文所描述，已从枯草芽孢杆菌ATCC 29233^TM中分离出和测序了具有显著过水解酶活性的酶，并且作为SEQ ID NO：32提供。

如本文所使用，术语“热纤维梭菌ATCC 27405^TM”是指具有国际保藏登记号ATCC 27405^TM的保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的热纤维梭菌菌株。来自热纤维梭菌ATCC 27405^TM的具有过水解酶活性的酶的氨基酸序列作为SEQ ID NO：14提供。

如本文所使用，术语“枯草芽孢杆菌ATCC 6633^TM”是指具有国际保藏登记号ATCC 6633^TM的保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的细菌细胞。已有报道枯草芽孢杆菌ATCC 6633^TM具有头孢菌素乙酰水解酶活性(美国专利6,465,233)。来自枯草芽孢杆菌ATCC 6633^TM的具有过水解酶活性的酶的氨基酸序列作为SEQ ID NO：8提供。

如本文所使用，术语“地衣芽孢杆菌ATCC 14580^TM”是指具有国际保藏登记号ATCC 14580^TM的保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的细菌细胞。已有报道地衣芽孢杆菌ATCC 14580^TM具有头孢菌素乙酰水解酶活性(GENBANKYP 077621)。来自地衣芽孢杆菌ATCC 14580^TM的具有过水解酶活性的酶的氨基酸序列作为SEQ ID NO：10提供。

如本文所使用，术语“短小芽孢杆菌PS213”是指据报道具有乙酰木聚糖酯酶活性的细菌细胞(GENBANKAJ249957)。来自短小芽孢杆菌PS213的具有过水解酶活性的酶的氨基酸序列作为SEQ ID NO：12提供。

如本文所使用，术语“那不勒斯栖热袍菌”是指据报道具有乙酰木聚糖酯酶活性的那不勒斯栖热袍菌菌株(GENBANKAAB70869)。来自那不勒斯栖热袍菌的具有过水解酶活性的酶的氨基酸序列作为SEQ IDNO：16提供。

如本文所使用，术语“海栖热袍菌MSB8”是指据报道具有乙酰木聚糖酯酶活性的细菌细胞(GENBANKNP_227893.1)。来自海栖热袍菌MSB8的具有过水解酶活性的酶的氨基酸序列作为SEQ ID NO：18提供。

如本文所使用，术语“克劳氏芽孢杆菌KSM-K16”是指据报道具有头孢菌素-C脱乙酰酶活性的细菌细胞(GENBANKYP_175265)。来自克劳氏芽孢杆菌KSM-K16的具有过水解酶活性的酶的氨基酸序列作为SEQID NO：26提供。

如本文所使用，术语“解糖热厌氧杆菌”是指据报道具有乙酰木聚糖酯酶活性的细菌株(GENBANKS41858)。来自解糖热厌氧杆菌的具有过水解酶活性的酶的氨基酸序列作为SEQ ID NO：70提供。

如本文所使用，术语“Thermotoga lettingae”是指据报道具有乙酰木聚糖酯酶活性的细菌细胞(GENBANKCP000812)。来自Thermotogalettingae的具有过水解酶活性的酶的推导的氨基酸序列作为SEQ IDNO：82提供。

如本文所使用，术语“Thermotoga petrophila”是指据报道具有乙酰木聚糖酯酶活性的细菌细胞(GENBANKCP000702)。来自Thermotogalettingae的具有过水解酶活性的酶的推导的氨基酸序列作为SEQ IDNO：90提供。

如本文所使用，术语“热袍菌属物种RQ2”是指据报道具有乙酰木聚糖酯酶活性的细菌细胞(GENBANKCP000969)。从热袍菌属物种RQ2鉴定了两种不同的乙酰木聚糖酯酶，并且在本文中称作“RQ2(a)”(推导的氨基酸序列作为SEQ ID NO：98提供)和“RQ2(b)”(推导的氨基酸序列作为SEQ ID NO：106提供)。

如本文所使用，“分离的核酸分子”和“分离的核酸片段”将可互换使用，并且是指单链或双链的，任选含有合成的、非天然的或改变了的核苷酸碱基的RNA或DNA聚合物。DNA聚合物形式的分离的核酸分子可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个区段构成。

术语“氨基酸”是指蛋白质或多肽的基本化学结构单位。在本文中使用下列缩写来表示具体氨基酸：

如本文所使用，“基本上相似的”是指其中一个或多个核苷酸碱基的改变导致一个或多个氨基酸的添加、取代或缺失，但不影响由DNA序列编码的蛋白质的功能性质(即过水解活性)的核酸分子。如本文所使用，“基本上相似的”还指具有与本文报道的序列有至少30％、优选至少33％、更优选至少40％、更优选至少50％、甚至更优选至少60％，甚至更优选至少70％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的氨基酸序列的酶，其中所得到的酶保留本发明的功能性质(即，过水解活性)。“基本上相似”还可以指由在严格条件下与本文报道的核酸分子杂交的核酸分子编码的具有过水解活性的酶。因此应当理解，本发明包含了超过具体的示例性序列。

例如，本领域众所周知的是，在给定位点处导致产生化学上等价的氨基酸但不影响编码蛋白质的功能性质的基因中的改变是常见的。为了本发明的目的，取代定义为在下述5组之一内的交换：

1.小的脂族非极性残基或稍微极性的残基：Ala、Ser、Thr(Pro、Gly)；

2.极性的、带负电荷的残基和它们的酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；

3.极性的、带正电荷的残基：His、Arg、Lys；

4.大的脂族非极性残基：Met，Leu，Ile，Val(Cys)；以及

5.大的芳族残基：Phe、Tyr、Trp。

因此，氨基酸丙氨酸，即一种疏水性氨基酸的密码子，可以被编码另一个疏水性更弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性更强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。相似地，导致用一个带负电荷的残基替换另一个带负电荷的残基(例如天冬氨酸替代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基替换另一个带正电荷的残基(例如赖氨酸替换精氨酸)的改变也可以预期产生功能上等价的产物。在许多情况下，导致蛋白质分子的N-末端和C-末端部分改变的核苷酸变化也预期不改变蛋白质的活性。

所提议的修饰中的每一种完全在本领域常规技术内，编码产物的生物活性保留的测定也在本领域常规技术内。此外，技术人员认识到本发明包括基本上相似的序列。在一个实施方案中，基本上相似的序列由其在严格条件下(0.1×SSC，0.1％SDS，65℃且用2×SSC，0.1％SDS，随后为0.1×SSC，0.1％SDS，65℃洗涤)与本文例示的序列杂交的能力限定。在一个实施方案中，本发明包括由在严格条件下与本文报道的核酸分子杂交的分离核酸分子编码的具有过水解酶活性的酶。在优选的实施方案中，本发明包括由在严格条件下与具有选自下组的核酸序列的核酸分子杂交的分离核酸分子编码的具有过水解酶活性的酶：SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：77，SEQ IDNO：80，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：101，SEQID NO：104和SEQ ID NO：105。

如本文所用，当在合适的温度和溶液离子强度条件下第一个分子的单链可以退火至另一分子时，核酸分子“可杂交”至另一核酸分子，例如cDNA、基因组DNA或RNA。杂交和洗涤条件是众所周知的，并且在Sambrook，J.和Russell，D.，T.“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor(2001)中举例说明。温度和离子强度条件确定了杂交的“严格性”。可以调节严格条件以筛选中度相似的分子(例如来自远缘生物的同源序列)到高度相似的分子(例如从近缘生物复制功能性酶的基因)。杂交后洗涤通常决定严格性条件。一组优选的条件采用一系列如下洗涤：开始采用6×SSC、0.5％SDS在室温下持续洗涤15分钟，然后再使用2×SSC、0.5％SDS在45℃下洗涤30分钟，然后使用0.2×SSC、0.5％SDS在50℃下重复洗涤30分钟两次。更优选的一组条件采用更高的温度，其中洗涤与上述洗涤相同，不同的是最后两次在0.2×SSC、0.5％SDS中洗涤30分钟时的温度被增加到60℃。另一组优选的严格杂交条件为0.1×SSC，0.1％SDS，65℃且用2×SSC，0.1％SDS洗涤，随后为与本文例示序列的0.1×SSC，0.1％SDS，65℃的最终洗涤。

杂交需要两种核酸含有互补序列，但是取决于杂交的严格性，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适严格性取决于核酸的长度和互补的程度，所述长度和互补程度是本领域内所熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm)按以下顺序依次降低：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。对于长度超过100个核苷酸的杂交体，已经推导出了用于计算Tm的公式(请参见Sambrook和Russell，同上)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更重要，而且寡核苷酸的长度决定了其特异性(参见Sambrook和Russell，同上)。在一个方面，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地，关于可杂交核酸的最低长度为长度至少约15个核苷酸，更优选长度至少约20个核苷酸，更加优选长度至少30个核苷酸，更加优选长度至少300个核苷酸，最优选长度至少800个核苷酸。此外，技术人员将认识到，可根据需要根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液盐浓度。

如本文所使用，术语“同一性百分比”是两条或更多条多肽序列之间或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较而确定。在本领域中，“同一性”还表示多肽或多核苷酸序列之间序列关联的程度。根据具体情况，它由这些序列的序列串之间的匹配程度确定。“同一性”和“相似性”可容易地通过已知方法计算出来，所述的方法包括但不限于以下文献中所描述的那些：“ComputationalMolecularBiology”(Lesk，A.M.，ed.)Oxford University Press，NY(1988)；“Biocomputing：Informatics andgenome Projects”(Smith，D.W.，ed.)Academic Press，NY(1993)；“Computer Analysis of Sequence Data，PartI”(Griffin，A.M.，和Griffin，H.g.，eds.)Humana Press，NJ(1994)；“SequenceAnalysis inMolecular Biology”(von Heinje，g.，ed.)Academic Press(1987)；and“Sequence Analysis Primer”(Gribskov，M.和Devereux，J.，eds.)StocktonPress，NY(1991)。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中编成了代码。序列比对和同一性百分比计算可以使用LASERGENE生物信息学计算套件(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的Megalign程序，Vector NTI v.7.0(Informax，Inc.，Bethesda，MD)的AlignX程序，或EMBOSS Open Software Suite(EMBL-EBI；Rice等人，Trends ingenetics16，(6)pp276-277(2000))来进行。序列的多重比对可以使用Clustal比对法(即CLUSTALW；例如1.83版本)(Higgins和Sharp，CABIOS，5：151-153(1989)；Higgins等人，Nucleic Acids Res.22：4673-4680(1994)；和Chenna等人，Nucleic Acids Res 31(13)：3497-500(2003)，可经欧洲生物信息学院得自欧洲分子生物实验室)使用缺省参数来进行。有关CLUSTALW蛋白比对的合适参数包括缺口存在罚分(GAP Existencepenalty)＝15，缺口延长(GAP extension)＝0.2，矩阵(matrix)＝gonnet(例如Gonnet250)，蛋白ENDGAP＝-1，蛋白GAPDIST＝4，和KTUPLE＝1。在一个实施方案中，采取缺省设定使用快速或缓慢比对，其中缓慢比对是优选的。或者，使用CLUSTALW方法(1.83版本)的参数还可以进行改进，以还使用KTUPLE＝1，缺口罚分(GAP PENALTY)＝10，缺口延长(GAP extension)＝1，矩阵(matrix)＝BLOSUM(例如BLOSUM64)，窗口(WINDOW)＝5，以及TOP DIAGONALS SAVED＝5。

在本发明的一个方面，合适的分离核酸分子(本发明的分离多核苷酸)编码多肽，所述多肽具有与本文所报道的氨基酸序列有至少30％、优选至少33％、优选至少40％、优选至少50％、优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少85％，甚至更优选至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的氨基酸序列。本发明的合适的核酸分子不仅具有上述同源性，而且通常还编码具有约300至约340个氨基酸、更优选约310至约330个氨基酸、最优选约318个氨基酸的多肽。

如本文所使用，术语“特征基序(signature motif)”、“CE-7特征基序”和“标志性基序”是指具有确定活性的酶家族所共有的保守结构。特征基序还可用于限定和/或鉴定对于限定底物家族具有相似酶活性的在结构上相关的酶家族。特征基序还可以是单个邻接氨基酸序列或者是一起形成特征基序的非邻接保守基序的集合。保守基序通常用氨基酸序列表示。如本文所述，本发明过水解酶属于CE-7糖酯酶家族。该酶家族可通过特征基序的存在来限定(Vincent等人，同上)。

如本文所使用，“密码子简并性”是指遗传密码允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下变化的性质。因此，本发明涉及编码氨基酸序列的所有或主要部分的任何核酸分子，所述氨基酸序列编码本发明的微生物多肽。技术人员非常了解在使用核苷酸密码子确定给定氨基酸时特定宿主细胞显示出的“密码子偏好性”。因此，在合成基因以改善其在宿主细胞中的表达时，希望设计基因以使得其密码子使用频率接近宿主细胞中优选的密码子使用频率。

如本文所使用，“合成的基因”可由使用本领域技术人员已知的方法化学合成的寡核苷酸构件装配而成。将这些构件进行连接并退火以形成基因区段，该基因区段随后在酶促作用下装配而构建成完整的基因。与DNA序列有关的“化学合成”是指在体外对组分核苷酸进行装配。可以采用完善建立的方法来完成DNA的手工化学合成，或者可使用许多种可商业获得的机器的其中一种来完成自动化学合成。因此，基于最优化核苷酸序列以反映宿主细胞的密码子偏倚，可以定制基因用以最优化基因表达。如果密码子使用偏向于宿主偏好的那些密码子，则技术人员会理解成功的基因表达的可能性。优选的密码子的确定可基于对来源于宿主细胞的基因(其中序列信息可获得)的检测。

如本文所使用，“基因”是指表达特定蛋白质的核酸分子，其包括编码序列前的调控序列(5′非编码序列)和编码序列后的调控序列(3′非编码序列)。“天然基因”是指天然存在的具有其自己的调控序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，其包含在天然情况下不是一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或者包含源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。“内源性基因”指位于生物的基因组内它的天然位置的天然基因。“外来”基因指正常情况下不存在于宿主生物体中，而是通过基因转移导入宿主生物体内的基因。外来基因可以包含***到非天然生物体内的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是通过转化方法导入基因组内的基因。

如本文所使用，“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、内部或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列，其可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性，或者翻译。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。

如本文所使用，“启动子”是指能够控制编码序列或功能RNA的表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′。启动子可以整个源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元件组成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件或生理条件而指导基因的表达。导致基因在大部分时间内表达的启动子通常称为“组成型启动子”。还应当进一步认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。

如本文所使用，“3′非编码序列”是指位于编码序列下游且包括能够影响mRNA加工或基因表达的多腺苷酸化识别序列(通常限于真核生物)和其他序列编码调节信号的DNA序列。多腺苷酸化信号通常特征在于影响聚腺苷酸束(通常限于真核生物)在mRNA前体3′末端的添加。

如本文所使用，术语“可操作地连接”是指单个核酸分子上的核酸序列的结合，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反义的方向可操作地连接至调控序列。

如本文所使用，术语“表达”是指源于本文描述的核酸分子的有义RNA(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。

在本文所用的，术语“转化”指将核酸分子转移至宿主生物体的基因组内，从而导致遗传学上稳定的遗传。在本发明中，宿主细胞的基因组包括染色体和染色体外(例如，质粒)基因。含有转化的核酸分子的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化的”生物体。

如本文所使用，术语“质粒”、“载体”和“盒”是指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA分子的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状)，其中多个核苷酸序列已连接或重组进一种独特构建体中，该独特构建体能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列与合适的3′末端非翻译序列一起引入细胞中。“转化盒”指含有外来基因并且除了该外来基因外还含有促进特定宿主细胞转化的元件的特定载体。“表达盒”是指包含外来基因并且除该外来基因以外还具有使得该基因在外来宿主中的表达增强的元件的特定载体。

如本文所使用，术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。一般的序列分析软件将包括但不限于，GCG程序套件(WisconsinPackage Version 9.0，genetics Computergroup(GCG)，Madison，WI)，BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschul et al.，J.Biol.215：403-410(1990)和DNASTAR(DNASTAR，Inc.1228 S.Park St.Madison，WI 53715 USA)，CLUSTALW(例如1.83版本；Thompson等人，Nucleic Acids Research，22(22)：4673-4680(1994)，以及引入了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methodsgenome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date 1992，111-20.编辑：Suhai，Sandor.Publisher：Plenum，New York，NY)，Vector NTI(Informax，Bethesda，MD)和Sequencher版本4.05。在本申请的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，除非另外指明，否则分析结果将基于所参考程序的“缺省值”。如本文所使用，“缺省值”将意指当第一次初始化时软件最初装载的由软件制造商设定的任何值或参数组。

如本文所使用，术语“生物污染物”是指包括但不限于微生物、孢子、病毒、朊病毒、以及它们的混合物的一种或多种不需要的和/或致病生物实体。该方法产生用于减少和/或消除存活的生物污染物的存在的有效浓度的至少一种过羧酸。在一个优选实施方案中，微生物污染物是存活的病原微生物。

如本文所使用，术语“消毒”是指破坏或阻止生物污染物生长的过程。如本文所使用，术语“消毒剂”是指通过破坏、中和或抑制生物污染物生长而进行消毒的试剂。消毒剂通常用于处理无生命物体或表面。如本文所使用，术语“防腐剂”是指抑制携带疾病的微生物生长的化学试剂。在该实施方案的一个方面，生物污染物是致病微生物。

如本文所使用，术语“杀病毒剂”是指抑制或破坏病毒的试剂，并且与“杀病毒试剂(viricide)”同义。表现出抑制或破坏病毒的能力的试剂描述为具有“杀病毒”活性。过酸可以具有杀病毒活性。可适用于本发明的本领域已知的一般供选择的杀病毒剂包括例如醇类、醚类、氯仿、甲醛、酚类、β-丙内酯、碘、氯、汞盐、羟胺、环氧乙烷、乙二醇、季铵化合物、酶和去污剂。

如本文所使用，术语“杀生物剂”是指灭活或破坏微生物的、一般是广谱的化学试剂。显示出灭活或破坏微生物的能力的试剂描述为具有“杀生物”活性。过酸可以具有杀生物活性。可适用于本发明的本领域已知的一般供选择的杀生物剂包括例如氯、二氧化氯、氯异氰尿酸酯、次氯酸盐、臭氧、丙烯醛、胺类、氯化酚类化合物、铜盐、有机硫化合物和季铵盐。

如本文所使用，短语“最小杀生物浓度”是指对于特定接触时间在目标微生物的存活群体中将产生所需致命的、不可逆的减少的杀生物试剂的最小浓度。效力可以通过处理后存活微生物的log₁₀减少进行度量。在一个方面，处理后存活微生物的目标减少是至少3-log减少，更优选至少4-log减少，最优选至少5-log减少。在另一个方面，最小杀生物浓度是存活微生物细胞的至少6-log减少。

如本文所使用，术语“过氧源”和“过氧的来源”是指当在水溶液中时，能够提供浓度为约1mM或更高的过氧化氢的化合物，包括但不限于过氧化氢、过氧化氢加合物(例如脲-过氧化氢加合物(过氧化脲))、过硼酸盐和过碳酸盐。如本文所描述，在反应成分组合后，由含水反应混合物中的过氧化合物提供的过氧化氢浓度最初为至少1mM。在一个实施方案中，含水反应混合物中的过氧化氢浓度为至少10mM。在另一个实施方案中，含水反应混合物中的过氧化氢浓度为至少100mM。在另一个实施方案中，含水反应混合物中的过氧化氢浓度为至少200mM。在另一个实施方案中，含水反应混合物中的过氧化氢浓度为500mM或更高。在另一个实施方案中，含水反应混合物中的过氧化氢浓度为1000mM或更高。含水反应混合物中过氧化氢与酶底物例如甘油三酸酯(H₂O₂∶底物)的摩尔比可以是约0.002-20，优选约0.1-10，最优选约0.5-5。

用于由羧酸酯和过氧化氢来酶催化制备过酸的合适的反应条件

一个方面，提供了生产包含过酸的含水混合物的方法，所述方法是通过在具有过水解活性的酶催化剂存在下将羧酸酯与无机过氧化物反应，所述无机过氧化物不限于过氧化氢、过硼酸钠或过碳酸钠。在一个实施方案中，酶催化剂包含具有属于CE-7糖酯酶家族的结构的过水解酶。在另一个实施方案中，过水解酶催化剂在结构上归类为头孢菌素C脱乙酰酶。在另一个实施方案中，过水解酶催化剂在结构上归类为乙酰木聚糖酯酶。

在一个实施方案中，过水解酶催化剂包括具有CE-7特征基序的酶，当使用CLUSTALW与参照序列SEQ ID NO：2比对时，所述特征基序包含：

i)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置118-120的RGQ基序；

ii)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置179-183的GXSQG基序；和

iii)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置298-299的HE基序；

其中所述酶还包含与SEQ ID NO：2的至少30％的氨基酸同一性。

在另一个实施方案中，当使用CLUSTALW与参照序列SEQ ID NO：2比对时，特征基序还包括第四个保守基序，该保守基序定义为在氨基酸残基267-269的LXD基序。

在另一个实施方案中，过水解酶催化剂包含选自下组的具有过水解酶活性的酶：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：18，SEQ IDNO：26，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：106。

在另一个实施方案中，酶催化剂包含选自SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：90，SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：106的氨基酸序列，或通过对所述氨基酸序列取代、去除或添加一个或多个氨基酸而衍生的具有过水解酶活性的基本上相似的酶。

在另一个实施方案中，具有过水解酶活性的基本上相似的酶与选自SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：82、SEQID NO：90、SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：106的一个或多个氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

在另一个实施方案中，具有过水解活性的酶选自SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：106。

在另一个实施方案中，过水解酶催化剂包含这样的酶，该酶具有由核酸分子编码的氨基酸序列，所述核酸分子在严格杂交条件下与选自下组的核酸序列杂交：SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：81，SEQ IDNO：85，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：104和SEQ ID NO：105。

在另一个实施方案中，过水解酶催化剂包含这样的酶，该酶具有由核酸分子编码的氨基酸序列，所述核酸分子在严格杂交条件下与选自下组的核酸序列杂交：SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：93，SEQ IDNO：96，SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：104和SEQ ID NO：105。

在另一个实施方案中，过水解酶催化剂包含这样的酶，该酶与如SEQ ID NO：61所限定的邻接特征基序具有至少30％，优选至少36％的氨基酸同一性，其中上述保守基序(例如RGQ、GXSQG和HE，以及任选LXD)被保留。

在一个实施方案中，合适的底物包括由下式提供的酯：

[X]_mR₅

其中X＝式R₆-C(O)O的酯基团

m＝1至R₅中的碳原子数；并且

其中所述酯在25℃下在水中具有至少5ppm的溶解度。

在另一实施方案中，合适的底物也包括下式的酯：

在另一实施方案中，合适的底物包括下式的甘油酯：

其中R₁＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R₃和R₄各自为H或R₁C(O)。

在另一实施方案中，R₆是任选被羟基或C1-C4烷氧基取代、任选包含一个或多个醚键的C1-C7线性烃基部分。在另一优选的实施方案中，R₆是任选被羟基取代和/或任选包含一个或多个醚键的C2-C7线性烃基部分。

在另一实施方案中，合适的底物也包括乙酰化糖，其选自乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多糖。在一个优选实施方案中，乙酰化糖包括乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多糖。在另一个实施方案中，乙酰化糖选自乙酰化木聚糖、乙酰化木聚糖片段、乙酰化木糖(例如木糖四乙酸酯)、乙酰化葡萄糖(例如葡萄糖五乙酸酯)、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛和三-O-乙酰基-己烯糖，以及乙酰化纤维素。在一个优选的实施方案中，乙酰化糖选自β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛和三-O-乙酰基-己烯糖，以及乙酰化纤维素。这样，乙酰化糖可以是用于通过本发明方法(即在过氧源存在下)产生过羧酸的合适的底物。

在一个实施方案中，底物选自：甘油一乙酸酯；甘油二乙酸酯；甘油三乙酸酯；甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯；甘油三丙酸酯；甘油一丁酸酯；甘油二丁酸酯；甘油三丁酸酯；葡萄糖五乙酸酯；木糖四乙酸酯；乙酰化木聚糖；乙酰化木聚糖片段；β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯；三-O-乙酰基-D-半乳醛；三-O-乙酰基-己烯糖；1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、2，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，2-戊二醇、2，5-戊二醇、1，6-戊二醇、1，2-己二醇、2，5-己二醇、1，6-己二醇的一酯或二酯；及其混合物。

在一个优选实施方案中，底物选自乙酸乙酯、乳酸甲酯、乳酸乙酯、乙醇酸甲酯、乙醇酸乙酯、甲氧基乙酸甲酯、甲氧基乙酸乙酯、3-羟基丁酸甲酯、3-羟基丁酸乙酯、2-乙酰基柠檬酸三乙酯、葡萄糖五乙酸酯、葡糖酸内酯、甘油酯(例如甘油单酯、二酯和三酯)例如甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯(二丙酸甘油酯)、甘油三丙酸酯(1，2，3-三丙酰基甘油)、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯(二丁酸甘油酯)、甘油三丁酸酯(1，2，3-三丁酰基甘油)、乙酰化糖、以及它们的混合物。

在另一优选方面，羧酸酯底物选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯、甘油三丙酸酯、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯、甘油三丁酸酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯。在另外一个方面，羧酸酯底物选自甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯。在一个优选的方面，羧酸酯是选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、以及它们的混合物的甘油酯。

羧酸酯以在酶催化的过水解后足以产生所需过酸浓度的浓度存在于反应混合物中。羧酸酯无需完全溶解于反应混合物中，但具有足够的溶解度，以允许通过过水解酶催化剂将酯转化成相应的过酸。羧酸酯以反应混合物的0.0005重量％至40重量％的浓度存在于反应混合物中，优选以反应混合物的0.1重量％至20重量％的浓度，和更优选以反应混合物的0.5重量％至10重量％的浓度存在于反应混合物中。羧酸酯的重量％可以任选大于羧酸酯的溶解度限度，使得羧酸酯的浓度在由水、酶催化剂和过氧源组成的反应混合物中是至少0.0005重量％，其中羧酸酯的剩余物保留为两相含水/有机反应混合物的第二个分开的相。并不是所有添加的羧酸酯都必须立即溶解于含水反应混合物中，并且在开始混合所有的反应成分后，额外的连续或不连续混合是任选的。

过氧源可以包括但不限于过氧化氢、过氧化氢加合物(例如脲-过氧化氢加合物(过氧化脲))、过硼酸盐和过碳酸盐。反应混合物中过氧化合物的浓度可以为0.0033重量％至约50重量％，优选0.033重量％至约40重量％，更优选0.33重量％至约30重量％。

许多过水解酶催化剂(完整细胞、透化的完整细胞和部分纯化的完整细胞提取物)已报道具有过氧化氢酶活性(EC 1.11.1.6)。过氧化氢酶催化过氧化氢转化成氧和水。在一个方面，过水解催化剂缺乏过氧化氢酶活性。在另一个方面，向反应混合物中添加过氧化氢酶抑制剂。过氧化氢酶抑制剂的实例包括但不限于叠氮化钠和硫酸羟胺。本领域技术人员可以根据需要调整过氧化氢酶抑制剂的浓度。过氧化氢酶抑制剂的浓度一般为0.1mM至约1M；优选为约1mM至约50mM；更优选为约1mM至约20mM。在一个方面，叠氮化钠浓度一般为约20mM至约60mM，而硫酸羟胺的浓度一般为约0.5mM至约30mM，优选约10mM。

在另一个实施方案中，酶催化剂缺乏显著的过氧化氢酶活性或被工程化以降低或消除过氧化氢酶活性。宿主细胞中的过氧化氢酶活性可以通过使用众所周知的技术破坏负责过氧化氢酶活性的基因的表达而得到下调或消除，所述技术包括但不限于转座子诱变、RNA反义表达、靶向诱变和随机诱变。在一个优选的实施方案中，编码内源性过氧化氢酶活性的基因被下调或破坏(即敲除)。如本文所使用，“破坏的”基因是其中由修饰基因编码的蛋白的活性和/或功能不再存在的基因。破坏基因的方法是本领域众所周知的，并且可以包括但不限于对基因进行***、去除或突变，只要相应蛋白的活性和/或功能不再存在即可。在另一个优选的实施方案中，生产宿主是大肠杆菌生产宿主，其包含破坏的选自katG(SEQ ID NO：47)和katE(SEQ ID NO：56)的过氧化氢酶基因。在另一个实施方案中，生产宿主是大肠杆菌菌株，其包含katg1和katE过氧化氢酶基因的下调和/或破坏。本文提供了包含katG和katE的双敲除的大肠杆菌菌株(参见实施例15；大肠杆菌菌株KLP 18)。

证实了对于过水解酶的大规模(10-L和更大)生产，与过氧化氢酶阴性菌株UM2(大肠杆菌Genetic Stock Center#7156，Yale University，NewHaven CT)相比，所构建的过氧化氢酶阴性大肠杆菌菌株KLP18(katG和katE双敲除)(实施例15)是优良的宿主，这是通过在发酵罐条件下的生长而确定的(实施例17-19)。虽然KLP18和UM2都是过氧化氢酶阴性菌株，但是已知UM2具有多种营养缺陷，因此需要富含酵母提取物和蛋白胨的培养基。甚至当采用富集培养基进行发酵时，UM2的生长也不佳，并且达到有限的最大细胞密度(OD)。相反，KLP18没有专门的营养需求，并且在单独的矿物质培养基中或者采用另外的酵母提取物都生长至高细胞密度(实施例20)。

含水反应混合物中催化剂的浓度依赖于催化剂的具体催化活性，并且进行选择以获得所需反应速率。过水解反应中的催化剂的重量一般为0.0005mg至10mg/mL反应总体积，优选为0.010mg至2.0mg/mL。还可以使用本领域技术人员众所周知的方法将催化剂固定在可溶性或不溶性载体上；参见例如，“Immobilization of Enzymes and Cells”；Gordon F.Bickerstaff，Editor；Humana Press，Totowa，NJ，USA；1997。固定化催化剂的使用允许在后续反应中回收和重新使用催化剂。酶催化剂可以是完整微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物、部分纯化或纯化的酶、以及它们的混合物的形式。

在一个方面，通过羧酸酯的化学过水解和酶促过水解的组合产生的过酸浓度足以提供在所需pH下用于漂白或消毒的有效浓度的过酸。在另一个方面，本方法提供了酶和酶底物的组合以产生所需有效浓度的过酸，其中在不存在添加的酶的情况下，产生的过酸浓度显著较低。尽管在许多情况下通过无机过氧化物与酶底物的直接化学反应可能存在酶底物的显著化学过水解，但产生的过酸浓度可能不足以在所需应用中提供有效浓度的过酸，并且通过向反应混合物中添加合适的过水解酶催化剂达到了过酸总浓度的显著增加。

通过至少一种羧酸酯的过水解所产生的过酸(例如过乙酸)的浓度是在过水解反应起始的10分钟内，优选5分钟内，最优选1分钟内至少约2ppm，优选至少20ppm，优选至少100ppm，更优选至少约200ppm过酸，更优选至少300ppm，更优选至少500ppm，更优选至少700ppm，更优选至少约1000ppm过酸，最优选至少2000ppm过酸。包含过酸的产物混合物可以任选用水或主要包含水的溶液稀释，以产生具有所需较低浓度的过酸的混合物。在一个方面，产生所需过酸浓度需要的反应时间不超过约2小时，优选不超过约30分钟，更优选不超过约10分钟，甚至更优选不超过约50分钟，最优选在约1分钟或更少时间内。在其他方面，在组合所述反应成分的约1分钟至约168小时内，或者在组合所述反应成分的约1分钟至约48小时内，或约1分钟至2小时内，或其中的任何此类时间间隔，将被一定浓度微生物群体污染的硬质表面或无生命物体与按照本文描述的方法形成的过酸接触。

选择反应温度以控制反应速率和酶催化剂活性的稳定性。反应温度可以是正好高于反应混合物的凝固点(大约0℃)至约75℃，反应温度的优选范围为约5℃至约55℃。

包含过酸的最终反应混合物的pH是约2至约9，优选约3至约8，更优选约5至约8，甚至更优选约6至约8，还甚至更优选约6.5至约7.5。在另一个实施方案中，反应混合物的pH是酸性的(pH＜7)。反应和最终反应混合物的pH可以任选通过添加合适的缓冲剂来加以控制，所述缓冲剂包括但不限于磷酸盐、焦磷酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐或柠檬酸盐。当采用时，缓冲剂的浓度通常为0.1mM至1.0M，优选为1mM至300mM，最优选为10mM至100mM。

在另一个方面，酶促过水解反应混合物可以包含有机溶剂，其作为分散剂，用于增强羧酸酯在反应混合物中的溶解速度。所述溶剂包括但不限于，丙二醇甲醚、丙酮、环己酮、二甘醇丁醚、三丙二醇甲醚、二甘醇甲醚、丙二醇丁醚、双丙甘醇甲醚、环己烷、苯甲醇、异丙醇、丙二醇，及其混合物。

在另一个方面，酶促过水解产物可以包含提供所需功能性的另外的成分。这些另外的成分包括但不限于缓冲剂、洗涤剂助剂、增稠剂、乳化剂、表面活性剂、润湿剂、抗腐蚀剂(例如苯并***)、酶稳定剂和过氧化物稳定剂(例如金属离子螯合剂)。许多另外的成分是洗涤剂工业中众所周知的(参见例如美国专利5,932,532；在此引入作为参考)。乳化剂的实例包括聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。增稠剂的实例包括但不限于LAPONITERD、玉米淀粉、PVP、CARBOWAX、CARBOPOL、CABOSIL、polysorbate 20、PVA和卵磷脂。缓冲***的实例包括但不限于磷酸二氢钠/磷酸氢二钠；氨基磺酸/三乙醇胺；柠檬酸/三乙醇胺；酒石酸/三乙醇胺；琥珀酸/三乙醇胺；和乙酸/三乙醇胺。表面活性剂的实例包括但不限于a)非离子表面活性剂例如环氧乙烷或环氧丙烷的嵌段共聚物，乙氧基化或丙氧基化直链和支链伯醇和仲醇，以及脂族氧化膦，b)阳离子表面活性剂例如季铵化合物，特别是具有与氮原子结合的C8-C20烷基，并且该氮原子还与3个C1-C2烷基结合的季铵化合物，c)阴离子表面活性剂例如链烷羧酸(例如，C8-C20脂肪酸)、烷基膦酸盐、链烷磺酸盐(例如十二烷基硫酸钠“SDS”)或直链或支链烷基苯磺酸盐、烯烃磺酸盐和d)两性和两性离子表面活性剂例如氨基羧酸、氨基二羧酸、烷基甜菜碱(alkybetaine)以及它们的混合物。另外的成分可以包括芳香剂、染料和过氧化氢稳定剂(例如金属螯合剂例如1-羟基亚乙基-1，1-二膦酸(DEQUEST2010，Solutia Inc.，St.Louis，MO和乙二胺四乙酸(EDTA))、TURPINALSL、DEQUEST0520、DEQUEST0531、酶活性稳定剂(例如聚乙二醇(PEG))和洗涤剂助剂。

在另一方面，在接触要消毒的表面或无生物物体前，酶促过水解产物可以预先混合，产生需要浓度的过氧羧酸。

在另一方面，在接触要消毒的表面或无生物物体前，酶促过水解产物不预先混合产生需要浓度的过氧羧酸，而是使产生需要浓度的过氧羧酸的反应混合物的成分与要消毒的表面或无生命物体接触，产生需要浓度的过氧羧酸。在一些实施方案中，反应混合物的成分在该位点组合或混合。在一些实施方案中，将反应成分送递或施用到该位点，随后混合或组合，以产生需要浓度的过氧羧酸。

使用过水解酶催化剂原位生产过酸

头孢菌素C脱乙酰酶(E.C.3.1.1.41；***命名头孢菌素C乙酰水解酶；CAHs)是具有将头孢菌素例如头孢菌素C、7-氨基头孢烷酸(cephalosporanic acid)和7-(噻吩-2-乙酰氨基)头孢烷酸上的乙酰基酯键水解的能力的酶(Abbott，B.和Fukuda，D.，Appl.Microbiol.30(3)：413-419(1975))。CAHs属于在结构上相关的酶的较大家族，该家族称为糖酯酶家族7(CE-7；参见Coutinho，P.M.，Henrissat，B.“Carbohydrate-active enzymes：an integrated database approach”，“RecentAdvances in Carbohydrate Bioengineering”，H.J.gilbert，g.Davies，B.Henrissat和B.Svensson eds.，(1999)The Royal Society of Chemistry，Cambridge，pp.3-12.)

CE-7家族包括CAH和乙酰木聚糖酯酶(AXEs；E.C.3.1.1.72)。CE-7家族成员共有共同的结构基序，并且是非常与众不同的，因为它们通常对于乙酰化寡木糖(xylooliogsaccharide)和头孢菌素C都表现出酯水解活性，这意味着CE-7家族代表一类具有针对一定范围小底物的多功能脱乙酰酶活性的蛋白(Vincent等人，J.Mol.Biol.，330：593-606(2003))。Vincent等人描述了在该家族成员之间的结构相似性，并且限定了CE-7家族的特征序列基序。

在植物、真菌(例如顶枝头孢(Cephalosporidium acremonium))，酵母(例如，类酵母红冬孢(Rhodosporidium toruloides)、胶粘红酵母(Rhodotorula glutinis))和细菌例如热厌氧杆菌属物种(Thermoanaerobacterium sp.)；Norcardia lactamdurans，和芽孢杆菌属(Bacillus)的各个成员中发现了CE-7家族的成员(Politino等人，Appl.Environ.Microbiol.，63(12)：4807-4811(1997)；Sakai等人，J.Ferment.Bioeng.85：53-57(1998)；Lorenz，W.和Wiegel，J.，J.Bacteriol179：5436-5441(1997)；Cardoza等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，54(3)：406-412(2000)；Mitshushima等人，同上，Abbott，B.和Fukuda，D.，Appl.Microbiol.30(3)：413-419(1975)；Vincent等人，同上，Takami等人，NAR，28(21)：4317-4331(2000)；Rey等人，genome Biol.，5(10)：article77(2004)；Degrassi等人，Microbiology.，146：1585-1591(2000)；美国专利6,645,233；.美国专利5,281,525；美国专利5,338,676；和WO 99/03984。与SEQ ID NO：2具有显著同源性的CE-7糖酯酶家族成员的不完全列表在表1中提供。

表1：与SEQ ID NO：2具有显著同源性的CE-7酶的实例

本发明过水解酶是CE-7糖酯酶家族的所有成员。如Vincent等人(同上)所述，该家族成员共有作为该家族特征的共同特征基序。本发明过水解酶的CLUSTALW比对表明所有成员都属于CE-7糖酯酶家族(图1，图片a-c)。表2提供了本发明过水解酶之间的总体氨基酸同一性百分比的比较。

表2：过水解酶之间的氨基酸同一性百分比¹

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15
																1	100
2	99	100
																3	99	99	100
4	96	96	97	100
																5	77	76	77	76	100
6	76	76	76	76	68	100
																7	57	57	57	56	56	56	100
8	42	43	43	43	43	42	41	100
																9	42	43	42	43	43	42	42	72	100
10	42	43	43	43	44	42	43	71	91	100
																11	41	43	43	43	45	42	43	71	97	91	100
12	41	42	42	42	43	41	42	71	98	91	97	100
																13	37	37	37	36	39	38	38	64	65	67	66	65	100
14	34	36	35	36	35	36	33	36	32	34	34	33	36	100
																15	33	34	33	33	32	34	32	30	30	32	31	31	32	34	100

¹＝通过使用BLOSUM62的blast2seq算法确定的同一性百分比，缺口开放(gap open)＝11，缺口延长(gap extension)＝1，x_drop＝0，预期(expect)＝10，并且字长(wordsize)＝3。Tatiana A.Tatusova，ThomasL.Madden(1999)，“Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein andnucleotide sequences”，FEMSMicrobiol Lett。174：247-250

1.枯草芽孢杆菌ATCC 31954^TM

2.枯草芽孢杆菌BE1010

3.枯草芽孢杆菌ATCC 29233

4.枯草芽孢杆菌ATCC 6633

5.地衣芽孢杆菌14580

6.短小芽孢杆菌PS213

7.热纤维梭菌ATCC 27405

8.栖热袍菌属物种RQ2(b)

9.栖热袍菌属物种RQ2(a)

10.那不勒斯栖热袍菌

11.海栖热袍菌

12.T.petrophila

13.T.lettingae

14.解糖热厌氧杆菌

15.克劳氏芽孢杆菌

虽然在总体氨基酸同一性百分比方面观察到了差异(即热纤维梭菌ATCC 27405^TM过水解酶：SEQ ID NO：14与枯草芽孢杆菌ATCC 31954^TM过水解酶：SEQ ID NO：2仅具有57％的氨基酸同一性，而克劳氏芽孢杆菌过水解酶(SEQ ID NO：26)与SEQ ID NO：2仅具有33％的同一性)，但是每一种本发明过水解酶都具有CE-7特征基序。因此，本发明的过水解酶催化剂是在结构上被归类为属于CE-7糖酯酶家族的酶。每一种本发明的过水解酶都包含CE-7特征(标志性)基序。

Vincent等人(同上)分析了CE-7酯酶的结构，并且已经鉴定了作为该家族标志的几个高度保守基序。如图1所示，高度保守基序(在图1中加下划线的；相对于SEQ ID NO：2的位置编号)包括Arg118-Gly119-Gln120(RGQ)、Gly179-Xaa180-Ser181-Gln182-Gly183(GXSQG)和His298-Glu299(HE)。此外，图1示出了可用于进一步表征特征基序的另外一个高度保守的Lys267-Xaa268-Asp269(LXD)基序。所有编号都是相对于参照序列(枯草芽孢杆菌ATCC 31954^TM过水解酶；SEQ ID NO：2)的编号。

在一个实施方案中，合适的过水解酶可以由CE-7特征基序的存在来鉴定(Vincent等人，同上)。在一个优选的实施方案中，使用针对枯草芽孢杆菌ATCC 31954^TM过水解酶(SEQ ID NO：2；即用于相对氨基酸位置编号的参照序列)的CLUSTALW比对来鉴定包含CE-7特征基序的过水解酶。根据SEQ ID NO：2的氨基酸残基编号，CE-7特征基序包括如下所定义的3个保守基序：

a)Arg118-Gly119-Gln120；

b)Gly179-Xaa180-Ser181-Gln182-Gly183；和

c)His298-Glu299。

在氨基酸残基位置180的Xaa通常是甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、色氨酸或苏氨酸。属于催化三联体的三个氨基酸残基中的两个以粗体表示。在一个实施方案中，氨基酸残基位置180上的Xaa选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和苏氨酸。

对CE-7糖酯酶家族内的保守基序的进一步分析表明，存在另外一个可进一步限定属于CE-7糖酯酶家族的过水解酶的保守基序(在SEQID NO：2的氨基酸位置267-269的LXD)(图1a-c)。在另一个实施方案中，上面限定的特征基序包括如下所定义的第四个保守基序：

Leu267-Xaa268-Asp269。

在氨基酸残基位置268的Xaa通常是异亮氨酸、缬氨酸或甲硫氨酸。所述第四个基序包括作为催化三联体(Ser181-Asp269-His298)的第三个成员的天冬氨酸残基(粗体)。

可使用多种众所周知的通用比对算法(即序列分析软件)来比对两个或多个氨基酸序列(代表具有过水解酶活性的酶)，以确定本发明特征基序的存在(例如，CLUSTALW或Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.，48：443-453(1970))。将比对的序列与参照序列(SEQ ID NO：2)进行比较。在一个实施方案中，采用参照氨基酸序列(如在本文中使用来自枯草芽孢杆菌ATCC 31954^TM的CAH序列(SEQ ID NO：2))的CLUSTAL比对(CLUSTALW)被用于鉴定属于CE-7酯酶家族的过水解酶。保守氨基酸残基的相对编号是基于参照氨基酸序列的残基编号，以解决比对序列内的少量***或缺失(5个氨基酸或更少)。

本文中例举的过水解酶之间的总体同一性百分比的比较表明，与SEQ ID NO：2具有小至33％同一性(同时保留特征基序)的酶表现出显著过水解酶活性，并且在结构上归类为CE-7糖酯酶。在一个实施方案中，本发明过水解酶包括这样的酶，所述酶包含本发明特征基序以及与SEQID NO：2的至少30％，优选至少33％，更优选至少40％，甚至更优选优选至少42％，甚至更优选至少50％，甚至更优选至少60％，甚至更优选至少70％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的氨基酸同一性。

所有本发明过水解酶都包含如表3中所示的上述特征基序。

表3：在具有过水解酶活性的本发明酶中发现的保守基序。

过水解酶序列	RGQ基序^a(残基#s)	GXSQG基序^a(残基#s)	LXD基序^b残基#s)	HE基序^a(残基#s)
					SEQ ID NO：2	118-120	179-183	267-269	298-299
SEQ ID NO：6	118-120	179-183	267-269	298-299
					SEQ ID NO：8	118-120	179-183	267-269	298-299
SEQ ID NO：10	119-121	180-184	268-270	299-300
					SEQ ID NO：12	118-120	179-183	267-269	298-299
SEQ ID NO：14	119-121	181-185	269-271	300-301
					SEQ ID NO：16	118-120	186-190	272-274	303-304
SEQ ID NO：18	118-120	186-190	272-274	303-304
					SEQ ID NO：26	117-119	180-184	270-272	301-302
SEQ ID NO：32	118-120	179-183	267-269	298-299
					SEQ ID NO：70	117-119	180-184	270-272	301-302
SEQ ID NO：82	118-120	186-190	272-274	303-304
					SEQ ID NO：90	118-120	186-190	272-274	303-304
SEQ ID NO.98RQ2(a)	118-120	186-190	272-274	303-304
					SEQ ID NO 106RQ2(b)	119-121	187-191	273-275	304-305

^a＝由Vincent等人，同上定义的用于限定特征基序的保守基序。

^b＝用于进一步限定Vincent等人，同上定义的特征基序的、在本文中鉴定的另一个基序。

或者，包含4个保守基序(RGQ、GXSQG、LXD和HE；SEQ ID NO：2的氨基酸残基118-299)的邻接特征基序(SEQ ID NO：61)也可用作邻接特征基序来鉴定CE-7糖酯酶(图1，图片A-C)。这样，预期具有过水解酶活性的合适的酶还可以鉴定为，与SEQ ID NO：61(在CE-7糖酯酶中发现的4个保守基序加下划线)具有至少30％的氨基酸同一性，优选至少36％，更优选至少40％，甚至更优选至少50％，更优选至少60％，甚至更优选至少70％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的氨基酸同一性。

RGQQSSEDTSISLHGHALGWMTKGILDKDTYYYRGVYLDAVRALEVISSFDEVDETRIGVTGGSQGGGLTIAAAALSDIPKAAVADYPYLSNFERAIDVALEQPYLEINSFFRRNGSPETEVQAMKTLSYFDIMNLADRVKVPVLMSIGLIDKVTPPSTVFAAYNHLETEKELKVYRYFGHE(SEQID NO：61)

表4中提供了使用邻接特征序列针对具有过水解酶活性的本发明CE-7酯酶的比较。使用采用缺省参数的BLASTP。

表4：具有过水解活性的各种CE-7糖酯酶相对于邻接特征序列(SEQID NO：61)的氨基酸同一性百分比

过水解酶序列	使用BLASTP的同一性％	E-分数(预计的)
			SEQ ID NO：2	100	3e-92
SEQ ID NO：6	98	6e-91
			SEQ ID NO：8	98	4e-98
SEQ ID NO：10	78	1e-78
			SEQ IDNO：12	80	3e-76
SEQ ID NO：14	63	2e-56
			SEQ ID NO：16	51	1e-41
SEQ ID NO：18	50	6e-35
			SEQ ID NO：26	36	7e-21
SEQ ID NO：32	99	2e-90
			SEQ ID NO：70	40	2e-26
SEQ ID NO：82	40	3e-30
			SEQ ID NO：90	46	6e-35
SEQ ID NO.98	46	6e-35
			SEQ ID NO.106	48	9e-36

或者，还可以使用与全长的一种或多种本发明过水解酶相比的氨基酸同一性百分比。因此，具有过水解酶活性的合适的酶与SEQ ID NO：2具有至少30％，优选至少33％，优选至少40％，优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的氨基酸同一性。在另一个实施方案中，合适的过水解酶催化剂包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14，SEQ IDNO：16，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：106。在优选实施方案中，可以使用合适的具有过水解酶活性的酶，其与SEQ IDNO：82或SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：98或SEQ ID NO：106具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的氨基酸同一性。

合适的过水解酶还可以包括相对于本发明过水解酶(例如SEQ IDNOs.82，90，98和106)之一具有一个或多个缺失、取代和/或***的酶。如表2所示，具有过水解酶活性的CE-7糖酯酶共享小至32％的总体氨基酸同一性。基于本发明实施例中提供的数据，具有属于CE-7糖酯酶家族的过水解酶活性的另外的酶可具有甚至更低的同一性百分比，只要酶保留保守特征基序即可。这样，缺失、取代和/或***的数目可以改变，只要在酶内其相对位置发现保守特征基序即可(见表3)。

此外，根据在相应核酸序列内发现的结构相似性来鉴定合适的酶是本领域技术人员众所周知的。可使用杂交技术来鉴定相似基因序列。因此，本发明合适的过水解酶催化剂包括由在严格条件下与具有选自下组的核酸序列的核酸分子杂交的核酸分子编码的氨基酸序列：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，SEQ IDNO：13，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：69，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：96，SEQ IDNO：97，SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：104和SEQ ID NO：105。

在另一个实施方案中，过水解酶催化剂包括以下酶：其具有由在严格条件下与具有选自下组的核酸分子杂交的核酸分子编码的氨基酸序列：SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：85，SEQID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：104和SEQ ID NO：105。

本发明方法使用属于CE-7家族糖酯酶的酶的过水解酶活性，在含水反应条件下原位产生工业上有用的、有效浓度的过酸。在一个实施方案中，具有过水解酶活性的酶在结构和功能上归类为头孢菌素C脱乙酰酶(CAH)。在另一个实施方案中，具有过水解酶活性的酶在结构和功能上归类为乙酰木聚糖酯酶(AXE)。

产生的过酸是具有相当反应性的，并且浓度可以随着时间延长而降低，这取决于包括但不限于温度和pH的变量。这样，可能希望使各种反应成分保持分离，特别是对于液体制剂。在一个方面，使过氧化氢来源与底物或过水解酶催化剂分离，优选地与两者分离。这可以使用各种技术，包括但不限于使用多隔室分室分配器(美国专利4,585,150)，以及在使用时将过水解酶催化剂与无机过氧化物和本发明底物在物理上组合以起始含水酶促过水解反应来实现。在接触被靶向用于处理的表面和/或物体之前，过水解酶催化剂可以任选固定在反应室主体内或与包含过酸的反应产物分离(例如过滤等)。过水解酶催化剂可以为液体基质或固体形式(即粉末、片)或包埋在固体基质内，所述固体基质随后与底物混合以起始酶促过水解反应。在一个进一步的方面，过水解酶催化剂可以包含在可溶性或多孔性小袋内，所述小袋可以加入含水底物基质中以起始酶促过水解。在另一个进一步方面，将包含酶催化剂的粉末悬浮在底物(例如甘油三乙酸酯)中，并且在使用时与在水中的过氧源混合。

用于测定过酸和过氧化氢浓度的HPLC测定方法。

在本发明方法中，可使用各种分析方法来分析反应物和产物，包括但不限于滴定、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、质谱法(MS)、毛细管电泳法(CE)、U.Karst等人描述的分析方法(Anal.Chem.，69(17)：3623-3627(1997))，以及如本文实施例中描述的2，2’-连氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸酯(ABTS)分析(S.Minning，等人，AnalyticaChimica Acta 378：293-298(1999)和WO 2004/058961 A1)。

过酸的最小杀生物浓度的测定

由J.gabrielson等人(J.Microbiol.Methods 50：63-73(2002))描述的方法可用于测定过酸或过氧化氢和酶底物的最小杀生物浓度(MBC)。该测定方法基于XTT还原抑制，其中XTT((2，3-二[2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基]-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-四唑鎓，内盐，单钠盐)是氧化还原染料，其通过在490nm或450Mn处测量的光密度(OD)的变化来指示微生物的呼吸活性。然而，存在可用于检测消毒剂和杀菌剂活性的各种其他方法，包括但不限于存活平板计数、直接显微计数、干重、浊度测量、吸光度和生物发光(参见例如Brock，Semour S.，“Disinfection，Sterilization，and Preservation”，第5版本，Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia，PA，USA；2001).

酶促制备的过酸组合物的用途

根据本发明方法生产的酶催化剂产生的过酸可以在各种硬质表面/无生命物体应用中用于降低微生物、真菌、朊病毒相关和病毒污染物的浓度，例如下述的净化：医疗器械(例如内窥镜)、纺织品(例如衣服、地毯)、食物制剂表面、食物保存和食物包装设备、用于食品包装的材料、鸡孵化场和生长设施、动物围栏和具有微生物和/或杀病毒活性的用过的加工水。酶产生的过酸可以在设计为灭活朊病毒的制剂(例如某些蛋白酶)中使用以另外的提供杀生物活性。在一个优选方面，本发明过酸组合物作为用于不可高压灭菌的医疗器械和食物包装设备的消毒剂是特别有用的。因为含过酸的制剂可以使用GRAS或食物级别成分(酶、酶底物、过氧化氢和缓冲剂)进行制备，所以酶产生的过酸还可以用于动物尸体、肉、水果和蔬菜的净化，或用于制备的食物的净化。酶产生的过酸可以引入产物内，所述产物的最终形式是粉末、液体、凝胶、薄膜、固体或气溶胶。酶产生的过酸可以稀释至仍提供有效净化的浓度。

通过使表面或物体与通过本发明方法生产的产物接触，包含有效浓度的过酸的组合物可以用于消毒被活病原微生物污染物污染(或怀疑被污染)的表面和/或物体。如本文所使用，“接触”是指使包含有效浓度的过酸的消毒组合物与怀疑被致病实体污染的表面或无生命物体接触足以清洁和消毒的一段时间。接触包括对怀疑被一定浓度微生物群体污染的表面或无生命物体喷雾、处理、浸没、冲刷、倾泻在其上或其内、混合、组合、涂抹、覆盖、施加、附着或以其他方式给予包含有效浓度过酸的过酸溶液或组合物，或形成有效浓度过酸的溶液或组合物。可将消毒剂组合物与清洁组合物进行组合，以提供清洁和消毒这两种作用。或者，可以将清洁剂(例如表面活性剂或洗涤剂)掺入到制剂内以在单一组合物中提供清洁和消毒这两种作用。

包含有效浓度过酸的组合物还可以包含至少一种另外的抗微生物剂、朊病毒降解蛋白酶组合、杀病毒剂、杀孢子剂或杀生物剂。当用于清洁和消毒被病原微生物、孢子、病毒、真菌和/或朊病毒污染(或怀疑被污染)的表面和/或物体时，这些试剂与通过本发明方法产生的过酸的组合可以提供增加的和/或协同效应。合适的抗微生物剂包括羧酸酯(例如对羟基苯甲酸烷基酯和肉桂酸烷基酯)，磺酸(例如十二烷基苯磺酸)，碘化合物或活性卤素化合物(例如，元素卤素，卤素氧化物(例如NaOCl、HOCl、HOBr、ClO₂)，碘，卤间化物(interhalides)(例如，一氯化碘、二氯化碘、三氯化碘、四氯化碘、氯化溴、一溴化碘或二溴化碘)，多卤化物，次氯酸盐，次氯酸，次溴酸盐，次溴酸，氯和溴乙内酰脲，二氧化氯和亚氯酸钠)，有机过氧化物，包括过氧化苯甲酰、过氧化烷基苯甲酰、臭氧、单态氧发生器、以及它们的混合物，酚衍生物(例如邻苯基苯酚、邻苄基对氯苯酚、叔戊基苯酚和羟基苯甲酸C₁-C₆烷基酯)、季铵化合物(例如氯化烷基二甲基苄基铵、氯化二烷基二甲基铵、以及它们的混合物)，和此类抗微生物剂的混合物，其量足以提供所需微生物保护程度。抗微生物剂的有效量包括约0.001重量％至约60重量％抗微生物剂、约0.01重量％至约15重量％的抗微生物剂或约0.08重量％至约2.5重量％的抗微生物剂。

在一个方面，当应用于部位上和/或部位处时，通过本方法形成的过酸可用于降低存活微生物污染物(例如，存活微生物群体)的浓度。如本文所使用，本发明“部位”包含适合于消毒或漂白的部分或全部靶表面。靶表面包括可能潜在被微生物、病毒、真菌、朊病毒或其组合污染的所有表面。非限制性实例包括在食物或饮料工业中发现的设备表面(例如罐、传送机、地板、排水管、冷却器、致冷机、设备表面、墙壁、阀、带、管、排水管、接头、裂缝其组合等)；建筑物表面(例如墙壁、地板和窗户)；非食物工业相关管和排水管，包括水处理设施、池和矿泉以及发酵罐；医院或兽医诊所表面(例如墙壁、地板、床、设备(例如内窥镜)、医院/兽医或其他医疗保健设施中穿着的衣物，包括衣服、刷、鞋和其他医院或兽医表面)；餐馆表面；浴室表面；盥洗室；衣物和鞋；用于家畜的畜舍或马房表面，所述家畜是例如家禽、家畜、奶牛、羊、马和猪；用于家禽或用于虾的孵化场；以及药物或生物药物表面(例如药物或生物药物制造设备，药物或生物药物成分，药物或生物药物赋形剂)。另外的硬质表面还包括食品，例如牛肉、家禽、猪肉、蔬菜、水果、海鲜、其组合等。部位还可以包括吸水材料例如受感染的亚麻制品或其他纺织品。部位还包括收获的植物或植物产品，包括种子、球茎、根茎、水果和蔬菜、生长植物，和特别是农作物生长植物，包括谷类、叶菜类和沙拉农作物、根菜类、豆类、浆果类、柑橘类水果和硬水果。

硬质表面材料的非限制性实例是金属(例如钢、不锈钢、铬、钛、铁、铜、黄铜、铝及其合金)，矿物质(例如混凝土)，聚合物和塑料(例如聚烯烃，例如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚(甲基)丙烯酸酯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚(丙烯腈、丁二烯、苯乙烯)、聚(丙烯腈、丁二烯)、丙烯腈丁二烯；聚酯例如聚对苯二甲酸乙二醇酯；和聚酰胺例如尼龙)。另外的表面包括砖、瓦、陶器、瓷器、木材、乙烯树脂(vinyl)、油毡和地毯。

重组微生物表达

本发明序列的基因和基因产物可以在异源宿主细胞中，特别是在微生物宿主细胞中产生。用于表达本发明基因和核酸分子的优选异源宿主细胞是微生物宿主，其可以在真菌或细菌科内发现，并且在宽范围的温度、pH值和溶剂耐受力下生长。例如，预期任何细菌、酵母和丝状真菌可以适当地充当本发明核酸分子表达的宿主。过水解酶可以在细胞内、细胞外或者在细胞内和细胞外组合表达，其中与用于回收通过细胞内表达产生的蛋白的方法相比，细胞外表达使得能够更容易地从发酵产物中回收所需蛋白。转录、翻译和蛋白质生物合成装置相对于用于产生细胞生物质的细胞原料保持不变；无论如何功能基因将得到表达。宿主菌株的实例包括但不限于细菌、真菌或酵母物种例如曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、糖酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、法夫酵母属(Phaffia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、耶氏酵母属(Yarrowia)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、单胞发酵菌属(Zymomonas)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、赤杆菌属(Erythrobacter)、绿菌属(Chlorobium)、色菌属(Chromatium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、纤维粘菌属(Cytophaga)、红杆菌属(Rhodobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacteria)、分支杆菌属(Mycobacterium)、异常球菌属(Deinococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、假平胞菌属(Sphingomonas)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基杆菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基弯菌属(Methylosinus)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、产碱菌属(Alcaligenes)、集胞藻属(Synechocystis)、聚球蓝细菌属(Synechococcus)、鱼腥蓝细菌属(Anabaena)、硫杆菌属(Thiobacillus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和粘球菌属(Myxococcus)。在一个实施方案中，细菌宿主菌株包括埃希氏菌属、芽孢杆菌属和假单胞菌属物种。在一个优选的实施方案中，细菌宿主细胞是大肠杆菌。

大规模的微生物生长和功能基因表达可以使用宽范围的简单或复杂的碳水化合物、有机酸和醇或饱和烃，例如在光合或化能自养宿主的情况下的甲烷或二氧化碳、氮、磷、硫、氧、碳或任何痕量微量营养素，包括小无机离子的形式和量。生长速度的调节可以通过给培养物添加或不添加一般不视为营养素或能量来源的特定调节分子来进行。

用于转化合适的宿主细胞的载体或盒是本领域众所周知的。一般地，载体或盒包含指导相关基因转录和翻译的序列、可选标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含含有转录起始控制的基因5′的区域和控制转录终止的DNA片段3′的区域。最优选的是当2个控制区都来源于与转化的宿主细胞同源和/或对生产宿主是天然的基因，尽管这样的控制区无需是这样来源的。

可用于驱动本发明头孢菌素C脱乙酰酶编码区在所需宿主细胞中表达的起始控制区或启动子有很多，并且是本领域技术人员熟悉的。基本上能够驱动这些基因的任何启动子都适于本发明，包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(可用于在糖酵母属中的表达)；AOX1(可用于在毕赤酵母菌属中的表达)；和lac、ara、tet、trp、lP_L、lP_R、T7、tac和trc(可用于在大肠杆菌中表达)以及可用于在芽孢杆菌属中表达的amy、apr、npr启动子和各种噬菌体启动子。

终止控制区也可以来源于对优选宿主细胞是天然的各种基因。在一个实施方案中，终止控制区的引入是任选的。在另一个实施方案中，嵌合基因包括来源于优选宿主细胞的终止控制区。

工业生产

可以应用各种培养方法以产生本发明的过水解酶催化剂。例如，由重组微生物宿主过量表达的特定基因产物的大规模生产可以通过分批和连续培养方法来生产。

经典的分批培养方法是封闭***，其中培养基的组成在培养开始时设定并且在培养过程期间不进行人工改变。因此，在培养过程开始时，用所需的一种或多种生物种子培养基，并且不向***中进一步添加任何物质就可以发生生长或代谢活性。然而，通常来说，“分批”培养是指碳源的添加是成批的，但经常试图控制诸如pH和氧浓度之类的因素。在分批***中，***的代谢产物和生物质组成持续改变直至培养结束时。在分批培养物内，细胞缓和经过静态迟缓期到达高速生长对数期，并最后达到稳定期，此时生长速率减缓或终止。如果不加以处理，稳定期的细胞将最终死亡。在某些***中对数期中的细胞通常负责最终产物或中间产物的批量生成。在其他***中可以获得稳定或指数后期生成。

标准分批***的一种变型是补料-分批***。补料-分批培养方法也适用于本发明，并且包括典型的分批式***，不同的是随着培养进程递增地添加底物。在代谢产物往往抑制细胞的代谢作用，以及其中期望培养基中具有有限量的底物时，补料-分批***是有用的。补料-分批***中的实际底物浓度难于测量，并根据一些可测量因素(例如pH、溶解的氧以及废气例如CO₂的分压)进行评估。分批和补料-分批培养方法在本领域内是常用的且众所周知，并且实例可见于如下文献：Thomas D.Brock，“Biotechnology：A Textbook of IndustrialMicrobiology”，第二版，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA(1989)和Deshpande，MukundV.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36：227(1992)。

所需过水解酶催化剂的商业生产也可以用连续培养来实现。连续培养是一种开放式***，其中将成分确定的培养基连续加入到生物反应器中，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续培养一般使细胞维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高液相密度。或者，连续培养可以用固定化细胞来进行，其中连续添加碳和营养素，并且连续从细胞团块中取出有价值的产物、副产物或废弃物。细胞固定可以使用广泛多样的由天然和/或合成材料组成的固体载体来进行。

连续或半连续培养允许调节影响细胞生长或最终产物浓度的一种因素或任何数目的因素。例如，一种方法将以固定的速率维持限制性营养物质(例如碳源或氮水平)并且允许所有其它参数调节。在其他***中影响生长的许多因素可以连续改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续***努力维持稳态生长条件，并且因此由于培养基取出导致的细胞丧失必须针对培养基中的细胞生长速度进行平衡。对于连续培养过程调节营养素和生长因子的方法以及用于使产物形成速度达到最大的技术是工业微生物学领域众所周知的，并且各种方法由Brock，同上所述。

本发明中的发酵培养基必须含有合适的碳底物。合适的底物可包括但不限于单糖，例如葡萄糖和果糖；二糖，例如乳糖或蔗糖；多糖，例如淀粉或纤维素或它们的混合物；以及来自可再生原料，例如干酪乳清渗透物、玉米浆、甜菜糖蜜及大麦麦芽的未纯化混合物。此外，碳底物还可以是一碳底物例如二氧化碳、甲烷或甲醇(例如，当宿主细胞是甲基营养微生物时)。相似地，假丝酵母属的多种物种将会代谢丙氨酸或油酸(Sulter等人，Arch.Microbiol.，153：485-489(1990))。因此，设想本发明中所利用的碳源可涵盖各种含碳底物并且将仅受限于生物体的选择。

可以通过本领域技术人员已知的任何方法实现从分配或补料分批发酵或连续培养物回收需要的过水解酶催化剂。例如，当细胞内生产过水解酶催化剂时，通过以下步骤从培养基分离细胞糊：离心或膜过滤，任选用水或所需pH下的含水缓冲液洗涤，然后对所需pH下的含水缓冲液中的细胞糊的悬浮液进行匀浆，产生含有所需过水解酶催化剂的细胞提取物。细胞提取物可以任选通过合适的过滤辅助物如硅藻土或二氧化硅进行过滤，以便在热处理步骤前除去细胞碎片，以便从过水解酶催化剂溶液沉淀出不需要的蛋白。然后可以通过膜过滤或离心从沉淀的细胞碎片和蛋白分离含所需过水解酶催化剂的溶液，通过额外的膜过滤浓缩得到的部分纯化的过水解酶催化剂溶液，然后任选与合适的载体(例如、麦芽糖糊精、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、或其混合物)混合，并且喷雾干燥，产生包含所需过水解酶催化剂的固体粉末。

申请人特别将所有引用的参考文献的完整内容引入本公开内容中。此外，当数量、浓度或其他数值或参数以范围、优选范围或优选上限数值和优选下限数值的列表形式给出时，它应理解为具体地公开由任何范围上限或优选数值和任何范围下限或优选数值的任何一对所构成的所有范围，而不管所述范围是否被单独地公开。凡在本文中给出某一数值范围之处，该范围均意在包括其端点，以及位于该范围内的所有整数和分数，除非另行指出。当定义一个范围时，不希望将范围限定于所列举的具体数值。

一般方法

提供下述实施例以证实优选实施方案。本领域技术人员应当理解，下述实施例中公开的技术代表由本发明人发现在本发明的实践中良好发挥作用的技术，并且因此可以视为构成关于其实践的优选方式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以在公开的具体实施方案中进行许多改变并且仍获得相同或相似结果。

除非另有说明，所有试剂和材料均得自DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)、TCI America(Portland，OR)、RocheDiagnostics Corporation(Indianapolis，IN)或Sigma/Aldrich ChemicalCompany(St.Louis，MO)。

说明书中的下述缩写对应如下的测量单位、技术、性质或化合物：“sec”或“s”是指秒，“min”是指分钟，“h”或“hr”是指小时，“μμL”是指微升，“mL”是指毫升，“L”是指升，“mM”是指毫摩尔浓度，“M”是指摩尔浓度，“mmol”是指毫摩尔，“ppm”是指每百万份数，“wt”是指重量，“wt％”是指重量百分比，“g”是指克，“μμg”是指微克，“g”是指重力，“HPLC”是指高效液相层析法，“dd H₂O”是指蒸馏和去离子水，“dcw”是指细胞干重，“ATCC”或“ATCC”是指美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)，“U”是指过水解酶活性单位，“rpm”是指每分钟转数，并且“EDTA”是指乙二胺四乙酸。

实施例1

枯草芽孢杆菌ATCC 31954 ^TM 的生长和细胞提取物的制备

将干燥培养物悬浮于5ML营养培养液(DIFCO；0003-01-6)中，并且在30℃培养3天后，将枯草芽孢杆菌ATCC 31954^TM培养物恢复活力。培养第3天后，将培养物的等分试样在胰胨豆胨琼脂培养平板(Becton，Dickinson，and Company；Franklin Lakes，NJ)上进行划线，并且在35℃培养24小时。将几个单个菌落刮到1微升接种环(Becton Dickinson；目录#220215)上，并且转移到50ML乳杆菌属MRS培养液(Hardy Diagnostics，Santa Maria，CA；目录#C5931)内。然后将培养物在30℃和200rpm搅拌速度下生长12小时。生长12小时后，将2mL培养物转移到包含100mLMRS培养液的无挡板的500mL摇瓶内，用于在30℃和200rpm搅拌速度下生长12-14小时。然后通过在5℃以15,000×g离心25分钟来收获细胞，并且将所得细胞糊保存于-80℃。

对于细胞提取物制备，将0.9g细胞糊以25重量％(细胞干重)悬浮于包含二硫苏糖醇(1mM)和EDTA(1mM)的0.05M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中。使细胞悬浮液两次通过具有16,000psi工作压力的弗氏压碎器。然后将粗提取物以20,000×g离心以去除细胞碎片，产生用于总可溶性蛋白测定(Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination，SigmaAldrich，Sigma目录#BCA1-KT)的澄清细胞提取物，然后在-80℃冷冻和保存。

实施例2

枯草芽孢杆菌ATCC 31954 ^TM 半纯化的细胞提取物的过水解活性的测定

将枯草芽孢杆菌(ATCC 31954^TM)细胞提取物的1.0mL等分试样(10mg总蛋白/mL，如实施例1中所述制备)用等体积的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)进行稀释，并通过100,000分子量截留(Molecular WeightCutoff)(MWCO)Centricon膜装置(Millipore Corp，Bedford，MA)进行过滤。所得到的滤液(半纯化的细胞提取物)包含用于可溶性总蛋白测定(Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination，Sigma目录#BCA1-KT)的1.5mg总蛋白/mL，并且该滤液的测定表明没有可测量的过氧化氢酶活性。

将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(250mM)、过氧化氢(2.5M)和0.100ML半纯化的细胞提取物(0.15mg提取物总蛋白)的1mL反应混合物于25℃混合。对照反应通过用50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)替换半纯化的细胞提取物来进行，以测定在不存在添加的半纯化细胞提取物的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过水解而产生的过乙酸的浓度。

根据由Karst等人描述的方法来进行反应混合物中过乙酸浓度的测定。在10分钟和30分钟时取出反应混合物的等分试样(0.250ML)，并且使用UltrafreeMC-滤器装置(30,000标称分子量极限(NormalMolecular Weight Limit)(NMWL)，Millipore目录#UFC3LKT 00)通过在12,000rpm下离心2分钟进行过滤；通过过滤去除等分试样的蛋白质成分来终止反应。将等分试样(0.100ML)的所得到的滤液转移至包含0.300Ml去离子水的1.5mL螺旋瓶盖HPLC瓶(Agilent Technologies，Palo Alto，CA；#5182-0715)中，然后加入0.100ML 20mM MTS(甲基对甲苯基硫)在乙腈中的溶液，将瓶盖上盖子，使内容物短暂混合，然后在约25℃于不存在光的情况下培养10分钟。随后向每个瓶中添加0.400mL乙腈和0.100mL三苯基膦(TPP，40mM)在乙腈中的溶液，再次将瓶盖上盖子，并且使所得溶液混合，并且在约25℃下于不存在光的情况下培养30分钟。随后向每个管形瓶中添加0.100mL 10mM N，N-二乙基-间甲苯甲酰胺(DEET；HPLC外标)，并且如下所述通过HPLC分析所得到的溶液。在10分钟和30分钟内产生的过乙酸浓度列举于表5中。

HPLC方法：

Supelco Discovery C8柱(10cm×4.0mm，5μm)(cat.#569422-U)w/前置柱Supelco Supelguard Discovery C8(Sigma-Aldrich；目录#59590-U)；10微升注射体积；采用CH₃CN(Sigma-Aldrich；#270717)和去离子H₂O以1.0ML/min和室温进行梯度洗脱：

时间(分钟:秒) (％CH₃CN)

0:00 40

3:00 40

3:10 100

4:00 100

4:10 40

7:00(停止) 40

表5：在枯草芽孢杆菌(ATCC 31954^TM)半纯化细胞提取物的存在或不存在下，通过甘油三乙酸酯(250mM)和过氧化氢(2.5M)于pH 6.5反应产生的过乙酸(PAA)。

实施例3

来自枯草芽孢杆菌ATCC 31954 ^TM 细胞提取物的半纯化酶的过水解活性

如实施例1中所述进行枯草芽孢杆菌ATCC 31954^TM生长和提取物制备，但是粗提取物不进行离心。将粗提取物用冷正丙醇(-20℃)进行分级分离。将包含无细胞提取物的烧瓶在冰浴中搅拌15分钟，随后滴加正丙醇(-20℃)(以防止提取物凝固)至40％(v/v)的浓度。将所得到的提取物/丙醇混合物在冰浴中搅拌30分钟，随后以12,000×g下于5℃离心10分钟，并将上清液放回到烧瓶中并置于冰浴内。在搅拌下向上清液中缓慢加入另外的正丙醇-20℃)至60％(v/v)的浓度，并且如上所述在冰浴中将所得到的混合物搅拌30分钟，然后离心。将来自该第二个级份的团块保存于冰上，并将上清液放回到烧瓶中并置于冰浴内。在搅拌下向上清液中缓慢加入冷正丙醇至80％(v/v)的浓度，并且如上所述将混合物搅拌30分钟且离心。将来自60-80％级份的团块保存于冰上。将来自40-60％(v/v)正丙醇级份和60-80％(v/v)正丙醇级份的团块溶解于最小量的0.05M磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中，并且测定所得溶液的总可溶性蛋白(Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination，目录#BCA1-KT)，随后冷冻和保存于-80℃。

将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(250mM)、过氧化氢(1.0M)和来自细胞提取物的40-60％(v/v)或60-80％(v/v)正丙醇级份(如上所述制备的)的0.10mg/mL可总溶性蛋白的1mL反应混合物于25℃进行混合。对照反应通过用50mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)替换包含半纯化酶的细胞提取物的正丙醇级份来进行，以测定在不存在添加的半纯化酶的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过水解所产生的过乙酸浓度。使用实施例2中描述的操作在5分钟和30分钟时测定反应混合物的过乙酸，并且将通过添加的酶产生的过乙酸浓度列于表6中。

表6。在枯草芽孢杆菌(ATCC 31954^TM)半纯化细胞提取物的存在或不存在下，通过甘油三乙酸酯(250mM)和过氧化氢(1.0M)于pH 6.5反应所产生的过乙酸(PAA)。

＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿

细胞提取物的总蛋白 5分钟内的 30分钟内的

正丙醇级份 (mg/mL反应) 过乙酸(ppm) 过乙酸(ppm)

无提取物 0 221 803

40-60％ 0.1 2829 4727

60-80％ 0.1 1832 3777

实施例4

来自枯草芽孢杆菌ATCC 31954 ^TM 细胞提取物的具有过水解活性的头孢菌素C脱乙酰酶的鉴定

将实施例3中描述的40-60％正丙醇级份的0.1mL样品(500μg总蛋白)在室温下与等体积的2×非变性(天然)样品缓冲液(Invitrogen)混合，并装载到1.5mm 8-16％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺小凝胶(2D凝胶；Invitrogen)的制备样品孔内。天然凝胶电泳使用Tris-甘氨酸电泳缓冲液(Invitrogen)在125V下操作90分钟。电泳后，制备凝胶用于使用pH指示剂溴百里酚蓝的原位酯酶活性测定。

将凝胶用去离子水洗涤10分钟×2，并且进行缓慢机械混合。然后使用10mM磷酸盐缓冲液将凝胶洗涤10分钟。除去磷酸盐缓冲液后，使包含665μL饱和溴百里酚蓝(溶于水中)的50mL 10mM磷酸盐缓冲液与凝胶一起培养10分钟，然后添加1mL纯甘油三乙酸酯(SigmaAldrich)。在培养10分钟内，在凝胶上146kDa处出现指示酯酶活性的1个黄色条带。

从凝胶中切下酯酶阳性条带，并且转移到50ML聚丙烯锥形管(Falcon)内。伴随轻轻混合的2次5mL去离子水洗涤后，从凝胶切片中取出黄色的溴百里酚蓝染色。然后在轻轻混合下将凝胶切片用0.9mL2×Novex Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液加100μL 10×NuPAGE还原剂(Invitrogen)处理30分钟。样品处理后，使用热水浴将凝胶切片和样品缓冲液于85℃培养5分钟。随后从培养管中取出凝胶切片，并且小心地置于1.5mm 8-16％Tris-Gly小凝胶的单个制备孔中。小心地排除气泡并且与成层凝胶直接接触。将在去离子水中制备的250-300μL温0.5％琼脂糖溶液加到制备孔内后，原位固定凝胶切片。将单个分子标记泳道装载15μL SeeBluePlus2预染色的MW标记(Invitrogen)。

凝胶切片的电泳在30V下操作30分钟，用于将蛋白质从凝胶切片电洗脱到平板凝胶内。电压随后经过10分钟从30V斜线上升至125V，随后为在125V进行90分钟的操作。电泳后，如XCell II^TM印迹手册(Invitrogen)中所述将分离的蛋白条带印迹到PVDF膜上，并且印迹缓冲液是10mM CAPS，pH 11.0。电泳印迹操作在25V下在转移装置的夹套中于室温用冰水操作2小时。

转移后，将PVDF膜用ProBlot染色溶液(Applied Biosystems，FosterCity，CA)染色1分钟，随后用甲醇∶水(50∶50)脱色。鉴定6个蛋白质条带并且各自进行N-末端测序。GenBank氨基酸序列数据库的Blast搜索后，具有酯酶相关序列同源性的唯一条带鉴定为条带1，并且17个N-末端氨基酸调用与枯草芽孢杆菌头孢菌素C脱乙酰酶(GENBANKBAA01729；Mitsushima等人，同上；美国专利5,528,152；和美国专利5,338,676)具有100％的氨基酸同一性。

实施例5

来自枯草芽孢杆菌ATCC 31954 ^TM 的过水解酶的克隆和表达

使用PUREGENEDNA纯化***(Gentra Systems，Minneapolis MN)从枯草芽孢杆菌ATCC 31954^TM分离出基因组DNA。通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的引物，从基因组DNA扩增过水解酶基因。将所得到的核酸产物(SEQ ID NO：1)亚克隆到pTrcHis2-TOPO(Invitrogen，Carlsbad CA)内，以产生鉴定为pSW186的质粒。还通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ IDNO：27和SEQ ID NO：28的引物，从基因组DNA扩增过水解酶基因。用限制酶PstI和XbaI切割所得核酸产物(SEQ ID NO：29)，并且亚克隆到pUC19中的PstI与XbaI位点之间，以产生鉴定为pSW194质粒。使用质粒pSW186和pSW194来转化大肠杆菌TOP10(Invitrogen，CarlsbadCA)、大肠杆菌MG1655(ATCC 47076^TM)、大肠杆菌UM2(大肠杆菌Genetic Stock Center#7156，Yale University，New Haven CT)和大肠杆菌KLP18(见实施例15)以产生分别鉴定为TOP10/pSW186、MG1655/pSW186、UM2/pSW186、KLP18/pSW186、TOP10/pSW194、MG1655/pSW194、UM2/pSW194和KLP18/pSW194的菌株。将TOP10/pSW186、MG1655/pSW186、UM2/pSW186、KLP18/pSW186、TOP10/pSW194、MG1655/pSW194、UM2/pSW194和KLP18/pSW194在LB培养基中于37℃在摇动下生长直至OD_600nm＝0.4-0.5，这时加入IPTG至最终浓度为1mM，并且继续培养2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以证实在20-40％总可溶性蛋白的过水解酶的表达。

实施例6

来自枯草芽孢杆菌BE1010的过水解酶的克隆和表达

使用PUREGENEDNA纯化***(Gentra Systems)从枯草芽孢杆菌BE1010(Payne和Jackson 1991 J.Bacteriol.173：2278-2282)分离出基因组DNA。通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的引物，从基因组DNA扩增过水解酶基因。将所得核酸产物(SEQ ID NO：5)亚克隆到pTrcHis2-TOPO(Invitrogen)内，以产生鉴定为pSW187的质粒。还通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的引物，从基因组DNA扩增过水解酶基因。用限制酶PstI和XbaI切割所得核酸产物(SEQ ID NO：30)，并且亚克隆到pUC19中的PstI与XbaI位点之间，以产生鉴定为pSW189的质粒。使用质粒pSW187和pSW189来转化大肠杆菌TOP10(Invitrogen)、大肠杆菌MG1655(ATCC 47076^TM)、大肠杆菌UM2(大肠杆菌GeneticStock Center#7156，Yale University，New Haven CT)和大肠杆菌KLP18(见实施例15)以产生分别鉴定为TOP10/pSW187，MG1655/pSW187，UM2/pSW187，KLP18/pSW187，TOP10/pSW189，MG1655/pSW189，UM2/pSW189和KLP18/pSW19的菌株。将TOP10/pSW187、MG1655/pSW187、UM2/pSW187、KLP18/pSW187、TOP10/pSW189、MG1655/pSW189、UM2/pSW189和KLP18/pSW189在LB培养基中于37℃在摇动下生长直至OD_600nm＝0.4-0.5，这时加入IPTG至最终浓度为1mM，并且继续培养2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以证实在20-40％总可溶性蛋白的过水解酶的表达。

实施例7

来自枯草芽孢杆菌ATCC 6633 ^TM 的过水解酶的克隆和表达

使用PUREGENEDNA纯化***从枯草芽孢杆菌ATCC 6633^TM分离出基因组DNA。通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的引物，从基因组DNA扩增过水解酶基因。将所得核酸产物(SEQ ID NO：7)亚克隆到pTrcHis2-TOPO内，以产生鉴定为pSW188的质粒。使用质粒pSW188来转化大肠杆菌MG1655(ATCC 47076^TM)和大肠杆菌UM2(大肠杆菌Genetic Stock Center#7156，Yale University，New Haven CT)以产生分别鉴定为MG1655/pSW188和UM2/pSW188的菌株。将MG1655/pSW188和UM2/pSW188在LB培养基中于37℃在摇动下生长直至OD_600nm＝0.4-0.5，这时加入IPTG至最终浓度为1mM，并且继续培养2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以证实在20-40％总可溶性蛋白的过水解酶的表达。

实施例8

来自枯草芽孢杆菌ATCC 29233 ^TM 的过水解酶的克隆和表达

使用PUREGENEDNA纯化***从枯草芽孢杆菌ATCC 29233^TM分离出基因组DNA。通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的引物，从基因组DNA扩增过水解酶基因。将所得核酸产物(SEQ ID NO：31)亚克隆到pTrcHis2-TOPO内，以产生鉴定为pSW190的质粒。使用质粒pSW190来转化大肠杆菌MG1655(ATCC 47076^TM)、大肠杆菌UM2(大肠杆菌genetic Stock Center#7156，Yale University，New Haven CT)和大肠杆菌KLP18(见实施例15)以产生分别鉴定为MG1655/pSW190、UM2/pSW190和KLP18/pSW190的菌株。将MG1655/pSW190、UM2/pSW190和KLP18/pSW190在LB培养基中于37℃在摇动下生长直至OD_600nm＝0.4-0.5，这时加入IPTG至最终浓度为1mM，并且继续培养2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以证实在20-40％总可溶性蛋白的过水解酶的表达。

实施例9

来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC 14580 ^TM 的过水解酶的克隆和表达

使用PUREGENEDNA纯化***从地衣芽孢杆菌ATCC 14580^TM分离出基因组DNA。通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34的引物，从基因组DNA扩增过水解酶基因。将所得核酸产物(SEQ ID NO：9)亚克隆到pTrcHis2-TOPO内，以产生鉴定为pSW191的质粒。使用质粒pSW191来转化大肠杆菌MG1655(ATCC 47076^TM)、大肠杆菌UM2(大肠杆菌Genetic Stock Center#7156，Yale University，New Haven CT)、大肠杆菌PIR1(Invitrogen，Carlsbad CA)和大肠杆菌KLP18(见实施例15)以产生分别鉴定为MG1655/pSW191、UM2/pSW191、PIR1/pSW191和KLP18/pSW191的菌株。将MG1655/pSW191、UM2/pSW191、PIR1/pSW191和KLP18/pSW191在LB培养基中于37℃在摇动下生长直至OD_600nm＝0.4-0.5，这时加入IPTG至最终浓度为1mM，并且继续培养2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以证实在20-40％总可溶性蛋白的过水解酶的表达。

实施例10

来自热纤维梭菌(Clostridia thermocellum)ATCC 27405 ^TM 的过水解酶的克隆和表达

使用PUREGENEDNA纯化***从热纤维梭菌ATCC 27405^TM分离出基因组DNA。通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36的引物，从基因组DNA扩增过水解酶基因。将所得核酸产物(SEQ ID NO：13)亚克隆到pTrcHis2-TOPO内，以产生鉴定为pSW193的质粒。使用质粒pSW193来转化大肠杆菌MG1655(ATCC 47076^TM)、大肠杆菌UM2(大肠杆菌Genetic Stock Center#7156，Yale University，New Haven CT)和大肠杆菌KLP18(见实施例15)以产生分别鉴定为MG1655/pSW193、UM2/pSW193和KLP18/pSW193的菌株。将MG1655/pSW193、UM2/pSW193和KLP18/pSW193在LB培养基中于37℃在摇动下生长直至OD_600nm＝0.4-0.5，这时加入IPTG至最终浓度为1mM，并且继续培养2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以证实在20-40％总可溶性蛋白的过水解酶的表达。

实施例11

来自短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)PS213的过水解酶的克隆和表达

使用对于在大肠杆菌中表达最优化的密码子(DNA 2.0，Menlo ParkCA)来合成如在GENBANK(登录号AJ249957)中报道的来自短小芽孢杆菌PS213的编码乙酰木聚糖酯酶的基因(axe1)。然后通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的引物来扩增该基因。将所得核酸产物(SEQ ID NO：60)亚克隆到pTrcHis2-TOPO(Invitrogen，Carlsbad CA)内，以产生鉴定为pSW195的质粒。使用质粒pSW195来转化大肠杆菌MG1655(ATCC47076^TM)、大肠杆菌UM2(大肠杆菌Genetic Stock Center#7156，YaleUniversity，New Haven CT)和大肠杆菌KLP18(见实施例15)以产生分别鉴定为MG1655/pSW195、UM2/pSW195和KLP18/pSW195的菌株。将MG1655/pSW195、UM2/pSW195和KLP18/pSW195在LB培养基中于37℃在摇动下生长直至OD_600nm＝0.4-0.5，这时加入IPTG至最终浓度为1mM，并且继续培养2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以证实在20-40％总可溶性蛋白的过水解酶的表达。

实施例12

来自那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana) 的过水解酶的克隆和表达

使用对于在大肠杆菌中表达最优化的密码子(DNA 2.0，Menlo ParkCA)来合成如在GENBANK(登录号58632)中报道的来自那不勒斯栖热袍菌的编码乙酰木聚糖酯酶基因。然后通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO：39和SEQ IDNO：40的引物来扩增该基因。将所得核酸产物(SEQ ID NO：41)亚克隆到pTrcHis2-TOPO内，以产生鉴定为pSW196的质粒。使用质粒pSW196来转化大肠杆菌MG1655(ATCC 47076^TM)、大肠杆菌UM2(大肠杆菌Genetic Stock Center#7156，Yale University，New Haven CT)和大肠杆菌KLP18(见实施例15)以产生分别鉴定为MG1655/pSW196、UM2/pSW196和KLP18/pSW196的菌株。将MG1655/pSW196、UM2/pSW196和KLP18/pSW196在LB培养基中于37℃在摇动下生长直至OD_600nm＝0.4-0.5，这时加入IPTG至最终浓度为1mM，并且继续培养2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以证实在20-40％总可溶性蛋白的过水解酶的表达。

实施例13

katG过氧化氢酶破坏的大肠杆菌菌株的构建

通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45的引物来从质粒pKD13(SEQ ID NO：43)扩增卡那霉素抗性基因(kan；SEQ ID NO：42)，以产生鉴定为SEQ ID NO：46的PCR产物。katG核酸序列作为SEQ IDNO：47提供，并且相应的氨基酸序列是SEQ ID NO：48。用温度敏感性质粒pKD46(SEQ ID NO：49)转化大肠杆菌MG1655(ATCC 47076^TM)，所述质粒含有λ-Red重组酶基因(Datsenko和Wanner，2000，PNAS USA97：6640-6645)，并且在LB-amp平板上于30℃选择24小时。通过电穿孔(BioRadgene Pulser，0.2cm比色杯，2.5kV，200W，25uF)将MG1655/pKD46用50-500ng PCR产物转化，并且在LB-kan平板上于37℃选择24小时。将几个菌落划线到LB-kan平板上，并且在42℃培养过夜以让pKD46质粒熟化。检查菌落以证实kanR/ampS表型。使用PUREGENEDNA纯化***从几个菌落分离出基因组DNA，并且使用鉴定为SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51的引物，通过PCR检查，以证实katG基因的破坏。将几个katG-破坏的菌株用温度敏感性质粒pCP20(SEQ ID NO：52)转化，所述质粒含有用于切除kan基因的FLP重组酶，并且在LB-amp平板上于37℃选择24小时。将几个菌落划线到LB平板上，并且在42℃培养过夜以让pCP20质粒熟化。检查两个菌落以证实kanS/ampS表型，并且称为MG1655KatG1和MG1655 KatG2。

实施例14

katE过氧化氢酶破坏的大肠杆菌菌株的构建

通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54的引物来从质粒pKD13(SEQ ID NO：43)扩增卡那霉素抗性基因(SEQ ID NO：42)以产生鉴定为SEQ ID NO：55的PCR产物。katE核酸序列作为SEQ ID NO：56提供，并且相应的氨基酸序列是SEQ ID NO：57。用温度敏感性质粒pKD46(SEQ ID NO：49)转化大肠杆菌MG1655(ATCC 47076^TM)，所述质粒含有λ-Red重组酶基因，并且在LB-amp平板上于30℃选择24小时。通过电穿孔(BioRadgene Pulser，0.2cm比色杯，2.5kV，200W，25uF)将MG1655/pKD46用50-500ng PCR产物转化，并且在LB-kan平板上于37℃选择24小时。将几个菌落划线到LB-kan平板上，并且在42℃培养过夜以让pKD46质粒熟化。检查菌落以证实kanR/ampS表型。使用PUREGENE DNA纯化***从几个菌落分离出基因组DNA，并且使用鉴定为SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59的引物，通过PCR检查，以证实katE基因的破坏。将几个katE-破坏的菌株用温度敏感性质粒pCP20(SEQID NO：52)转化，所述质粒含有用于切除kan基因的FLP重组酶，并且在LB-amp平板上于37℃选择24小时。将几个菌落划线到LB平板上，并且在42℃培养过夜以让pCP20质粒熟化。检查两个菌落以证实kanS/ampS表型，并且称为MG1655 KatE1和MG1655 KatE2。

实施例15

katG过氧化氢酶和katE过氧化氢酶破坏的大肠杆菌菌株(KLP18)的构建

通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54的引物来从质粒pKD13(SEQ ID NO：43)扩增卡那霉素抗性基因(SEQ ID NO：42)以产生鉴定为SEQ ID NO：55的PCR产物。用温度敏感性质粒pKD46(SEQ IDNO：49)转化大肠杆菌MG1655 KatG1(实施例13)，所述质粒含有λ-Red重组酶基因，并且在LB-amp平板上于30℃选择24小时。通过电穿孔(BioRadgene Pulser，0.2cm比色杯，2.5kV，200W，25uF)将MG1655KatG1/pKD46用50-500ng PCR产物转化，并且在LB-kan平板上于37℃选择24小时。将几个菌落划线到LB-kan平板上，并且在42℃培养过夜以让pKD46质粒熟化。检查菌落以证实kanR/ampS表型。使用PUREGENEDNA纯化***从几个菌落分离出基因组DNA，并且使用鉴定为SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59的引物，通过PCR检查，以证实katE基因的破坏。将几个katE-破坏的菌株(ΔkatE)用温度敏感性质粒pCP20(SEQ ID NO：52)转化，所述质粒含有用于切除kan基因的FLP重组酶，并且在LB-amp平板上于37℃选择24小时。将几个菌落划线到LB平板上，并且在42℃培养过夜以让pCP20质粒熟化。检查两个菌落以证实kanS/ampS表型，并且称为MG1655 KatG1KatE18.1和MG1655KatG1KatE23。MG1655 KatG1KatE18.1指定为大肠杆菌KLP18。

实施例16

评估过水解酶分子量

将获自表达得自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和热纤维梭菌的过水解酶基因的大肠杆菌KLP18(一种过氧化氢酶双敲除的大肠杆菌MG1655)的摇瓶生长物的细胞团悬浮在含有二硫苏糖醇(1mM)的2.2mL0.05M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中。将每个细胞悬浮液通过具有16,000psi(约110.3MPa)的工作压力的弗氏压碎器两次。将粗提取物以20,000×g离心以除去细胞碎片，获得澄清粗提取物，分析其总可溶性蛋白(Bicinchoninic Acid Kit[BCA]for Protein Determination，Sigma Aldrich，BCA1-KT)。

将含有20μg总蛋白的澄清化的粗提取物(5μL)在室温与等体积的2×非变性(天然)样品缓冲液(Invitrogen)混合，并且加载到1.5mM×10孔4-12％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺小凝胶(Invitrogen)的样品孔内，向两个单独的孔内加载7.5μL NATIVEMARK^TM Unstained Protein Standard(Invitrogen)。使用Tris-甘氨酸电泳缓冲液(Invitrogen)在125V进行天然凝胶电泳105分钟。电泳后，使用pH指示剂溴百里酚蓝原位进行凝胶的酯酶活性测定。

在缓慢机械混合下，将凝胶用去离子水洗涤10min×2。然后在缓慢机械混合下，将凝胶用10mM pH 7.0磷酸盐缓冲液洗涤10分钟。除去磷酸盐缓冲液之后，将含有400μL饱和溴百里酚蓝水溶液的30ML 10mMpH 7.0磷酸盐缓冲液与凝胶培养10分钟，然后加入1ML纯净的甘油三乙酸酯(Tessenderlo Fine Chemicals；Staffordshire，UK)。在培养2分钟内，在活性过水解酶位点形成了黄色条带。所有枯草芽孢杆菌物种和地衣芽孢杆菌都具有在约216kDa分子量的强条带。热纤维梭菌表现出在约432kDa的强主要条带以及在约576kDa的次要条带，这表明了酯酶活性。通过在与条带相邻的凝胶中打小孔来将所有条带标记。将凝胶用去离子水洗涤10min×2，并且缓慢机械混合，以除去酯酶活性染色。然后在缓慢机械混合下将凝胶用10mM pH 7.0磷酸盐缓冲液洗涤10分钟以准备进行蛋白染色。加入考马斯蓝(Coomassie blue)染色剂以覆盖凝胶。缓慢机械混合5分钟后，倾析出考马斯蓝，并且用40mL去染液(de-stain)(10％乙酸、30％甲醇、60％去离子水)替换。去染后，估测活性区域的分子量。结果总结于表7中。

表7：过水解酶分子量的评估

实施例17

表达枯草芽孢杆菌BE1010过水解酶的大肠杆菌UM2/pSW187的发酵

通过向2L摇瓶中加入包含LB Miller培养基(DIFCO)的0.5L种子培养基来制备发酵罐种子培养物。将培养基的pH调节至6.8，并且在摇瓶中灭菌。灭菌后，加入1mL氨苄青霉素贮备液(25mg/mL)。给种子培养基接种1mL大肠杆菌UM2/pSW187在20％甘油中的培养物，并且在36℃以300rpm培养。将种子培养物以大约1-2OD₅₅₀转移到35℃下的14L发酵罐(Braun)中，所述发酵罐包含8L培养基，所述培养基含有KH₂PO₄(3.50g/L)、七水FeSO₄(0.05g/L)、七水MgSO₄(2.0g/L)、二水柠檬酸钠(1.90g/L)、酵母提取物(Ambrex 695，5.0g/L)、Biospumex153K消泡剂(0.25ML/L，Cognis Corporation)、NaCl(1.0g/L)、二水CaCl₂(10g/L)和NIT痕量元素溶液(10ML/L)。所述痕量元素溶液含有一水柠檬酸(10g/L)、水合MnSO₄(2g/L)、NaCl(2g/L)、七水FeSO₄(0.5g/L)、七水ZnSO₄(0.2g/L)、五水CuSO₄(0.02g/L)和二水NaMoO₄(0.02g/L)。灭菌后的加入包括60g补料分批溶液(见下文)和16.0ML氨苄青霉素贮备液(25mg/mL)。所述补料分批溶液含有2.4kg 60％w/w葡萄糖、0.6L 25g/L酵母提取物和50g/LBacto蛋白胨(DIFCO)。当葡萄糖浓度降至低于0.5g/L时，开始葡萄糖进料，以0.3g/分钟开始，并且每小时分别逐渐提高至0.35、0.40、0.47和0.53g/分钟；之后速度保持恒定。监测培养基中的葡萄糖浓度，并且如果浓度超过0.1g/L，则降低加入速度或者暂时停止加入。在OD₅₅₀＝7时，通过加入16ML IPTG(0.5M)来开始诱导。将温度控制在36℃，并且充气固定在2slpm(每分钟标准升数)，以400rpm进行搅拌。将pH控制在6.8；使用NH₄OH(29％w/w)和H₂SO₄(20％w/v)来进行pH控制。头部压力为0.5巴。在加入IPTG之后8小时，通过离心来收获细胞。

实施例18

表达枯草芽孢杆菌ATCC 31954 ^TM 过水解酶的大肠杆菌 UM2/pSW186或表达地衣芽孢杆菌ATCC 14580 ^TM 过水解酶的大肠杆菌UM2/pSW191的发酵

使用表达枯草芽孢杆菌ATCC 31954^TM过水解酶的大肠杆菌UM2/pSW186或表达地衣芽孢杆菌ATCC 14580^TM过水解酶的大肠杆菌UM2/pSW191，如实施例17所述制备种子培养物。发酵培养基是LBMiller(25g/L，DIFCO)。灭菌后的加入包括50g葡萄糖溶液(50％w/w)和16.0ML氨苄青霉素贮备液(25mg/mL)。使用葡萄糖(50％w/w)用于补料分批发酵。当葡萄糖浓度降至低于0.5g/L时，以0.3g/分钟的恒定速度开始葡萄糖进料。监测培养基中的葡萄糖浓度，并且如果浓度超过0.1g/L，则降低加入速度或者暂时停止加入。在OD₅₅₀＝2时，通过加入16mLIPTG(0.5M)来开始诱导。将温度控制在36℃，并且充气固定在2slpm，以400rpm进行搅拌。将pH控制在6.8；使用NH₄OH(29％w/w)和H₂SO₄(20％w/v)进行pH控制。头部压力为0.5巴。在加入IPTG之后8小时，通过离心来收获细胞。

实施例19

表达枯草芽孢杆菌BE1010过水解酶的大肠杆菌 KLP18/PSW189或表达地衣芽孢杆菌ATCC 14580 ^TM 过水解酶的大肠杆菌KLP18/PSW191的发酵

通过向2L摇瓶中加入0.5L种子培养基来制备发酵罐种子培养物，所述培养基含有酵母提取物(Amberx 695，5.0g/L)、K₂HPO₄(10.0g/L)、KH₂PO₄(7.0g/L)、二水柠檬酸钠(1.0g/L)、(NH₄)₂SO₄(4.0g/L)、七水MgSO₄(1.0g/L)和柠檬酸铁铵(0.10g/L)。将培养基的pH调节至6.8，并且将培养基在摇瓶中灭菌。灭菌后的加入包括葡萄糖(50wt％，10.0ML)和1ML氨苄青霉素(25mg/mL)贮备液。给种子培养基接种1mL大肠杆菌KLP18/PSW189或KLP18/PSW191在20％甘油中的培养物，并且在35℃和300rpm培养。将种子培养物以约1-2OD₅₅₀转移到35℃下的14L发酵罐(Braun)中，所述发酵罐包含8L培养基，所述培养基含有KH₂PO₄(3.50g/L)、七水FeSO₄(0.05g/L)、七水MgSO₄(2.0g/L)、二水柠檬酸钠(1.90g/L)、酵母提取物(Ambrex 695，5.0g/L)、Biospumex153K消泡剂(0.25ML/L，Cognis Corporation)、NaCl(1.0g/L)、二水CaCl₂(10g/L)和NIT痕量元素溶液(10ML/L)。所述痕量元素溶液含有一水柠檬酸(10g/L)、水合MnSO₄(2g/L)、NaCl(2g/L)、七水FeSO₄(0.5g/L)、七水ZnSO₄(0.2g/L)、五水CuSO₄(0.02g/L)和二水NaMoO₄(0.02g/L)。灭菌后的加入包括葡萄糖溶液(50％w/w，80.0g)和氨苄青霉素(25mg/mL)贮备液(16.00ML)。使用葡萄糖溶液(50％w/w)用于分批补料。当葡萄糖浓度降至0.5g/L时，开始葡萄糖进料，以0.31g进料/分钟开始，并且每小时分别逐渐提高至0.36、0.42、0.49、0.57、0.66、0.77、0.90、1.04、1.21、1.41、1.63g/分钟；之后速度保持恒定。监测培养基中的葡萄糖浓度，并且如果浓度超过0.1g/L，则降低加入速度或者暂时停止加入。对于大肠杆菌KLP18/PSW191，在OD₅₅₀＝80时，通过加入16ML IPTG(0.5M)来开始诱导，对于大肠杆菌KLP18/PSW189，生长较慢，在OD₅₅₀＝56时开始诱导。将溶解氧(DO)浓度控制在25％空气饱和度。首先通过叶轮搅拌速度(400至1400rpm)，然后通过充气速度(2至10slpm)来控制DO。将pH控制在6.8。使用NH₄OH(29％w/w)和H₂SO₄(20％w/v)进行pH控制。头部压力为0.5巴。在加入IPTG之后16小时，通过离心来收获细胞。

实施例20

大肠杆菌KLP18与大肠杆菌UM2作为发酵宿主用于过水解酶生产的比较

使用大肠杆菌KLP18(实施例15)来产生转化体(实施例5、8、9和10)，按照实施例19中描述的方法让所述转化体在多个10L发酵中生长。将这些操作的最终OD与按照实施例17和18中描述的发酵方法操作的产生表达这些相同过水解酶的大肠杆菌UM2转化体(实施例5、8、9和10)的发酵进行比较。表8总结了用UM2和KLP18作为宿主的10-L发酵操作，并且证明了与UM2相比，KLP18具有优异的性能。

表8

实施例21

在大肠杆菌转化体中表达的枯草芽孢杆菌 ATCC 31954 ^TM 过水解酶的评估

将在实施例5中描述的3种转化体大肠杆菌TOP10/pSW186、大肠杆菌MG1655/pSW186和大肠杆菌UM2/pSW186在包含具有氨苄青霉素(100μg/mL)的Miller’s LB培养液(50mL；Mediatech，Inc，Herndon，VA)的无挡板的摇瓶中，于35-37℃在200rpm搅拌下生长14-16小时。这3种转化体过夜生长后，通过在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的新鲜Miller’s LB培养液内制备每种培养物的1∶100稀释液，将每种培养物进行传代培养。于35-37℃在200rpm搅拌下生长3小时后，通过添加IPTG至1mM的终浓度来诱导每种培养物。在相同条件下另外生长3小时后，通过以26,000×g下于5℃离心20分钟收获来自每种培养物的细胞糊。将每种转化体的细胞提取物根据实施例1中描述的操作进行制备，不同之处是用于制备25wt％湿细胞悬浮液的提取缓冲液包含0.05M磷酸钾(pH 7.0)和1mM二硫苏糖醇。

包含在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中的甘油三乙酸酯(250mM)、过氧化氢(1.0M)和来自3种细胞提取物(如上所述制备)之一的50μg提取物总蛋白的单独1mL反应于25℃进行。通过用50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)替换提取物总蛋白溶液来进行对照反应，以测定在不存在添加的提取物蛋白的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过水解而产生的过乙酸浓度。第二组对照反应使用由未转化的大肠杆菌TOP10、大肠杆菌MG1655和大肠杆菌UM2的提取物制备的50μg提取物总蛋白来进行，以测定在不存在表达的过水解酶的情况下由每种菌株产生的过酸的本底水平。反应混合物中的过乙酸浓度(表9)是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。

表9：在大肠杆菌TOP10/pSW186、大肠杆菌MG1655/pSW186和大肠杆菌UM2/pSW186的细胞提取物存在下，通过甘油三乙酸酯(250mM)和过氧化氢(1.0M)于pH 6.5的反应产生的过乙酸(PAA)。

实施例22

表达枯草芽孢杆菌ATCC 31954 ^TM 过水解酶的大肠杆菌 TOP10/pSW186提取物的过水解活性

按照实施例21中描述的方法，使用大肠杆菌TOP10/pSW186转化体提取物来进行单独的1.0ML甘油三乙酸酯过水解反应，以在反应中提供下列总蛋白浓度之一：每一反应中196μg/mL、98μg/mL、49μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.0μg/mL或1.5μg/mL总蛋白浓度(表10)。

表10：在包含甘油三乙酸酯(250mM)和过氧化氢(1.0M)于pH6.5的反应中，过乙酸(PAA)浓度对于来源于大肠杆菌TOP10/pSW186转化体提取物的总蛋白浓度的依赖性。

实施例23

表达枯草芽孢杆菌ATCC 31954 ^TM 过水解酶的大肠杆菌 UM2/pSW186提取物的过水解活性

在包含在磷酸盐缓冲液(Pi，100mM、200mM或300mM)中的甘油三乙酸酯(40mM或100mM)、过氧化氢(40mM或100mM)和提取物总蛋白(0.1mg/mL或1.0mg/mL)的1.0ML过水解反应(如实施例21中所述进行)中，使用大肠杆菌UM2/pSW186转化体提取物(20mg总蛋白/mL提取物，如实施例21中所述制备)，每一反应于pH 6.5或7.5在25℃进行(表11)。

表11：使用来源于大肠杆菌UM2/pSW186转化体提取物的过水解酶，在pH 6.5或7.5下过乙酸(PAA)浓度对甘油三乙酸酯和过氧化氢浓度的依赖性。

实施例24

在来源于枯草芽孢杆菌BE1010的大肠杆菌转化体中表达的过水解酶的评估

将在实施例6中描述的大肠杆菌TOP10/pSW187、大肠杆菌MG1655/pSW187和大肠杆菌UM2/pSW187转化体在包含具有氨苄青霉素(100μg/mL)的Miller’s LB培养液(50mL；Mediatech，Inc.，Herndon，VA)的无挡板的摇瓶中，于35-37℃在200rpm搅拌下生长14-16小时。这3种转化体过夜生长后，通过在包含氨苄青霉素(100μg/mL)的新鲜Miller’s LB培养液内制备每种培养物的1∶00稀释，将每种培养物进行传代培养。于35-37℃在200rpm搅拌下生长3小时后，通过添加IPTG至1mM的终浓度来诱导每种培养物。在相同条件下另外生长3小时后，通过以26,000×g下于5℃离心20分钟收获来自每种培养物的细胞糊。对于细胞提取物制备，重复实施例1中描述的操作，不同之处是用于制备25wt％湿细胞悬浮液的提取缓冲液包含0.05M磷酸钾(pH 7.0)和1mM二硫苏糖醇。

将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(250mM)、过氧化氢(1.0M)和50μg提取物总蛋白的单独1.0mL反应于25℃使用每种转化体提取物来进行。通过用50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)替换提取物总蛋白溶液来进行对照反应，以测定通过甘油三乙酸酯由过氧化氢的化学过水解产生的过乙酸浓度。第二组对照反应使用由未转化的大肠杆菌TOP10、大肠杆菌MG1655和大肠杆菌UM2的提取物制备的50μg提取物总蛋白来进行，以测定在不存在表达的过水解酶的情况下由每种菌株生产的过酸的本底水平。反应混合物中的过乙酸浓度(表12)是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。

表12：在大肠杆菌TOP10/pSW187、大肠杆菌MG1655/pSW187和大肠杆菌UM2/pSW187的细胞提取物的存在下，通过甘油三乙酸酯(250mM)与过氧化氢(1.0M)于pH 6.5的反应产生的过乙酸(PAA)。

实施例25

评估在大肠杆菌转化体中表达的过水解酶

如实施例5、6、7、8、9、10、18和19中所述制备转化体。将每种转化体的细胞提取物根据实施例1中描述的操作进行制备，不同之处是用于制备25wt％湿细胞悬浮液的提取缓冲液包含0.05M磷酸钾(pH7.0)和1mM二硫苏糖醇。

将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(250mM)、过氧化氢(1.0M)和50μg提取物总蛋白的单独1mL反应于25℃进行。通过用50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)替换提取物总蛋白溶液来进行对照反应，以测定在不存在添加的提取物蛋白的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过水解而产生的过乙酸浓度。第二组对照反应使用由未转化的大肠杆菌TOP10、大肠杆菌MG1655、大肠杆菌UM2和大肠杆菌KLP18的提取物制备的50μg提取物总蛋白来进行，以测定在不存在表达的过水解酶的情况下由每种菌株产生的过酸的本底水平。反应混合物中的过乙酸浓度(表13)是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。

表13：在得自大肠杆菌TOP10、大肠杆菌MG1655、大肠杆菌UM2、大肠杆菌PIR2和大肠杆菌KLP18的转化体细胞提取物的50μg总提取物蛋白/mL存在下，通过甘油三乙酸酯(250mM)和过氧化氢(1.0M)于pH 6.5的反应产生的过乙酸(PAA)。

实施例26(比较实施例)

评估市售脂肪酶的过水解

在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(250mM)、过氧化氢(1.0M)和50μg市售脂肪酶的单独1mL反应于25℃进行。不采用市售脂肪酶来进行对照反应，以测定在不存在添加的脂肪酶下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过水解而产生的过乙酸浓度。反应混合物中的过乙酸浓度(表14)是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。市售脂肪酶得自Sigma/Aldrich Chemical Company(St.Louis，MO)，BioCatalytics(Pasadena，CA)，Meito Sangyo Co.(Nagoya，Japan)，AmanoEnzymes(Lombard，IL)，Novozymes(Franklinton，NC)，Valley Research(South Bend，IN)和Enzyme Development Corporation(ENZECO；NewYork，NY)。

表14：在50μg/mL市售脂肪酶存在下通过甘油三乙酸酯(250mM)与过氧化氢(1.0M)于pH 6.5的反应产生的过乙酸(PAA)。

实施例27

评估在大肠杆菌转化体中表达的过水解酶

按照实施例21中描述的方法制备表达过水解酶的转化体的细胞提取物。将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(105mM)、过氧化氢(78mM)和1mg或2mg来自细胞提取物(如上所述制备的)的提取物总蛋白的单独1mL反应在25℃进行。通过用50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)替换提取物总蛋白溶液来进行对照反应，以测定在不存在添加的提取物蛋白的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过水解而产生的过乙酸浓度。反应混合物中的过乙酸浓度(表15)是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。

表15：在得自大肠杆菌MG1655、大肠杆菌UM2、大肠杆菌PIR2和大肠杆菌KLP18的转化体细胞提取物的1mg或2mg总提取物蛋白/mL存在下，通过甘油三乙酸酯(105mM)和过氧化氢(78mM)于pH6.5或7.5的反应产生的过乙酸(PAA)。

实施例28(比较实施例)

评估市售脂肪酶的过水解

将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(105mM)、过氧化氢(78mM)和1mg市售脂肪酶的单独1mL反应于25℃进行。不采用市售脂肪酶来进行对照反应，以测定在不存在添加的脂肪酶下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过水解而产生的过乙酸浓度。反应混合物中的过乙酸浓度(表16)是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。

表16：在1mg/mL市售脂肪酶存在下通过甘油三乙酸酯(105mM)与过氧化氢(78mM)于pH 6.5的反应产生的过乙酸(PAA)。

实施例29

具有润湿剂的芽孢杆菌ATCC31954 ^TM 过水解酶活性

按照实施例21中描述的方法制备表达枯草芽孢杆菌ATCC 31954^TM过水解酶的大肠杆菌UM2/pSW186转化体的细胞提取物。将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中包含甘油三乙酸酯(105mM)、过氧化氢(78mM)、润湿剂COLATERICMSC-NA(混合的短链二丙酸钠；Colonial ChemicalCo.)，SURFYNOL2502(一种乙氧基化/丙氧基化基于炔的表面活性剂；Air Products and Chemicals；Utrecht，NL)，SURFYNOLMD-20，SILWETL7650(一种聚环氧烷改性的聚二甲基硅氧烷；ChemturaCorp，Middlebury，CT)或SILWETL8620；一种基于硅氧烷的表面活性剂)和1mg提取物总蛋白的单独1mL反应在25℃进行。通过用50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)替换提取物总蛋白溶液来进行对照反应，以测定在不存在添加的提取物蛋白的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过水解而产生的过乙酸浓度。反应混合物中的过乙酸浓度(表17)是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。

表17：在得自表达枯草芽孢杆菌ATCC 31954^TM过水解酶的大肠杆菌UM2/pSW186的转化体细胞提取物的1mg总提取物蛋白/mL存在下，通过甘油三乙酸酯(105mM)和过氧化氢(78mM)于pH 7.5的反应产生的过乙酸(PAA)。

实施例30

具有润湿剂的枯草芽孢杆菌BE1010过水解酶活性

按照实施例21中描述的方法制备表达枯草芽孢杆菌BE1010过水解酶的大肠杆菌UM2/pSW187转化体的细胞提取物。将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(105mM)、过氧化氢(78mM)、润湿剂(PLURONIC17R4(一种聚氧化烯醚表面活性剂；BASF，Mount Olive，NJ)，PLURONICL43(一种双官能嵌段共聚物表面活性剂)或SILWETL7650)和1mg提取物总蛋白的单独1mL反应在25℃进行。通过用50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)替换提取物总蛋白溶液来进行对照反应，以测定在不存在添加的提取物蛋白的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过水解而产生的过乙酸浓度。反应混合物中的过乙酸浓度(表18)是根据实施例2中描述的KarstKarst等人的方法测定的。

表18：在得自表达枯草芽孢杆菌BE1010过水解酶的大肠杆菌UM2/pSW187的转化体细胞提取物的1mg总提取物蛋白/mL存在下，通过甘油三乙酸酯(105mM)和过氧化氢(78mM)于pH 6.5的反应产生的过乙酸(PAA)。

实施例31

具有润湿剂和螯合剂的过水解酶活性

按照实施例21中描述的方法制备表达枯草芽孢杆菌BE1010过水解酶的大肠杆菌UM2/pSW187转化体的细胞提取物。将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(105mM)、过氧化氢(78mM)、润湿剂(SILWETL7650)、螯合剂(TURPINALSL；羟乙磷酸；Solutia Inc.，St.Louis，MO)和1mg提取物总蛋白的单独1mL反应在25℃进行。通过用50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)替换提取物总蛋白溶液来进行对照反应，以测定在不存在添加的提取物蛋白的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过水解而产生的过乙酸浓度。反应混合物中的过乙酸浓度(表19)是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。

表19：在得自表达枯草芽孢杆菌BE1010过水解酶的大肠杆菌UM2/pSW187的转化体细胞提取物的1mg总提取物蛋白/mL存在下，通过甘油三乙酸酯(105mM)和过氧化氢(78mM)于pH 6.5的反应产生的过乙酸(PAA)。

实施例32

具有润湿剂、螯合剂和腐蚀抑制剂的过水解酶活性

按照实施例21中描述的方法制备表达枯草芽孢杆菌BE1010过水解酶的大肠杆菌UM2/pSW187转化体的细胞提取物。将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(105mM)、过氧化氢(78mM)、润湿剂(SILWETL7650)、螯合剂(TURPINALSL)、腐蚀抑制剂(苯并***)和1mg提取物总蛋白的单独1mL反应在25℃进行。通过用50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)替换提取物总蛋白溶液来进行对照反应，以测定在不存在添加的提取物蛋白的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过水解而产生的过乙酸浓度。反应混合物中的过乙酸浓度(表20)是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。

表20：在得自表达枯草芽孢杆菌BE1010过水解酶的大肠杆菌UM2/pSW187的转化体细胞提取物的1mg总提取物蛋白/mL存在下，通过甘油三乙酸酯(105mM)和过氧化氢(78mM)于pH 6.5的反应产生的过乙酸(PAA)。

实施例33

使用固定化枯草芽孢杆菌ATCC 31954 ^TM 或BE1010 过水解酶的过乙酸生成

将0.50g AMBERZYMEOxirane酶固定聚合载体(Rohm and Haas，Philadelphia，PA)在5.0mL 0.225M磷酸钠缓冲液(pH 8.0)中的悬浮液于室温在旋转平台上混合24小时，所述缓冲液含有得自大肠杆菌KLP/pSW189(表达枯草芽孢杆菌BE1010过水解酶)或大肠杆菌UM2/pSW186(表达枯草芽孢杆菌ATCC 31954^TM过水解酶)的提取物(如实施例21中所述制备的)的10mg/mL总可溶性蛋白，然后将悬浮液从固定化的酶中倾析出，用4份40mL体积的磷酸盐缓冲液(50mM，pH 6.5)洗涤，并且在该相同缓冲液中于5℃保存。在使用之前，将固定化酶通过真空过滤来干燥。

将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(250mM)、过氧化氢(1.0M)和1.5mg/mL或5.0mg/mL固定化过水解酶(如上所述制备的)的单独1mL反应于25℃进行。进行对照反应以确定在没有添加的固定化酶存在的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过水解而产生的过乙酸浓度。反应混合物中的过乙酸浓度(表21)是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。

表21：在固定化枯草芽孢杆菌ATCC 31954^TM或BE1010过水解酶存在下通过甘油三乙酸酯(250mM)和过氧化氢(1.0M)于pH 6.5的反应产生的过乙酸(PAA)。

实施例34

使用得自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和热纤维梭菌的过水解酶的甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯和甘油一乙酸酯的混合物的过水解

将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含甘油二乙酸酯(118mM)、甘油三乙酸酯(42mM)和甘油一乙酸酯(90mM)的混合物、过氧化氢(1.0M)和得自大肠杆菌UM2细胞提取物(如实施例21所述制备的)的含有枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌或热纤维梭菌过水解酶的50μg提取物总蛋白的单独1mL反应于25℃进行。通过用50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)替换提取物总蛋白溶液来进行对照反应，以测定在不存在添加的提取物蛋白的情况下，通过甘油二乙酸酯(118mM)、甘油三乙酸酯(42mM)和甘油一乙酸酯(90mM)的混合物被过氧化氢化学过水解而产生的过乙酸浓度。使用由未转化的大肠杆菌UM2的提取物制备的50μg提取物总蛋白来运行第二个对照反应，以确定在没有表达的过水解酶存在的情况下由大肠杆菌菌株产生的过酸本底水平。反应混合物中的过乙酸浓度(表22)是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。

表22：在得自表达过水解酶的大肠杆菌UM2的转化体细胞提取物的50μ总提取物蛋白/mL存在下，通过甘油二乙酸酯(118mM)、甘油三乙酸酯(42mM)和甘油一乙酸酯(90mM)的混合物与过氧化氢(1.0M)于pH6.5的反应而产生的过乙酸(PAA)。

实施例35

使用得自枯草芽孢杆菌BE1010的过水解酶的甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯和甘油一乙酸酯的混合物的过水解

将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含甘油二乙酸酯(49.6mM)、甘油三乙酸酯(17.6mM)和甘油一乙酸酯(37.8mM)的混合物、过氧化氢(78mM)和得自大肠杆菌KLP18/pSW189细胞提取物(如实施例21所述制备的)的1mg或2mg提取物总蛋白的单独1mL反应在25℃进行。通过用50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)替换提取物总蛋白溶液来进行对照反应，以测定在不存在添加的提取物蛋白的情况下，通过甘油二乙酸酯(49.6mM)、甘油三乙酸酯(17.6mM)和甘油一乙酸酯(37.8mM)被过氧化氢化学过水解而产生的过乙酸浓度。反应混合物中的过乙酸浓度(表23)是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。

表23：在得自表达枯草芽孢杆菌BE1010过水解酶的大肠杆菌KLP18/pSW189的转化体细胞提取物的1mg或2mg总提取物蛋白/mL存在下，通过甘油二乙酸酯(49.6mM)、甘油三乙酸酯(17.6mM)和甘油一乙酸酯(37.8mM)的混合物与过氧化氢(78mM)于pH 6.5的反应而产生的过乙酸(PAA)。

实施例36

通过枯草芽孢杆菌ATCC 31954 ^TM 过水解酶的乙酰化糖的过水解

按照实施例21中描述的方法制备表达枯草芽孢杆菌ATCC 31954^TM过水解酶的大肠杆菌UM2/pSW186转化体的细胞提取物。将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含0.1M乙酰化糖(β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛或三-O-乙酰基-己烯糖(Aldrich))、过氧化氢(100或500mM)、2mg提取物总蛋白的单独1mL反应于25℃进行。通过用50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)替换提取物总蛋白溶液来进行对照反应，以测定在不存在添加的提取物蛋白的情况下，通过0.1M乙酰化糖(β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛或三-O-乙酰基-己烯糖)被过氧化氢化学过水解而产生的过乙酸浓度。反应混合物中的过乙酸浓度(表24)是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。

表24：在得自表达枯草芽孢杆菌ATCC 31954^TM过水解酶的大肠杆菌UM2/pSW186的转化体细胞提取物的2mg总提取物蛋白/mL存在下，通过乙酰化糖(100mM)和过氧化氢(100或500mM)于pH 6.5的反应而产生的过乙酸(PAA)。

实施例37

通过枯草芽孢杆菌BE1010过水解酶的乙酰化糖的过水解

按照实施例21中描述的方法制备表达枯草芽孢杆菌BE1010过水解酶的大肠杆菌KLP18/pSW189转化体的细胞提取物。将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含0.1M乙酰化糖(β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯，三-O-乙酰基-D-半乳醛或三-O-乙酰基-己烯糖(Aldrich))、过氧化氢(100或500mM)、2mg提取物总蛋白的单独1mL反应于25℃运行。通过用50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)替换提取物总蛋白溶液来进行对照反应，以测定在不存在添加的提取物蛋白的情况下，通过0.1M乙酰化糖(β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛或三-O-乙酰基-己烯糖)被过氧化氢化学过水解而产生的过乙酸浓度。反应混合物中的过乙酸浓度(表25)是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。

表25：在得自表达枯草芽孢杆菌BE1010过水解酶的大肠杆菌KLP18/pSW189转化体的转化体细胞提取物的2mg总提取物蛋白/mL存在下，通过乙酰化糖(100mM)和过氧化氢(100或500mM)于pH 6.5的反应而产生的过乙酸(PAA)。

实施例38

来自克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)KSM-K16 的过水解酶的克隆和表达

使用对于在大肠杆菌中表达最优化的密码子(DNA 2.0，Menlo ParkCA)来合成如在GENBANK(登录号P_175265；SEQ ID NO：26)中报道的来自克劳氏芽孢杆菌KSM-K16的编码头孢菌素-C水解酶的基因。然后通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67的引物来扩增该基因(SEQ IDNO：65)。将所得核酸产物(SEQ ID NO：64)用限制酶PstI和XbaI切割，亚克隆到pUC19中的PstI和XbaI位点之间，产生鉴定为pSW200的质粒。使用pSW200质粒来转化大肠杆菌UM2(大肠杆菌Genetic StockCenter#7156，Yale University，New Haven CT)以产生鉴定为UM2/pSW200的菌株。将UM2/pSW200在LB培养基中于37℃在摇动下生长直至OD_600nm＝0.4-0.5，这时加入IPTG至最终浓度为1mM，并且继续培养2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以证实在20-40％总可溶性蛋白的过水解酶的表达。冷冻细胞糊，在-80℃下保存。

实施例39

来自解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium saccharolyticum) 的过水解酶的克隆和表达

使用对于在大肠杆菌中表达最优化的密码子(DNA 2.0，Menlo ParkCA)来合成如在GENBANK登录号S41858(SEQ ID NO：70)中报道的来自解糖热厌氧杆菌的编码乙酰木聚糖酯酶的基因。然后通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ IDNO：71和SEQ ID NO：72的引物来扩增该基因(SEQ ID NO：69)。将所得核酸产物(SEQ ID NO：68)用限制酶PstI和XbaI切割，亚克隆到pUC19中的PstI和XbaI位点之间，产生鉴定为pSW201的质粒。使用pSW201质粒来转化大肠杆菌UM2(大肠杆菌Genetic Stock Center#7156，YaleUniversity，New Haven CT)以产生鉴定为UM2/pSW201的菌株。将UM2/pSW201在LB培养基中于37℃在摇动下生长直至OD_600nm＝0.4-0.5，这时加入IPTG至最终浓度为1mM，并且继续培养2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以证实在20-40％总可溶性蛋白的过水解酶的表达。冷冻细胞糊，在-80℃下保存。

实施例40

来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima) MSB8的过水解酶的克隆和表达

使用对于在大肠杆菌中表达最优化的密码子(DNA 2.0，Menlo ParkCA)来合成如在GENBANK(登录号NP_227893.1；SEQ ID NO：18)中报道的来自海栖热袍菌MSB8的编码乙酰木聚糖酯酶的基因。然后通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：72的引物来扩增该基因(SEQ ID NO：74)。将所得核酸产物(SEQ ID NO：73)用限制酶PstI和XbaI切割，亚克隆到pUC19中的PstI和XbaI位点之间，产生鉴定为pSW202的质粒。使用pSW202质粒来转化大肠杆菌UM2(大肠杆菌Genetic Stock Center#7156，Yale University，New Haven CT)以产生鉴定为UM2/pSW202的菌株。将UM2/pSW202在LB培养基中于37℃在摇动下生长直至OD_600nm＝0.4-0.5，这时加入IPTG至最终浓度为1mM，并且继续培养2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以证实在20-40％总可溶性蛋白的过水解酶的表达。冷冻细胞糊，在-80℃下保存。

实施例41

使用来自克劳氏芽孢杆菌KSM-K16、解糖热厌氧杆菌和海栖热袍菌 MSB8的过水解酶生产过乙酸

表达来自克劳氏芽孢杆菌KSM-K16(大肠杆菌UM2/pSW200，实施例38)、解糖热厌氧杆菌(大肠杆菌UM2/pSW201，实施例39)和海栖热袍菌MSB8(大肠杆菌UM2/pSW202，实施例40)的过水解酶的转化体的细胞提取物各自是通过以下方法制备的：使细胞糊(25wt％湿细胞重量)在含二硫苏糖醇(1mM)的0.05M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中的悬浮液通过具有16,000psi(约110.32MPa)的工作压力的弗氏压碎器两次。然后将粗提取物以20,000×g离心以去除细胞碎片，产生用于总可溶性蛋白测定(Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination，SigmaAldrich，Sigma目录#BCA1-KT)的澄清细胞提取物，然后在-80℃冷冻和保存。

50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中的含甘油三乙酸酯、过氧化氢和提取物总蛋白(按照上文描述制备)的反应(5mL)在25℃下进行。在第一组双份反应中，反应物(和相应浓度)是：甘油三乙酸酯(250mM)、过氧化氢(1.0M)和提取物总蛋白(50μg/mL)。在第二组双份反应中，反应物(和相应浓度)是：甘油三乙酸酯(100mM)、过氧化氢(250mM)和提取物总蛋白(1.0mg/mL)。对照反应是通过用50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)代替提取物总蛋白溶液而进行的，以测定在不存在添加的提取物蛋白的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过水解而产生的过乙酸浓度。所有反应另外含有500ppm TURPINALSL(羟乙磷酸；Solutia Inc.，St.Louis，MO)，其最初是在使用前作为稳定剂加入过氧化氢水溶液中的。

反应混合物中的过乙酸浓度是根据Karst等人，同上的方法测定的。在5分钟和30分钟内产生的过乙酸浓度列于表26中。

表26：25℃和pH 6.5时过乙酸(PAA)浓度对甘油三乙酸酯、过氧化氢和从表达来自克劳氏芽孢杆菌KSM-K16(大肠杆菌UM2/pSW200)、解糖热厌氧杆菌(大肠杆菌UM2/pSW201)和海栖热袍菌MSB8(大肠杆菌UM2/pSW202)的过水解酶的转化体制备的提取物总蛋白浓度的依赖性

实施例42

来自Thermotoga lettmgae的过水解酶的克隆和表达

使用对于在大肠杆菌中表达最优化的密码子(DNA 2.0，Menlo ParkCA)来合成如在GENBANK(登录号CP000812)中报道的来自Thermotoga lettingae的编码乙酰木聚糖酯酶(SEQ ID NO：82)的基因。然后通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：76的引物来扩增该基因。将所得核酸产物(SEQ ID NO：77)亚克隆到pTrcHis2-TOPO(Invitrogen，Carlsbad CA)中，产生鉴定为pSW219的质粒。也通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：79的引物来扩增该基因。将所得核酸产物(SEQ ID NO：80)用限制酶PstI和XbaI切割，使用PstI和XbaI位点亚克隆到pUC19中，产生pSW220。使用质粒pSW219和pSW220来转化大肠杆菌KLP18(过氧化氢酶双敲除)，分别产生鉴定为KLP18/PSW219和KLP18/pSW220的菌株。将KLP18/PSW219和KLP18/pSW220在LB培养基中于37℃在摇动下生长直至OD_600nm＝0.4-0.5，这时加入IPTG至最终浓度为1mM，并且继续培养2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以证实在10-20％总可溶性蛋白的过水解酶的表达。

实施例43

来自Thermotoga petrophila的过水解酶的克隆和表达

使用对于在大肠杆菌中表达最优化的密码子(DNA 2.0，Menlo ParkCA)来合成如在GENBANK(登录号CP000702)中报道的来自Thermotoga petrophila的编码乙酰木聚糖酯酶的基因(SEQ ID NO：90)。然后通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO：83和SEQ ID NO：84的引物来扩增该基因。将所得核酸产物(SEQ ID NO：85)亚克隆到pTrcHis2-TOPO(Invitrogen，Carlsbad CA)中，产生鉴定为pSW221的质粒。也通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：87的引物来扩增该基因。将所得核酸产物(SEQ ID NO：88)用限制酶PstI和XbaI切割，亚克隆到pUC 19中的PstI和XbaI位点之间，产生鉴定为pSW222的克隆。使用质粒pSW221和pSW222来转化大肠杆菌KLP18(过氧化氢酶双敲除)，分别产生鉴定为KLP18/PSW221和KLP18/pSW222的菌株。将KLP18/PSW221和KLP18/pSW222在LB培养基中于37℃在摇动下生长直至OD_600nm＝0.4-0.5，这时加入IPTG至最终浓度为1mM，并且继续培养2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以证实在10-20％总可溶性蛋白的过水解酶的表达。

实施例44

使用来自Thermotoga lettingae的过水解酶生产过乙酸

表达来自Thermotoga lettmgae的过水解酶的转化体(KLP18/pSW220，实施例42)的细胞提取物是通过以下方法制备的：使细胞糊(20wt％湿细胞重量)在含二硫苏糖醇(1mM)的0.05M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中的悬浮液通过具有16,000psi(约110.32MPa)的工作压力的弗氏压碎器两次。然后将粗提取物以20,000×g离心以去除细胞碎片，产生用于总可溶性蛋白测定(Bicinchoninic Acid Kit for ProteinDetermination，Sigma Aldrich，Sigma目录#BCA1-KT)的澄清细胞提取物。将澄清的提取物在75℃下加热20分钟，然后立即在冰/水浴中冷却。得到的混合物离心除去沉淀的蛋白，收集上清液，按上文测定总可溶性蛋白。上清液的SDS-PAGE表明过水解酶至少85-90％纯。将上清液在干冰中冷冻，在-80℃下保存。

50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2)或50mM碳酸氢钠缓冲液(pH 8.5)中的含甘油三乙酸酯、过氧化氢和来自热处理的、离心细胞提取物上清液的总蛋白(按照上文描述制备)的反应(10mL总体积)在24℃或10℃下进行。对每个反应条件进行对照反应，以测定在不存在添加的提取物蛋白的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过水解而产生的过乙酸浓度。反应混合物中的过乙酸浓度是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。在1分钟、5分钟和30分钟内产生的过乙酸浓度列于表27中。

表27：过乙酸(PAA)浓度对甘油三乙酸酯、过氧化氢和来自热处理的、离心细胞提取物上清液的总蛋白浓度的依赖性，所述上清液从表达来自Thermotoga lettingae的过水解酶的转化体(大肠杆菌KLP18/pSW220)制备

实施例45

使用来自Thermotoga petrophila的过水解酶生产过乙酸

表达来自Thermotoga petrophila的过水解酶(SEQ ID NO.90)的转化体(KLP18/pSW221，实施例43)的细胞提取物是通过以下方法制备的：使细胞糊(20wt％湿细胞重量)在含二硫苏糖醇(1mM)的0.05M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中的悬浮液通过具有16,000psi(约110.32MPa)的工作压力的弗氏压碎器两次。然后将粗提取物以20,000×g离心以去除细胞碎片，产生用于总可溶性蛋白测定(Bicinchoninic Acid Kit for ProteinDetermination，Sigma Aldrich，Sigma目录#BCA1-KT)的澄清细胞提取物。将澄清的提取物在75℃下加热20分钟，然后立即在冰/水浴中冷却。得到的混合物离心除去沉淀的蛋白，收集上清液，按上文测定总可溶性蛋白。上清液的SDS-PAGE表明过水解酶至少85-90％纯。将上清液在干冰中冷冻，在-80℃下保存。

50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2)或50mM碳酸氢钠缓冲液(pH 8.5)中的含甘油三乙酸酯、过氧化氢和来自热处理的、离心细胞提取物上清液的总蛋白(按照上文描述制备)的反应(2mL总体积)在24℃或10℃下进行。对每个反应条件进行对照反应，以测定在不存在添加的提取物蛋白的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过水解而产生的过乙酸浓度。反应混合物中的过乙酸浓度是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。在1分钟、5分钟和30分钟内产生的过乙酸浓度列于表28中。

表28：过乙酸(PAA)浓度对甘油三乙酸酯、过氧化氢和来自热处理的、离心细胞提取物上清液的总蛋白浓度的依赖性，所述上清液从表达来自Thermotoga petrophila的过水解酶的转化体(大肠杆菌KLP18/pSW221)制备

实施例46

来自热袍菌属物种(Thermotoga sp.)RQ2的第一过水解酶的克隆和表达

使用对于在大肠杆菌中表达最优化的密码子(DNA 2.0，Menlo ParkCA)来合成如在GENBANK(登录号CP000969)中报道的来自热袍菌属物种RQ2的编码第一乙酰木聚糖酯酶(SEQ ID NO：98)的基因。第一过水解酶在本文称作“RQ 2(a)”。然后通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO：91和SEQ ID NO：92的引物来扩增该基因。将所得核酸产物(SEQ ID NO：93)亚克隆到pTrcHis2-TOPO(Invitrogen，Carlsbad CA)中，产生鉴定为pSW223的质粒。也通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：95的引物来扩增该基因。将所得核酸产物(SEQ ID NO：96)用限制酶PstI和XbaI切割，亚克隆到pUC19中的PstI和XbaI位点之间，产生鉴定为pSW224的质粒。使用质粒pSW223和pSW224来转化大肠杆菌KLP18(过氧化氢酶双敲除)，分别产生鉴定为KLP18/PSW223和KLP18/pSW224的菌株。将KLP18/PSW223和KLP18/pSW224在LB培养基中于37℃在摇动下生长直至OD_600nm为约0.4-0.5，这时加入IPTG至最终浓度为1mM，并且继续培养2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以证实在10-20％总可溶性蛋白的过水解酶的表达。

实施例47

来自热袍菌属物种(Thermotoga sp.)RQ2的第二过水解酶的克隆和表达

使用对于在大肠杆菌中表达最优化的密码子(DNA 2.0，Menlo ParkCA)来合成如在GENBANK(登录号CP000969)中报道的来自热袍菌属物种RQ2的编码第二乙酰木聚糖酯酶(SEQ ID NO：106)的基因。第二过水解酶在本文称作“RQ 2(b)”。然后通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO：99和SEQ IDNO：100的引物来扩增该基因。将所得核酸产物(SEQ ID NO：101)亚克隆到pTrcHis2-TOPO(Invitrogen，Carlsbad CA)中，产生鉴定为pSW225的质粒。也通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO：102和SEQ ID NO：103的引物来扩增该基因。将所得核酸产物(SEQ ID NO：104)用限制酶PstI和XbaI切割，亚克隆到pUC19中的PstI和XbaI位点之间，产生鉴定为pSW226的克隆。使用质粒pSW225和pSW226来转化大肠杆菌KLP18(过氧化氢酶双敲除)，分别产生鉴定为KLP18/PSW225和KLP18/pSW226的菌株。将KLP18/PSW225和KLP18/pSW226在LB培养基中于37℃在摇动下生长直至OD_600nm为约0.4-0.5，这时加入IPTG至最终浓度为1mM，并且继续培养2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以证实在10-20％总可溶性蛋白的过水解酶的表达。

实施例48

用来自热袍菌属物种RQ2的第一过水解酶的过水解酶活性生产过乙酸

表达来自热袍菌属物种RQ2的本文中称作“RQ2(a)”第一乙酰木聚糖酯酶(SEQ ID NO：98)的过水解酶的转化体(KLP18/pSW223，实施例46)的细胞提取物是通过以下方法制备的：使细胞糊(20wt％湿细胞重量)在含二硫苏糖醇(1mM)的0.05M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中的悬浮液通过具有16,000psi(约110.32MPa)的工作压力的弗氏压碎器两次。然后将粗提取物以20,000×g离心以去除细胞碎片，产生用于总可溶性蛋白测定(Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination，Sigma Aldrich，Sigma目录#BCA1-KT)的澄清细胞提取物。将澄清的提取物在75℃下加热20分钟，然后立即在冰/水浴中冷却。得到的混合物离心除去沉淀的蛋白，收集上清液，按上文测定总可溶性蛋白。上清液的SDS-PAGE表明过水解酶至少85-90％纯。将上清液在干冰中冷冻，在-80℃下保存。

50mM碳酸氢钠缓冲液(10mL总体积，pH 8.1)或50mM磷酸钠缓冲液(2mL总体积，pH 7.2)中的含甘油三乙酸酯、过氧化氢和来自热处理的、离心细胞提取物上清液的总蛋白(按照上文描述制备)的反应(2mL总体积)在25℃下进行。对每个反应条件进行对照反应，以测定在不存在添加的提取物蛋白的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过水解而产生的过乙酸浓度。反应混合物中的过乙酸浓度是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。在1分钟、5分钟和30分钟内产生的过乙酸浓度列于表29中。

表29：过乙酸(PAA)浓度对甘油三乙酸酯、过氧化氢和来自热处理的、离心细胞提取物上清液的总蛋白浓度的依赖性，所述上清液从表达来自热袍菌属物种RQ2的RQ2(a)过水解酶的转化体(大肠杆菌KLP18/pSW223)制备

实施例49

用来自热袍菌属物种RQ2的第二过水解酶的过水解酶活性生产过乙酸

表达来自热袍菌属物种RQ2的本文中称作“RQ2(b)”的第二乙酰木聚糖酯酶(SEQ ID NO：106)的过水解酶的转化体(KLP18/pSW226，实施例47)的细胞提取物是通过以下方法制备的：使细胞糊(20wt％湿细胞重量)在含二硫苏糖醇(1mM)的0.05M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中的悬浮液通过具有16,000psi(约110.32MPa)的工作压力的弗氏压碎器两次。然后将粗提取物以20,000×g离心以去除细胞碎片，产生用于总可溶性蛋白测定(Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination，Sigma Aldrich，Sigma目录#BCA1-KT)的澄清细胞提取物。将澄清的提取物在75℃下加热20分钟，然后立即在冰/水浴中冷却。得到的混合物离心除去沉淀的蛋白，收集上清液，按上文测定总可溶性蛋白。上清液的SDS-PAGE表明过水解酶至少85-90％纯。将上清液在干冰中冷冻，在-80℃下保存。

50mM碳酸氢钠缓冲液(10mL总体积，pH 8.1)或50mM磷酸钠缓冲液(2mL总体积，pH 7.2)中的含甘油三乙酸酯、过氧化氢和来自热处理的、离心细胞提取物上清液的总蛋白(按照上文描述制备)的反应(2mL总体积)在25℃下进行。对每个反应条件进行对照反应，以测定在不存在添加的提取物蛋白的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过水解而产生的过乙酸浓度。反应混合物中的过乙酸浓度是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。在1分钟、5分钟和30分钟内产生的过乙酸浓度列于表30中。

表30：过乙酸(PAA)浓度对甘油三乙酸酯、过氧化氢和来自热处理的、离心细胞提取物上清液的总蛋白浓度的依赖性，所述上清液从表达来自热袍菌属物种RQ2的RQ2(b)过水解酶的转化体(大肠杆菌KLP18/pSW226)制备

实施例50

用过碳酸钠和来自Thermotoga lettingae或Thermotoga petrophil a的过水解酶生产过乙酸

用来自表达来自Thermotoga lettingae的过水解酶(SEQ ID NO.82)的转化体(KLP18/pSW220，实施例42)或表达来自Thermotogapetrophila的过水解酶(SEQ ID NO.90)的转化体(KLP18/pSW222，实施例43)重复实施例44和45描述的程序，但是用过碳酸钠(约25wt％H₂O₂)代替过氧化氢水溶液，以产生100mM或250mM过氧化氢的最初浓度。50mM碳酸氢钠缓冲液(2mL总体积，pH 8.1)中的含甘油三乙酸酯、过碳酸钠和热处理的、离心细胞提取物上清液的反应在24℃下进行。对每个反应条件进行对照反应，以测定在不存在添加的提取物蛋白的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过水解而产生的过乙酸浓度。反应混合物中的过乙酸浓度是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。在1分钟、5分钟和30分钟内产生的过乙酸浓度列于表31中。

表31：过乙酸(PAA)浓度对甘油三乙酸酯、过氧化氢和来自热处理的、离心细胞提取物上清液的总蛋白浓度的依赖性，所述上清液从表达来自Thermotoga lettingae(KLP18/pSW220)或Thermotoga petrophila(KLP18/pSW222)的过水解酶的转化体制备

Claims

1.生产过氧羧酸的方法，所述方法包括：

a)提供一组反应成分，所述成分包括：

1)至少一种选自下组的底物：

i)具有以下结构的酯

[X]_mR₅

其中X＝式R₆C(O)O的酯基团；

R₅＝C1-C6线性、支链或环状烃基部分，其任选被羟基取代，其中R₅中的每个碳原子各自连接不超过一个羟基或不超过一个酯基团；其中R₅任选包含一个或多个醚键；

m＝1至R₅中的碳原子数；并且

其中所述酯在25℃下在水中具有至少5ppm的溶解度；

ii)具有以下结构的甘油酯

iii)选自乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多糖的乙酰化糖；

2)过氧源；以及

3)酶催化剂，其包含具有过水解酶活性的酶，其中所述酶是SEQ IDNO：18所示的多肽；以及

b)在合适的反应条件下将所述反应成分组合，由此产生过氧羧酸。

2.使用酶促产生的过氧羧酸组合物消毒硬质表面或无生命物体的方法，所述方法包括：

a)提供一组反应成分，所述成分包括：

1)至少一种选自下组的底物：

i)具有以下结构的酯

[X]_mR₅

其中X＝式R₆C(O)O的酯基团；

R₅＝C1-C6线性、支链或环状烃基部分，其任选被羟基取代；其中R₅中的每个碳原子各自连接不超过一个羟基或不超过一个酯基团；其中R₅任选包含一个或多个醚键；

m＝1至R₅中的碳原子数；并且

其中所述酯在25℃下在水中具有至少5ppm的溶解度；

ii)具有以下结构的甘油酯

iii)选自乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多糖的乙酰化糖；

2)过氧源；以及

b)在合适的反应条件下将所述反应成分组合，由此产生过氧羧酸；以及

c)使所述硬质表面或无生命物体与过氧羧酸接触，由此将所述表面或所述无生命物体消毒。

3.权利要求2的方法，进一步包括稀释通过组合所述反应成分产生的所述过氧羧酸。

4.权利要求2的方法，其中使所述硬质表面或无生命物体在组合所述反应成分后5分钟至168小时内与过氧羧酸接触。

5.权利要求4的方法，其中使所述硬质表面或无生命物体在组合所述反应成分后5分钟至48小时内与过氧羧酸接触。

6.权利要求5的方法，其中使所述硬质表面或无生命物体在组合所述反应成分后5分钟至2小时内与过氧羧酸接触。

7.权利要求2的方法，其中所述硬质表面或无生命物体上的存活生物污染物的浓度降低至少3-log。

8.权利要求7的方法，其中所述硬质表面或无生命物体上的存活生物污染物的浓度降低至少5-log。

9.用酶促产生的过氧羧酸组合物消毒硬质表面或无生命物体的方法，所述方法包括在合适的含水反应条件下在所述硬质表面或无生命物体上将一组反应成分组合，所述反应成分包括：

1)至少一种选自下组的底物：

i)具有以下结构的酯

[X]_mR₅

其中X＝式R₆C(O)O的酯基团；

m＝1至R₅中的碳原子数；并且

其中所述酯在25℃下在水中具有至少5ppm的溶解度；

ii)具有以下结构的甘油酯

iii)选自乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多糖的乙酰化糖；

2)过氧源；以及

3)酶催化剂，其包含具有过水解活性的酶，其中所述酶是SEQ IDNO：18所示的多肽，

由此产生过氧羧酸，从而消毒所述硬质表面或无生命物体。

10.权利要求9的方法，其中所述过氧羧酸是稀释的。

11.权利要求1-10的任一项的方法，其中所述底物选自甘油一乙酸酯；甘油二乙酸酯；甘油三乙酸酯；甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯；甘油三丙酸酯；甘油一丁酸酯；甘油二丁酸酯；甘油三丁酸酯；葡萄糖五乙酸酯；木糖四乙酸酯；乙酰化木聚糖；β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯；三-O-乙酰基-D-半乳醛；三-O-乙酰基-己烯糖；1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、2，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，2-戊二醇、2，5-戊二醇、1，2-己二醇、2，5-己二醇、1，6-己二醇的一酯或二酯；及其混合物。

12.权利要求1-10的任一项的方法，其中所述酶由SEQ ID NO：17所示的核酸分子编码。

13.权利要求1-10的任一项的方法，其中在组合所述反应成分后5分钟至2小时内以至少20ppm的浓度产生过氧羧酸。

14.权利要求1-10的任一项的方法，其中所产生的过氧羧酸是过乙酸、过丙酸、过丁酸、过乳酸、过乙醇酸、过甲氧基乙酸、过-β-羟基丁酸或其混合物。

15.权利要求1-10的任一项的方法，其中所产生的过氧羧酸是过乙酸。

16.权利要求1-10的任一项的方法，其中所述酶催化剂是微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物、部分纯化的酶或纯化的酶的形式。

17.权利要求1-10的任一项的方法，其中所述酶催化剂缺乏过氧化氢酶活性。