JP5276600B2 - 過加水分解活性を有する酵素を用いた過酸の生産 - Google Patents
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Description
a)一式の反応成分を備えること、該成分は、以下を含む:
1)以下からなる群より選択されるカルボン酸エステル:
i)以下の構造を有するエステル:
そしてnは、1〜10である];および
ii)以下の構造を有するグリセリド:
iii)アセチル化単糖、アセチル化二糖およびアセチル化多糖からなる群より選択されるアセチル化糖;
2)過酸素源;および
3)過加水分解活性を有する酵素触媒、該酵素触媒は、CLUSTALWを用いて参照配列の配列番号2にアラインした(aligned)場合、シグネチャーモチーフを含む酵素を含み、該シグネチャーモチーフは、以下を含む:
i)アミノ酸の位置118〜120におけるRGQモチーフ;
ii)アミノ酸の位置179〜183におけるGXGSGモチーフ;および
iii)アミノ酸の位置298〜299におけるHEモチーフ;ならびに
b)該反応成分を適切な水性反応条件下で組合わせることによって、ペルオキシカルボン酸を生産させること。
a)一式の反応成分を備えること、該成分は、以下を含む:
1)以下からなる群より選択される基質:
i)以下の構造を有するエステル:
そしてnは、1〜10である];および
ii)以下の構造を有するグリセリド:
iii)アセチル化単糖、アセチル化二糖、およびアセチル化多糖からなる群より選択されるアセチル化糖;
2)過酸素源;および
3)過加水分解活性を有する酵素触媒、該酵素触媒は、CLUSTALWを用いて参照配列の配列番号2にアラインした場合、シグネチャーモチーフを含み、該シグネチャーモチーフは、以下を含む:
i)アミノ酸の位置118〜120におけるRGQモチーフ;
ii)アミノ酸の位置179〜183におけるGXGSGモチーフ;および
iii)アミノ酸の位置298〜299におけるHEモチーフ;および
b)該反応成分を適切な水性反応条件下で組合わせることによって、ペルオキシカルボン酸生成物を生成させること;
c)場合により、該ペルオキシカルボン酸生成物を希釈すること;ならびに
d)上記硬表面または無生物を、工程b)または工程c)で生産されたペルオキシカルボン酸と接触させることによって、上記表面または上記無生物を消毒すること。
a)以下からなる群より選択される基質:
1)以下の構造を有するエステル:
そしてnは、1〜10である];および
3)アセチル化単糖、アセチル化二糖およびアセチル化多糖からなる群より選択されるアセチル化糖;および
b)過酸素源;ならびに
c)過加水分解活性を有する酵素触媒、該酵素触媒は、CLUSTALWを用いて参照配列の配列番号2にアラインした場合、シグネチャーモチーフを有する酵素を含み、該シグネチャーモチーフは、以下を含む:
i)アミノ酸の位置118〜120におけるRGQモチーフ;
ii)アミノ酸の位置179〜183におけるGXGSGモチーフ;および
iii)アミノ酸の位置298〜299におけるHEモチーフ。
a)酵素触媒(該酵素触媒は、CE−7シグネチャーモチーフを有するペルヒドロラーゼ酵素を含む)、およびモノアセチン、ジアセチン、トリアセチンおよびそれらの混合物からなる群より選択されるカルボン酸エステルを含む第一の混合物;該第一の混合物は、場合により、無機または有機緩衝液、腐食抑制剤、浸潤剤およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるさらなる成分を含む;ならびに
b)過酸素源および水を含む第二の混合物(該第二の混合物は、場合により、キレート剤をさらに含む)。
a)酵素触媒(CE−7シグネチャーモチーフを有するペルヒドロラーゼ酵素を含む)と、アセチル化単糖、アセチル化二糖、アセチル化多糖およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるアセチル化糖とを含む第一の混合物(該第一の混合物は、場合により、無機または有機緩衝液、腐食抑制剤および浸潤剤をさらに含む);ならびに
b)過酸素源および水を含む第二の混合物(該第二の混合物は、場合により、キレート剤を含む)。
以下の配列は、37C.F.R.1.821〜1.825(「ヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則(Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures−the Sequence Rules)」)に準拠し、世界知的所有権機関(WIPO)標準ST.25(1998)、ならびに、欧州特許条約(EPC)および特許協力条約(PCT)の規則5.2および49.5(a−bis)ならびに細則208および実施細則の付属書Cに記載の配列表の要件に従う。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データで用いられる記号および様式は、37C.F.R.§1.822に記載されている規則に準拠する。
上述した課題は、CE−7炭水化物エステラーゼファミリーに属する酵素が、カルボン酸エステル基質を過酸に変換するのに有意な過加水分解活性を示すという発見によって解決した。消毒および/または漂白用途のために、この構造的に関連する酵素ファミリーを用いて、高い効率で過酸濃度を生成させることができる。
a)以下を含む第一の混合物:
i)ペルヒドロラーゼ活性を有する酵素触媒、該酵素触媒は、CE−7シグネチャーモチーフを有する酵素を含む;および
ii)カルボン酸エステル基質(上記第一の混合物は、場合により、無機または有機緩衝液、腐食抑制剤、浸潤剤およびそれらの組み合わせからなる群より選択される成分を含む);ならびに
b)過酸素源および水を含む第二の混合物(該第二の混合物は、場合により、キレート剤を含む)。
1.小さい脂肪族の非極性またはわずかに極性を有する残基:Ala、Ser、Thr(Pro、Gly);
2.極性の負電荷を有する残基およびそれらのアミド:Asp、Asn、Glu、Gln;
3.極性の正電荷を有する残基:His、Arg、Lys;
4.大きい脂肪族の非極性残基:Met、Leu、Ile、Val(Cys);および
5.大きい芳香族残基:Phe、Tyr、Trp。
本発明の一形態において、過加水分解活性を有する酵素触媒の存在下で、カルボン酸エステルと、無機過酸化物、これらに限定されないが過酸化水素、過ホウ酸ナトリウムまたは過炭酸ナトリウムとを反応させることによって過酸を含む水性混合物の製造方法を提供する。一実施態様において、このような酵素触媒は、CE−7炭水化物エステラーゼファミリーに属する構造を有するペルヒドロラーゼを含む。その他の実施態様において、ペルヒドロラーゼ触媒は、構造的にセファロスポリンCデアセチラーゼと分類される。その他の実施態様において、ペルヒドロラーゼ触媒は、構造的にアセチルキシランエステラーゼと分類される。
a)アミノ酸残基118〜120としてRGQモチーフ;
b)アミノ酸残基179〜183としてGXSQGモチーフ;および
c)アミノ酸残基298〜299としてHEモチーフ。
a)以下の式で示されるエステル:
そしてnは、1〜10である];
b)以下の式で示されるグリセリド:
c)アセチル化単糖、二糖および多糖からなる群より選択されるアセチル化糖。
セファロスポリンCデアセチラーゼ(E.C.3.1.1.41;分類名は、cephalosporin C acetylhydrolases;CAH)は、セファロスポリンC、7−アミノセファロスポラン酸、および7−(チオフェン−2−アセトアミド)セファロスポラン酸のようなセファロスポリンに結合したアセチルエステルを加水分解する能力を有する酵素である(Abbott,B.and Fukuda,D.,Appl.Microbiol.30(3):413−419(1975)。CAHは、炭水化物エステラーゼファミリー7と称されるより大きい構造的に関連する酵素のファミリーに属する(CE−7;Coutinho,P.M.,Henrissat,B.“Carbohydrate−active enzymes:an integrated database approach” in Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering,H.J.Gilbert,G.Davies,B.HenrissatおよびB.Svensson編集(1999)The Royal Society of Chemistry,Cambridge,3〜12頁を参照)。
RGQQSSEDTSISLHGHALGWMTKGILDKDTYYYRGVYLDAVRALEVISSFDEVDETRIGVTGGSQGGGLTIAAAALSDIPKAAVADYPYLSNFERAIDVALEQPYLEINSFFRRNGSPETEVQAMKTLSYFDIMNLADRVKVPVLMSIGLIDKVTPPSTVFAAYNHLETEKELKVYRYFGHE (配列番号61)。
反応物および生産物を解析するために、本発明の方法において様々な分析方法を用いることができ、このような分析方法としては、これらに限定されないが、滴定、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、ガスクロマトグラフィー(GC)、マススペクトロスコピー(MS)、キャピラリー電気泳動(CE)、U.Karst等(Anal.Chem.,69(17):3623−3627(1997))によって説明されている分析法、および本発明の実施例で説明されるような2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンゾチアゾリン)−6−スルホネート(ABTS)分析(S.Minning等,Analytica Chimica Acta 378:293−298(1999)、およびWO2004/058961A1)が挙げられる。
J.Gabrielson等(J.Microbiol.Methods 50:63−73(2002))によって説明されている方法を用いて、過酸または過酸化水素、および酵素基質の最少殺菌濃度(MBC)を決定することができる。この分析方法はXTT還元の阻害に基づいており、ここでXTT((2,3−ビス[2−メトキシ−4−ニトロ−5−スルホフェニル]−5−[(フェニルアミノ)カルボニル]−2H−テトラゾリウム、分子内塩、モノナトリウム塩)は、490nmまたは450nmで測定された光学密度(OD)の変化によって微生物の呼吸活性を指示する酸化還元色素である。しかしながら、消毒剤および防腐剤の活性の試験に利用可能な様々なその他の方法があり、例えば、これらに限定されないが、生存可能なプレートの計数、直接的な顕微鏡による計数、乾燥質量、濁度測定、吸光度および生物発光(例えば、Brock,Semour S.,Disinfection,Sterilization,and Preservation,第5版,リッピンコット・ウィリアムス&ウィルキンス(Lippincott Williams&Wilkins),フィラデルフィア,ペンシルベニア州,米国;2001を参照)が挙げられる。
本発明に係る方法に従って製造した酵素触媒により生成した過酸は、様々な硬表面/無生物への用途において、微生物、真菌、プリオン関連およびウイルス汚染の濃度を減少させるために用いることができ、例えば、医療機器(例えば内視鏡)、テクスタイル(例えば、衣服、カーペット)、調理用の表面、食品保存および食品包装器具、食品の包装に用いられる材料、ニワトリの孵化場、および飼育施設、動物の囲い、および微生物および/または殺ウイルス活性を有する使用済みのプロセス水の汚染除去に用いることができる。酵素により生成した過酸をプリオンを不活性化するように設計された製剤(例えば、所定のプロテアーゼ)に用いて、追加の殺菌活性を提供してもよい。好ましい形態において、本発明の過酸組成物は、特に、オートクレーブ不可能な医療機器や食品包装装置のための消毒剤として有用である。過酸を含む製剤は、GRASまたは食品グレードの成分(酵素、酵素基質、過酸化水素、および緩衝液)を用いて調製してもよいために、酵素により生成した過酸はさらに、動物の死体、肉、果物および野菜の汚染除去のために、または加工食品の汚染除去のために用いてもよい。酵素により生成した過酸は、最終的な形態が、粉末、液体、ゲル、フィルム、固体またはエアロゾルである製品に組み込んでもよい。酵素により生成した過酸は、なお有効な汚染除去効果を示すような濃度に希釈してもよい。
本発明の配列の遺伝子および遺伝子産物は、異種宿主細胞中で、具体的には微生物宿主の細胞中で生産してもよい。本発明の遺伝子および核酸分子を発現させるための好ましい異種宿主細胞は、真菌または細菌属内で見出すことができ、広範な温度、pH値および溶媒耐性にわたり成長する微生物宿主である。例えば、細菌、酵母および糸状菌のいずれかが、適切に本発明の核酸分子の発現の宿主となり得ることが考えられる。ペルヒドロラーゼは、細胞内、細胞外または細胞内と細胞外の両方の組み合わせで発現される可能性があり、ここにおいて細胞外で発現させる方が、細胞内発現によって生産されたタンパク質を回収する方法よりも、発酵産物からの所望のタンパク質の回収が容易になる。転写、翻訳およびタンパク質生合成装置は、細胞のバイオマスを生成するのに用いられる細胞供給材料と比較して不変のままであり;それにもかかわらず機能的な遺伝子は発現する。宿主株の例としては、これらに限定されないが、細菌、真菌または酵母種が挙げられ、例えば、アスペルギルス属、トリコデルマ属、サッカロミセス属、ピチア属、ファフィア(Phaffia)属、カンジダ、ハンセヌラ属、ヤロウイア属(Yarrowia)、サルモネラ属、バチルス属、アシネトバクター属、ジモモナス属、アグロバクテリウム属、エリスロバクター属(Erythrobacter)、クロロビウム属、クロマチウム属、フラボバクテリウム属、キトファガ属、ロドバクター属、ロドコッカス属、ストレプトマイセス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリア属、マイコバクテリウム属、デイノコッカス属、エシェリキア属、エルウィニア属、パントエア属、シュードモナス属、スフィンゴモナス属、メチロモナス属、メチロバクター属、メチロコッカス属、メチロサイナス属(Methylosinus)、メチロマイクロビウム属(Methylomicrobium)、メチロシスティス属(Methylocystis)、アルカリゲネス属、シネコシスティス属(Synechocystis)、シネココッカス属(Synechococcus)、アナベナ属、チオバチルス属、メタノバクテリウム属、クレブシエラ属、およびミクソコッカス属が挙げられる。一実施態様において、細菌の宿主株としては、エシェリキア属、バチルス属、およびシュードモナス属が挙げられる。その他の好ましい実施態様において、細菌の宿主細胞は、エシェリキア・コリである。
本発明のペルヒドロラーゼ触媒を生産するのに様々な培養方法を適用することができる。例えば、組換え微生物宿主からの過剰発現させた特定の遺伝子産物の大規模な生産は、バッチ式および連続培養法のどちらによっても生産することができる。
本発明の好ましい側面を実証するために、以下の実施例を示す。当業者であれば当然ながら、以下の実施例で開示された技術は、本発明者らによって本発明の実施において十分に機能することが発見された技術を示しており、従って、その実施にとって好ましいモードを構成するものとすることができる。しかしながら、当業者であれば当然ながら、本発明の開示に照して、開示された特定の実施態様に多くの変更をなすことができ、それでもなお本発明の本質および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似した結果が得ることができる。
バチルス・ズブチリスATCC31954 TM の増殖および細胞抽出物の調製
5mLの栄養液体培地(ディフコ;0003−01−6)中にバチルス・ズブチリス(ATCC31954TM)の乾燥させた培養物を懸濁し、30℃で3日間インキュベートすることによって培養物を復活させた。インキュベートしてから3日目に、培養液のアリコートをトリプチケースソイ寒天培養プレート(ベクトン,ディッキンソン・アンド・カンパニー(Becton,Dickinson,and Company);ニュージャージー州フランクリンレイクス)上に線状に塗布し、35℃で24時間インキュベートした。1マイクロリットルの植菌ループ(ベクトン・ディッキンソン(Becton Dickinson);カタログ番号220215)に数個のシングルコロニーを掻き取り、50mLのラクトバチルスMRSブロス(ハーディ・ダイアグノスティクス(Hardy Diagnostics),カリフォルニア州サンタマリア;カタログ番号C5931)に移した。次に、この培養物を、30℃で、200rpmの撹拌速度で12時間増殖させた。増殖させてから12時間後に、2mLの培養液を、100mLのMRSブロスを含む500mLのバッフルなしの振盪フラスコに移し、30℃および200rpmで12〜14時間撹拌することによって増殖させた。その後細胞を、15,000×gで25分間、5℃での遠心分離によって採取し、得られた細胞のペーストを−80℃で保存した。
バチルス・ズブチリスATCC31954 TM の半精製した細胞抽出物の過加水分解活性の決定
バチルス・ズブチリス(ATCC31954TM)細胞抽出物(1mLあたり10mgのタンパク質総量、実施例1で説明されているようにして調製した)の1.0mLのアリコートを、等しい体積の50mMリン酸緩衝液(pH7.0)で希釈し、100,000分子量カットオフ(MWCO)のセントリコン(Centricon)メンブレンユニット(ミリポア社(Millipore Corp),マサチューセッツ州ベッドフォード)を通過させてろ過した。得られた1mLあたり1.5mgのタンパク質総量を含むろ液(半精製した細胞抽出物)を、総可溶性タンパク質(Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination、シグマカタログ番号BCA1−KT)について分析したところ、このろ液の分析は測定可能なカタラーゼ活性を示さなかった。
スペルコ・ディスカバリー(Supelco Discovery)C8カラム(10cm×4.0mm、5μm)(カタログ番号569422−U)w/プレカラムは、スペルコ・スペルガード・ディスカバリー(Supelco Supelguard Discovery)C8(シグマ−アルドリッチ;カタログ番号59590−U);10マイクロリットルの注入体積;CH3CN(シグマ−アルドリッチ;番号270717)および脱イオンH2Oを、1.0mL/分および周囲温度で用いた勾配法:
バチルス・ズブチリスATCC31954 TM 細胞抽出物の半精製した酵素の過加水分解活性
バチルス・ズブチリスATCC31954TMの増殖および抽出物製造を実施例1で説明されているようにして行った(ただしを未精製の抽出物は遠心分離しなかった)。未精製の抽出物を冷たい n−プロパノール(−20℃)を用いて分画した。氷浴中で無細胞抽出物を含むフラスコを15分間撹拌し、続いてn−プロパノール(−20℃)を40%(v/v)の濃度まで滴下して添加した(抽出物の凍結を防ぐため)。得られた抽出物/プロパノール混合物を氷浴中で30分間撹拌し、続いて、5℃で、12,000×gで10分間遠心分離し、上清をフラスコに戻し、氷浴に置いた。追加のn−プロパノール(−20℃)を上清に、60%(v/v)の濃度まで撹拌しながらゆっくり添加し、得られた混合物を氷浴中で30分間撹拌し、続いて、前述の通りに遠心分離した。この第二の分画からのペレットを 氷上で保存し、上清をフラスコに戻し、氷浴に置いた。冷たい n−プロパノールを上清に、80%(v/v)の濃度まで撹拌しながらゆっくり添加し、この混合物を30分間撹拌し、前述の通りに遠心分離した。60〜80%分画からのペレットを氷上で保存した。40〜60%(v/v)n−プロパノール分画および60〜80%(v/v)n−プロパノール分画からのペレットを、最小量の0.05Mリン酸緩衝液(pH6.5)中に溶解させ、得られた溶液を総可溶性タンパク質(Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination、カタログ番号BCA1−KT)について分析し、続いて凍結させ、−80℃で保存した。
の可溶性タンパク質総量を含む1mLの反応混合物を25℃で混合した。添加された半精製した酵素の非存在下で、過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を決定するために、半精製した酵素を含む細胞抽出物のn−プロパノール分画の代わりに50mMリン酸緩衝液(pH6.5)を用いることによってコントロール反応を行った。この反応混合物を、実施例2で説明した手順を用いて5分間および30分間で過酢酸について分析し、表6に、添加された酵素によって生産された過酢酸の濃度を掲記した。
バチルス・ズブチリスATCC31954 TM 細胞抽出物由来の過加水分解活性を有するセファロスポリンCデアセチラーゼの同定
実施例3で説明した40〜60%のn−プロパノール分画の0.1mLサンプル(総タンパク質500μg)を、等しい体積の2X非変性(天然型)サンプル緩衝液(インビトロジェン(Invitrogen))と共に室温で混合し、1.5mmの8〜16%トリス−グリシンポリアクリルアミドミニゲル(2Dゲル;インビトロジェン)の調製用サンプルウェルにローディングした。トリス−グリシンランニング緩衝液(インビトロジェン)を用いて天然型ゲル電気泳動を125Vで90分間稼働させた。電気泳動の後、ゲルをその場でのエステラーゼ活性分析用にpHインジケーター、ブロモチモールブルーを用いて調製した。ゲルを脱イオン水で10分間で2回洗浄し、機械的にゆっくり混合した。続いてゲルを10mMリン酸緩衝液を用いて10分間洗浄した。リン酸緩衝液を除去した後、665μLの飽和ブロモチモールブルー(水中)を含む10mMリン酸緩衝液50mLを、ゲルと10分間インキュベートし、続いて1mLの未希釈のトリアセチン(シグマ・アルドリッチ)を添加した。インキュベートから10分以内に、ゲル上にエステラーゼ活性を示す146kDaの位置に1つの黄色のバンドが現れた。
ーカー(インビトロジェン)をローディングした。
バチルス・ズブチリスATCC31954 TM からのペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
ゲノムDNAを、PUREGENE(R)DNA精製システムを用いて(ジェントラ・システムズ,ミネソタ州ミネアポリス)バチルス・ズブチリスATCC31954TMから単離した。配列番号3および配列番号4と同定されたプライマーを用いたPCR(94℃で0.5分間、55℃で0.5分間、70℃で1分間、30サイクル)によってそのゲノムDNAからペルヒドロラーゼ遺伝子を増幅した。pSW186と同定されたプラスミドを作製するために、得られた核酸生成物(配列番号1)を、pTrcHis2−TOPO(R)にサブクローニングした(インビトロジェン,カリフォルニア州カールスバッド)。さらにペルヒドロラーゼ遺伝子も、配列番号27および配列番号28と同定されたプライマーを用いたPCR(94℃で0.5分間、55℃で0.5分間、70℃で1分間、30サイクル)によってゲノムDNAから増幅した。得られた核酸生成物(配列番号29)を制限酵素PstIおよびXbaIで切断し、pUC19中のPstIとXbaI部位との間にサブクローニングしてpSW194として固定されたプラスミドを作成した。それぞれTOP10/pSW186、MG1655/pSW186、UM2/pSW186、KLP18/pSW186、TOP10/pSW194、MG1655/pSW194、UM2/pSW194、およびKLP18/pSW194と同定された株を作製するために、プラスミドpSW186およびpSW194を用いて、E.コリTOP10(インビトロジェン,カリフォルニア州カールスバッド)、E.コリMG1655(ATCC47076TM)、E.コリUM2(E.COLI GENETIC STOCK CENTER番号7156,イェール大学,コネチカット州ニューヘブン)、およびE.コリKLP18(実施例15を参照)を形質転換した。TOP10/pSW186、MG1655/pSW186、UM2/pSW186、KLP18/pSW186、TOP10/pSW194、MG1655/pSW194、UM2/pSW194、およびKLP18/pSW194を、LB培地中で37℃で振盪しながら、OD600nm=0.4〜0.5になるまで増殖させ、その時点でIPTGを最終濃度1mMまで添加し、インキュベートを2〜3時間続けた。細胞を遠心分離によって採取し、SDS−PAGEを行い、ペルヒドロラーゼの発現を、20〜40%の総可溶性タンパク質で確認した。
バチルス・ズブチリスBE1010からのペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
ゲノムDNAを、PUREGENE(R)DNA精製システムを用いて(ジェントラ・システムズ)バチルス・ズブチリスBE1010(PayneおよびJackson 1991 J.Bacteriol.173:2278−2282)から単離した。配列番号3および配列番号4と同定されたプライマーを用いたPCR(94℃で0.5分間、55℃で0.5分間、70℃で1分間、30サイクル)によってそのゲノムDNAからペルヒドロラーゼ遺伝子を増幅した。pSW187と同定されたプラスミドを作製するために、得られた核酸生成物(配列番号5)を、pTrcHis2−TOPO(R)(インビトロジェン)にサブクローニングした。
バチルス・ズブチリスATCC6633 TM からのペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
ゲノムDNAを、PUREGENE(R)DNA精製システムを用いてバチルス・ズブチリスATCC6633TMから単離した。配列番号3および配列番号4と同定されたプライマーを用いたPCR(94℃で0.5分間、55℃で0.5分間、70℃で1分間、30サイクル)によってそのゲノムDNAからペルヒドロラーゼ遺伝子を増幅した。得られた核酸生成物(配列番号7)を、pTrcHis2−TOPO(R)にサブクローニングして、pSW188と同定されたプラスミドを作製した。それぞれMG1655/pSW188、およびUM2/pSW188と同定された株を作製するために、プラスミドpSW188を用いて、E.コリMG1655(ATCC47076TM)、およびE.コリUM2(E.COLI GENETIC STOCK CENTER番号7156,イェール大学,コネチカット州ニューヘブン)を形質転換した。MG1655/pSW188、およびUM2/pSW188を、LB培地中で37℃で振盪しながら、OD600nm=0.4〜0.5になるまで増殖させ、その時点でIPTGを、1mMの最終濃度まで添加し、インキュベートを2〜3時間続けた。細胞を遠心分離によって採取し、SDS−PAGEを行い、ペルヒドロラーゼの発現を、20〜40%の総可溶性タンパク質で確認した。
バチルス・ズブチリスATCC29233 TM からのペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
ゲノムDNAを、PUREGENE(R)DNA精製システムを用いてバチルス・ズブチリスATCC29233TMから単離した。配列番号3および配列番号4と同定されたプライマーを用いたPCR(94℃で0.5分間、55℃で0.5分間、70℃で1分間、30サイクル)によってそのゲノムDNAからペルヒドロラーゼ遺伝子を増幅した。得られた核酸生成物(配列番号31)を、pTrcHis2−TOPO(R)にサブクローニングして、pSW190と同定されたプラスミドを作製した。それぞれMG1655/pSW190、UM2/pSW190、およびKLP18/pSW190と同定された株を作製するために、プラスミドpSW190を用いて、E.コリMG1655(ATCC47076TM)、E.コリUM2(E.COLI GENETIC STOCK CENTER番号7156,イェール大学,コネチカット州ニューヘブン)、およびE.コリKLP18(実施例15を参照)を形質転換した。MG1655/pSW190、UM2/pSW190、およびKLP18/pSW190を、LB培地中で37℃で振盪しながら、OD600nm=0.4〜0.5になるまで増殖させ、その時点でIPTGを、1mMの最終濃度まで添加し、インキュベートを2〜3時間続けた。細胞を遠心分離によって採取し、SDS−PAGEを行い、ペルヒドロラーゼの発現を、20〜40%の総可溶性タンパク質で確認した。
バチルス・リケニフォルミスATCC14580 TM からのペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
ゲノムDNAを、PUREGENE(R)DNA精製システムを用いてバチルス・リケニフォルミスATCC14580TMから単離した。配列番号33および配列番号34と同定されたプライマーを用いたPCR(94℃で0.5分間、55℃で0.5分間、70℃で1分間、30サイクル)によってそのゲノムDNAからペルヒドロラーゼ遺伝子を増幅した。得られた核酸生成物(配列番号9)を、pTrcHis2−TOPO(R)にサブクローニングして、pSW191と同定されたプラスミドを作製した。それぞれMG1655/pSW191、UM2/pSW191、PIR1/pSW191、およびKLP18/pSW191と同定された株を作製するために、プラスミドpSW191を用いて、E.コリMG1655(ATCC47076TM)、E.コリUM2(E.COLI GENETIC STOCK CENTER番号7156,イェール大学,コネチカット州ニューヘブン)、E.コリPIR1(インビトロジェン,カリフォルニア州カールスバッド)、およびE.コリKLP18(実施例15を参照)を形質転換した。MG1655/pSW191、UM2/pSW191、PIR1/pSW191、およびKLP18/pSW191を、LB培地中で37℃で振盪しながら、OD600nm=0.4〜0.5になるまで増殖させ、その時点でIPTGを最終濃度1mMまで添加し、インキュベートを2〜3時間続けた。細胞を遠心分離によって採取し、SDS−PAGEを行い、ペルヒドロラーゼの発現を、20〜40%の総可溶性タンパク質で確認した。
クロストリジウム・テルモセルムATCC27405 TM からのペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
ゲノムDNAを、PUREGENE(R)DNA精製システムを用いてクロストリジウム・テルモセルムATCC27405TMから単離した。配列番号35および配列番号36と同定されたプライマーを用いたPCR(94℃で0.5分間、55℃で0.5分間、70℃で1分間、30サイクル)によってそのゲノムDNAからペルヒドロラーゼ遺伝子を増幅した。得られた核酸生成物(配列番号13)を、pTrcHis2−TOPO(R)にサブクローニングして、pSW193と同定されたプラスミドを作製した。それぞれMG1655/pSW193、UM2/pSW193、およびKLP18/pSW193と同定された株を作製するために、プラスミドpSW193を用いて、E.コリMG1655(ATCC47076TM)、E.コリUM2(E.COLI GENETIC STOCK CENTER番号7156,イェール大学,コネチカット州ニューヘブン)、およびE.コリKLP18(実施例15を参照)を形質転換した。MG1655/pSW193、UM2/pSW193、およびKLP18/pSW193を、LB培地中で37℃で振盪しながら、OD600nm=0.4〜0.5になるまで増殖させ、その時点でIPTGを最終濃度1mMまで添加し、インキュベートを2〜3時間続けた。細胞を遠心分離によって採取し、SDS−PAGEを行い、ペルヒドロラーゼの発現を、20〜40%の総可溶性タンパク質で確認した。
バチルス・プミルスPS213からのペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
GENBANK(R)で報告されているようなB.プミルスPS213由来のアセチルキシランエステラーゼ(axe1)をコードする遺伝子(受託番号AJ249957)を、E.コリ(DNA2.0,カリフォルニア州メンローパーク)中での発現に関して最適化されたコドンを用いて合成した。続いて配列番号37および配列番号38と同定されたプライマーを用いたPCR(94℃で0.5分間、55℃で0.5分間、70℃で1分間、30サイクル)によってその遺伝子を増幅した。pSW195と同定されたプラスミドを作製するために、得られた核酸生成物(配列番号60)を、pTrcHis2−TOPO(R)にサブクローニングした(インビトロジェン,カリフォルニア州カールスバッド)。それぞれMG1655/pSW195、UM2/pSW195、およびKLP18/pSW195と同定された株を作製するために、プラスミドpSW195を用いて、E.コリMG1655(ATCC47076TM)、E.コリUM2(E.COLI GENETIC STOCK CENTER番号7156,イェール大学,コネチカット州ニューヘブン)、およびE.コリKLP18(実施例15を参照)を形質転換した。MG1655/pSW195、UM2/pSW195、およびKLP18/pSW195を、LB培地中で37℃で振盪しながら、OD600nm=0.4〜0.5になるまで増殖させ、その時点でIPTGを、1mMの最終濃度まで添加し、インキュベートを2〜3時間続けた。細胞を遠心分離によって採取し、SDS−PAGEを行い、ペルヒドロラーゼの発現を、20〜40%の総可溶性タンパク質で確認した。
サーモトガ・ネアポリタナからのペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
GENBANK(R)で報告されているようなサーモトガ・ネアポリタナ由来のアセチルキシランエステラーゼをコードする遺伝子(受託番号58632)を、E.コリ(DNA2.0,カリフォルニア州メンローパーク)中での発現に関して最適化されたコドンを用いて合成した。続いて配列番号39および配列番号40と同定されたプライマーを用いたPCR(94℃で0.5分間、55℃で0.5分間、70℃で1分間、30サイクル)によってその遺伝子を増幅した。得られた核酸生成物(配列番号41)を、pTrcHis2−TOPO(R)にサブクローニングして、pSW196と同定されたプラスミドを作製した。それぞれMG1655/pSW196、UM2/pSW196、およびKLP18/pSW196と同定された株を作製するために、プラスミドpSW196を用いて、E.コリMG1655(ATCC47076TM)、E.コリUM2(E.COLI GENETIC STOCK CENTER番号7156,イェール大学,コネチカット州ニューヘブン)、およびE.コリKLP18(実施例15を参照)を形質転換した。MG1655/pSW196、UM2/pSW196、およびKLP18/pSW196を、LB培地中で37℃で振盪しながら、OD600nm=0.4〜0.5になるまで増殖させ、その時点でIPTGを、1mMの最終濃度まで添加し、インキュベートを2〜3時間続けた。細胞を遠心分離によって採取し、SDS−PAGEを行い、ペルヒドロラーゼの発現を、20〜40%の総可溶性タンパク質で確認した。
katGカタラーゼが破壊されたE.コリ株の構築
配列番号46と同定されたPCR産物を作製するために、配列番号44および配列番号45と同定されたプライマーを用いたPCR(94℃で0.5分間、55℃で0.5分間、70℃で1分間、30サイクル)によってカナマイシン耐性遺伝子(kan;配列番号42)をプラスミドpKD13(配列番号43)から増幅した。katG核酸配列は配列番号47として示され、それに対応するアミノ酸配列は配列番号48である。E.コリMG1655(ATCC47076TM)を、λ−レッドリコンビナーゼ遺伝子(DatsenkoおよびWanner,2000,PNAS USA 97:6640−6645)を含む温度感受性プラスミドpKD46(配列番号49)で形質転換し、LB−ampプレート上で30℃で24時間選択した。MG1655/pKD46を、PCR産物50〜500ngでエレクトロポレーション(バイオラッド・ジーン・パルサー(BioRad Gene Pulser)、0.2cmキュベット、2.5kV、200W、25uF)によって形質転換し、LB−kanプレート上で37℃で24時間選択した。数個のコロニーを、LB−kanプレート上に線状に塗布し、42℃で一晩インキュベートしてpKD46プラスミドを処理した。コロニーをチェックして、kanR/ampSの表現型を確認した。ゲノムDNAを、PUREGENE(R)DNA精製システムを用いて数個のコロニーから単離し、配列番号50および配列番号51と同定されたプライマーを用いたPCRによってチェックし、katG遺伝子の破壊を確認した。数種のkatGが破壊された株を、FLPリコンビナーゼを含む温度感受性プラスミドpCP20(配列番号52)で形質転換し、これを用いて、kan遺伝子を切り出し、LB−ampプレート上で37℃で24時間選択した。数個のコロニーを、LBプレート上に線状に塗布し、42℃で一晩インキュベートして、pCP20プラスミドを処理した。2つのコロニーをチェックして、kanS/ampSの表現型を確認し、MG1655KatG1、およびMG1655KatG2と命名した。
katEカタラーゼが破壊されたE.コリ株の構築
配列番号55と同定されたPCR産物を作製するために、配列番号53および配列番号54と同定されたプライマーを用いたPCR(94℃で0.5分間、55℃で0.5分間、70℃で1分間、30サイクル)によってカナマイシン耐性遺伝子(配列番号42)をプラスミドpKD13(配列番号43)から増幅した。katE 核酸配列は、配列番号56として与えられ、それに対応するアミノ酸配列は配列番号57である。E.コリMG1655(ATCC47076TM)を、λ−レッドリコンビナーゼ遺伝子を含む温度感受性プラスミドpKD46(配列番号49)で形質転換し、LB−ampプレート上で30℃で24時間選択した。MG1655/pKD46を、PCR産物50〜500ngでエレクトロポレーション(バイオラッド・ジーン・パルサー、0.2cmキュベット、2.5kV、200W、25uF)によって形質転換し、LB−kanプレート上で37℃で24時間選択した。数個のコロニーを、LB−kanプレート上に線状に塗布し、42℃で一晩インキュベートしてpKD46プラスミドをキュアした(cure)。コロニーをチェックして、kanR/ampSの表現型を確認した。ゲノムDNAを、PUREGENE DNA精製システムを用いて数個のコロニーから単離し、配列番号58および配列番号59と同定されたプライマーを用いたPCRによってチェックし、katE遺伝子の破壊を確認した。数個のkatEが破壊された株を、FLPリコンビナーゼを含む温度感受性プラスミドpCP20(配列番号52)で形質転換し、これを用いて、kan遺伝子を切り出し、LB−ampプレート上で37℃で24時間選択した。数個のコロニーを、LBプレート上に線状に塗布し、42℃で一晩インキュベートして、pCP20プラスミドをキュアした。2つのコロニーをチェックして、kanS/ampSの表現型を確認し、MG1655 KatE1、およびMG1655 KatE2と命名した。
katGカタラーゼおよびkatE カタラーゼが破壊されたE.コリ株(KLP18)の構築
配列番号55と同定されたPCR産物を作製するために、配列番号53および配列番号54と同定されたプライマーを用いたPCR(94℃で0.5分間、55℃で0.5分間、70℃で1分間、30サイクル)によってカナマイシン耐性遺伝子(配列番号42)をプラスミドpKD13(配列番号43)から増幅した。E.コリMG1655KatG1(実施例13)を、温度感受性プラスミドpKD46(配列番号49)で形質転換し、LB−ampプレート上で30℃で24時間選択した。MG1655KatG1/pKD46を、PCR産物50〜500ngでエレクトロポレーション(バイオラッド・ジーン・パルサー、0.2cmキュベット、2.5kV、200W、25uF)によって形質転換し、LB−kanプレート上で37℃で24時間選択した。数個のコロニーを、LB−kanプレート上に線状に塗布し、42℃で一晩インキュベートしてpKD46プラスミドをキュアした。コロニーをチェックして、kanR/ampSの表現型を確認した。ゲノムDNAを、PUREGENE(R)DNA精製システムを用いて数個のコロニーから単離し、配列番号58および配列番号59と同定されたプライマーを用いたPCRによってチェックし、katE遺伝子の破壊を確認した。数種のkatEが破壊された株(ΔkatE)を、FLPリコンビナーゼを含む温度感受性プラスミドpCP20(配列番号52)で形質転換し、これを用いて、kan遺伝子を切り出し、LB−ampプレート上で37℃で24時間選択した。数個のコロニーを、LBプレート上に線状に塗布し、42℃で一晩インキュベートして、pCP20プラスミドを処理した。2つのコロニーをチェックして、kanS/ampSの表現型を確認し、MG1655KatG1KatE18.1、およびMG1655KatG1KatE23と命名した。MG1655KatG1KatE18.1をE.コリKLP18と命名した。
ペルヒドロラーゼの分子量の推定
振盪フラスコでのE.コリKLP18、バチルス・ズブチリス、バチルス・リケニフォルミス、およびクロストリジウム・テルモセルム由来のペルヒドロラーゼ遺伝子を発現するE.コリMG1655のカタラーゼ二重ノックアウトの増殖によって得られた細胞ペレットを、ジチオスレイトール(1mM)を含む2.2mLの0.05Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に懸濁した。各細胞懸濁液を、16,000psi(〜110.3MPa)の作動圧力を有するフレンチプレスに2回通過させた。未精製の抽出物を、20,000×gで遠心分離し、残滓を除去し、透明な未精製の抽出物を作成し、これを総可溶性タンパク質について分析した(Bicinchoninic Acid Kit [BCA] for Protein Determination、シグマ・アルドリッチ、BCA1−KT)。
B.ズブチリスBE1010のペルヒドロラーゼを発現するE.コリUM2/pSW187の発酵
発酵槽用の種培養を、2Lの振盪フラスコにLBミラー(Miller)培地(ディフコ)を含む種培地0.5Lを入れることによって調製した。培地のpHを6.8に調整し、フラスコ中で滅菌した。滅菌後、アンピシリンストック溶液(25mg/mL)1mLを添加した。種培地に、20%グリセロール中のE.コリUM2/pSW187培養物1mLを植え付け、36℃、および300rpmで培養した。OD550が約1〜2になったら、種培養を、35℃で、KH2PO4(3.50g/L)、FeSO4七水和物(0.05g/L)、MgSO4七水和物(2.0g/L)、クエン酸ナトリウム二水和物(1.90g/L)、酵母抽出物(アンブレックス(Ambrex)695、5.0g/L)、バイオスプメックス(Biospumex)153K消泡剤(0.25mL/L,コグニス社(Cognis Corporation))、NaCl(1.0g/L)、CaCl2二水和物(10g/L)、およびNIT微量元素溶液(10mL/L)を含む培地8Lと共に、14Lの発酵槽(ブラウン(Braun))に移した。微量元素溶液は、クエン酸一水和物(10g/L)、MnSO4水和物(2g/L)、NaCl(2g/L)、FeSO4七水和物(0.5g/L)、ZnSO4七水和物(0.2g/L)、CuSO4五水和物(0.02g/L)、およびNaMoO4二水和物(0.02g/L)を含む。滅菌後の添加物は、流加培養溶液60g(以下を参照)、およびアンピシリンストック溶液(25mg/mL)16.0mLを含む。流加培養溶液は、60%w/wグルコース2.4kg、25g/Lの酵母抽出物0.6L、および50g/Lのバクト(Bacto)ペプトン(ディフコ)を含む。グルコース濃度が0.5g/L未満に減少したらグルコース供給を、最初は0.3g/分で開始して、次第に、毎時それぞれ0.35、0.40、0.47および0.53g/分に増加させた;その後速度を一定に保った。培地中のグルコース濃度をモニターし、濃度が0.1g/Lを超えたら、添加速度を低くするか、または一時的に止めた。OD550=7で、IPTG(0.5M)16mLを添加することによって誘導を開始した。温度を36℃に制御し、通気を2slpm(標準リットル/分)に400rpmで撹拌しながら固定した。pHを6.8に制御した;NH4OH(29%w/w)、およびH2SO4(20%w/v)をpHコントロールに用いた。ヘッドの圧力は、0.5barとした。IPTGを添加してから8時間後に細胞を遠心分離によって採取した。
B.ズブチリスATCC31954 TM のペルヒドロラーゼを発現するE.コリUM2/pSW186、またはB.リケニフォルミスATCC14580 TM のペルヒドロラーゼを発現するE.コリUM2/pSW191の発酵
実施例17で説明されているようにして、B.ズブチリスATCC31954TMのペルヒドロラーゼを発現するE.コリUM2/pSW186、またはB.リケニフォルミスATCC14580TMのペルヒドロラーゼを発現するE.コリUM2/pSW191を用いて種培養を製造した。発酵培地は、LBミラー(25g/L,ディフコ)であった。滅菌後の添加物は、グルコース溶液50g(50%w/w)、およびアンピシリンストック溶液(25mg/mL)16.0mLを含む。流加培養発酵のために、グルコース(50%w/w)を用いた。グルコース濃度が0.5g/L未満に減少したらグルコース供給を0.3g/分の一定速度で開始させた。培地中のグルコース濃度をモニターし、濃度が0.1g/Lを超えたら、添加速度を低くするか、または一時的に止めた。OD550=2で、IPTG(0.5M)16mLを添加することによって誘導を開始した。温度を36℃に制御し、通気を2slpmに400rpmで撹拌しながら固定した。pHを6.8に制御した;NH4OH(29%w/w)、およびH2SO4(20%w/v)をpHコントロールに用いた。ヘッドの圧力は、0.5barとした。IPTGを添加してから8時間後に細胞を遠心分離によって採取した。
B.ズブチリスBE1010のペルヒドロラーゼを発現するE.コリKLP18/PSW189、またはB.リケニフォルミスATCC14580 TM のペルヒドロラーゼを発現するE.コリKLP18/PSW191の発酵
発酵槽用の種培養を、2Lの振盪フラスコに酵母抽出物(アンブレックス695、5.0g/L)、K2HPO4(10.0g/L)、KH2PO4(7.0g/L)、クエン酸ナトリウム二水和物(1.0g/L)、(NH4)2SO4(4.0g/L)、MgSO4七水和物(1.0g/L)、およびクエン酸鉄(III)アンモニウム(0.10g/L)を含む種培地0.5Lを入れることによって製造した。培地のpHを6.8に調整し、培地をフラスコ中で滅菌した。滅菌後の添加物は、グルコース(50質量%、10.0mL)、およびアンピシリン(25mg/mL)ストック溶液1mLを含む。種培地に、20%グリセロール中のE.コリKLP18/PSW189、またはKLP18/PSW191の培養物1mLを植え付け、35℃および300rpmで培養した。OD550が約1〜2になったら、種培養を、35℃で、KH2PO4(3.50g/L)、FeSO4七水和物(0.05g/L)、MgSO4七水和物(2.0g/L)、クエン酸ナトリウム二水和物(1.90g/L)、酵母抽出物(アンブレックス695、5.0g/L)、バイオスプメックス(Biospumex)153K消泡剤(0.25mL/L,コグニス社)、NaCl(1.0g/L)、CaCl2二水和物(10g/L)、およびNIT微量元素溶液(10mL/L)を含む培地8Lと共に14Lの発酵槽(ブラウン)に移した。微量元素溶液は、クエン酸一水和物(10g/L)、MnSO4水和物(2g/L)、NaCl(2g/L)、FeSO4七水和物(0.5g/L)、ZnSO4七水和物(0.2g/L)、CuSO4五水和物(0.02g/L)、およびNaMoO4二水和物(0.02g/L)を含む。滅菌後の添加物は、グルコース溶液(50%w/w、80.0g)、およびアンピシリン(25mg/mL)ストック溶液(16.00mL)を含む。グルコース溶液(50%w/w)を流加培養のために用いた。グルコース濃度が0.5g/Lに減少したら、グルコース供給を初めは1分あたり0.31gの供給量で開始させ、次第に、毎時それぞれ0.36、0.42、0.49、0.57、0.66、0.77、0.90、1.04、1.21、1.411.63g/分に増加させた;その後速度を一定に保った。培地中のグルコース濃度をモニターし、濃度が0.1g/Lを超えたら、供給速度を低くするか、または一時的に止めた。E.コリKLP18/PSW191の場合、OD550=80で、IPTG(0.5M)16mLを添加することによって誘導を開始し、一方で、E.コリKLP18/PSW189の場合、増殖がそれより遅く、OD550=56で誘導を開始した。溶存酸素(DO)濃度を25%の空気飽和状態に制御した。DOをまずはインペラーの撹拌速度によって(400〜1400rpm)制御し、その後は通気速度(2〜10slpm)によって制御した。pHを6.8に制御した。NH4OH(29%w/w)、およびH2SO4(20%w/v)をpHコントロールに用いた。ヘッドの圧力は、0.5barとした。IPTGを添加してから16時間後に細胞を遠心分離によって採取した。
ペルヒドロラーゼ生産の発酵宿主としてのE.コリKLP18、およびE.コリUM2
E.コリKLP18(実施例15)を用いて、実施例19で説明されている方法に従って複数の発酵液10L中で増殖させた形質転換体(実施例5、8、9および10)を作製した。これらの実験の最終的なODを、実施例17および18で説明されている発酵方法に従って行われた、これらの同じペルヒドロラーゼを発現するE.コリUM2形質転換体(実施例5、8、9および10)を生産した発酵液と比較した。表8に、宿主としてUM2およびKLP18の両方を用いた10Lの発酵実験が要約されており、UM2と比較してKLP18の優れた性能が実証された。
E.コリ形質転換体で発現されたバチルス・ズブチリスATCC31954 TM のペルヒドロラーゼの評価
実施例5で説明した3種の形質転換体E.コリTOP10/pSW186、E.コリMG1655/pSW186、およびE.コリUM2/pSW186を、アンピシリン(100μg/mL)を含むミラーLB液体培地(50mL;メディアテック社(Mediatech,Inc),バージニア州ハーンドン)を含むバッフルなしの振盪フラスコ中で、14〜16時間、35〜37℃、200rpmの撹拌で増殖させた。3種の形質転換体を一晩増殖させた後、それぞれの培養液を、アンピシリン(100μg/mL)を含む新しいミラーLB液体培地でそれぞれの培養液の1:100希釈液を調製することによって再度培養した。35〜37℃で3時間、200rpmの撹拌で増殖させた後、それぞれの培養を、最終濃度1mMにIPTGを添加することによって誘導した。同じ条件下でさらに3時間増殖させた後、それぞれの培養からの細胞のペーストを、5℃で、26,000×gで20分間遠心分離することによって採取した。それぞれの形質転換体の細胞抽出物を、実施例1で説明した手順に従って調製した(ただし、25質量%の湿潤した細胞懸濁液を製造するために用いた抽出緩衝液は、0.05Mリン酸カリウム(pH7.0)、および1mMのジチオスレイトールで構成された)。
バチルス・ズブチリスATCC31954 TM のペルヒドロラーゼを発現するE.コリTOP10/pSW186抽出物のの過加水分解活性
別々の1.0mLのトリアセチン過加水分解反応を、実施例21で説明されているようにしてE.コリTOP10/pSW186形質転換体抽出物を用いて行って、各反応で以下の反応物中の総タンパク質濃度:196μg/mL、98μg/mL、49μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.0μg/mL、または1.5μg/mLの総タンパク質濃度(表10)の1つが与えられた。
バチルス・ズブチリスATCC31954 TM のペルヒドロラーゼを発現するE.コリUM2/pSW186抽出物の過加水分解活性
E.コリUM2/pSW186形質転換体の抽出物(抽出物1mLあたり20mgのタンパク質総量、実施例21で説明されているようにして調製した)を、pH6.5または7.5で、各反応において25℃で、トリアセチン(40mM、または100mM)、過酸化水素(40mM、または100mM)、およびリン酸緩衝液(Pi、100mM、200mMまたは300mM)中の総抽出物タンパク質(0.1mg/mL、または1.0mg/mL)を含む1.0mLの過加水分解反応で用いた(実施例21で説明されているようにして反応を行った)(表11)。
バチルス・ズブチリスBE1010から誘導されたE.コリ形質転換体で発現されたペルヒドロラーゼの評価
実施例6で説明したE.コリTOP10/pSW187、E.コリMG1655/pSW187、およびE.コリUM2/pSW187形質転換体を、アンピシリン(100μg/mL)を含むミラーLB液体培地(50mL;メディアテック社,バージニア州ハーンドン)を含むバッフルなしの振盪フラスコ中で、14〜16時間、35〜37℃で、200rpmの撹拌で増殖させた。3種の形質転換体を一晩増殖させた後、それぞれの培養液を、アンピシリン(100μg/mL)を含む新しいミラーLB液体培地でそれぞれの培養液の1:100希釈液を調製することによって再度培養した。35〜37℃で3時間、200rpmの撹拌で増殖させた後、それぞれの培養を、最終濃度1mMにIPTGを添加することによって誘導した。同じ条件下でさらに3時間増殖させた後、それぞれの培養からの細胞のペーストを、5℃で、26,000×gで20分間遠心分離することによって採取した。細胞抽出物を調製するために、実施例1で説明した手順を繰り返した(ただし、25質量%の湿潤した細胞懸濁液を調製するために用いた抽出緩衝液は、0.05Mリン酸カリウム(pH7.0)、および1mMのジチオスレイトールで構成された)。
E.コリ形質転換体で発現されたペルヒドロラーゼの評価
実施例5、6、7、8、9、10、18および19で説明されているようにして形質転換体を調製した。それぞれの形質転換体の細胞抽出物を、実施例1で説明した手順に従って調製した(ただし、25質量%の湿潤した細胞懸濁液を調製するために用いた抽出緩衝液は、0.05Mリン酸カリウム(pH7.0)、および1mMのジチオスレイトールで構成された)。
市販のリパーゼの過加水分解に関する評価
トリアセチン(250mM)、過酸化水素(1.0M)、および50mMリン酸緩衝液(pH6.5)中の市販のリパーゼ50μgを含む別個の1mLの反応を25℃で行った。添加されたリパーゼの非存在下で過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を決定するために、コントロール反応を市販のリパーゼを用いずに行った。反応混合物中の過酢酸の濃度(表14)を、実施例2で説明したKarst等の方法に従って決定した。市販のリパーゼは、シグマ/アルドリッチ・ケミカル社(ミズーリ州セントルイス)、バイオカタリティクス(BioCatalytics,カリフォルニア州パサデナ)、名糖産業株式会社(Meito Sangyo Co.)(日本国名古屋)、天野エンザイム(Amano Enzymes)(イリノイ州ロンバード)、ノボザイムズ(Novozymes)(ノースカロライナ州フランクリントン)、バレー・サーチ(Valley Research)(インディアナ州サウスベンド)、およびエンザイム・デベロップメント・コーポレーション(エンゼコ(ENZECO(R));ニューヨーク州ニューヨーク)から得た。
E.コリ形質転換体で発現されたペルヒドロラーゼの評価
ペルヒドロラーゼを発現する形質転換体の細胞抽出物を実施例21で説明した手順に従って製造した。トリアセチン(105mM)、過酸化水素(78mM)、および1mg、または50mMリン酸緩衝液(pH6.5)中の細胞抽出物(上述の通りに製造された)からの総抽出物タンパク質2mgを含む別個の1mLの反応を25℃で行った。添加された抽出物タンパク質の非存在下で過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を決定するために、総抽出物タンパク質溶液の代わりに50mMリン酸緩衝液(pH6.5)を用いることによってコントロール反応を行った。反応混合物中の過酢酸の濃度(表15)を、実施例2で説明されているKarst等の方法に従って決定した。
市販のリパーゼの過加水分解に関する評価
トリアセチン(105mM)、過酸化水素(78mM)および50mMリン酸緩衝液(pH6.5)中の市販のリパーゼ1mgを含む別個の1mLの反応を25℃で行った。添加されたリパーゼの非存在下で過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を決定するために、コントロール反応を市販のリパーゼを用いずに行った。反応混合物中の過酢酸の濃度(表16)を、実施例2で説明したKarst等の方法に従って決定した。
湿潤剤を用いた場合のB.ズブチリスATCC31954 TM のペルヒドロラーゼ活性
B.ズブチリスATCC31954TMのペルヒドロラーゼを発現するE.コリUM2/pSW186形質転換体の細胞抽出物を実施例21で説明した手順に従って調製した。トリアセチン(105mM)、過酸化水素(78mM)、浸潤剤 COLATERIC(R)MSC−NA(混合型の短鎖ナトリウムジプロピオナート;コロニアル・ケミカル社(Colonial Chemical Co.))、スルフィノール(SURFYNOL(R))2502(エトキシ化/プロポキシル化されたアセチレンベースの界面活性剤;エアープロダクツ・アンド・ケミカルズ(Air Products and Chemicals);ユトレヒト,オランダ)、スルフィノール(R)MD−20、シルウェット(SILWET(R))L7650(ポリアルキレンオキシドで改変されたポリジメチルシロキサン;ケムチュラ社(Chemtura Corp),コネチカット州ミドルバリー)、またはシルウェット(R)L8620;シロキサンベースの界面活性剤)、および50mMリン酸緩衝液(pH7.5)中の総抽出物タンパク質1mgを含む別個の1mLの反応を25℃で行った。添加された抽出物タンパク質の非存在下で過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を決定するために、総抽出物タンパク質溶液の代わりに50mMリン酸緩衝液(pH6.5)を用いることによってコントロール反応を行った。反応混合物中の過酢酸の濃度(表17)を、実施例2で説明したKarst等の方法に従って決定した。
湿潤剤を用いた場合のB.ズブチリスBE1010のペルヒドロラーゼ活性
B.ズブチリスATCC31954TMのペルヒドロラーゼを発現するE.コリUM2/pSW187形質転換体の細胞抽出物を実施例21で説明した手順に従って調製した。トリアセチン(105mM)、過酸化水素(78mM)、浸潤剤(プルロニック(PLURONIC(R))17R4(ポリオキシアルキレンエーテル界面活性剤;BASF、ニュージャージー州マウントオリーブ)、プルロニック(R)L43(二官能性のブロックコポリマー界面活性剤)、またはシルウェット(R)L7650)、および50mMリン酸緩衝液(pH6.5)中の総抽出物タンパク質1mgを含む別個の1mLの反応を25℃で行った。添加された抽出物タンパク質の非存在下で過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を決定するために、総抽出物タンパク質溶液の代わりに50mMリン酸緩衝液(pH6.5)を用いることによってコントロール反応を行った。反応混合物中の過酢酸の濃度(表18)を、実施例2で説明したKarst等の方法に従って決定した。
潤滑剤およびキレート剤を用いた場合のペルヒドロラーゼ活性
B.ズブチリスBE1010のペルヒドロラーゼを発現するE.コリUM2/pSW187形質転換体の細胞抽出物を実施例21で説明した手順に従って調製した。トリアセチン(105mM)、過酸化水素(78mM)、浸潤剤(シルウェット(R)L7650)、キレート剤(ターピナル(R)SL;エチドロン酸;ソルティア社,ミズーリ州セントルイス)、および50mMリン酸緩衝液(pH6.5)中の総抽出物タンパク質1mgを含む別個の1mLの反応を25℃で行った。添加された抽出物タンパク質の非存在下で過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を決定するために、総抽出物タンパク質溶液の代わりに50mMリン酸緩衝液(pH6.5)を用いることによってコントロール反応を行った。反応混合物中の過酢酸の濃度(表19)を、実施例2で説明したKarst等の方法に従って決定した。
浸潤剤、キレート剤、および腐食抑制剤を用いた場合のペルヒドロラーゼ活性
B.ズブチリスBE1010のペルヒドロラーゼを発現するE.コリUM2/pSW187形質転換体の細胞抽出物を実施例21で説明した手順に従って調製した。トリアセチン(105mM)過酸化水素(78mM)、浸潤剤(シルウェット(R)L7650)、キレート剤(ターピナル(R)SL)、腐食抑制剤(ベンゾトリアゾール)、および50mMリン酸緩衝液(pH6.5)中の総抽出物タンパク質1mgを含む別個の1mLの反応を25℃で行った。添加された抽出物タンパク質の非存在下で過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を決定するために、総抽出物タンパク質溶液の代わりに50mMリン酸緩衝液(pH6.5)を用いることによってコントロール反応を行った。反応混合物中の過酢酸の濃度(表20)を、実施例2で説明したKarst等の方法に従って決定した。
固定化されたB.ズブチリスATCC31954 TM 、またはBE1010のペルヒドロラーゼを用いた過酢酸の生産
E.コリKMP/pSW189(B.ズブチリスBE1010のペルヒドロラーゼを発現する)、またはE.コリUM2/pSW186(B.ズブチリスATCC31954TMのペルヒドロラーゼを発現する)のいずれかの抽出物(実施例21で説明されているようにして調製した)からの10mg/mLの総可溶性タンパク質を含む5.0mLの0.225Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)中のAMBERZYME(R)オキシラン酵素固定化用高分子支持体(ローム・アンド・ハース(Rohm and Haas),ペンシルベニア州フィラデルフィア)0.50gの懸濁液を、回転式プラットフォームで室温で24時間混合した。続いて上清を固定化酵素からデカントし、酵素を440mL量のリン酸緩衝液(50mM、pH6.5)で洗浄し、これと同じ緩衝液中で5℃で保管した。使用前に、この固定化酵素を真空ろ過で乾燥させた。
B.ズブチリス、B.リケニフォルミスおよびC.テルモセルム由来のペルヒドロラーゼを用いた、ジアセチン、トリアセチンおよびモノアセチンの混合物の過加水分解
ジアセチン(118mM)、トリアセチン(42mM)、およびモノアセチン(90mM)、過酸化水素(1.0M)、および50mMリン酸緩衝液(pH6.5)中のペルヒドロラーゼを含むE.コリUM2細胞抽出物(実施例21で説明されているようにして調製された)からの総抽出物タンパク質50μgの混合物を含む別個の1mLの反応を25℃で行った。添加された抽出物タンパク質の非存在下で過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を決定するために、総抽出物タンパク質溶液の代わりに50mMリン酸緩衝液(pH6.5)を用いることによってコントロール反応を行った。発現されたペルヒドロラーゼの非存在下でE.コリ株によって生産された過酸のバックグラウンドレベルを決定するために、形質転換されていないE.コリUM2の抽出物から製造された総抽出物タンパク質50μgを用いて、第二のコントロール反応を行った。反応混合物中の過酢酸の濃度(表22)を、実施例2で説明したKarst等の方法に従って決定した。
B.ズブチリスBE1010由来のペルヒドロラーゼを用いたジアセチン、トリアセチンおよびモノアセチンの混合物の過加水分解
ジアセチン(49.6mM)、トリアセチン(17.6mM)、およびモノアセチン(37.8mM)、過酸化水素(78mM)、および50mMリン酸緩衝液(pH6.5)中の細胞抽出物(実施例21で説明されているようにして調製された)からの総抽出物タンパク質1mgまたは2mgの混合物を含む別個の1mLの反応を25℃で行った。添加された抽出物タンパク質の非存在下で過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を決定するために、総抽出物タンパク質溶液の代わりに50mMリン酸緩衝液(pH6.5)を用いることによってコントロール反応を行った。反応混合物中の過酢酸の濃度(表23)を、実施例2で説明したKarst等の方法に従って決定した。
B.ズブチリスATCC31954 TM のペルヒドロラーゼによるアセチル化糖の過加水分解
B.ズブチリスATCC31954TMのペルヒドロラーゼを発現するE.コリUM2/pSW186形質転換体の細胞抽出物を実施例21で説明した手順に従って調製した。0.1Mのアセチル化糖(β−D−リボフラノース−1,2,3,5−テトラアセテート、トリ−O−アセチル−D−ガラクタール、またはトリ−O−アセチル−D−グルカール(アルドリッチ))、過酸化水素(100または500mM)、50mMリン酸緩衝液(pH6.5)中の総抽出物タンパク質2mgを含む別個の1mLの反応を25℃で行った。添加された抽出物タンパク質の非存在下で過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を決定するために、総抽出物タンパク質溶液の代わりに50mMリン酸緩衝液(pH6.5)を用いることによってコントロール反応を行った。反応混合物中の過酢酸の濃度(表24)を、実施例2で説明したKarst等の方法に従って決定した。
B.ズブチリスBE1010のペルヒドロラーゼによるアセチル化糖の過加水分解
B.ズブチリスBE1010のペルヒドロラーゼを発現するE.コリKLP18/pSW189形質転換体の細胞抽出物を実施例21で説明した手順に従って調製した。0.1Mのアセチル化糖(β−D−リボフラノース−1,2,3,5−テトラアセテート、トリ−O−アセチル−D−ガラクタール、またはトリ−O−アセチル−D−グルカール(アルドリッチ))、過酸化水素(100、または500mM)、50mMリン酸緩衝液(pH6.5)中の総抽出物タンパク質2mgを含む別個の1mLの反応を25℃で行った。添加された抽出物タンパク質の非存在下で過酸化水素によるトリアセチンの化学的な過加水分解によって生産された過酢酸の濃度を決定するために、総抽出物タンパク質溶液の代わりに50mMリン酸緩衝液(pH6.5)を用いることによってコントロール反応を行った。反応混合物中の過酢酸の濃度(表25)を、実施例2で説明したKarst等の方法に従って決定した。
Claims (16)
- カルボン酸エステルからペルオキシカルボン酸を生産する方法であって、該方法は:
a)一式の反応成分を備えること、該成分は、以下を含む:
1)以下からなる群より選択される基質:
i)以下の構造を有するエステル:
ヒドロキシルまたはC1〜C4アルコキシ基で置換される)であり、R2は、C1〜C10の直鎖または分岐鎖のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、(CH2CH2−O)nH、または(CH2CH(CH3)−O)nHであり、
そしてnは、1〜10である];および
ii)以下の構造を有するグリセリド:
ヒドロキシルまたはC1〜C4アルコキシ基で置換される)であり、R3およびR4はそれぞれ、HまたはR1C(O)である];および
iii)アセチル化単糖、アセチル化二糖およびアセチル化多糖からなる群より選択され
るアセチル化糖;
2)過酸素源;および
3)過加水分解活性を有する酵素触媒、該酵素触媒は、配列番号2、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16および配列番号32からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、CLUSTALWを用いて参照配列の配列番号2にアラインする以下のシグネチャーモチーフを含む酵素を含む:
i)配列番号2に記載のアミノ酸の位置118〜120におけるRGQモチーフ;
ii)配列番号2に記載のアミノ酸の位置179〜183におけるGXSQGモチーフ;および
iii)配列番号2に記載のアミノ酸の位置298〜299におけるHEモチーフ;ならびに
b)該反応成分を適切な水性反応条件下で組合わせることによって、ペルオキシカルボン酸を生産させること、
を含む、上記方法。 - 酵素的に生産されたペルオキシカルボン酸組成物を用いて硬表面または無生物を消毒する方法であって、該方法は、以下:
a)一式の反応成分を備えること、該成分は、以下を含む:
1)以下からなる群より選択される基質:
i)以下の構造を有するエステル:
ヒドロキシルまたはC1〜C4アルコキシ基で置換される)であり、R2は、C1〜C10の直鎖または分岐鎖のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、(CH2CH2−O)nH、または(CH2CH(CH3)−O)nHであり、およびnは、1〜10である];および
ii)以下の構造を有するグリセリド:
ヒドロキシルまたはC1〜C4アルコキシ基で置換される)であり、R3およびR4はそれぞれ、HまたはR1C(O)であり;
iii)アセチル化単糖、アセチル化二糖、およびアセチル化多糖からなる群より選択さ
れるアセチル化糖];
2)過酸素源;および
3)過加水分解活性を有する酵素触媒、該酵素触媒は、配列番号2、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16および配列番号32からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、CLUSTALWを用いて参照配列の配列番号2にアラインする以下のシグネチャーモチーフを含む酵素を含む:
i)配列番号2に記載のアミノ酸の位置118〜120におけるRGQモチーフ;
ii)配列番号2に記載のアミノ酸の位置179〜183におけるGXSQGモチーフ;
および
iii)配列番号2に記載のアミノ酸の位置298〜299におけるHEモチーフ;
b)該反応成分を適切な水性反応条件下で組合わせることによって、ペルオキシカルボン酸生産物を生成させること;
c)場合により、該ペルオキシカルボン酸生成物を希釈すること;ならびに
d)前記硬表面または無生物を、工程b)または工程c)で生産されたペルオキシカルボン酸と接触させ、それにより、前記表面または前記無生物を消毒すること、
を含む、上記方法。 - 酵素が、配列番号2、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、および配列番号32からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、または前記アミノ酸配列に1または数個のアミノ酸を置換、欠失または付加することによって誘導されたペルヒドロラーゼ活性を有する実質的に類似した酵素である、請求項1または2に記載の方法。
- アセチル化糖が、グルコースペンタアセテート、キシローステトラアセテート、アセチル化キシラン、β−D−リボフラノース−1,2,3,5−テトラアセテート、トリ−O−アセチル−D−ガラクタール、およびトリ−O−アセチル−グルカールからなる群より選択される、請求項1または2に記載の方法。
- 生産されたペルオキシカルボン酸が、過酢酸、過プロピオン酸、過酪酸、過乳酸、過グリコール酸、過メトキシ酢酸、過β−ヒドロキシ酪酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項1または2に記載の方法。
- 硬表面または無生物が、タンク、コンベヤー、床、ドレーン、パイプ、クーラー、冷凍庫、器具の表面、壁、バルブ、ベルト、ジョイント、窓、水処理施設、プール、温泉場、発酵タンク、薬剤または生物薬剤の製造装置、薬剤または生物薬剤成分、薬剤または生物薬剤の添加剤、衣類、医療器具、歯科用器具、外科用器具、内視鏡、腹腔鏡、洗浄具、靴、料理用の表面、調理用の表面、浴室の表面、トイレ、家畜、ウシ、乳牛、ヤギ、ウマ、ブタ、牛肉、家禽、豚肉、野菜、果物、海産食物、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項2に記載の方法。
- グリセリド基質が、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、モノプロピオニン、ジプロピオニン、トリプロピオニン、モノブチリン、ジブチリン、トリブチリン、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項1または2に記載の方法。
- 酵素触媒が、微生物細胞、透過性微生物細胞、微生物細胞抽出物、部分精製酵素、および精製した酵素からなる群より選択される形態である、請求項1または2に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法によって生産された消毒剤または漂白組成物。
- ペルオキシカルボン酸を生成させる系であって、該系は、以下を含む:
a)以下からなる群より選択される基質:
1)以下の構造を有するエステル:
ヒドロキシルまたはC1〜C4アルコキシ基で置換される)であり、R2は、C1〜C10の直鎖または分岐鎖のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、(CH2CH2−O)nH、または(CH2CH(CH3)−O)nHであり、
そしてnは、1〜10である];および
2)以下の構造を有するグリセリド:
ヒドロキシルまたはC1〜C4アルコキシ基で置換される)であり、R3およびR4はそれぞれ、HまたはR1C(O)である];および
3)アセチル化単糖、アセチル化二糖、およびアセチル化多糖からなる群より選択されるアセチル化糖;および
b)過酸素源;および
c)過加水分解活性を有する酵素触媒(該酵素触媒は、配列番号2、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16および配列番号32からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、CLUSTALWを用いて参照配列の配列番号2にアラインする以下のシグネチャーモチーフを含む酵素を含む:
i)配列番号2に記載のアミノ酸の位置118〜120におけるRGQモチーフ;
ii)配列番号2に記載のアミノ酸の位置179〜183におけるGXSQGモチーフ;および
iii)配列番号2に記載のアミノ酸の位置298〜299におけるHEモチーフ)。 - 反応成分のセットを水性反応条件下で組合わせると、過カルボン酸がその場生成する、請求項10に記載のペルオキシカルボン酸を生成させる系。
- 反応成分が、1つまたはそれ以上のキレート剤、1つまたはそれ以上の湿潤剤、1つまたはそれ以上の腐食抑制剤、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される1つまたはそれ以上の成分をさらに含む、請求項11に記載のペルオキシカルボン酸を生成させる系。
- 以下を含む製剤:
a)過加水分解活性を有する酵素触媒(酵素触媒は、配列番号2、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16および配列番号32からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、CLUSTALWを用いて参照配列の配列番号2にアラインする以下のi)〜iii)のシグネチャーモチーフを含む酵素を含む:i)配列番号2に記載のアミノ酸の位置118〜120におけるRGQモチーフ;ii)配列番号2に記載のアミノ酸の位置179〜183におけるGXSQGモチーフ;およびiii)配列番号2に記載のアミノ酸の位置298〜299におけるHEモチーフ)、およびモノアセチン、ジアセチン、トリアセチンおよびそれらの混合物からなる群より選択されるカルボン酸エステルを含む第一の混合物;該第一の混合物は、場合により、無機または有機緩衝液、腐食抑制剤、浸潤剤およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるさらなる成分を含む;ならびに
b)過酸素源および水を含む第二の混合物(該第二の混合物は、場合により、キレート剤をさらに含む)。 - 以下を含む製剤:
a)過加水分解活性を有する酵素触媒(配列番号2、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16および配列番号32からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、CLUSTALWを用いて参照配列の配列番号2にアラインする以下のi)〜iii)のシグネチャーモチーフを含む酵素を含む:i)配列番号2に記載のアミノ酸の位置118〜120におけるRGQモチーフ;ii)配列番号2に記載のアミノ酸の位置179〜183におけるGXSQGモチーフ;およびiii)配列番号2に記載のアミノ酸の位置298〜299におけるHEモチーフ)、およびアセチル化単糖、アセチル化二糖、アセチル化多糖およびそれらの組合わせからなる群より選択されるアセチル化糖を含む第一の混合物(該第一の混合物は、場合により、無機または有機緩衝液、腐食抑制剤および浸潤剤をさらに含む);ならびに
b)過酸素源および水を含む第二の混合物(該第二の混合物は、場合により、キレート剤を含む)。 - 請求項13または14に記載の第一の混合物および第二の混合物とを組合わせ、それによりペルオキシカルボン酸を生産させることによって生成された消毒製剤。
- katEにおける破壊とkatGにおける破壊とを含む組換えエシェリキア・コリ細胞該組換えエシェリキア・コリ細胞は、エシェリキア・コリUM2ではなく、かつ、少なくとも1つのペルヒドロラーゼ活性を有する酵素をさらに含み、該酵素は、配列番号2、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16および配列番号32からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、CLUSTALWを用いて参照配列の配列番号2にアラインする以下:i)配列番号2に記載のアミノ酸の位置118〜120におけるRGQモチーフ;ii)配列番号2に記載のアミノ酸の位置179〜183におけるGXSQGモチーフ;およびiii)配列番号2に記載のアミノ酸の位置298〜299におけるHEモチーフのシグネチャーモチーフを含む、細胞。
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