CN101970023A - 三维的丝羟基磷灰石组合物 - Google Patents
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Abstract
本文记载了方法和组合物,所述组合物包含丝聚合物和羟基磷灰石的混合物。本文所述的方法可用于制备丝聚合物与羟基磷灰石的混合物,并还提供了可成形为所希望形状的混合物。本文还包括具有所希望形状的、包含丝聚合物与羟基磷灰石混合物的组合物,所述组合物可进一步植入例如以促进骨愈合或牙齿结构或支撑。所述组合物还可包含试剂(例如治疗剂)或细胞。
Description
相关申请的交叉引用
本申请根据35USC.§119(e)要求于2008年2月7日提交的美国临时申请号61/026,896和于2008年8月1日提交的美国临时申请号61/085,569的优先权,将其内容整体引入本文作为参考。
政府支持
本发明是在由美国国家卫生研究院授予的资助金号ED002520和EB003210的政府支持下作出的。政府在本发明中拥有一定的权利。
技术领域
本发明涉及丝素蛋白(silk fibroin)和羟基磷灰石的混合物。本发明还涉及骨和牙齿的修复以及置换。
背景技术
组织修复和再生的主要目标是体外开发用于生产可植入结构的生物替代品,所述可植入结构在缺损区域内起到支撑的作用并加速体内的再生性生长。
近年来,生物可降解聚合物如聚(乙醇酸)、聚(L-乳酸)(PLLA)以及它们的共聚物聚(L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)已经在组织形成的研究中用作支架材料(Sofia等人,Journal of Biomedical Materials Research 2001,54,139-148)。这些聚合物的优点包括其生物相容性和可降解性。然而,由于在水解期间产生酸性降解产物,PLGA可诱发炎症(Sofia等人,Journal of Biomedical Materials Research 2001,54,139-148)。使用可造成水解速率和组织响应分布不一致的聚酯还存在加工难度。因此,需要具有更可控的特征(例如水解速率、结构和机械强度)且同时具有生物可再吸收性和生物相容性的聚合物材料。生物聚合物材料经常显示出不能被合成聚合物材料再现的性质的组合(Perez-Rigueiro等人,Science,1998,70:2439-2447;Hutmacher D.,Biomaterials 2000,21,2529-2543)。骨组织是一个实例;用于骨组织再生的支架需要高的机械强度和孔隙度,同时需要生物可降解性和生物相容性。
若干研究表明,骨髓干细胞(BMSC)能够沿着成骨细胞系分化,并形成三维的骨样组织(Holy等人,J.Biomed.Mater.Res.(2003)65A:447-453;Karp等人,J.Craniofacial Surgery 14(3):317-323)。然而,其存在着重大的局限性。一些磷酸钙支架显示出有限的降解能力(Ohgushi等人,1992,在CRC Handbook of Bioactive Ceramics.中,T.Yamamuro,L.L.Hench以及J.Wilson,编者Boca Raton,FL:CRC Press.235-238),或是降解作用过于迅速(Petite等人,2000,Nat.Biotechnol.18:959-963)。难于将机械性能进行匹配以支持合乎需要的功能也仍旧是一个问题(Harris等人,J.Biomed.Mater.Res.42:396-402)。
研究还表明,BMSC能够沿着成软骨细胞系分化,并在生物材料基板(例如聚(乳酸-共-乙醇酸)或聚L-乳酸上形成三维的软骨样组织(Caterson等人,2001,J.Biomed.Mater.Res.57:94-403;Martin等人,2001,J.Biomed.Mater.Res.55:29-235)。然而,这些用于软骨形成的支架的应用显现出与其在骨工程学的应用中所观察到的相同局限性。
需要新的生物相容性聚合物,特别是适用于支架形成的聚合物,所述支架用于机械上坚固的应用,例如骨或软骨。
发明内容
对于牙科学和医学中新生物材料的寻找已经扩展至天然材料,例如蛋白聚合物。蚕丝(例如从家蚕(Bombyx mori)进行处理的蚕丝)是一种用于牙科学应用和医学应用的候选方案,其范围从修复材料到组织工程学支架。
本文记载了方法和组合物,所述组合物包含丝聚合物和羟基磷灰石的混合物。本文所述的方法可用于制备丝聚合物与羟基磷灰石的混合物,并还提供了可成形为所希望形状的混合物。本文所述的方法和组合物允许可植入结构的形成,所述可植入结构可被植入例如以促进骨愈合或牙齿结构或支撑。
在本文所述的一方面中,本发明者开发了一种包含丝聚合物和羟基磷灰石颗粒的混合物的制品,其中,丝在羟基磷灰石颗粒周围形成不可溶状态。在这一方面以及本文所述的全部其他方面中,在形成所述丝的不可溶状态之前,通过将丝聚合物和羟基磷灰石颗粒混合可形成一种制品。
在这一方面和本文所述的全部其他方面的一个实施方案中,丝聚合物和羟基磷灰石颗粒混合在一起,从而形成基本上均匀的混合物。
在这一方面和本文所述的全部其他方面的另一个实施方案中,丝聚合物和羟基磷灰石颗粒的混合物可在具有所希望形状/尺寸的器具中进行固化,从而使得所得到的制品基本上保持其形成时所在器具的形状。
在这一方面和本文所述的全部其他方面的在另一个实施方案中,丝聚合物和羟基磷灰石颗粒的混合物可在组成方面由本领域技术人员自行进行变化,从而使得所述制品包含0.1-90wt%的羟基磷灰石(0.1-90wt%羟基磷灰石范围内的全部组成)。
在本文所述的这一方面和全部其他方面的其他实施方案中,用丝聚合物与羟基磷灰石的混合物制成的制品还包含生物活性剂。作为替代或除此以外,所述制品可还包含生丝纤维。
本文所公开的本发明的另一方面为可植入结构的生产,所述可植入结构包含丝聚合物和羟基磷灰石颗粒的混合物,其中,所述丝聚合物基本上包围所述羟基磷灰石颗粒。在一个实施方案中,所述可植入结构由基本上均匀的、丝聚合物和羟基磷灰石颗粒的混合物形成。
在本文所述的这一方面和全部其他方面的另一个实施方案中,丝聚合物和羟基磷灰石颗粒的混合物可在具有所希望形状/尺寸的器具中进行固化,从而使得所得到的结构基本上保持其形成时所在器具的形状。
在本文所述的这一方面和全部其他方面的另一个实施方案中,丝和羟基磷灰石的结构提供了在植入后被生物再吸收的临时支架,或者所述结构在植入后整合入骨之中。
本文所述的另一方面为制造可植入结构的方法,所述方法包括将丝聚合物溶液与羟基磷灰石颗粒混合以及诱导所述丝聚合物形成不可溶状态,从而使得所述丝聚合物在所述羟基磷灰石颗粒周围形成不可溶状态。
本文还公开了用于生产可植入结构的试剂盒,所述试剂盒或体系包含(a)冻干的丝聚合物或丝聚合物和(b)羟基磷灰石颗粒、(c)它们用的包装材料。在一个实施方案中,所述试剂盒或体系还包含溶剂,例如HFIP。在另一个实施方案中,所述体系还包含用于使所述丝聚合物形成不可溶状态的器具。
本文还描述了在个体体内对骨进行修复或强化的方法,所述方法包括以下步骤:(a)将丝聚合物溶液与羟基磷灰石颗粒混合,以形成糊状组合物;(b)将所述糊状组合物施用于个体体内需要对骨进行修复或强化的区域,所述个体患有骨损伤或骨缺损;以及(c)使所述丝聚合物在所施用的糊状组合物中形成不可溶状态;其中,包含不可溶状态丝聚合物的所施用组合物提供用于被骨组织置换的支架。
定义
本文所使用的术语“丝聚合物”或“丝素蛋白”包括蚕丝心蛋白以及昆虫或蜘蛛的丝蛋白(Lucas等人,Adv.Protein Chem 13:107-242(1958))。丝心蛋白优选从含有溶解的蚕丝或蜘蛛丝的溶液中获得。通常,对丝素蛋白的丝聚合物进行处理以基本上除去丝胶。例如从家蚕获得蚕丝蛋白,例如从棒络新妇蛛(Nephila clavipes)获得蜘蛛丝。或者,适用于本发明中的丝蛋白可从含有基因工程学丝的溶液获得,例如从细菌、酵母、哺乳动物细胞、转基因动物或转基因植物获得。举例来说,参见WO97/08315和美国专利5,245,012。本文所使用的术语“生丝”或“生丝纤维”是指尚未进行处理以除去丝胶的丝纤维,并因而涵盖了例如直接取自茧的丝纤维。
当用于有关丝聚合物的情况时,本文所使用的术语“不可溶状态”是指形成或处于基本上无定形状态,主要是β-片层构象。术语“形成不可溶状态”并不意味着反映出丝单体聚合为丝聚合物。相反,其意味着反映出可溶性丝聚合物转化为水不溶的状态。如果本文所使用的丝聚合物可通过离心作用制成小粒,或者如果其在37℃以下通过浸入水中或用水冲洗不能溶解,则其处于“不可溶状态”。
本文所使用的术语“在所述羟基磷灰石颗粒周围”是指形成丝聚合物和羟基磷灰石颗粒的基本上均匀的混合物,从而使得所述丝的固化或形成不可溶状态在相同的器具中基本上作为一个单元发生。因此,所述术语“在所述羟基磷灰石颗粒周围”排除了例如羟基磷灰石颗粒二次沉积至预形成的不可溶丝聚合物上的情形。术语“基本上均匀的”是指所述丝聚合物和羟基磷灰石颗粒结合在一起以形成例如糊状物,其中所述丝和羟基磷灰石作为混合物完全相互分散。
本文所使用的术语“经生物再吸收的”或“生物再吸收”是指内源性组织或细胞渗入植入结构,使得所述可植入结构与组织进行整合,其中所述植入结构的一种或多种组分被新的组织置换。
本文所使用的术语“包括”或“包含”用于表示本发明必需的组合物、方法及其各自的组成部分,其仍然为开放式的术语,包括未指定的元素,无论该元素是否必需。
本文所使用的术语“主要由......组成”描述了其他元素的并入,所述其他元素可包含于所述组合物、方法或其各自组成部分的说明中,并且限于那些不会实质上对本发明的基础和新特征造成影响的元素。
术语“由...组成”是指,本文所述的发明、组合物、方法及其各自的组成部分意在排除任何对于所述组分、组合物或方法而言,不视为必要元素的元素。
附图说明
图1显示了提取出丝胶前后的蚕茧。
图2显示了用于本文所述的丝制备方法的透析技术。图左侧显示了透析卡(dialysis cassette)中的丝溶液,图右侧显示了透析卡在低渗溶液中的透析作用。
图3显示了在冻干作用后经冷冻干燥的丝的代表性实例。
图4显示了充满丝溶液的器具的实例,还显示了接下来将丝溶液浸在甲醇中以除去HFIP并使得丝固化或形成不可溶状态。
图5显示了本文所使用的产生丝聚合物的一个实施方案的示意性描述,并显示了示例性描述用该方法制得的丝块的照片。
图6显示了示例性的30%羟基磷灰石-丝混合物,并显示了将混合物包装入示例性器具的步骤。
图7显示了具有各种形状以及尺寸的丝聚合物结构的一些实施方案的照片。
图8描述了生产丝纤维的示例性的方法,所述方法包括以下步骤:(a)将丝缠绕在托架(bracket)上;(b)提取丝胶;(c)将丝切断;以及(d)将丝进行干燥。
图9显示了示例性的丝聚合物块,所述丝聚合物块在未溶解的丝纤维存在下在圆柱形器具中形成。
图10为显示数种示例性的未矿化的丝样品和矿化的丝样品的压缩模量的图。
表1显示了未矿化的丝聚合物、矿化的丝生物聚合物以及市售的牙科用复合树脂修复材料的压缩模量值。
表2显示了复合物和矿化的丝聚合物与牙质粘接的剪切粘接强度。
具体实施方式
丝聚合物的分离
丝是一种被充分记载的由蚕、家蚕生产的天然纤维,其传统上已经以线的形式在纺织品中使用了数千年。这种丝含有:被称为丝心蛋白的纤维状蛋白(同时含有重链和轻链),其形成线的核心;以及被称为丝胶的胶样蛋白,其包围所述丝心蛋白纤维以将其粘合在一起。丝心蛋白是高度不溶的蛋白,其含有高达90%的氨基酸(甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸),从而使得在纤维中形成β-片层(Asakura等人,Encyclopedia of Agricultural Science,Arntzen,C.J.,Ritter,E.M.著;Academic Press:New York,NY,1994;Vol.4,pp 1-11)。
由于具有可观的机械性能、生物相容性和生物可降解性,丝为生物材料和组织工程学提供了一组重要的可选材料(Altman,G.H.等人,Biomaterials 2003,24,401-416;Cappello,J.等人,J.Control.Release 1998,53,105-117;Foo,C.W.P.等人,Adv.Drug Deliver.Rev.2002,54,1131-1143;Dinerman,A.A.等人,J.Control.Release 2002,82,277-287;Megeed,Z.等人,Adv.Drug Deliver.Rev.2002,54,1075-1091;Petrini,P.等人,J.Mater.Sci-Mater.M.2001,12,849-853;Altman,G.H.等人,Biomaterials 2002,23,4131-4141;Panilaitis,B.等人,Biomaterials 2003,24,3079-3085)。再加工的丝(例如丝心蛋白)的独特机械性能及其生物相容性,使得丝纤维在生物技术材料和医学应用中的用途格外引人注意。举例来说,已经有记载将三维的多孔丝支架用于组织工程学(Meinel等人,Ann.Biomed.Eng.2004Jan;32(1):112-22;Nazarov,R.等人,Biomacromolecules(2004),5,718-726)。此外,已经探索将再生的丝素蛋白薄膜作为氧渗透膜和药物渗透膜、酶固定用的支持物以及细胞培养用的底物(Minoura,N.等人,Polymer 1990,31,265-269;Chen,J.等人,Minoura,N.,Tanioka,A.1994,35,2853-2856;Tsukada,M.等人,Polym.Sci.Part B Polym.Physics 1994,32,961-968)。此外,丝水凝胶已经在组织工程学以及药物输送中发现了许多应用(Megeed等人,Pharm.Res.2002 Jul;19(7):954-9;Dinerman等人,J.Control.Release.2002 Aug 21;82(2-3):277-87)。
本文记载了用于制备可植入结构的方法和组合物,所述组合物包含丝和羟基磷灰石。在这些结构中,丝聚合物在羟基磷灰石颗粒周围形成不可溶状态。所述结构用作植入物,从而支撑骨修复或牙齿修复,或例如向植入部位输送一种或多种生物活性剂。本文所述的用于实施本发明的方法、材料和考虑的事项在下文中进行描述。要进行浓缩的丝素蛋白溶液可通过本领域技术人员已知的任何方法制备。
实施例中记载了一种使用下述步骤的方法:通过将蚕茧在Na2CO3中煮沸提取丝胶;然后在溴化锂(LiBr)中溶解;冻干;重新溶解于有机溶剂六氟异丙醇(HFIP);然后将其加入用于形成制品的器具。
或者,其有利之处在于可避免使用有机溶剂。当经处理的材料在体外或体内暴露于细胞时,这类溶剂可造成生物相容性问题。此外,在希望在将被植入的结构中包含生物活性剂(例如生长因子或其他生物活性分子)的情况下,其有利之处在于可使用全水性方法以保持所述生物活性剂的活性。
有机溶剂也可改变丝心蛋白材料的性质。举例来说,将丝素蛋白薄膜浸入有机溶剂(例如甲醇)导致水合物或溶胀结构的脱水,造成晶化并因而损失了水中的溶解度。此外,就组织工程学支架而言,有机溶剂的使用会使得丝材料更不可降解。
举例来说,制备用于制备矿化丝制品的丝的全水性方法记载于US20070187862中,将其引入本文作为参考。
矿物质
用于本文所述方法的矿物质可包含人们希望使用的任何生物相容性矿物质。优选的矿物质为羟基磷灰石,就其与骨的兼容性而言,羟基磷灰石具有公知的特性。不同尺寸的羟基磷灰石颗粒可用于合成可植入结构,并且可从商业来源获得纳米晶体、粉末、颗粒和块,例如Berkeley Advanced Biomaterials(Berkeley,CA)。羟基磷灰石颗粒的尺寸可按照丝的不溶化作用,依据材料的性质进行大范围的变化。羟基磷灰石的颗粒可为例如纳米颗粒;或者可非常大,例如500μm以及达到毫米尺寸。所用颗粒的尺寸会改变制品的性能,例如压缩模量、剪切粘接强度和孔隙度。本文预期了使用各种羟基磷灰石颗粒尺寸的方法。
丝聚合物和羟基磷灰石颗粒的组合
本文描述了与生产包含丝聚合物和羟基磷灰石颗粒的混合物的制品或可植入结构有关的方法。如上文所述,将所述丝聚合物进行分离和处理。将丝聚合物和羟基磷灰石颗粒混合为基本上均匀的混合物(例如糊状物),并在存在羟基磷灰石颗粒且优选包围羟基磷灰石颗粒的情况下,使得丝聚合物形成不可溶状态。形成均匀混合物不包括羟基磷灰石颗粒的溶解,而是所述颗粒与已溶解的丝相互混合,从而产生糊状物质。所产生的不可溶结构可作为可植入结构使用。
羟基磷灰石颗粒的量可从0.1wt%羟基磷灰石至90wt%的羟基磷灰石进行变化。优选地,羟基磷灰石颗粒为至少1wt%、至少2wt%、至少5wt%、至少10wt%、至少20wt%、至少30wt%、至少40wt%、至少50wt%、至少60wt%、至少70wt%、至少80wt%、达到且包括至少90wt%,或该范围内羟基磷灰石的任意百分比。举例来说,羟基磷灰石颗粒可在下述范围内:0.1%-90%、0.1%-80%、0.1%-70%、0.1%-60%、0.1%-50%、0.1%-40%、0.1%-30%、0.1%-20%、0.1%-10%、0.1%-5%、0.1%-1%、90%-80%、90%-70%、90%-60%、90%-50%、90%-40%、90%-30%、90%-20%、90%-10%、90%-5%、90%-2%、90%-1%、90%-0.1%、10%-50%、15%-45%、20%-40%、30%-70%、30%-60%、30%-50%、30%-40%、10%-30%、15%-30%或20%-30%。
丝形成不可溶状态
通常,再生的丝素蛋白可溶于水,需要浸入醇或其他适合的试剂以得到不可溶且无定形的组合物,所述组合物主要包含作为β-片层结构的丝聚合物(Sofia等人,Journal of Biomedical Materials Research 2001,54,139-148)。因此,在浸入水溶液之前,首先将丝结构浸在β-片层结构诱导剂(例如醇)中,以诱导向β-片层结构的相变。可对β-片层结构诱导剂的种类进行选择,以产生具有不同性质的结构。举例来说,当用甲醇和丙醇诱导β-片层结构时,所产生的结构更结实但更脆,因此适用于骨的再生。本文预期了丝不溶化作用(包括不依赖有机溶剂或醇的不溶化作用)的各种方法,并且基于本文所述的制品或结构需要的特性,来调节所述方法。US 20070187862记载了从溶解的丝素蛋白制备不可溶丝结构的全水性方法。
器具
本文所述的丝聚合物可在任意器具中形成不可溶状态,只要能将丝从所述器具中移出。器具为可将所述丝混合物倒入或装入的包含空腔的任意容器,所述空腔具有在丝形成不可溶状态后所希望结构的形状。因此,在去除所述器具后,丝-羟基磷灰石结构基本上保持器具空腔的形状。器具的体积可大于所希望结构的体积,这是因为例如丝形成不可溶状态时会伴有丝-羟基磷灰石混合物的收缩。此外,丝混合物可在其周围形成不可溶状态的器具也在本文预期内,从而使得已固化的丝保持器具外表面的形状。
器具可由例如塑料、玻璃、陶瓷或金属构成。在某些实施方案中,其有利之处在于利用柔性器具,以允许在所产生的制品未结构破坏下移出丝聚合物。用于本文所述方法的器具可由本领域技术人员在宽范围内自行改变。此外,可容易地改变器具的选择以适应特定的需要。
应当理解的是,作为选择或除此以外,本文所述的可植入结构可从块或其他结构进行碾磨,以产生最终的可植入结构。因此,本领域技术人员可使用在器具内形成所希望的形状,或是可碾磨或切割成给定的形状,以产生所希望的形状。
可植入结构
“可植入结构”通常为植入后在宿主生物体体内不产生免疫应答的任意结构。因此,举例来说,可植入结构不应为刺激物或含有刺激物或含有LPS等。此外,在某些情况下,可植入结构优选应允许或不阻止细胞渗入、血管生长或者会抑制所述结构被生物再吸收或整合进入组织的其他性能。对于这类情况,举例来说,重要的是所述结构并非简单的固体三维形式,而是包含或逐渐形成一些孔隙度,使得细胞等能够在再吸收过程中进入(也就是说,除非希望没有生物再吸收作用)。虽然通常优选可植入结构不增加或引起免疫应答(例如,针对植入物组分的炎症或抗体增加),但在某些情况下有利的是所述结构诱导免疫应答(例如,生成针对特定抗原的抗体)或防止整合进入组织。这些方面也在本文所述方法的预期之内。
可植入结构能够应用于多种用途,然而,如本文所述,优选将可植入结构植入用于骨结构或牙齿结构的修复或支撑。可植入丝结构可以用于例如:为牙齿、断骨、脆弱的骨提供临时支架;或加速骨折、骨裂、钙化作用损失等的治愈。作为修复或支撑组织的主要用途或次要用途,本文所述的结构或制品也可用于输送生物活性剂。可用于这些实施方案的生物活性剂在下文进行描述。
通常,组织再生生长期的长度将取决于被植入丝结构的特定组织。所述生长期可延续至新的组织达到所希望的性能,例如直至再生的组织已经达到特定的厚度、尺寸、强度、蛋白组分的组成和/或特定的细胞密度。评价这些参数的方法是本领域技术人员已知的。可植入结构应以不超过组织生长期的速率进行再吸收。因此,直至***组织发生足够的渗入(通过本领域已知的方法检测),所述结构都应基本上保持完整,并且可植入结构不再是组织强度或结构(例如骨密度)所必需的。在原位(例如通过促进所希望的生物过程)或者例如通过在植入后浸出所述结构,这类试剂可提供预防性或治疗性的有益效果。
生物活性剂
在一个优选的实施方案中,将添加剂(例如药物/治疗剂、或生物活性剂)并入丝-羟基磷灰石混合物。举例来说,在形成可植入结构期间,可将生长因子、药物或生物组分并入所述混合物。
可与本文所述方法共同使用的不同药物/治疗剂的种类广泛,包括小分子、蛋白、抗体、肽和核酸,但不限于此。通常,可通过本发明给予的生物活性剂包括但不限于:抗感染剂,例如抗菌剂和抗病毒剂;化疗剂(即抗癌剂);抗排异剂;止痛剂和止痛剂组合;消炎剂;激素,例如类固醇;生长因子(骨形态发生蛋白(即BMP 1-7)、骨形态发生样蛋白(即GFD-5、GFD-7和GFD-8)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(即FGF 1-9)、血小板源生长因子(PDGF)、***(IGF-I和IGF-II)、转化生长因子(TGF-β-III)、血管内皮生长因子(VEGF));抗血管生成蛋白,例如内皮他丁(endostatin);以及其他天然来源的或基因工程学的蛋白、多糖、糖蛋白或脂蛋白。对于例如骨生长而言重要的生长因子记载于“The Cellular and Molecular Basis of Bone Formation and Repair”(Vicki Rosen和R.Scott Thies著,R.G.Landes公司出版),本文将其引入作为参考。另外,本文所述的混合物可用于输送任意种类的分子化合物,例如药理学材料、维生素、镇静剂、类固醇、安眠剂、抗生素、化疗剂、***素和放射性药物。本文所述的丝羟基磷灰石结构适合于输送上述材料以及其他材料,包括但不限于:蛋白、肽、核苷酸、碳水化合物、单糖、细胞、基因、抗血栓剂、抗代谢剂、生长因子抑制剂、生长促进剂、抗凝剂、抗有丝***剂、纤溶剂、抗炎类固醇和单克隆抗体。
尽管在一些方面制品本身可被认为作为输送生物活性剂的载体,但是本文所述制品的生物活性剂/治疗剂/药物可通过与药学上可接受的载体混合而进行配制。可使用不溶解或不影响已固化的丝/羟基磷灰石结构的任何药物载体。生物活性剂或治疗剂能够以液体、充分磨碎的固体或任何其他适当的物理形式加到丝-羟基磷灰石混合物中。或者,可通过将所述结构浸在包含生物活性剂的溶液中,向预形成的本文所述丝-羟基磷灰石结构中加入生物活性剂。也就是说,当丝-羟基磷灰石结构形成时,并非必须存在生物活性剂。
适用于本文所述方法的其他生物活性剂的实例包括但不限于:已知影响细胞附着的细胞附着介体或其变体,例如胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖或含有已知的整联蛋白结合区域(例如“RGD”整联蛋白结合序列)的肽(Schaffner P & Dard,2003,Cell Mol.Life Sci.Jan,60(1):119-32;Hersel U.等人,2003,Biomaterials Nov,24(24):4385-415);生物活性配体;以及增强或排除特定种类的细胞或组织向内生长的物质。这类添加剂在组织工程学应用方面特别有用,例如对结构进行体外设计以包含细胞,所述细胞将有益特性给予将要植入的结构。举例来说,三维的丝-羟基磷灰石支架基质的细胞成群(celluar population)的步骤优选在生长因子的存在下进行,所述生长因子对于促进用于在基质上成群的培养细胞增殖是有效的。促进增殖的试剂将取决于所用的细胞种类。举例来说,当使用成纤维细胞时,此处使用的生长因子可为成纤维细胞生长因子(FGF),最优选碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(人重组bFGF,UPSTATE Biotechnology,Inc.)。增强增殖或分化的添加剂的其他实例包括但不限于:骨诱导性物质,例如骨形态发生蛋白(BMP);细胞因子;生长因子,例如表皮生长因子(EGF)、血小板源生长因子(PDGF)、***(IGF-I和IGF-II)和TGF-α等。当然,这类添加剂可用于激发宿主细胞以渗入和/或置换体内植入结构的情形。
可植入结构可用于向细胞和组织输送治疗剂。在本文所述的结构中掺入例如药剂、生长因子和其他生物调节剂、酶或可能的话甚至是细胞的能力保证了这些组分长期释放的稳定性以及对于活性和释放更好的控制。
所述混合物中也可包含其他必要的试剂或表明用于辅助生物活性剂的稳定性或活性的其他试剂,从而将混合物用以产生含有本文所述生物活性剂的矿化的丝结构。因此,可根据需要加入必要的缓冲液、盐或辅因子。
压缩结构和压缩模量试验
本领域技术人员已知并且有能力进行压缩模量试验。举例来说,可以利用3366试验仪,使用10kN的负载传感器进行压缩模量试验。在通常适用于对本文所制备的结构进行试验的方法中,在试验前1天,将样品在0.9%NaCl溶液中浸泡。试验参数的改变根据ASTM标准ASTM D695:用于硬质塑料压缩性质的标准试验方法(卷03.01,444-476,2006;以及08.01,78-85,2006),将其引入本文作为参考。可在负载下使用1mm/min的十字头伸长速率,并可以按200样品/min的采样速率记录位移。使用例如1.9材料试验软件,用区段模量的方法计算蚕丝材料的压缩模量,所述方法将最小二乘法拟合应用于两个负载边界之间所记录的数据点。使用在100N和300N、以及2500N和4500N的负载范围中记录的应力-应变数据,计算复合材料的压缩模量。这些负载范围被判断位于每种材料的负载变形曲线的直线部分之内。
剪切粘接强度测试
剪切粘接应力测试是测定在一定的剪切力下丝-羟基磷灰石结构保持与牙质粘合的强度。
首先,制备丝-羟基磷灰石结构用于测试,并与用类似方式制备的、具有已知剪切粘接强度的复合物进行对比。制备丝-羟基磷灰石结构的一种方法如下所述。在一个实施方案中,提取人牙并置于丙烯酸中。将牙齿进行修整以露出平的牙质表面,然后用240粒度的砂纸磨光润湿。以适当的尺寸制备圆柱形的矿化丝生物聚合物结构用于测试(例如约6.5mm的直径,约4-6mm的高度)。将丝的粘接表面用9.5%氢氟酸刻蚀,然后在适当的粘接压力水平(例如约500g±100g)下用树脂水泥(Variolink II,Ivoclar Vivadent)接合至牙质表面。作为对照,可制备具有类似尺寸的已粘接的复合物-树脂圆柱,并粘接至牙质,用于与丝-羟基磷灰石结构比较。可将复合物-树脂(4Seasons,Ivoclar Vivadent)装入塑料细管,以制造出均匀的复合物圆柱用于粘接(直径约5.8mm,高度约5mm)。用第五代单组分粘合剂(Excite,Ivoclar Vivadent)将树脂复合物圆柱粘接到牙质表面上,然后光固化20秒。将经粘接的样品在37℃的水中贮存24h。
可用Instron 4202以0.5mm/min的十字头速度得到剪切粘接强度。然后可将所产生的丝-羟基磷灰石结构的强度,与已知强度的复合物或不含羟基磷灰石的丝结构的强度进行对比。
体内结构形成
除植入预形成的结构外,本文还预期了所述结构可以糊状物的形式应用,然后在体内固化为不可溶状态。这种给予方法特别可用于为损伤的部位直接定制所述结构的形状和尺寸,并且通过例如骨修复容易地进行说明。通过将丝-羟基磷灰石混合物直接施用于发病或损伤区域(即缺损部位),然后混合物形成不可溶状态,可将部分骨有效地置换或强化。骨自身可开始修复,植入结构随时间降解,从而被个体自身的骨置换。因此,不需要除去丝结构的进一步过程。这种给予模式的主要优点在于,植入物形状可在要修复的部位成形,不需要在缺损部位之外进行设计和形成。
体内结构形成的基本步骤包括:使丝-羟基磷灰石形成混合物;将所述混合物置入需要修复的部位;然后所述混合物在修复部位形成不可溶状态(本文中也称为“固化”)。
为了使对修复部位周围的组织的损害最小化,有必要使用全水性方法形成丝糊状物。在一个实施方案中,含有羟基磷灰石颗粒的丝溶液(水溶液)在浓缩的凝胶或浆液中制备。该体系可被注入缺损部位,或成形至油灰状的稠度并置入缺损。由于丝通过β-片层的形成受到了稳定化作用,因此所述材料会在应用期间随时间硬化。发生β-片层的形成的原因在于:在注入或成形油灰期间施加的剪切应力;在伤口侧的局部脱水作用;或这两种效应的组合。
丝-羟基磷灰石糊状物固化为不可溶状态也可通过在置入体内以前将混合物预热然后冷却来实现。此外,可使用生理上中性的加速剂,例如甘油。在一个实施方案中,丝-羟基磷灰石混合物在置入缺损之前进行超声处理。
应当理解的是,前述详细说明以及下述实施例仅为说明性的,不应被理解为对本发明范围的限定。对于所公开实施方案的各种变化和改进对本领域技术人员而言将会是显而易见的,其并未脱离本发明的精神和范围。此外,出于记载和公开的目的,在此以引用的方式清楚地将本发明指明的所有专利、专利申请和出版物并入,例如,在这些出版物中描述的可用于本发明的方法学。提供这些出版物仅仅是因为它们的公开早于本申请的申请日。在这一点上,不应将任何事物视为本发明者无权根据在先发明或因任何其他原因使本发明的内容早于这些公开内容的认定。所有关于日期的陈述或关于此类文件内容的表达均基于申请人可得的信息,不构成对此类文件的日期或内容的正确性的任何认定。
本发明可在下列已编号的段落中的任一项中进行定义。
1.一种包含丝聚合物和羟基磷灰石颗粒的混合物的制品,其中,所述丝在所述羟基磷灰石颗粒周围形成不可溶状态。
2.一种包含丝聚合物和羟基磷灰石颗粒的混合物的制品,其中,所述丝在所述羟基磷灰石颗粒的存在下形成不可溶状态。
3.如段落1或2所述的制品,其中,所述丝聚合物和所述羟基磷灰石颗粒处于基本上均匀的混合物中。
4.如段落1、2或3所述的制品,其中,所述制品基本上保持其形成时所在器具的形状。
5.如段落1-4中任一段所述的制品,其中,所述制品包含0.1-90wt%的羟基磷灰石。
6.如前述段落中任一段所述的制品,所述制品还包含生物活性剂。
7.如前述段落中任一段所述的制品,所述制品还包含生丝纤维。
8.一种包含丝聚合物和羟基磷灰石颗粒的混合物的可植入结构,其中,所述丝聚合物基本上包围所述羟基磷灰石颗粒。
9.如段落8所述的结构,其中,所述丝聚合物和所述羟基磷灰石颗粒处于基本上均匀的混合物中。
10.如段落8或9所述的结构,其中,所述结构基本上保持其形成时所在器具的形状。
11.如段落8、9或10所述的可植入结构,所述结构在植入后被生物再吸收。
12.如段落8-11中任一段所述的可植入结构,所述结构在植入后被整合到骨之中。
13.一种用于制造可植入结构的方法,所述方法包括将丝聚合物溶液与羟基磷灰石颗粒混合以及诱导所述丝聚合物形成不可溶状态,从而使得所述丝聚合物在所述羟基磷灰石颗粒周围形成不可溶状态。
14.如段落13所述的方法,其中,所述丝聚合物和所述羟基磷灰石颗粒处于基本上均匀的混合物中。
15.如段落13或14所述的方法,其中,所述可植入结构包含0.1-90wt%的羟基磷灰石。
16.如段落13、14或15中所述的方法,其中,所述可植入结构还包含生物活性剂。
17.如段落13-16中任一段所述的方法,其中,所述可植入结构还包含生丝纤维。
18.如前述段落中任一段所述的结构,其中,所述可植入结构基本上保持其形成时所在器具的形状。
19.如前述段落中任一段所述的方法,其中,所述可植入结构在植入后被生物再吸收。
20.如前述段落中任一段所述的方法,其中,所述可植入结构在植入后被整合入骨中。
21.一种用于生产可植入结构的试剂盒,所述试剂盒包含:
(a)冻干的丝聚合物;
(b)羟基磷灰石颗粒;以及
(c)它们用的包装材料。
22.如段落21所述的试剂盒,所述试剂盒还包含HFIP溶剂。
23.如段落21或22所述的试剂盒,所述试剂盒还包含用于使丝聚合物形成不可溶状态的器具。
24.一种对个体体内的骨进行修复或强化的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)将丝聚合物溶液与羟基磷灰石颗粒混合,以形成糊状组合物;
(b)将所述糊状组合物施用于个体体内需要对骨进行修复或强化的区域,所述个体患有骨损伤或骨缺损;以及
(c)使所述丝聚合物在所施用的糊状组合物中形成不可溶状态;
其中,包含不可溶状态丝聚合物的所施用组合物提供用于被骨组织置换的支架。
实施例
实施例1:用于制备丝/羟基磷灰石制品和可植入结构的方法学的一种实
施方案。
A.生丝的提取和冲洗
切开干茧并提取蚕的组织。为了促进丝胶的提取,将茧切为若干块,并将5g蚕茧组织在0.02M Na2CO3溶液中煮沸30-45分钟,以从丝茧中提取丝胶。将丝松散地浸入液体,在煮沸时露出尽可能多的表面积。从溶液中将丝移出并绞拧,然后在烧杯内的温蒸馏水(每5克使用1L)中浸泡20分钟,不时搅拌。该步骤重复两次经上,在第三次洗涤后,将丝控去水份,绞拧,摊平铺开,在通风橱中干燥12-18h。干燥后丝的质量为无丝胶的丝初始质量的约70-75%,如图1所示。
B.在溴化锂溶液中溶解
然后,将丝溶解于9.3M的LiBr溶液,以丝质量/LiBr计,丝浓度为20%重量/体积比。使丝在60℃的箱内溶解4h。
C.丝溶液的透析
用注射器将12mL等分的已溶解的丝溶液转入12mL透析卡。将每个装有丝溶液的透析卡对于1L蒸馏水进行透析。举例来说,高达4个透析卡可包含在一个5L容量的塑料桶中,并且会需要4L水,如图2所示。在1h、4h后各换一次蒸馏水,然后在接下来的2天内每12h换一次蒸馏水,总计换水6次。
D.离心
用注射器从透析卡中采集丝溶液,并将其转入45mL的离心管。将丝溶液冷藏,然后以9,000RPM离心30分钟,以除去任何从最初的茧中残留的杂质/碎片(参见图3)。使离心作用在20分钟的时间段内减慢至平缓地停止。将丝溶液转入新的管,冷藏后重复第二次离心作用。
E.将丝冷冻然后干燥
将含有已纯化的丝的离心管的上层除去,然后将管置于冰箱内过夜。将冷冻的丝冻干,以产生冻干的纯丝。在干燥环境中,这种形式的丝可在室温下贮藏几个星期。
F.将丝溶解于HFIP(六氟异丙醇)
将冻干的丝称重并溶解于HFIP,HFIP的体积为产生17%重量/体积丝的最终浓度所需体积的90%。在加入最终的10%HFIP前,使丝溶解约2天。在加入其余的HFIP后,将溶液放置约4h,以使溶液适当混合。丝溶解过程示于图5。
G.将丝的HFIP溶液倒入再聚合胶囊以及HFIP的去除
用注射器将不连续体积的丝溶液(完全溶解后)转入用于形成不可溶丝结构的胶囊。选择胶囊紧密地密封,但具有任意形状,使得最终的丝块呈所用胶囊的形式(参见图6)。
24h后,向丝胶囊中加入甲醇,以加速HFIP的蒸发。丝填料在甲醇的存在下随着其固化而显著收缩。
H.矿化的蚕丝聚合物处理及说明
作为对17%丝聚合物制造工艺进行的变化,向丝溶液中加入无机矿物质(已经溶解于HFIP后)。制造负载有矿物质的丝聚合物的试验模型,从而例如改进材料的机械性能。所用的无机矿物质为羟基磷灰石(HA=Ca10(PO4)6(OH)2)。
合成含有高达30%HA的、负载有矿物的丝聚合物材料。如果希望的话,可制备更高的比例,达到例如40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高。在将必要量的HA粉末(在这种情况下产生30质量%)加到丝-HFIP混合物后,所产生的材料具有面团状的稠度,如图8所示。负载矿物的丝材料的粘度高于纯丝溶液的粘度,从而使得无法用注射器进行等分。然而,在足够的压力下,矿化的丝溶液混合物可注入具有任意几何形状和尺寸的空腔,用于形成不可溶的丝-羟基磷灰石结构。为制得矿化丝材料的试验模型,将材料装入例如塑料吸管尖端和圆柱形塑料胶囊等物品。发现在被装入材料的空腔远端的小开口使得空腔被充入更少的空隙,取得了更大的成功。
在分配入胶囊或成形不可溶的丝-羟基磷灰石结构之后,还使用与本文所述未矿化的丝材料同样的步骤对矿化丝材料完成处理。具有各种形状和尺寸的丝聚合物/羟基磷灰石结构如图9所示。
I.整合有生丝纤维的矿化蚕丝聚合物
除加入羟基磷灰石之外,丝聚合材料的另一种变化是将未溶解的丝纤维加到混合物中,以有助于在结构上加强丝聚合物。举例来说,如果纤维与所施加的压力方向平行,这种做法会特别有利。
通过丝胶提取步骤对丝纤维进行处理,然后将其切成长度约3mm的切片,如图10所示。制备含有约2质量%未溶解丝纤维的矿化丝块的试验模型,并示于图11。丝纤维并未定向于任何特定的方向,而是在将其装入胶囊时被***到丝-矿物质混合物中。
J.为加速去除残留HFIP而对完成后样品进行的抽真空步骤
从通风橱移出样品后,发现全部形式的丝聚合物的完成样品都具有HFIP的气味。额外的处理步骤是将完成样品在真空箱(参见图12)中放置约2天。将少数完成样品以-25atm置于真空泵中。经此处理后,HFIP的气味减弱,但并未完全消除。避免由残余溶剂所引起的潜在问题的另一种方法是使用避免使用有机溶剂的全水性方法。
实施例2:丝/羟基磷灰石制品和结构的机械性能
将一批30%HA和未矿化的丝聚合物在处理期间装入圆柱形几何体,以测定这两种材料的压缩模量。
如表1所示,压缩模量测试表明向丝聚合物中加入矿物质相对有益的效果。
所进行的另一个研究是在基于矿化丝的生物聚合物与天然提取的牙齿的牙质之间,用树脂水泥进行剪切粘接强度试验(表2)。作为对照,还对粘接的牙科用复合物-树脂小块的剪切粘接强度试验进行评价,所述小块具有类似的尺寸且粘接在牙质上。
表1:未矿化的丝生物聚合物、矿化丝生物聚合物以及市售的牙科用复合树脂修复材料的压缩模量测试(n=24,每组8个),通过单因素方差分析(one-way ANOVA)进行分析。
表2:粘接至牙质的复合物和矿化丝聚合物(n=16)的剪切粘接强度试验,通过独立样本T-检验进行分析
Claims (28)
1.一种包含丝聚合物和羟基磷灰石颗粒的混合物的制品,其中,所述丝在所述羟基磷灰石颗粒周围形成不可溶状态。
2.一种包含丝聚合物和羟基磷灰石颗粒的混合物的制品,其中,所述丝在所述羟基磷灰石颗粒的存在下形成不可溶状态。
3.如权利要求1或2所述的制品,其中,所述丝聚合物和所述羟基磷灰石颗粒处于基本上均匀的混合物中。
4.如权利要求1、2或3所述的制品,其中,所述制品基本上保持其形成时所在器具的形状。
5.如权利要求1-4中任一项所述的制品,其中,所述制品包含0.1-90wt%的羟基磷灰石。
6.如前述权利要求中任一项所述的制品,所述制品还包含生物活性剂。
7.如前述权利要求中任一项所述的制品,所述制品还包含生丝纤维。
8.一种包含丝聚合物和羟基磷灰石颗粒的混合物的可植入结构,其中,所述丝聚合物基本上包围所述羟基磷灰石颗粒。
9.如权利要求8所述的结构,其中,所述丝聚合物和所述羟基磷灰石颗粒处于基本上均匀的混合物中。
10.如权利要求8或9所述的结构,其中,所述结构基本上保持其形成时所在器具的形状。
11.如权利要求8、9或10所述的可植入结构,所述结构在植入后被生物再吸收。
13.如权利要求8-11中任一项所述的可植入结构,所述结构在植入后被整合到骨之中。
14.一种用于制造可植入结构的方法,所述方法包括将丝聚合物溶液与羟基磷灰石颗粒混合以及诱导所述丝聚合物形成不可溶状态,从而使得所述丝聚合物在所述羟基磷灰石颗粒周围形成不可溶状态。
15.如权利要求13所述的方法,其中,所述丝聚合物和所述羟基磷灰石颗粒处于基本上均匀的混合物中。
16.如权利要求13或14所述的方法,其中,所述可植入结构包含0.1-90wt%的羟基磷灰石。
17.如权利要求13、14或15所述的方法,其中,所述可植入结构还包含生物活性剂。
18.如权利要求13-16中任一项所述的方法,其中,所述可植入结构还包含生丝纤维。
19.如前述权利要求中任一项所述的结构,其中,所述可植入结构基本上保持其形成时所在器具的形状。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述可植入结构在植入后被生物再吸收。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述可植入结构在植入后被整合入骨中。
22.一种用于生产可植入结构的试剂盒,所述试剂盒包含:
(a)冻干的丝聚合物;
(b)羟基磷灰石颗粒;以及
(c)它们用的包装材料。
23.如权利要求21所述的试剂盒,所述试剂盒还包含HFIP溶剂。
24.如权利要求21或22所述的试剂盒,所述试剂盒还包含用于使丝聚合物形成不可溶状态的器具。
25.一种对个体体内的骨进行修复或强化的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)将丝聚合物溶液与羟基磷灰石颗粒混合,以形成糊状组合物;
(b)将所述糊状组合物施用于个体体内需要对骨进行修复或强化的区域,所述个体患有骨损伤或骨缺损;以及
(c)使所述丝聚合物在所施用的糊状组合物中形成不可溶状态;
其中,包含不可溶状态丝聚合物的所施用组合物提供用于被骨组织置换的支架。
26.权利要求1-7中任一项所述的制品在对需要修复的骨进行体内修复或强化中的用途。
27.权利要求1-7中任一项所述的制品用于制备对需要修复的骨进行体内修复或强化的药物的用途。
28.权利要求8-13中任一项所述的可植入结构在对需要修复的骨进行修复或强化中的用途。
29.权利要求1-7中任一项所述的可植入结构用于制备对需要修复的骨进行体内修复或强化的药物的用途。
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