CN101955889B

CN101955889B - 一株镉盐抗性热带假丝酵母及其应用

Info

Publication number: CN101955889B
Application number: CN2010105031597A
Authority: CN
Inventors: 陈叶福; 肖冬光; 王晓琼; 杜丽平; 张翠英; 郭学武
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2010-10-12
Filing date: 2010-10-12
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2030-10-12
Also published as: CN101955889A

Abstract

本发明公开了一株镉盐抗性热带假丝酵母，及利用该菌株生产富含谷胱甘肽(GSH)酵母菌体的方法。所述热带假丝酵母(Candida tropicalis)CV26于2010年9月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.4190。该菌株能以木糖或半纤维素水解糖液为碳源在胞内积累GSH，且生物量较高，可用于富含谷胱甘肽(GSH)酵母菌体的生产。富含谷胱甘肽酵母既可以用于谷胱甘肽提取得到谷胱甘肽和菌体蛋白，也可直接作为功能性酵母使用。利用该酵母发酵木质纤维素水解液中的木糖生产富含谷胱甘肽(GSH)酵母菌体，可为木糖的高效利用开辟新道路。

Description

一株镉盐抗性热带假丝酵母及其应用

【技术领域】

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一株镉盐抗性热带假丝酵母及其在生产富含谷胱甘肽菌体中的应用。

【背景技术】：

谷胱甘肽(glutathione，GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸缩合而成的生物活性三肽，在生物体内分为还原型和氧化型，其中还原型谷胱甘肽分子中同时含有γ-谷氨酰基和活性巯基，可参与多种生物反应，对维持细胞的正常状态具有重要意义。谷胱甘肽具有解毒、抗氧化和防衰老作用，还直接或间接参与蛋白质和DNA合成、物质的运输、新陈代谢及细胞保护等重要生理功能，应用前景广阔。

谷胱甘肽的生产方法有溶剂萃取法、化学合成法、生物法。生物法包括酶法和发酵法，其中发酵法是利用微生物自身代谢产生谷胱甘肽，与其他方法相比具有简便，易控，易扩大生产等优点，从而成为主要的生产方法。发酵法生产谷胱甘肽的关键问题在于如何提高细胞密度以及细胞内的谷胱甘肽含量，二者的有机结合将有利于谷胱甘肽产量的大幅度提高。细胞密度的提高可通过对发酵过程的优化控制(包括高密度培养)获得，而胞内谷胱甘肽含量的提高通常是由菌种选育来实现的，主要有两种方法：一是采用常规诱变育种选育高产菌株，二是利用遗传工程技术构建具有GSH合成酶活性的基因工程菌。

在国内，用于谷胱甘肽发酵生产的菌种大多为酿酒酵母和产朊假丝酵母，发酵碳源大多为糖蜜、葡萄糖、蔗糖，以木糖为碳源发酵生产谷胱甘肽尚未见报道。木质纤维素是地球上最丰富、最廉价的可再生资源，而半纤维素占木质纤维素原料的30％左右，半纤维素经水解后得到五碳糖和六碳糖的混合糖液，其中木糖是半纤维素中含量最多的糖分，也是整个木质纤维素类物质中含量仅次于葡萄糖的第二大糖分。例如玉米秸秆中就含有大量的半纤维素，其结构单元有木糖、***糖、葡萄糖等，其中木糖占一半以上。我国是农业大国，农作物秸秆年产量超过6亿吨，但利用率较低，仅有少部分用作饲料或作为造纸和生产化工产品的原料，大量秸秆被用于薪柴或腐烂废弃，造成资源极大浪费。纤维素乙醇生产是目前公认的一条木质纤维素物质生物转化的有效途径，但因木糖乙醇发酵困难，导致现有纤维素乙醇生产技术大多忽略或无奈放弃了木糖发酵，只利用了纤维原料中的纤维素部分，致使原料利用率偏低，基本在30％～35％水平，生产1吨燃料乙醇需6～7吨木质纤维素类原料，这不但增加了生产成本，造成资源浪费，而且加大了含五碳糖废水的处理难度和成本。如能将秸秆类物质中的木糖转化为富含谷胱甘肽的酵母菌体，既可为谷胱甘肽生产开发新原料，又可为木糖的有效利用开辟新道路。

【发明内容】：

本发明的目的是针对上述存在问题，提供一株镉盐抗性热带假丝酵母，该菌株可发酵木糖或半纤维素水解糖液得到富含谷胱甘肽的酵母菌体。

本发明的技术方案：：

一株镉盐抗性热带假丝酵母CV26，所述热带假丝酵母CV26(Candida tropicalis CV26)于2010年9月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.4190。

一种应用上述热带假丝酵母CV26生产富含谷胱甘肽的酵母菌体的方法，采用木糖和半纤维素水解液摇瓶发酵，步骤为：

1)从活化斜面上挑取一环CV26菌种接入种子培养基中，30℃、160r/min摇床培养24h，得种子液；

2)将种子液以5～15％的接种量，接入木糖发酵培养基或半纤维素水解糖液发酵培养基中进行发酵，发酵条件为：装液量20～60mL/250mL、摇床转速140～180r/min、温度26～32℃、pH值5～8、发酵时间为28～40h。

一种应用上述热带假丝酵母CV26生产富含谷胱甘肽的酵母菌体的方法，采用5L发酵罐木糖发酵，步骤为：

2)种子培养液按5～15％的接种量，接入含有3L木糖发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵，发酵条件为：在溶氧为25％～35％、pH值5～8、温度为26～32℃的条件下培养14～20h。

所述种子培养基的组成为：木糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母浸粉10g/L。

所述木糖发酵培养基的组成为：木糖(25～35)g/L、尿素(2.5～5.5)g/L、玉米浆(0.5～3)％(v/v)、KH₂PO₄(0.5～1.5)g/L、K₂HPO₄·3H₂O (1.5～3.5)g/L、MgSO₄(0.05～0.15)g/L。

所述半纤维素水解糖液发酵培养基的组成为：木糖浓度(30～35)g/L、葡萄糖浓度(2～6)g/L的半纤维素水解液，按照所述木糖发酵培养基的组成，添加除木糖之外的其他培养基成分之后所得。

本发明的优点和积极效果：

本发明通过紫外诱变结合镉盐抗性筛选得到镉盐抗性、胞内谷胱甘肽生成量提高的热带假丝酵母突变株CV26，并且通过发酵培养基和发酵条件优化，有效提高了该突变株以木糖为碳源时的菌体生物量和胞内谷胱甘肽含量。应用本发明菌种可将木糖或半纤维素水解糖液中的木糖高效转化为富含谷胱甘肽的酵母菌体，木糖摇瓶发酵的胞内GSH含量可达13.996mg/g干菌体，生物量8.65mg/L，纤维素水解液摇瓶发酵胞内GSH含量可达11.615mg/g干菌体，生物量7.8mg/L；5L发酵罐木糖发酵的GSH产量为135.885mg/L，胞内GSH含量9.991mg/g干菌体，生物量14.4g/L。富含谷胱甘肽的酵母菌体既可以用于谷胱甘肽提取得到谷胱甘肽和菌体蛋白两种产品，也可以直接作为功能性酵母使用。本发明为木糖的有效利用开辟了新途径，也为谷胱甘肽生产开发了新原料，可有效提高纤维素乙醇等木质纤维素生物转化过程的原料利用率，增加企业经济效益，减小环境污染。

【附图说明】：

附图为5L发酵罐木糖发酵进程曲线。

【具体实施方式】：

实施例1：镉盐抗性、可利用木糖积累谷胱甘肽的热带假丝突变株CV26的诱变筛选

以能利用木糖的热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)CT1463为出发菌株，选择致死率为85％的紫外诱变剂量(照射90s)对热带假丝酵母进行诱变，将诱变后的菌液均匀涂布于0.7mmol/L的镉盐抗性平板上，30℃避光培养2～3d后挑取突变株，最后获得80株镉盐抗性提高的酵母突变株，命名为CV1～CV80。将突变株进行谷胱甘肽发酵实验，发酵28h后测定胞内谷胱甘肽生成量，与出发株做对照，得到一株谷胱甘肽产量和含量明显提高的突变株CV26，GSH产量较出发菌株提高37％；胞内含量提高49％，结果见表1。

表1突变株CV26与出发菌株谷胱甘肽生成量相比较

实施例2：木糖和半纤维素水解液摇瓶发酵

以突变株CV26为实验菌株，以木糖为碳源，通过培养基和发酵条件优化，得到较化木糖发酵培养基为：木糖30g/L，尿素4.5g/L，玉米浆1％(v/v)，KH₂PO₄ 1g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2.5g/L，MgSO₄0.1g/L，0.1MPa灭菌15min；优化发酵条件为：接种量10％，装液量30mL/250mL，摇床转速160r/min，温度30℃，pH值7，培养时间为36h。玉米芯水解液发酵培养基的制备方法如下：先以玉米芯为原料，通过稀酸水解制得半纤维素水解液，再按照木糖发酵培养基的培养基组成，向半纤维素水解液中添加除木糖之外的其他培养基成分。玉米芯稀酸水解的具体条件为：硫酸浓度1.5％，料液比1∶10，水解温度120℃，水解时间3h。此条件下水解液中木糖浓度为33g/L，葡萄糖浓度4g/L。

从活化斜面上挑取一环CV26菌体接种至装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中培养，30℃ 160r/min摇床培养24h，得种子液。种子培养基组成为：木糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L。种子液以10％接种量，接入上述木糖发酵培养基和半纤维素水解液发酵培养基中，30℃ 160r/min摇瓶发酵，培养36h，结果见表2。

表2.突变株CV26摇瓶发酵实验结果

由表2可知，突变株CV26利用水解液的发酵略低于其它木糖发酵，因为水解液中含有糠醛、羟甲基糠醛、乙酸和酚类物质等菌体生长抑制成分。

实施例3：5L发酵罐木糖发酵

在摇瓶发酵的基础上，通过5L发酵罐进行CV26木糖发酵产谷胱甘肽实验，考察了发酵罐培养中酵母生物量和谷胱甘肽生成情况。种子培养基和种子培养方法，木糖发酵培养基组成与实施例2中相同。

5L发酵罐发酵条件具体为：发酵罐装液量为罐容的60％，接种量10％，初始pH值为7，发酵温度为30℃，溶氧为30％，发酵18h。间隔一定时间取样，测定谷胱甘肽产量、残糖量、生物量和pH，绘得发酵进程图如图1所示。在5L的罐上，发酵至14h木糖基本被耗尽，生物量不再增加，较摇瓶发酵的36h大大缩短。生物量较摇瓶发酵有较大的提高，最高达到14.4g/L，谷胱甘肽产量略有提高，最高为135.885mg/L，胞内GSH含量为9.991mg/g，较摇瓶发酵有所降低。但胞内谷胱甘肽含量和GSH产量至18h仍呈增加趋势，说明若延长发酵时间，仍有进一步提高GSH胞内含量和产量的可能。

Claims

1.一株镉盐抗性热带假丝酵母(Candida tropicalis)CV26，其特征在于：所述热带假丝酵母CV26于2010年9月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.4190。

2.一种应用权利要求1所述热带假丝酵母CV26生产富含谷胱甘肽的酵母菌体的方法，其特征在于：采用木糖和半纤维素水解液摇瓶发酵，步骤为：

3.一种应用权利要求1所述热带假丝酵母CV26生产富含谷胱甘肽的酵母菌体的方法，其特征在于：采用5L发酵罐木糖发酵，步骤为：

4.根据权利要求2或3所述应用热带假丝酵母CV26生产富含谷胱甘肽的酵母菌体的方法，其特征在于：所述种子培养基的组成为：木糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母浸粉10g/L。

5.根据权利要求2或3所述应用热带假丝酵母CV26生产富含谷胱甘肽的酵母菌体的方法，其特征在于：所述木糖发酵培养基的组成为：木糖25～35g/L、尿素2.5～5.5g/L、玉米浆0.5～3体积％、KH₂PO₄0.5～1.5g/L、K₂HPO₄·3H₂O1.5～3.5g/L、MgSO₄0.05～0.15g/L。