CN106032542A - 发酵纤维素水解液来生成乙醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及发酵纤维素水解液来生成乙醇的方法。本发明揭示一种用于制备乙醇的方法，它包括下列步骤：提供纤维素水解液，它含有可发酵糖与至少一种选自于由下列所构成的群组中的发酵抑制物：醋酸、羟甲糠醛、糠醛以及酚类化合物；添加含氨的水性溶液至该纤维素水解液中，以形成具有pH值落在5.5至7.0内的混合液；以及将木糖‑利用的酿酒酵母菌添加至该混合液中，并容许该酿酒酵母菌来发酵该混合液，而使得乙醇被生成。
Description
技术领域
本发明有关于一种用于制备乙醇的方法，它包括下列步骤：提供纤维素水解液(cellulosic hydrolysate)，它含有可发酵糖(fermentable sugars)与至少一种选自于由下列所构成的群组中的发酵抑制物(fermentation inhibitor)：醋酸、羟甲糠醛(hydroxymethyl furfural)、糠醛(furfural)以及酚类化合物(phenolic compounds)；添加含氨的水性溶液(aqueous solution comprising ammonia)至该纤维素水解液中，以形成具有pH值落在5.5至7.0内的混合液；以及将木糖-利用的酿酒酵母菌(xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae)添加至该混合液中，并容许该酿酒酵母菌来发酵该混合液，而使得乙醇被生成。
背景技术
木质纤维素生物质(lignocellulosic biomass)是一种经由工业与农林业运作而被大量地生产的可再生能量资源(renewable energy resources)。利用化学方法或生物学方法来将木质纤维素生物质转换成生物质能[也就是说纤维素乙醇(cellulosic ethanol)]已被广泛地研究与探讨。相较于化学方法，生物学方法因为对于生态环境较为有利并且能源需求较低而特别受到重视。
由于木质纤维素具有特殊的结晶结构(crystalline structure)，它主要含有纤维素(cellulose)、半纤维素(hemicellulose)以及木质素(lignin)，因此在生成纤维素乙醇的过程中必须经过下面2个步骤：(1)将木质纤维素经过适当的前处理(pretreatment)与水解处理(hydrolysis process)而使得纤维素与半纤维素释出六碳糖(主要为葡萄糖)与五碳糖(主要为木糖)；以及(2)将所得到的六碳糖与五碳糖进行微生物发酵(microbial fermentation)以产生乙醇。在利用木质纤维素生物质来生成乙醇的过程中会得到纤维素水解液，该纤维素水解液除 了含有六碳糖与五碳糖等外，还具有部分因上述前处理造成五碳糖或六碳糖以及木质素降解而释放出的发酵抑制物[例如醋酸、糠醛、羟甲糠醛(HMF)以及酚类化合物等]。
酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)具有将纤维素水解液中的六碳糖(例如葡萄糖)转化为乙醇的代谢能力，因而已被广泛地利用于工业发酵产业上。但是，酿酒酵母菌无法有效利用该纤维素水解液中所存在的大量五碳糖(例如木糖、***糖等)。因此，近年来有许多研究是通过遗传代谢工程(genetic metabolic engineering)的方式来改善上述问题的。例如，将木糖-发酵细菌(xylose-fermentation bacteria)中与木糖代谢路径有关联的基因导入至酿酒酵母菌中，由此所得到的木糖-发酵酿酒酵母菌(xylose-fermenting Saccharomyces cerevisiae)可以有效地共发酵五碳糖与六碳糖，进而增加乙醇的产量(B.等人(2007),Appl.Microbiol.Biotechnol.,74:937-953)。
此外，于TW I450963(对应于US 20140087438A1和CN 103695329A)当中，申请人也揭示一种具有木糖还原酶基因(xylose reductase gene)、木糖醇脱氢酶基因(xylitol dehydrogenase gene)与木酮糖激酶基因(xylulokinase gene)的酿酒酵母菌，它以寄存编号DSM 25508被寄存于德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,DSMZ)，并且以寄存编号BCRC 920077被寄存于新竹食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心(FIRDI的BCRC)。这件前案专利的全部公开内容在此并入本申请以作为参考。
虽然已有文献揭示通过对酿酒酵母菌进行基因修饰来提高乙醇的产量，但是纤维素水解液中所含有的发酵抑制物会抑制酿酒酵母菌的生长与发酵，而使得五碳糖与六碳糖的利用率降低，进而影响乙醇的产量。
为了降低发酵抑制物所造成的不利影响，已有研究利用菌种的驯化 (acclimation)或基因改造(genetic modification)的方式来提高酿酒酵母菌对于这些发酵抑制物的耐受性，借此提升乙醇的产量。例如，在Carlos Martín等人(2007),Biosource Technology,98:1767-1773中，Carlos Martín等人将基因重组的木糖-利用的酿酒酵母菌培养于添加有甘蔗渣水解液(sugarcane bagasse hydrolysates)的培养基中，并将含有各种抑制物[包括酚类化合物、糠醛以及脂族酸(aliphatic acid)]的甘蔗渣水解液，以持续进料的方式添加至该培养基中以提高抑制物的浓度，借此让该木糖-利用的酿酒酵母菌可以进行适应(adaptation)。所得到的经适应的菌株可以较快的速率来转化糠醛与HMF，并且相较未经适应的原始菌株具有较高的乙醇产量。
在Petersson A.等人(2006),Yeast,23:455-464中，Petersson A.等人通过转基因的方式让酿酒酵母菌可以大量表达负责还原HMF的NADPH-依赖的乙醇脱氢酶(NADPH-dependant alcohol dehydrogenase)ADH6基因，所得到的过度表达ADH6基因的酵母菌菌株经由实验证实，在糠醛存在下可以有效地利用人工培养基中所含有的葡萄糖，并且具有较高的HMF转换率(conversion rate)[也就是说可将更多的HMF还原成5-羟甲糠醇(5-hydroxymethylfurfuryl alcohol)]，这表示该过度表达ADH6的菌株对于HMF更具耐受性。
另外，在Gorsich SW等人(2006),Appl Microbiol Biotechnol.,71:339-349中，Gorsich SW等人发现过度表达ZWF-1的酿酒酵母菌菌株在添加有毒性浓度的糠醛的人工葡萄糖培养基中可以生长，这表示该会过度表达ZWF-1的菌株对于糠醛具有耐受性并且能更有效地将木质纤维素转化为乙醇。
虽然上述涉及基因工程的研究已可提高酿酒酵母菌对于发酵抑制物的适应性，但是转基因的稳定性须长期追踪与确认，若要将其大规模地应用于发酵工业上来达致大量发酵产乙醇的目的，仍有其限制并且存在有高风险。
为此，即有人提出在无须使用经特殊转基因的菌株的情况下，通过去毒处理(detoxification)来移除纤维素水解液中的发酵抑制物，以降低发酵抑制物 的不利影响。常见的去毒处理包括：(1)物理去毒处理(physical detoxification)，诸如蒸发(evaporation)以及膜介导的去毒处理(membrane mediated detoxification)；(2)化学去毒(chemical detoxification)，诸如中和(neutralization)、氢氧化钙超施石灰(calcium hydroxide overliming)、活性炭处理(activated charcoal treatment)以及离子交换树脂(ion exchange resins)；以及(3)生物去毒(biological detoxification)，诸如使用虫漆酶(laccase)或木质素过氧化物酶(lignin peroxidase)等。但是，这些去毒处理会使得纤维素乙醇的制程变得较为繁杂，而所需要的成本也相对提高，同时可能会使纤维素水解液中的还原糖流失。
因此，发展出一种无须经去除发酵抑制物的处理且直接对纤维素水解液进行发酵产乙醇的方法，从而能简化操作程序、降低成本与耗能，以及有效地利用有机废弃物来生产乙醇以供作为干净的生物质能源，会是我们所企望达成的。
发明内容
于是，在第一个方面，本发明提供一种用于制备乙醇的方法，它包括：
提供纤维素水解液，它含有可发酵糖与至少一种选自于由下列所构成的群组中的发酵抑制物：醋酸、羟甲糠醛、糠醛以及酚类化合物；
添加含氨的水性溶液至该纤维素水解液中，以形成具有pH值落在5.5至7.0内的混合液；以及
将木糖-利用的酿酒酵母菌添加至该混合液中，并容许该酿酒酵母菌来发酵该混合液，而使得乙醇被生成。
本发明的方法，在发酵所述混合液的过程中，通过添加所述含氨的水性溶液而使得所述混合液的pH值被维持落在5.5至7.0的范围内。
本发明的方法，所述混合液具有pH值落在5.5至6.5的范围内。
本发明的方法，所述混合液具有pH值落在5.8至6.2的范围内。
本发明的方法，所述含氨的水性溶液选自于下列所构成的群组：氢氧化铵水溶液、硫酸铵水溶液、氯化铵水溶液，以及它们的组合。
本发明的方法，所述可发酵糖包含一种五碳糖以及一种六碳糖。
本发明的方法，所述可发酵糖包含葡萄糖与木糖。
本发明的方法，所述纤维素水解液通过对一种纤维素生物质依序地进行前处理以及水解处理而被制得，所述纤维素生物质选自于下列所构成的群组：生物能源作物、农业残余物、都市固体废弃物、工业固体废弃物、来自造纸的淤泥、庭园废弃物、废材与林业废弃物，以及它们的组合。
本发明的方法，所述纤维素生物质选自于下列所构成的群组：芒草、软木、硬木、玉米穗轴、作物残渣、玉米秸秆、禾草、麦秆、大麦秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、蜀黍植物材料、大豆植物材料、得自谷粒的研磨的组分、树木、树枝、根、叶、木屑、灌木与灌木丛、蔬菜、水果以及花，以及它们的组合。
本发明的方法，所述前处理选自于下列所构成的群组：蒸气爆裂、热化学前处理法、机械粉碎、酸处理、有机溶解、亚硫酸盐前处理，以及它们的组合。
具体实施方式
本发明的上述以及其它目的、特征与优点，在参照以下的详细说明与较佳实施例后，将变得明显。
除非另外有所定义，在本文中所使用的所有技术性与科学术语具有熟悉本发明所属技艺的人士所共同了解的意义。熟悉本技艺者会认知到许多与那些被描述于本文中的相似或等效的方法和材料，它们可被用于实施本发明。当然，本发明决不受到所描述的方法和材料的限制。
为了有效解决能源枯竭的问题以及避免生态环境持续遭受破坏，本技术领域的研究人员致力于开发洁净的生物质能。利用生物质性废弃物作为酵母菌的发酵原料来生产乙醇不但可以解决废弃物所造成的环保问题，也可达到废弃物再利用的目的，因而成为目前最受重视的研究方向。
植物性生物质含有大量的纤维素、半纤维素及木质素等成分，这些成分会互相缠绕包覆而形成复杂且坚韧的网状结构，这会使得在利用植物性生物质来生产乙醇的过程中受到限制，因此该植物性生物质通常会先经过适当的前处理[如热化学分解(thermochemical degradation)]来帮助它的网状结构打开，继而经由纤维素分解酶将其水解成五碳糖以及六碳糖。然而，植物性生物质在经过上述处理后所产生的发酵抑制物(例如，醋酸、糠醛以及羟甲糠醛等)会影响酵母菌发酵产乙醇的能力。为了解决此问题，目前较常使用的方法是对酵母菌菌株进行基因改造或驯化，或是进一步将所述发酵抑制物移除，从而提高乙醇的整体产率。但是，经基因改造或驯化的酵母菌菌株需要定期追踪以确保它所具有的特性仍存在，而移除抑制物会使得制程复杂化且导致成本遽增。
基于上述，申请人致力于发展一种可供工业发酵产业更有效地利用纤维素并大规模地生成乙醇的方法，特别地，该方法不需要对纤维素水解液进行去毒处理，也不需要通过驯化或基因重组的方式来降低发酵抑制物对于酿酒酵母菌菌株的影响，同时能提升木糖-利用的酿酒酵母菌对于纤维素水解液的木糖利用率，并降低木糖醇的累积，进而增加乙醇的产量。
于是，申请人经多方研究后，于本发明中提供一种用于制备乙醇的方法，它包括下列步骤：
提供纤维素水解液，它含有可发酵糖与至少一种选自于由下列所构成的群组中的发酵抑制物：醋酸、羟甲基糠醛、糠醛以及酚类化合物；
添加含氨的水性溶液至该纤维素水解液中，以形成具有pH值落在5.5至 7.0内的混合液；以及
将木糖-利用的酿酒酵母菌添加至该混合液中，并容许该酿酒酵母菌来发酵该混合液，而使得乙醇被生成。
依据本发明，在发酵该混合液的过程中，通过添加该含氨的水性溶液而使得该混合液的pH值被维持落在5.5至7.0的范围内。
较佳地，该混合液的pH值被维持在为5.5至6.5的范围内。更佳地，该混合液的pH值被维持在为5.8至6.2的范围内。在本发明的一个较佳具体例中，该混合液的pH值被维持在6.0。
如本文中所用的，术语“木糖-利用的酿酒酵母菌”与“木糖-发酵的酿酒酵母菌”可被交替地使用，它意欲涵盖具有木糖发酵能力的所有酿酒酵母菌菌株，其中包括那些为熟习此项技术人士所易于获得者(例如，可购自于国内或国外寄存机构者)，或者利用本技艺中所惯用的基因改造方法将不具有木糖发酵能力的天然酿酒酵母菌菌株进行转基因而制得者。有关木糖-利用的酿酒酵母菌菌株可参见，但不限于：Carlos Marín等人(2002),Enzyme and Microbial Technology,31:274-282；Miroslav Sedlak和Nancy W.Y.Ho(2004),Applied Biochemistry and Biotechnology,113-116:405-416；B.等人(2007)(同上述)；Zhang A.等人(2007),Letters in Applied Microbiology,44:212-217；Hubmann G.等人(2011),Applied and Environmental Microbiology,77:5857-5867；US 20130196399A1；以及TW I450963等。
在本发明的一个较佳具体例中，该木糖发酵的酿酒酵母菌是一株fps1基因与gpd2基因皆被删除或破坏的酿酒酵母菌菌株。在本发明的一个更佳具体例中，该木糖发酵的酿酒酵母菌通过将一株以寄存编号BCRC 920077被寄存于食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心(FIRDI的BCRC)的酿酒酵母菌的基因组DNA中的fps1基因与gpd2基因进行删除或破坏而被制得。
如本文中所用的，术语“含氨的水性溶液(aqueous solution comprising ammonia)”意指在水性介质中添加下列物质：氨气(ammonia gas)(NH3)、包含铵离子(ammonium ions)(NH4)的化合物[诸如，氢氧化铵(ammonium hydroxide)、氯化铵(ammonium chloride)或硫酸铵(ammonium sulfate)]、在分解后释放氨的化合物(诸如尿素)，以及它们的组合。
依据本发明，该含氨的水性溶液是氢氧化铵水溶液(即氨水)或氯化铵水溶液。在本发明的一个较佳具体例中，该含氨的水性溶液是氨水。
依据本发明，该纤维素水解液通过对纤维素生物质(cellulosic biomass)依序地进行前处理以及水解处理而被制得。
如本文中所用的，术语“纤维素水解液”与“木质纤维素水解液”和“生物质水解液(biomass hydrolysate)”可被交替地使用，并且意指由生物质的糖化(saccharification)所产生的产物，其中术语“糖化(saccharification)”表示从多糖产生可发酵糖。
如本文中所用的，术语“纤维素生物质”与“木质纤维素生物质(lignocellulosic biomass)”可被交替地使用，并且意指任何包括纤维素、半纤维素、木质素、淀粉、寡糖和/或单糖的纤维素材料。
依据本发明，该纤维素生物质可以衍生自单一来源，或者该纤维素生物质可以包含衍生自多种来源的混合物。例如，该纤维素生物质可以为由玉米秸秆(corn stover)与玉米穗轴(corn cobs)所构成的混合物，或者由禾草(grass)与叶所构成的混合物。
适用于本发明的纤维素生物质包括，但不限于：生物能源作物(bioenergy crops)、农业残余物(agricultural residues)、都市固体废弃物(municipal solid waste)、工业固体废弃物(industrial solid waste)、来自造纸的淤泥(sludge from paper manufacture)、庭园废弃物(yard waste)、废材(wood waste)与林业废弃物(forestry waste)，以及它们的组合。
较佳地，该纤维素生物质选自于下列所构成的群组：芒草(miscanthus)、 软木(softwood)、硬木(hardwood)、玉米穗轴(corn cobs)、作物残渣(crop residues)[诸如玉米壳(corn husks)]、玉米秸秆(corn stover)、禾草(grasses)、麦秆(wheat straw)、大麦秆(barley straw)、干草(hay)、稻秆(rice straw)、柳枝稷(switchgrass)、废纸(waste paper)、甘蔗渣(sugarcane bagasse)、蜀黍植物材料(sorghum plant material)、大豆植物材料(soybean plant material)、得自谷粒(grains)的研磨的组分、树木、树枝、根、叶、木屑(sawdust)、灌木(shrubs)与灌木丛(bushes)、蔬菜、水果以及花，以及它们的组合。
适用于本发明的前处理包括，但不限于：蒸气爆裂(steam explosion)、热化学前处理法(thermal chemical pretreatment)、机械粉碎、酸处理、有机溶解(organosolve)、亚硫酸盐前处理(sulfite pretreatment)，以及它们的组合。在本发明的一个较佳具体例中，该纤维素生物质在被进行该水解处理前有先经过蒸气爆裂处理。
依据本发明，该纤维素水解液在加入该含氨的水性溶液前可进一步被混合以营养盐组合物。在本发明的一个较佳具体例中，该营养盐组合物包含有下列盐类：(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O以及KH2PO4。
<实施例>
本发明将就下面的实施例来做进一步说明，但应了解的是，这些实施例仅供例示说明用，而不应被解释为本发明的实施上的限制。
一般实验材料：
1.制备Δfps1Δgpd2双突变的酿酒酵母菌接种源(inoculum of the Δfps1 Δgpd2 double mutant of Saccharomyces cerevisiae)：
在下面实验中所使用的酿酒酵母菌菌株是Δfps1Δgpd2双突变的酿酒酵母菌，它大体上依据Zhang A.等人(2007)(同上述)以及Hubmann G.等人(2011)(同上述)当中所述的方法而被制备。简言之，首先，依据Zhang A.等人(2007)(同上述)当中所述的方法，将可共发酵五碳糖与六碳糖的酿酒酵母菌 BCRC 920077(得自于申请人先前专利申请TW I450963，也以寄存编号DSM 25508被寄存于DSMZ)的fps1基因剔除，继而将所得到的Δfps1突变菌株进一步依据Hubmann G.等人(2011)(同上述)当中所揭示的方法来进行gpd2基因的剔除，借此而得到Δfps1Δgpd2双突变的酿酒酵母菌菌株(下面简称“经双突变的酿酒酵母菌”)。
之后，将上述所得到的经双突变的酿酒酵母菌接种于YPD培养基中，并于恒温振荡培养箱(30℃、200rpm)内进行培养直到OD600值达至20。接着，将所形成的培养物予以离心，然后收集细胞沉淀物并使用无菌水予以清洗数次，继而以无菌水来充分悬浮菌体，由此所得到的细胞悬浮液被拿来作为下面实施例中的经双突变的酿酒酵母菌接种源。
2.纤维素水解液(cellulosic hydrolysate)的制备：
在下面实施例中所使用的纤维素生物质包括：稻秆(得自于弘远农产商行)以及芒草(得自于嘉义大学农改场)。首先，将芒草或稻秆切成适当的尺寸，继而以粉碎机予以粉碎，接着加入3wt％硫酸溶液予以混合均匀，并在60℃下进行反应历时60分钟。之后，将所得到的混合物置于立式圆筒型高压蒸煮槽(购自于七福工业股份有限公司)，继而通入蒸气并在为190至200℃的温度下进行加热历时7分钟。接着，将通过上述酸催化蒸气爆裂前处理(acid-catalyzed steam explosion pretreatment)所得到的蒸煮液以NaOH来调整pH值至5.0，继而加入由纤维素酶(cellulase)与半纤维素酶(hemicellulase)所构成的混合物(NovozymesCTec3，使用量为0.12克酶混合物/克纤维素生物质)，并在为50℃的温度下以及为120rpm的搅拌速率下进行纤维素分解处理(cellulolytic processes)历时72小时，借此而得到经酸催化蒸气爆裂的稻杆或芒草纤维素水解液。
另外，经蒸气爆裂的稻杆或芒草纤维素水解液大体上依据上述方式来进行制备，不同的地方在于：在进行前处理时，以水代替硫酸溶液来与经粉碎 的纤维素生物质进行混合。
3.在下面的实施例中，用于添加至纤维素水解液的营养盐组合物具有下面表1所示的配方。
表1.营养盐组合物的配方
| 成分 | 浓度(g/L) |
| (NH4)2SO4 | 5 |
| MgSO4·7H2O | 0.05 |
| KH2PO4 | 3 |
一般实验方法：
1.高效液相层析(high performance liquid chromatography,HPLC)分析：
在下面的实施例中，纤维素水解液以及发酵代谢物(fermentation metabolites)中所含有的成分及其浓度(g/L)参考美国国家再生能源实验室(National Renewable Energy Laboratory,NREL)所颁布的有关标准生物质分析的实验室分析程序(laboratory analytical procedures,LAPs)，并通过使用配备有一个折射率(RI)侦测器(refractive index detector)的高效液相层析仪(DIONEX Ultimate 3000)来进行测定，其中所使用的管柱以及操作条件如下：分析管柱为Aminex HPX-87H管柱(BioRad)；流动相为5mM硫酸(配于水中)；流速被控制为0.6mL/分钟；样品注射体积为20μL；RI温度控制在65℃。
此外，为供比对，使用不同浓度的葡萄糖(1.2-24mg/mL)、木糖(1.2-24mg/mL)、木糖醇(0.2-6mg/mL)、甘油(0.2-8mg/mL)、羟甲糠醛(HMF)(0.2-8mg/mL)、醋酸(0.2-12mg/mL)、乙醇(1.0-15mg/mL)、糠醛(0.2-8mg/mL)以及酚类化合物(0.2-8mg/mL)来分别作为校正标准品(controlstandard)并进行相同的分析，这些化学物质购自于Sigma。
实施例1.在使用经酸催化蒸气爆裂的稻杆纤维素水解液作为基质下，添加NH4OH对于经双突变的酿酒酵母菌发酵产乙醇的影响
在本实施例中，依据上面“一般实验材料”的第2项[纤维素水解液的制备]所得到的经酸催化蒸气爆裂的稻杆纤维素水解液被拿来作为基质，并探讨于发酵过程中NH4OH碱性溶液的添加与否，对于经双突变的酿酒酵母菌利用葡萄糖与木糖来进行发酵产乙醇的影响。
此外，为供比较，经去毒处理的稻杆纤维素水解液(下称“去毒水解液”)被拿来一起进行相同的发酵实验。有关稻杆纤维素水解液的去毒处理依据Jing-Ping Ge等人(2011),African Journal of Microbiology Research,5:1163-1168当中所述的超施石灰(overliming)以及使用活性炭(activated charcoal)来进行，并略作修改。简言之，将依据上面“一般实验材料”的第2项[纤维素水解液的制备]所得到的经酸催化蒸气爆裂的稻杆纤维素水解液以适量的Ca(OH)2来调整pH值至10，继而置于室温下反应历时120分钟，接着于10000rpm下予以离心历时5分钟，然后收集上清液并以H2SO4溶液来调整pH值至5.0。之后，加入5％活性炭(购自于和泰股份有限公司，型号MAX-703)并在40℃下反应历时60分钟，接着经由过滤以及离心处理来移除活性碳滤饼(filter cake)等不可溶物质，所得到的滤液即为该去毒水解液。
在进行发酵产乙醇前，该经酸催化蒸气爆裂的稻杆纤维素水解液以及该去毒水解液分别依照上面“一般实验方法”的第1项[高效液相层析分析]所述的方法来测量各种糖类以及抑制物的浓度，而所测得的结果被显示于下面表2中。
表2.各个水解液中的糖类以及抑制物的浓度
从表2可见，与该经酸催化蒸气爆裂的稻杆纤维素水解液相较下，该去毒水解液中不含有HMF、糠醛以及酚类化合物，而仅含有较少量的醋酸。此 外，该去毒水解液中的葡萄糖浓度也较低。由此可知，去毒处理会去除大部分的抑制物，但同时会使得葡萄糖的含量被降低。
实验方法：
将该经酸催化蒸气爆裂的稻杆纤维素水解液分成2组(包括对照组以及NH4OH组)，接着将如表1中所示的营养盐组合物添加至各组水解液中，继而分别以NH4OH来调整pH值至6。之后，将依据上面“一般实验材料”的第1项[制备Δfps1Δgpd2双突变的酿酒酵母菌的接种源]所得到的经双突变的酿酒酵母菌接种源以为1:20(v/v)的接种量接种至各个培养瓶中并予以混合均匀，继而置于恒温震荡培养室内，并在为30℃的温度下以及为150rpm的震荡速率下进行发酵反应历时72小时。在整个发酵期间，对NH4OH组适时地添加NH4OH以使其pH值被维持在6。至于对照组则不作任何处理。
另外，该去毒水解液大体上参照上面NH4OH组的方式来进行相同的实验，唯独使用NaOH来取代NH4OH。之后，将各组的发酵培养物于12000rpm下予以离心历时10分钟，所得到的发酵代谢物分别依照上面“一般实验方法”的第1项[高效液相层析分析]当中所述的方法来进行葡萄糖、木糖、木糖醇以及乙醇的含量分析。有关葡萄糖或木糖的利用率是以所测得的葡萄糖或木糖的总量相对于发酵前各自所测得的总量的百分比值(％)来表示。此外，将发酵后所测得的木糖醇的总量与发酵期间木糖的总利用量(即发酵前所测得的木糖总量减去发酵后所测得者)相比较，从而获得一个比值(即木糖醇生成量)，若该比值越低，代表越多的木糖被转化为乙醇，而非以木糖醇的形式累积。至于乙醇产量(yield)，则是通过将发酵后所生成的乙醇总量与发酵期间葡萄糖和木糖的总利用量(即发酵前所测得的葡萄糖与木糖的总量减去发酵后所测得者)相比较而被计算出。
结果：
本实验所测得的结果被显示于下面表3中。
表3.各组水解液被接种以经双突变的酿酒酵母菌并经过发酵后所测得的糖类利用率、木糖醇生成量与乙醇产量
从表3可见，当以经酸催化蒸气爆裂的稻杆纤维素水解液作为基质(无论在发酵过程中是否添加NH4OH)，或者直接以去毒水解液作为基质，各组发酵代谢物所测得的葡萄糖利用率皆为100％，至于木糖利用率以及乙醇产量，NH4OH组则皆显著优于对照组。由此可知，在发酵过程中添加NH4OH可以显著地提升木糖利用率，进而增加乙醇的产量。
此外，将经酸催化蒸气爆裂的稻杆纤维素水解液的NH4OH组与去毒水解液作比较可发现，以经酸催化蒸气爆裂的稻杆纤维素水解液作为基质并且以NH4OH来调整该水解液的成分或在发酵过程中添加NH4OH可以产生更佳的木糖利用率与乙醇产量。这个实验结果显示，本发明所揭示的技术不需要进一步经过水解液的去毒处理步骤即可以有效地提高木糖利用率与乙醇产量。
实施例2.在使用经酸催化蒸气爆裂的稻秆与芒草纤维素水解液作为基质下，添加不同碱性溶液对于经双突变的酿酒酵母菌发酵产乙醇的影响
本实施例使用依据上面“一般实验材料”的第2项[纤维素水解液的制备]所制得的经酸催化蒸气爆裂的稻秆或芒草纤维素水解液作为基质，并探讨以不同的碱性溶液(包括NH4OH、KOH以及NaOH溶液)来调整水解液的pH值，并于发酵过程中添加所述碱性溶液对于经双突变的酿酒酵母菌利用葡萄糖与木糖来进行发酵产乙醇的影响。
在进行发酵产乙醇前，该经酸催化蒸气爆裂的稻秆或芒草纤维素水解液分别依照上面“一般实验方法”的第1项[高效液相层析分析]所述的方法来测量各种糖类以及醋酸的浓度，而所测得的结果被显示于下面表4中。
表4.经酸催化蒸气爆裂的芒草与稻秆纤维素水解液中的葡萄糖、木糖以及醋酸的浓度
| 组成 | 稻秆纤维素水解液 | 芒草纤维素水解液 |
| 醋酸(g/L) | 6.2 | 8.7 |
| 葡萄糖(g/L) | 79.2 | 80 |
| 木糖(g/L) | 36.9 | 55.9 |
实验方法：
首先，将该经酸催化蒸气爆裂的稻秆与芒草纤维素水解液各自分成3组(包括KOH组、NaOH组以及NH4OH组)，接着各自以KOH、NaOH以及NH4OH来调整pH值至6，所得到的各组稻秆与芒草纤维素水解液大体上依据上面实施例1所述的实验方法来进行经双突变的酿酒酵母菌的发酵产乙醇实验，不同的地方在于：在整个发酵期间，分别对KOH组、NaOH组以及NH4OH组适时地添加NaOH、KOH以及NH4OH，而使得它们的pH值皆被维持在6.0。
之后，各组的发酵代谢物分别依照上面“一般实验方法”的第1项[高效液相层析分析]当中所述的方法来进行葡萄糖、木糖、木糖醇以及乙醇的含量分析，继而依据实施例1当中的所述的方式来分别计算出糖类利用率、木糖醇生成量与乙醇产量。
结果：
本实验所测得的结果被显示于下面表5中。
表5.各组稻秆与芒草纤维素水解液被接种以经双突变的酿酒酵母菌并经过发酵后所测得的糖类利用率、木糖醇生成量与乙醇产量
从表5可见，无论以稻秆或芒草纤维素水解液作为基质，各组发酵代谢物所测得的葡萄糖利用率皆为100％，至于木糖利用率以及乙醇产量，NH4OH组皆显著优于NaOH组或KOH组。由此可知，与NaOH与KOH相较下，以NH4OH来调整水解液的pH值并在发酵过程中添加NH4OH可以更加显著地提升木糖利用率，并降低木糖醇累积，进而增加乙醇的产量。
实施例3.在使用经蒸气爆裂的芒草纤维素水解液作为基质下，通过添加NH4OH来调整pH值对于经双突变的酿酒酵母菌发酵产乙醇的影响
本实施例使用依据上面“一般实验材料”的第2项[纤维素水解液的制备]所制得的经蒸气爆裂的芒草纤维素水解液作为基质，并探讨于发酵过程中通过添加NH4OH来将该芒草纤维素水解液的pH值分别维持在5、6或7下，对于经双突变的酿酒酵母菌利用葡萄糖与木糖来进行发酵产乙醇的影响。
在进行发酵产乙醇前，该经蒸气爆裂的芒草纤维素水解液依照上面“一般实验方法”的第1项[高效液相层析分析]所述的方法而被测量到含有7.3g/L的醋酸、81.8g/L的葡萄糖以及34.7g/L的木糖。
实验方法：
首先，将该经蒸气爆裂的芒草纤维素水解液分为3组(包括pH 5组、pH 6组以及pH 7组)，接着以NH4OH来将pH 5组、pH 6组以及pH 7组的pH值分别调整至5、6以及7，所得到的各组芒草纤维素水解液大体上依据上面实施例1所述的实验方法来进行经双突变的酿酒酵母菌的发酵产乙醇实验，不同的地方在于：在整个发酵期间，分别对各组适时地添加NH4OH，而使得它们的pH值被维持在最初所既定的数值下。
之后，各组的发酵代谢物分别依照上面“一般实验方法”的第1项[高效液相层析分析]当中所述的方法来进行葡萄糖、木糖、木糖醇以及乙醇的含量分析，继而依据实施例1当中的所述的方式来分别计算出糖类利用率、木糖醇生成量与乙醇产量。
结果：
本实验所测得的结果被显示于下面表6中。
表6.具有不同pH值的芒草纤维素水解液被接种以经双突变的酿酒酵母菌并经过发酵后所测得的糖类利用率、木糖醇生成量与乙醇产量
| pH 5组 | pH 6组 | pH 7组 | |
| 葡萄糖利用率(％) | 100 | 100 | 100 |
| 木糖利用率(％) | 35.1 | 99.3 | 94.1 |
| 木糖醇生成量(g/g) | 0.18 | 0.09 | 0.11 |
| 乙醇产量(g/g) | 0.393 | 0.413 | 0.396 |
从表6可见，无论该经蒸气爆裂的芒草纤维素水解液的pH值维持在5、6或7，各组发酵代谢物所测得的葡萄糖利用率皆为100％，至于木糖利用率、木糖醇生成量以及乙醇产量，pH 6组皆显著优于pH 7组与pH 5组。申请人据此而认为，在发酵过程中，通过添加NH4OH来控制纤维素水解液的pH值在6.0可以达至最佳的木糖利用率，并有效降低木糖醇的累积，进而提高乙醇的产量。
于本说明书中被引述的所有专利和文献以其整体被并入本申请作为参考资料。若有所冲突时，本申请详细说明(包含界定在内)将占上风。
虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述，明显地在不背离本发明的范围和精神下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明只受如随文检附的权利要求书所示者的限制。
生物材料保藏信息说明
保藏编号：DSM 25508
分类命名：酿酒酵母菌
保藏日期：2011年12月20日
保藏单位：德国微生物菌种保藏中心GmbH
保藏单位地址：银浩芬斯彻7B D-38124不伦瑞克
Claims (10)
1.一种用于制备乙醇的方法，其特征在于，所述方法包含下列步骤：
提供一个纤维素水解液，它含有一种可发酵糖与至少一种选自于由下列所构成的群组中的发酵抑制物：醋酸、羟甲基糠醛、糠醛以及酚类化合物；
添加一个含氨的水性溶液至所述纤维素水解液中，以形成一个具有pH值落在5.5至7.0内的混合液；以及
将一种木糖-利用的酿酒酵母菌添加至所述混合液中，并容许所述酿酒酵母菌来发酵所述混合液，而使得乙醇被生成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在发酵所述混合液的过程中，通过添加所述含氨的水性溶液而使得所述混合液的pH值被维持落在5.5至7.0的范围内。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合液具有pH值落在5.5至6.5的范围内。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合液具有pH值落在5.8至6.2的范围内。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含氨的水性溶液选自于下列所构成的群组：氢氧化铵水溶液、硫酸铵水溶液、氯化铵水溶液，以及它们的组合。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述可发酵糖包含一种五碳糖以及一种六碳糖。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述可发酵糖包含葡萄糖与木糖。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纤维素水解液通过对一种纤维素生物质依序地进行前处理以及水解处理而被制得，所述纤维素生物质选自于下列所构成的群组：生物能源作物、农业残余物、都市固体废弃物、工业固体废弃物、来自造纸的淤泥、庭园废弃物、废材与林业废弃物，以及它们的组合。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述纤维素生物质选自于下列所构成的群组：芒草、软木、硬木、玉米穗轴、作物残渣、玉米秸秆、禾草、麦秆、大麦秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、蜀黍植物材料、大豆植物材料、得自谷粒的研磨的组分、树木、树枝、根、叶、木屑、灌木与灌木丛、蔬菜、水果以及花，以及它们的组合。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述前处理选自于下列所构成的群组：蒸气爆裂、热化学前处理法、机械粉碎、酸处理、有机溶解、亚硫酸盐前处理，以及它们的组合。
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