CN101946850B - 一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料及其制备方法和用途，属于微生物发酵饲料和液体饲料领域。本发明的罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料是经定向选育的罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri(保藏编号为：CGMCC3457)按照优化的发酵液体饲料工艺制成的液体发酵饲料，不仅包括用于罗伊氏乳杆菌发酵的干基质，罗伊氏乳杆菌活菌含量1-5×10⁸cfu/g及其乳酸代谢产物，水分含量40-60％，pH值为4.5-5.5。还包括4％的预混料，为在发酵结束后再添加，4％的预混料不含任何抗生素。本发明的发酵液体饲料工艺简单，易于散养户操作，能够在粗放的猪场环境中进行良好发酵，制备的发酵液体饲料对断奶仔猪、生长猪、育肥猪的生长性能效果显著。不仅能够提高饲料利用率，促进动物生长，而且还能改善并维持肠道菌群平衡，提高免疫力和抗病力，改善动物体型与产品品质，显著降低饲料成本，增加经济效益。

Description

一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料及其制备方法及用途，属于微生物发酵饲料和液体饲料领域。

背景技术

发酵液体饲料(Fermented Liquid Feed，简写FLF)，作为一种新型饲料，它的最早使用是在20世纪80年代末的荷兰，之后，丹麦、法国、瑞典、西班牙、瑞士等国也陆续加入到了使用者的行列，近几年来，发酵液体饲料在欧洲已广泛使用，并成为人们研究的热点。可改善饲料的消化特性，提高猪的生产性能，尤其是在预防断奶仔猪腹泻、提高采食量和日增重方面已取得了显著的效果。但还有一些关键技术问题尚需解决：发酵液体饲料的适宜菌种开发、发酵液体饲料的发酵工艺，特别是菌种的好坏将直接影响发酵液体饲料的饲喂效果。比如，饲喂***含大量杂菌，原料中含不适于发酵的菌或含量太低不足以抑制有害菌等，这些问题都会引起发酵液体饲料的发酵不良。

目前，关于发酵液体饲料的研究也只是集中在养猪生产中，更确切的说是对断奶仔猪的研究，而对生长猪等却鲜有报道。

由中国国家知识产权局公开的申请号为200610165284.5，发明名称为“液态猪饲料发酵工艺及设备”的发明专利申请，公开了由乳酸菌、粪链球菌，酵母菌与黑曲霉、芽孢杆菌混合配比发酵液态饲料的工艺及设备，菌种繁多，培养工艺复杂，并且制备的液体发酵饲料仅应用在断奶后仔猪上。

针对上述存在的技术问题，本发明提出的解决方案是：从健康成长猪肠道内容物中分离筛选出乳酸菌，并经体外抑菌试验和动物饲喂效果实验选育适宜发酵液体饲料的优良菌种，然后采用液体深层发酵工艺制备乳酸菌发酵液；优化罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料的工艺参数；并且制备的发酵液体饲料不仅对断奶仔猪的生长性能效果显著，而且对生长猪、育肥猪的生长性能效果也显著。因此本发明的罗伊氏乳杆菌是适宜液体发酵饲料的优良菌种，能够有效抑制饲喂***、饲料原料中含有的大量杂菌、有害菌的生长繁殖，保证发酵液体饲料良好发酵，并且制备发酵液体饲料的工艺简单，易于操作，能够在粗放的猪场环境中进行发酵，效果良好，对断奶仔猪、生长猪、育肥猪的生长性能效果显著。

发明内容

本发明的目的在于提供一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料，包括用于罗伊氏乳杆菌发酵的干基质，活菌含量为1-5×10⁸cfu/g罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri(保藏编号为CGMCC3457)及其乳酸等代谢产物，水分含量40-60％，pH值为4.5-5.5。

本发明所述的用于罗伊氏乳杆菌发酵的干基质为全价料的大料部分，不包括4％的预混料，全价料为参照NRC(1998)猪的营养需要配制的常规基础日粮。

本发明所述的一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料还包括4％的预混料，为在罗伊氏乳杆菌发酵上述干基质结束后添加，为市场上销售的不含有任何抗生素药物的4％预混料。

本发明的另一目的在于提供一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料的制备方法。

本发明的另一目的在于提供罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料的用途。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明所述的一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料的制备方法，包括优良乳酸菌的选育及其菌种鉴定，罗伊氏乳杆菌发酵液的制备，应用罗伊氏乳杆菌发酵液制备发酵液体饲料的步骤及发酵工艺参数优化。

1、本发明所述的一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料的制备方法，其中优良乳酸菌的选育及其菌种鉴定，具体步骤如下：

(1)肠道内容物中优良乳酸菌菌种的分离筛选：

无菌操作取健康成年猪盲肠内容物，用无菌生理盐水作适当稀释。蘸取稀释液在MRS平板培养基上划线接种，30-37℃厌氧培养24-48小时，挑取形态及颜色各异的菌落分别划线接种作纯培养，并进行镜检，观察分离细菌的颜色及形态特征。

挑取平板上纯培养的革兰氏阳性无芽孢杆菌接种于MRS液体培养基，30-37℃厌氧培养16-24小时。将细菌培养液按20-25％的比例添加灭菌甘油，混匀，-20℃保存、备用。分别编号为CL9、L3、WW1、LB2、W0、S64。

本发明所述的MRS平板培养基：牛肉膏1.0g、胰蛋白胨0.5g、酵母浸出粉0.5g、葡萄糖1.5g、乳糖0.5g、5％半胱氨酸1.0ml、吐温-800.1ml、氯化镁0.05g、柠檬酸铁铵0.2g、硫酸锰0.005g、乙酸钠0.5g、琼脂粉1.4g、无水磷酸氢二钠0.2g、100ml蒸馏水，调pH值至5.4。

本发明所述的MRS液体培养基：为MRS平板培养基中不添加琼脂粉。

(2)对常见致病菌抑菌效果优良的乳酸菌菌种的选育

应用体外抑菌圈法筛选步骤(1)分离的乳酸菌。将乳酸菌菌株接种到MRS液体培养基中，30-37℃厌氧培养16-24h后，通过测定OD₅₀₀值调整活菌数为5×10⁸cfu/ml。同时将致病菌接种于营养肉汤中，37℃培养18h后，调整活菌数至1×10⁶cfu/mL，将营养琼脂培养基冷却到40℃左右时倾注到无菌培养皿中，待凝固后，吸取致病菌菌液0.1ml在平板表面均匀涂开，37℃固定培养菌落30min，在平板上打直径4mm的孔，孔深3mm。将调整好浓度的乳酸菌液注至满孔，于37℃微需氧环境培养48h观察结果，测定抑菌圈大小。实验结果如下：

乳酸菌对常见致病菌的抑菌实验结果单位：mm

结果表明：乳酸菌WW1、S64对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌抑菌效果最好，对四株致病菌都有显著的抑菌效果。这为能够有效抑制饲喂***、饲料原料中含有的大量杂菌、有害菌的生长繁殖，保证发酵液体饲料良好发酵奠定了基础。

本发明所述的营养琼脂培养基为：牛肉膏1.0g，蛋白胨1.0g，葡萄糖1.0g，NaCl 0.5g，琼脂1.5-2.0g，蒸馏水100ml，pH 7.0。

本发明所述的营养肉汤培养基为：牛肉膏1.0g，蛋白胨1.0g，葡萄糖1.0g，NaCl 0.5g，蒸馏水100ml，pH 7.0。

(3)适宜发酵液体饲料的优良乳酸菌菌种的筛选——动物饲喂实验法

实验设计：

选择健康状况良好的40日龄仔猪108头，平均体重为10kg。液体饲料为基础日粮和水的混合物，水料比均为1.6∶1。

采用单因子完全随机化的实验设计将108头断奶仔猪随机分成9组，以圈为单位进行饲养，预饲期为7天，试验期为28天。9组仔猪分别采食9种日粮。日粮配方及营养水平见表1，实验设计见表2。

表1、断奶仔猪日粮配方及营养水平

本发明的4％断奶仔猪预混料每千克含：CuSO₄ 15g，FeSO₄ 10g，ZnSO₄ 8g，MnSO₄ 2.5g，Na₂Se₂O₃ 10％0.15g，10％KI 0.5g，VA 83万IU，VD3137万IU，VE 850IU，VK 55mg，VB1 55mg，VB2 200mg，泛酸钙280mg，烟酸555mg，VB6 25mg，VB12 55mg，叶酸110mg，VH 25mg，胆碱15g。特别指出的是本发明的4％预混料中不含有任何抗生素药物。

表2、实验设计表

饲养管理：

试验开始前，用清水冲洗猪舍，以2％的KOH消毒，再用0.3％来苏水稀释液喷洒消毒猪舍。每圈设1个饲槽和1个饮水器，用红外灯供热。仔猪自由采食和饮水，圈舍保持清洁卫生。

测定指标：平均日增重、料肉比、腹泻指数、腹泻率。

实验结果：

表3、适宜发酵液体饲料的优良乳酸菌菌种的筛选结果

由上表看出，实验组V效果最好，即菌种WW1的发酵液体饲料对断奶仔猪的生长性能效果最好，能显著提高断奶仔猪的日增重、减低料肉比与腹泻率，并且与对照组、NFLF、EM组差异显著。因此本发明选用乳杆菌WW1作为发酵液体饲料的优良菌种。

(4)优良乳酸菌的菌种鉴定

利用16S rDNA分子生物学法结合部分传统生理生化实验鉴定步骤(3)的乳酸菌WW1为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)。并于2009年11月20日，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏编号为：CGMCC3457。罗伊氏乳杆菌的生物学特性如下：

罗伊氏乳杆菌(拉丁名：Lactobacillus reuteri)菌落为不规则型，圆形凸起、光滑，边缘整齐，在血平板上，菌落白色或乳白色。菌体形状呈轻微不规则、圆形末端的弯曲杆菌，大小为0.7-1.0×2.0-5.0μm，通常单个、成对、小簇存在。罗伊氏乳杆菌生长培养特性：能够利用葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、***糖、密二糖、棉籽糖、核糖等，不能利用纤维二糖、木糖、海藻糖等。最适生长温度为36-40℃，最适发酵温度35-40℃，最高生长温度43-45℃，起始生长pH值为6.7-7.0，在pH值为4.5-5.0以下或者pH值为8.0-8.5以上的环境中一般不生长，罗伊氏乳杆菌属专性异性发酵菌种，能发酵糖产生CO₂、乳酸、乙酸和乙醇。

2、本发明所述的一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料的制备方法，其中罗伊氏乳杆菌发酵液的制备过程如下：

(1)罗伊氏乳杆菌种子液的制备：

将试管斜面保藏菌种无菌操作接种至装有400mlMRS培养基的500ml三角瓶中，30-40℃恒温静止厌氧培养10-24h。

(2)罗伊氏乳杆菌发酵液的制备：

将上述制备的罗伊氏乳杆菌种子液按照5-10％接种量接种至装有40L发酵培养基的50L发酵罐中，30-40℃恒温厌氧培养16-24h。

本发明所述的MRS培养基为：牛肉膏1.0g、胰蛋白胨0.5g、酵母浸出粉0.5g、葡萄糖1.5g、乳糖0.5g、5％半胱氨酸1.0ml、吐温-800.1ml、氯化镁0.05g、柠檬酸铁铵0.2g、硫酸锰0.005g、乙酸钠0.5g、琼脂粉1.4g、无水磷酸氢二钠0.2g、100ml蒸馏水，调pH值至5.4。

本发明所述的发酵培养基为：葡萄糖2g，酵母浸出粉0.5g，牛肉蛋白粉1g，鱼肉汁1g，吐温800.01ml，醋酸钠0.5g，柠檬酸铁铵0.2g，硫酸镁0.058g，硫酸锰0.0028，蒸馏水100ml，调pH值至5.4-6.5。

3、本发明所述的一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料的制备方法，其中应用罗伊氏乳杆菌发酵液制备发酵液体饲料的步骤和工艺参数如下：

(1)用于罗伊氏乳杆菌液体发酵的干基质的配制：本发明所述的用于罗伊氏乳杆菌发酵的干基质，是全价料的大料部分，不包括4％预混料。即：先将全价料中4％预混料之外的大料成分按照配比混匀制成用于发酵的干饲料。全价料为参照NRC(1998)猪的营养需要进行配制的常规基础日粮。原因是：4％预混料中的氨基酸会被大肠杆菌、乳酸菌等在发酵过程中分解掉，造成氨基酸的损失，另外4％预混料中的胆碱、矿物质等会在一定程度上抑制甚至杀死罗伊氏乳杆菌而不能进行有效的发酵液体饲料。

(2)罗伊氏乳杆菌发酵液的稀释：按照1‰-1％的接种量将罗伊氏乳杆菌发酵液接种于一定量的地下水或自来水的容器中，搅拌均匀，待用。其中地下水或自来水的装液量为50-70％。

(3)罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料的工艺参数：将步骤(1)的干基质与步骤(2)稀释好的菌液混合均匀，水料比为1.2-1.8∶1，盖盖，密封，培养温度为15-35℃，厌氧培养16-48h，pH值为4.5-5.5，终止发酵。

(4)将步骤(3)制备好的液体发酵饲料中添加4％预混料配成全价料，混匀，即得罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料，立即饲喂。本发明所述的4％预混料为市场上销售的不含有任何抗生素药物的预混料。

根据本发明所述的由罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料制备方法得到的液体发酵饲料，是一种新型无抗绿色饲料，不仅能够提高饲料利用率，促进动物生长，而且还能改善并维持肠道菌群平衡，提高免疫力和抗病力，替代抗生素，改善动物产品品质，并能有效改善猪的体型，增加经济效益。

本发明的优点和有益效果是：本发明所述的罗伊氏乳杆菌是从健康猪盲肠内容物中筛选并经动物饲喂实验选育得到的适宜液体发酵饲料的优良菌种，能够有效抑制饲喂***、饲料原料中含有的大量杂菌、有害菌的生长繁殖，保证发酵液体饲料良好发酵。并且发酵液体饲料工艺简单，易于散养户操作，制备的液体发酵饲料效果显著，不仅能够提高饲料利用率，促进动物生长，而且还能改善并维持肠道菌群平衡，提高免疫力和抗病力，替代抗生素，改善动物产品品质，并能有效改善猪的体型，增加经济效益。

具体实施方式

通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：优良乳酸菌菌种的选育及菌种鉴定

(1)肠道内容物中优良乳酸菌菌种的分离筛选：

无菌操作取健康成年猪盲肠内容物，用无菌生理盐水作适当稀释。蘸取稀释液在MRS平板培养基上划线接种，37℃厌氧培养24小时，挑取形态及颜色各异的菌落分别划线接种作纯培养，并进行镜检，观察分离细菌的颜色及形态特征。

挑取平板上纯培养的革兰氏阳性无芽孢杆菌接种于MRS液体培养基，37℃厌氧培养24小时。将细菌培养液按20％的比例添加灭菌甘油，混匀，-20℃保存、备用。分别编号为CL9、L3、WW1、LB2、W0、S64。

本发明所述的MRS培养基：牛肉膏1.0g、胰蛋白胨0.5g、酵母浸出粉0.5g、葡萄糖1.5g、乳糖0.5g、5％半胱氨酸1.0ml、吐温-800.1ml、氯化镁0.05g、柠檬酸铁铵0.2g、硫酸锰0.005g、乙酸钠0.5g、琼脂粉1.4g、无水磷酸氢二钠0.2g、100ml蒸馏水，调pH值至5.4。

(2)对常见致病菌有抑菌效果的优良乳酸菌菌种的选育

应用体外抑菌圈法筛选步骤(1)分离的乳酸菌。将乳酸菌菌株接种到MRS液体培养基中，37℃培养16h后，通过测定OD₅₀₀值调整活菌数为5×10⁸cfu/ml。同时将致病菌接种于营养肉汤中，37℃培养18h后，调整活菌数至1×10⁶cfu/mL，将营养琼脂培养基冷却到40℃左右时倾注到无菌培养皿中，待凝固后，吸取大肠杆菌菌液1ml在平板表面均匀涂开，37℃固定培养菌落30min，在平板上打直径4mm的孔，孔深3mm。将调整好浓度的菌液注至满孔，于37℃微需氧环境培养48h观察结果，测定抑菌圈大小。实验结果如下：

表1、乳酸菌对常见致病菌的抑菌实验结果单位：mm

结果表明：乳酸菌WW1、S64对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌抑菌效果最好，对四株致病菌都有显著的抑菌效果。

(3)适宜发酵液体饲料的优良乳酸菌菌种的筛选——仔猪饲喂效果筛选实验

实验设计：

选择健康状况良好的40日龄仔猪108头，平均体重为10kg。液体饲料为基础日粮和水的混合物，水料比均为1.6∶1。

采用单因子完全随机化的实验设计将108头断奶仔猪随机分成9组，以圈为单位进行饲养，预饲期为7天，试验期为28天。9组仔猪分别采食9种日粮。日粮配方见表2，实验设计见表3。

表2、断奶仔猪日粮配方

本发明的4％断奶仔猪预混料每千克含：CuSO₄ 15g，FeSO₄ 10g，ZnSO₄ 8g，MnSO₄ 2.5g，Na₂Se₂O₃ 10％0.15g，10％KI 0.5g，VA 83万IU，VD3137万IU，VE 850IU，VK 55mg，VB1 55mg，VB2 200mg，泛酸钙280mg，烟酸555mg，VB6 25mg，VB12 55mg，叶酸110mg，VH 25mg，胆碱15g。特别指出的是本发明的4％预混料中不含有任何抗生素药物。

表3、实验设计表

饲养管理：

试验开始前，用清水冲洗猪舍，以2％的KOH消毒，再用0.3％来苏水稀释液喷洒消毒猪舍。每圈设1个饲槽和1个饮水器，用红外灯供热。仔猪自由采食和饮水，圈舍保持清洁卫生。

测定指标：日增重、料肉比、腹泻指数、腹泻率

实验结果：

表4、适宜发酵液体饲料的优良乳酸菌菌种的筛选结果

由上表看出，实验组V效果最好，即菌种WW1的发酵液体饲料对断奶仔猪的生长性能效果最好，能显著提高断奶仔猪的日增重、料肉比、减低腹泻率，并且与对照组、NFLF、EM组差异显著。因此本发明选用罗伊氏乳杆菌WW1作为发酵液体饲料的优良菌种。

(4)优良乳酸菌的菌种鉴定

利用16S rDNA分子生物学法结合部分传统生理生化实验鉴定步骤选育的优良乳酸菌WW1为罗伊氏乳杆菌。罗伊氏乳杆菌的生物学特性如下：

罗伊氏乳杆菌(拉丁名：Lactobacillus reuteri)菌落为不规则型，圆形凸起、光滑，边缘整齐，在血平板上，菌落白色或乳白色。菌体形状呈轻微不规则、圆形末端的弯曲杆菌，大小为0.7-1.0×2.0-5.0um，通常单个、成对、小簇存在。罗伊氏乳杆菌生长培养特性：能够利用葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、***糖、密二糖、棉籽糖、核糖等，不能利用纤维二糖、木糖、海藻糖等。最适生长温度为36-40℃，最适发酵温度35-40℃，最高生长温度43-45℃，起始生长pH值为6.7-7.0，在pH值为4.5-5.0以下或者pH值为8.0-8.5以上的环境中一般不生长，罗伊氏乳杆菌属专性异性发酵菌种，能发酵糖产生CO₂、乳酸、乙酸和乙醇。

实施例2：罗伊氏乳杆菌发酵液的制备

(1)罗伊氏乳杆菌种子液的制备：

将试管斜面保藏菌种无菌操作接种至装有400mlMRS培养基的500ml三角瓶中，30℃恒温厌氧培养24h。

(2)罗伊氏乳杆菌发酵液的制备：

将上述制备的罗伊氏乳杆菌种子液按照5％接种量接种至装有40L发酵培养基的50L发酵罐中，40℃恒温厌氧培养16h。

本发明所述的MRS培养基为：牛肉膏1.0g、胰蛋白胨0.5g、酵母浸出粉0.5g、葡萄糖1.5g、乳糖0.5g、5％半胱氨酸1.0ml、吐温-800.1ml、氯化镁0.05g、柠檬酸铁铵0.2g、硫酸锰0.005g、乙酸钠0.5g、琼脂粉1.4g、无水磷酸氢二钠0.2g、100ml蒸馏水，调pH值至5.4。

本发明所述的发酵培养基为：葡萄糖2.0g，酵母浸出粉0.5g，牛肉蛋白粉1.0g，鱼肉汁1.0g，吐温800.01ml，醋酸钠0.5g，柠檬酸铁铵0.2g，硫酸镁0.058g，硫酸锰0.0028，蒸馏水100ml，调pH值至5.4。

实施例3、应用罗伊氏乳杆菌制备发酵液体饲料的步骤及工艺参数

(1)用于罗伊氏乳杆菌液体发酵的干基质的配制：本发明所述的用于罗伊氏乳杆菌发酵的干基质，为全价料的大料部分，不包括4％预混料，全价料为参照NRC(1998)猪的营养需要进行配制的常规基础日粮。即：将玉米66％、豆粕11％、麸皮14％、鱼粉5％混匀便得到用于罗伊氏乳杆菌发酵的干基质。

(2)菌液的稀释：按照1‰的接种量将罗伊氏乳杆菌发酵液接种于一定量的地下水或自来水的容器中，搅拌均匀，待用，其中地下水或自来水的装液量为50％。

(3)罗伊氏乳杆菌液体发酵饲料的工艺：将步骤(1)混合好的干基质与步骤(2)稀释好的菌液混合均匀，水料比为1.2∶1，盖盖，密封，培养温度为35℃，厌氧培养16h。

(4)将步骤(3)制备好的液体发酵饲料中添加一定4％预混料配成全价料，搅拌均匀，立即饲喂，本发明所述的的4％预混料为市场上销售的不含有任何抗生素药物的预混料。

实施例4、应用罗伊氏乳杆菌制备发酵液体饲料的步骤及工艺参数

(1)用于罗伊氏乳杆菌液体发酵的干基质的配制：本发明所述的用于罗伊氏乳杆菌液体发酵的干基质，为全价料的大料部分，不包括4％预混料，即将玉米68％、豆粕7％、麸皮16％、鱼粉5％混匀即可得到用于罗伊氏乳杆菌液体发酵的干基质。

(2)菌液的稀释：按照1％的接种量将罗伊氏乳杆菌发酵液接种于一定量的地下水或自来水的器中，搅拌均匀，待用，其中地下水或自来水的装液量为70％。

(3)罗伊氏乳杆菌液体发酵饲料的工艺：将步骤(1)混合好的干基质与步骤(2)稀释好的菌液混合均匀，水料比为1.8∶1，盖盖，密封，培养温度为15℃，厌氧培养48h。

(4)将步骤(3)制备好的液体发酵饲料中添加一定4％预混料配成全价料，搅拌均匀，立即饲喂，本发明所述的的4％预混料为市场上销售的不含有任何抗生素药物的预混料。

实施例5：本发明的罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料对断奶仔猪生长性能的影响

实验设计：

按单因子多重复设计本试验，将54头体重相近的28日龄断奶仔猪随机分为3个处理、每个处理3个重复、每个重复6头猪，预饲期为7天，试验期一个月。对照组日粮为普通全价饲料，见实施例1中的表2、断奶仔猪日粮配方，NFLF组：饲喂前将对照组日粮按水料比1.2∶1混合，搅拌均匀后制得湿拌料组日粮。实验组：本发明的实施例3制备的罗伊氏乳杆菌液体发酵饲料。

饲养管理：

试验开始前，用清水冲洗猪舍，以2％的KOH消毒，再用0.3％来苏水稀释液喷洒消毒猪舍。每圈设1个饲槽和1个饮水器，用红外灯供热。仔猪自由采食和饮水，圈舍保持清洁卫生。

测定指标：日增重、料肉比、腹泻率。

实验结果

表5、罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料对断奶仔猪生长性能的影响

由上表看出，实验组效果最好，即本发明的罗伊氏乳杆菌液体发酵饲料对断奶仔猪的生长性能效果最好，能显著提高断奶仔猪的日增重，减低料肉比、腹泻率，并且与对照组、NFUF组差异显著。

实施例6：本发明的罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料对生长猪消化道菌群及生长性能的影响

按单因子多重复设计本试验，将54头体重相近的生长育肥猪随机分为3个处理、每个处理3个重复、每个重复6头猪，试验期一个月。

3个处理组均为玉米-豆粕型基础日粮，对照组日粮为普通全价饲料，日粮组成及营养水平见表6。NFLF组：将对照组日粮按1.8∶1水料比混合，搅拌均匀后制得湿拌料组日粮。实验组：本发明的实施例4制备的罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料。

表6、生长猪日粮组成及营养水平

本发明的4％生长猪预混料每千克含：CuSO₄ 20g，FeSO₄ 12.5g，ZnSO₄ 11.5g，MnSO₄ 2.5g，Na₂Se₂O₃ 1％1.5g，KI 1％5g，VA 80万IU，VD₃ 136万IU，VE 680IU，VK 44mg，VB₁ 44mg，VB₂160mg，泛酸钙224mg，烟酸440mg，VB₆20mg，VB₁₂ 40mg，叶酸80mg，VH 20mg，胆碱13g。特别指出的是本发明的4％预混料中不含有任何抗生素药物。

表7、罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料对生长育肥猪生长性能的影响

注：表内同行肩注字母不同表示差异显著(P＜0.05)，有相同字母表示差异不显著。所有数据均为干物质基础下计算。

由上表看出，实验组效果最好，即本发明的罗伊氏乳杆菌液体发酵饲料对生长猪的生长性能效果最好，能显著提高断奶仔猪的日增重、降低料肉比，并且与对照组、NFLF组差异显著。

表8、罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料对粪中微生物区系的影响

注：表内同行肩注字母不同表示差异显著(P＜0.05)，有相同字母表示差异不显著。

由上表看出，饲喂本发明的罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料，能够显著提高生长猪粪便中的乳酸菌数量，显著降低大肠杆菌、沙门氏菌的数量。

实施例7：本发明的罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料对育肥猪生长性能的影响

试验设计

本试验按单因子多重复设计，将36头平均体重60.60±0.08的杜长大三元杂交育肥猪，随机分为2个处理，每个处理3个重复，每个重复6头猪。对照组：饲喂基础日粮，实验组：本发明的实施例4制备的液体发酵饲料。基础日粮见表9。

表9、育肥猪日粮组成及营养水平

本发明的4％生长猪预混料每千克含：CuSO₄ 20g，FeSO₄ 12.5g，ZnSO₄ 11.5g，MnSO₄ 2.5g，Na₂Se₂O₃ 1％1.5g，KI 1％5g，VA 80万IU，VD₃ 136万IU，VE 680IU，VK 44mg，VB₁ 44mg，VB₂160mg，泛酸钙224mg，烟酸440mg，VB₆20mg，VB₁₂40mg，叶酸80mg，VH 20mg，胆碱13g。特别指出的是本发明的4％预混料中不含有任何抗生素药物。

饲养管理

试验开始前，用清水冲洗猪舍，以2％的KOH消毒，再用0.3％来苏水稀释液喷洒消毒猪舍。每圈设1个饲槽和1个饮水器，自由采食和饮水，圈舍保持清洁卫生。

测定指标：日增重、料肉比。

实验结果

表10、罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料对育肥猪生长性能的影响

由上表看出，实验组效果最好，即本发明的罗伊氏乳杆菌液体发酵饲料对育肥猪的生长性能效果最好，能显著提高育肥猪的日增重、降低料肉比，并且与对照组差异显著。

Claims (4)

1.一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料，其特征在于，包括用于罗伊氏乳杆菌发酵的干基质，罗伊氏乳杆菌活菌含量1-5×10⁸cfu/g及其乳酸代谢产物，水分含量40-60％，pH值为4.5-5.5，所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)为保藏号为CGMCC3457的菌种。

2.如权利要求1所述的一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料，其特征在于，4％的预混料在发酵结束后再添加，为市场上销售的不含任何抗生素药物的4％预混料。

3.一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料的制备方法，其特征在于，所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)为保藏号为CGMCC3457的菌种，制备方法包括：罗伊氏乳杆菌发酵液的制备，应用罗伊氏乳杆菌发酵液制备发酵液体饲料的步骤和工艺参数优化，

所述的罗伊氏乳杆菌发酵液的制备过程如下：

(1)罗伊氏乳杆菌种子液的制备：

将试管斜面保藏菌种接种至装有400mlMRS培养基的500ml三角瓶中，30-40℃恒温静止厌氧培养10-24h，

(2)罗伊氏乳杆菌发酵液的制备：

将步骤(1)制备的罗伊氏乳杆菌种子液按照5-10％接种量接种至装有40L发酵培养基的50L发酵罐中，30-40℃恒温厌氧培养16-24h，

所述的发酵培养基为：葡萄糖2g，酵母浸出粉0.5g，牛肉蛋白粉1g，鱼肉汁1g，吐温800.01ml，醋酸钠0.5g，柠檬酸铁铵0.2g，硫酸镁0.058g，硫酸锰0.0028，蒸馏水100ml，调pH值至5.4-6.5，

所述的应用罗伊氏乳杆菌发酵液制备发酵液体饲料的步骤及工艺参数如下：

(1)用于罗伊氏乳杆菌液体发酵的干基质的配制：

所述的用于乳酸菌液体发酵的干基质，是全价料的大料部分，不包括4％预混料，即：先将全价料中4％预混料之外的大料成分按照配比混匀制成用于发酵的干基质，所述的全价料为参照NRC(1998)猪的营养需要配制的常规基础日粮，

(2)罗伊氏乳杆菌发酵液的稀释：

按照1‰-1％的接种量将罗伊氏乳杆菌发酵液接种于一定量的地下水或自来水的容器中，搅拌均匀，待用，其中地下水或自来水的装液量为50-70％，

(3)罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料的工艺参数：

将步骤(1)混合好的干基质与步骤(2)稀释好的菌液混合均匀，水料比为1.2-1.8∶1，盖盖，密封，培养温度为15-35℃，厌氧培养16-48h，pH值为4.5-5.5，终止发酵，

(4)将步骤(3)制备好的液体发酵饲料中添加4％预混料配成全价料，搅拌均匀，即得罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料，立即饲喂。

4.如权利要求1所述的一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料，是一种无抗绿色饲料，可用于直接饲喂断奶仔猪、生长猪、育肥猪。