CN109329561A - 一种嗜酸乳杆菌发酵液体饲料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种嗜酸乳杆菌发酵液体饲料的制备方法，包括以下步骤：筛选出适宜用作制造发酵液体饲料的嗜酸乳杆菌；将筛选得到的嗜酸乳杆菌扩大培养，制得发酵种子液；将植物性原料粉碎，向其中加入水制得料液；将嗜酸乳杆菌发酵种子液接入料液，混合、发酵，制得液态发酵饲料。制得的液体发酵饲料pH值为3.8～4.3，嗜酸乳杆菌活菌含量为1.0～4.0×109CFU/mL，乳酸含量为17.00～22.00mg/mL。本发明选择适宜的菌株，产酸能力强，能量损失少。本发明的发酵工艺简单，种子液、发酵液的制备均不需要厌氧，制成发酵饲料的耗时短，发酵结束后的pH值低，乳酸含量高，活菌数量高。

Description

一种嗜酸乳杆菌发酵液体饲料的制备方法
技术领域
本发明属于饲料制造领域，具体涉及一种嗜酸乳杆菌发酵液体饲料的制备方法。
背景技术
发酵液体饲料(Fermented Liquid Feed，FLF)是一种新型的液体饲料，广泛应用于荷兰、瑞典、丹麦等国。与传统的液体饲料不同，发酵液体饲料主要利用益生菌对液体状态下的谷物饲料进行发酵，将谷物饲料中的不易消化的大分子物质降解为易消化的小分子物质，提高饲料原料的利用率。微生物发酵过程中会产生很多消化酶(淀粉酶、蛋白酶等)、有机酸(乳酸、丁酸等)等代谢产物，也可以提高饲料原料的营养价值、促进动物的消化吸收，其中含有大量的活性益生菌，对改善动物体的肠道健康有很大帮助。
近年来，液体发酵饲料在欧洲得到了越来越多的应用，显现出良好的饲养效果和经济效益，在改善动物健康、提高动物生产性能、减少抗生素类药物使用等方面具有很大的优势。但目前国内对液体发酵饲料的研究还不是很多，而且在国内的使用率很低，这一方面是由于受饲喂***的制约，另一方面也因为发酵工艺较复杂，因此国内需要发展操作简单的发酵工艺。
发明名称为“一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料及其制备方法和用途”的中国专利200910249684.8，公开了由罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料的工艺及用途，种子液、发酵液的制备需要厌氧，制成发酵饲料的耗时长，需要16～48h，发酵结束后的pH值为4.5～5.5，pH值偏高，对于液体发酵饲料中乳酸含量没有明确指标。
针对上述问题，本发明提出的解决方案是：从实验室现有的乳酸菌中筛选出适宜发酵液体饲料、产酸能力强的菌株，采用静置培养的方法制备乳酸菌种子液，相比厌氧培养对设备的要求简单，操作方便，然后对发酵液体饲料的发酵工艺进行优化。本发明的嗜酸乳杆菌为同型乳酸发酵菌，可以在发酵6～12h后使发酵体系的pH值达到3.8～4.3，能有效抑制有害菌的生长，并且乳酸菌的活菌数量可以达到1.0～4.0×109CFU/mL，而且测定了液体发酵饲料中的乳酸含量，可以达到17.00～22.00mg/mL。
发明内容
为解决以上技术问题，本发明提出一种嗜酸乳杆菌发酵液体饲料的制备方法，为液体发酵饲料的实施应用提供一种无需厌氧培养制备种子液、发酵饲料周期短，现场操作方便，产酸量高的发酵方法，应用前景广泛。
本发明的技术方案是：一种嗜酸乳杆菌发酵液体饲料的制备方法，包括以下步骤：
1)从乳酸菌中筛选出适宜用作制造发酵液体饲料的嗜酸乳杆菌；
2)将所述嗜酸乳杆菌扩大培养，制得发酵种子液；
3)将植物性原料粉碎，向其中加入水制得料液；
4)将2)得到的嗜酸乳杆菌发酵种子液接入料液，混合、发酵，制得液态发酵饲料。
优选的，在所述步骤1)中，筛选得到嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus保藏号为CICC6090。
优选的，在所述步骤1)中，嗜酸乳杆菌是至少以发酵时间、发酵温度、产酸含量、是否产气、抑制病原菌能力为综合指标筛选出的同型发酵乳酸菌。
优选的，在所述步骤1)中的乳酸菌包括但不限于嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、酵母菌。
优选的，在所述步骤2)中的发酵种子液的制备过程为：甘油保存菌种划MRS琼脂平板得到单菌落；挑取单菌落接种于装有10mL灭菌MRS肉汤的试管中，36±1℃静置培养6～8h；4～6％的接种量转接于装有灭菌MRS肉汤的三角瓶中，36±1℃静置培养6h，得到发酵种子液。
优选的，在所述步骤3)中，植物性原料包括但不限于全脂米糠、小麦、玉米、豆粕、大豆粉。
优选的，在所述步骤3)中，料液的水分含量为60～80％。
优选的，在所述步骤4)中，嗜酸乳杆菌种子液的接种量为1～6％。
优选的，在所述步骤4)中，混合后静置发酵，发酵温度25～35℃，发酵时间6～10h。
优选的，在所述步骤4)中，混合后静置发酵，发酵温度25～35℃，发酵时间6～8h。
优选的，在所述步骤4)中，混合后静置发酵，发酵温度30℃，发酵时间6h。
优选的，在所述步骤4)中，制得的液态发酵饲料，pH值为3.8～4.3，嗜酸乳杆菌活菌含量1.0～4.0×109CFU/mL，乳酸含量17.00～22.00mg/mL。
本发明从实验室现有的乳酸菌中筛选出适宜发酵液体饲料、产酸能力强的菌株，采用静置培养的方法制备乳酸菌种子液，相比厌氧培养对设备的要求简单，操作方便，本发明还对发酵液体饲料的发酵工艺进行了优化。本发明的嗜酸乳杆菌为同型乳酸发酵菌，可以在发酵6～10h后使发酵体系的pH值达到3.8～4.3，能有效抑制有害菌的生长，并且乳酸菌的活菌数量可以达到1.0～4.0×109CFU/mL，经测定，液体发酵饲料中的乳酸含量可以达到17.00～22.00mg/mL。
本发明选择适宜的菌株，产酸能力强，能量损失少。本发明的发酵工艺简单，种子液、发酵液的制备均不需要厌氧，制成发酵饲料的耗时短，发酵结束后的pH值低，乳酸含量高，活菌数量高。
具体实施方式
下面将结合实例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种嗜酸乳杆菌发酵液体饲料的制备方法，包括以下步骤：
1)从乳酸菌中筛选出适宜用作制造发酵液体饲料的嗜酸乳杆菌；
2)将所述嗜酸乳杆菌扩大培养，制得发酵种子液；
3)将植物性原料粉碎，向其中加入水制得料液；
4)将2)得到的嗜酸乳杆菌发酵种子液接入料液，混合、发酵，制得液态发酵饲料。
优选的，在所述步骤1)中，筛选得到嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus保藏号为CICC6090。
优选的，在所述步骤1)中，嗜酸乳杆菌是是至少以发酵时间、发酵温度、产酸含量、是否产气、抑制病原菌能力为综合指标筛选出同型发酵乳酸菌，生长速度快、产酸能力强、发酵性能稳定。
优选的，在所述步骤1)中的乳酸菌包括但不限于嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、酵母菌。
优选的，在所述步骤2)中的发酵种子液的制备过程为：甘油保存菌种划MRS琼脂平板得到单菌落；挑单菌落接种于装有10mL灭菌MRS肉汤的试管中，36±1℃静置培养6～8h；4～6％的接种量转接于装有灭菌MRS肉汤的三角瓶中，36±1℃静置培养6～8h，得到发酵种子液。
优选的，在所述步骤3)中，植物性原料包括但不限于全脂米糠、小麦、玉米、豆粕、大豆粉。
优选的，在所述步骤3)中，料液的水分含量为60～80％。
优选的，在所述步骤4)中，嗜酸乳杆菌种子液的接种量为1～6％。
优选的，在所述步骤4)中，混合后静置发酵，发酵温度25～35℃，发酵时间6～10h。
优选的，在所述步骤4)中，混合后静置发酵，发酵温度25～35℃，发酵时间6～8h。
优选的，在所述步骤4)中，混合后静置发酵，发酵温度30℃，发酵时间6h。
优选的，在所述步骤4)中，制得的液态发酵饲料，pH值为3.8～4.3，嗜酸乳杆菌活菌含量1.0～4.0×109CFU/mL，乳酸含量17.00～22.00mg/mL。
一般性说明：具体实施例中所用到的植物性原料全脂米糠、小麦购自当地市场，实验室粗粉后使用；嗜酸乳杆菌种子液培养基、活菌数测定培养基分别为MRS肉汤、MRS琼脂，均购自广东环凯。
液体发酵饲料中全脂米糠∶小麦＝1∶3，水分75％，嗜酸乳杆菌接种量为5％，发酵温度30℃，发酵时间6h。
实施例1：嗜酸乳杆菌筛选
乳酸菌按发酵类型可以分为三大类：同型乳酸发酵、异型乳酸发酵和兼性异型乳酸发酵。
同型乳酸发酵是微生物以葡萄糖为底物通过糖酵解途径(EMP途径)降解为丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的催化下还原为乳酸。在同型乳酸发酵过程中，微生物利用1mol葡萄糖可以生成2mol乳酸，异型乳酸发酵除生成乳酸外还生成CO2和乙醇或乙酸等物质。
根据乳酸菌的发酵类型，在同型发酵中：C6H12O6→2C3H6O3，葡萄糖的净能为12.4MJ/kg，乳酸的净能为11.5MJ/kg(两分子乳酸)，所以在同型乳酸发酵中净能的损失为(12.4-11.5)/12.4＝7.3％。在异型发酵中：C6H12O6+O2→C3H6O3+C2H4O2+CO2+H2O，葡萄糖的净能为12.4MJ/kg，此发酵类型中产生一分子乳酸(净能为11.5/2MJ/kg)、一分子乙酸(净能为9.8/3MJ/kg，一分子葡萄糖生成3分子乙酸的净能为9.8MJ/kg)，所以发酵后的净能为11.5/2+9.8/3＝9.02MJ/kg，在异型乳酸发酵中净能的损失为(12.4-9.02)/12.4＝27.3％。我们希望在发酵饲料中产生更多的乳酸、减少能量的损失，同型发酵的乳酸菌是首选菌株。根据发酵类型的差异，通过观察培养菌株是否产气可以简单区分出同型发酵与异型发酵。
选择实验室保存的五株乳酸菌：X-1-2(嗜酸乳杆菌)、X-1-3(植物乳杆菌)、X-1-4(干酪乳杆菌)、X-1-5(嗜酸乳杆菌CICC 6090)和乳酸乳球菌进行产气试验，初步确定发酵液体饲料菌株，具体操作如下：将保存的菌株分别划线于MRS琼脂平板，36±1℃恒温静置培养48±2h；挑取平板上的单菌落接种于MRS肉汤试管，(肉汤试管中放置小倒管，根据小倒管中有无气泡产生来判断是否产气，)36±1℃恒温静置培养48h，观察产气情况。所选五株乳酸菌中，产气菌株有两个：X-1-2和乳酸乳球菌，X-1-3、X-1-4、X-1-5均不产气，可以判断不产气的三株乳酸菌为同型乳酸发酵菌株，用它们来发酵液体饲料可以得到更多的乳酸、更少的能量损失。
再将X-1-3(植物乳杆菌)、X-1-4(干酪乳杆菌)、X-1-5(嗜酸乳杆菌CICC 6090)三株菌进行抑菌能力对比，具体操作如下：将保存的菌株分别划线于MRS琼脂平板，36±1℃恒温静置培养48±2h；挑取平板上的单菌落接种于MRS肉汤试管，36±1℃恒温静置培养16h，取此培养液进行抑菌试验。抑菌试验指示菌为大肠埃希氏菌(ATCC 25922)、大肠埃希氏菌(CVCC 15271402)、鼠伤寒沙门氏菌(CMCC 50115)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、产气荚膜梭菌(ATCC 13142)，指示菌菌液制备：从产气荚膜梭菌甘油管中接100uL至10mL FT肉汤中，37℃培养20h；其余指示菌从斜面试管中挑取一环于10mL MH肉汤中，37℃培养至与0.5麦氏比浊管比对生长的菌量(或在630nm波长检测吸收值为0.090～0.100)一致，放入冰箱备用(不得超过24h)。采用琼脂扩散法进行抑菌试验：将培养好的指示菌菌液分别取1mL到平皿中(每个菌液平行两次，产气荚膜梭菌需涂布)；将冷却至46℃左右的MHA培养基分别倾注20mL于已加入菌液的平皿中，摇动平皿使菌液与培养基混匀，放置冷却凝固；用经灭菌的直径为8mm的打孔器在凝固后的琼脂平板上打孔，加入不同乳酸菌培养液；放入37℃生化培养箱培养16h(产气荚膜梭菌需厌氧培养)；观察并记录抑菌圈直径，结果如表1所示。
表1三株菌的抑菌效果对比
注：表1中“-”表不没有抑菌圈出现。
用X-1-3(植物乳杆菌)、X-1-4(干酪乳杆菌)、X-1-5(嗜酸乳杆菌CICC 6090)三株菌进行发酵液体饲料，相同发酵温度与时间下对比pH值及乳酸含量，具体操作如下：将保存的菌株分别划线于MRS琼脂平板，于36±1℃恒温静置培养48±2h；挑取平板上的单菌落接种于MRS肉汤试管(10mL)，36±1℃恒温静置培养6h；将MRS肉汤试管的种子液转接至MRS肉汤三角瓶中，36±1℃恒温静置培养6h得到三级发酵种子液用于发酵液体饲料。
将经过粗粉的全脂米糠和小麦，按照质量比1∶3混合均匀，加入3倍重量的水，并接种5％的三级发酵种子液，混合均匀后30℃恒温发酵6h，制得液态发酵饲料。取制得液态发酵饲料的样品测定pH值及乳酸含量：液体发酵饲料的pH值采用PHS-3CpH计测定，液体发酵饲料乳酸含量的测定按照GB/T 23877-2009进行，pH值及乳酸含量的测定结果如表2所示。
表2三株乳酸菌发酵液体饲料效果对比
结合三株乳酸菌的抑菌能力及发酵效果对比：X-1-5的综合抑菌效果略优于其余两株乳酸菌；发酵效果对比可以看出X-1-5的pH值为3.88，低于其余两株菌发酵pH值，而该菌发酵乳酸含量为19.32，与X-1-3的发酵含量基本相同，高于X-1-4的发酵含量。
综合菌株筛选试验结果，选择X-1-5(嗜酸乳杆菌CICC 6090)进行液体发酵饲料的制备。
实施例2：嗜酸乳杆菌发酵液体饲料的制备
将保藏号为CICC6090的嗜酸乳杆菌菌种转接于MRS琼脂平板上，于36±1℃恒温静置培养48±2h；挑取平板上的单菌落接种于MRS肉汤试管，36±1℃恒温静置培养6h；将MRS肉汤试管的种子液转接至MRS肉汤三角瓶中，36±1℃恒温静置培养6h得到三级发酵种子液用于发酵液体饲料。
将经过粗粉的全脂米糠和小麦，按照质量比1∶3混合均匀，加入3倍重量的水，并接种5％的嗜酸乳杆菌种子液，混合均匀后30℃恒温发酵6h，制得液态发酵饲料。
取制得液态发酵饲料的样品测定pH值：液体发酵饲料的pH值采用PHS-3CpH计测定，结果为3.85。液体发酵饲料嗜酸乳杆菌活菌含量的测定按照GB 4789.35-2016进行，结果为嗜酸乳杆菌活菌含量3.3×109CFU/mL。液体发酵饲料乳酸含量的测定按照GB/T23877-2009进行，结果为乳酸含量22.01mg/mL。
实施例3：嗜酸乳杆菌发酵液体饲料的制备
将保藏号为CICC6090的嗜酸乳杆菌菌种转接于MRS琼脂平板上，于36±1℃恒温静置培养48±2h；挑取平板上的单菌落接种于MRS肉汤试管，36±1℃恒温静置培养6h；将MRS肉汤试管的种子液转接至MRS肉汤三角瓶中，36±1℃恒温静置培养6h得到三级发酵种子液用于发酵液体饲料。
将经过粗粉的全脂米糠和小麦，按照质量比1∶3混合均匀，加入3倍重量的水，并接种5％的嗜酸乳杆菌种子液，混合均匀后35℃恒温发酵8h，制得液态发酵饲料。
取样测定嗜酸乳杆菌活菌含量：液体发酵饲料的pH值采用PHS-3CpH计测定，结果为3.61。液体发酵饲料嗜酸乳杆菌活菌含量的测定按照GB4789.35-2016进行，结果为2.3×109CFU/mL。液体发酵饲料乳酸含量的测定按照GB/T 23877-2009进行，结果为乳酸含量20.96mg/mL。
实施例4：嗜酸乳杆菌发酵液体饲料的制备
将保存的嗜酸乳杆菌菌种转接于MRS琼脂平板上，于36±1℃恒温静置培养48±2h；挑取平板上的单菌落接种于MRS肉汤试管，36±1℃恒温静置培养6h；将MRS肉汤试管的种子液转接至MRS肉汤三角瓶中，36±1℃恒温静置培养6h得到三级种子液用于发酵液体饲料。
将经过粗粉的全脂米糠和小麦，按照质量比1∶3混合均匀，加入3倍重量的水，并接种5％的嗜酸乳杆菌种子液，混合均匀后25℃恒温发酵10h，制得液态发酵饲料。
取样测定乳酸含量：液体发酵饲料的pH值采用PHS-3CpH计测定，结果为4.08。液体发酵饲料嗜酸乳杆菌活菌含量的测定按照GB4789.35-2016进行，结果为1.9×109CFU/mL。液体发酵饲料乳酸含量的测定按照GB/T 23877-2009进行，结果为乳酸含量17.99mg/mL。
本发明从实验室现有的乳酸菌中筛选出适宜发酵液体饲料、产酸能力强的菌株，采用静置培养的方法制备乳酸菌种子液，相比厌氧培养对设备的要求简单，操作方便，本发明还对发酵液体饲料的发酵工艺进行了优化。本发明的嗜酸乳杆菌为同型乳酸发酵菌，可以在发酵6～10h后使发酵体系的pH值达到3.8～4.3，能有效抑制有害菌的生长，并且乳酸菌的活菌数量可以达到1.0～4.0×109CFU/mL，而且测定了液体发酵饲料中的乳酸含量，可以达到17.00～22.00mg/mL。
本发明选择适宜的菌株，产酸能力强，能量损失少。本发明的发酵工艺简单，种子液、发酵液的制备均不需要厌氧，制成发酵饲料的耗时短，发酵结束后的pH值低，乳酸含量高，活菌数量高。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种嗜酸乳杆菌发酵液体饲料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)从乳酸菌中筛选出适宜用作制造发酵液体饲料的嗜酸乳杆菌；
2)将所述嗜酸乳杆菌扩大培养，制得发酵种子液；
3)将植物性原料粉碎，向其中加入水制得料液；
4)将2)得到的嗜酸乳杆菌发酵种子液接入料液，混合、发酵，制得液态发酵饲料。
2.根据权利要求1所述的嗜酸乳杆菌发酵液体饲料的制备方法，其特征在于，在所述步骤1)中，筛选得到嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus保藏号为CICC6090。
3.根据权利要求1所述的嗜酸乳杆菌发酵液体饲料的制备方法，其特征在于，在所述步骤1)中，嗜酸乳杆菌是至少以发酵时间、发酵温度、产酸含量、是否产气、抑制病原菌能力为综合指标筛选出的同型发酵乳酸菌。1乳酸菌。
4.根据权利要求1所述的嗜酸乳杆菌发酵液体饲料的制备方法，其特征在于，在所述步骤2)中的发酵种子液的制备过程为：甘油保存菌种划MRS琼脂平板得到单菌落；挑取单菌落接种于装有10mL灭菌MRS肉汤的试管中，36±1℃静置培养6～8h；4～6％的接种量转接于装有灭菌MRS肉汤的三角瓶中，36±1℃静置培养6～8h，得到发酵种子液。
5.根据权利要求1所述的嗜酸乳杆菌发酵液体饲料的制备方法，其特征在于，在所述步骤3)中，植物性原料包括但不限于全脂米糠、小麦、玉米、豆粕、大豆粉。
6.根据权利要求1所述的嗜酸乳杆菌发酵液体饲料的制备方法，其特征在于，在所述步骤3)中，料液的水分含量为60～80％。
7.根据权利要求1所述的嗜酸乳杆菌发酵液体饲料的制备方法，其特征在于，在所述步骤4)中，嗜酸乳杆菌种子液的接种量为1～6％。
8.根据权利要求1所述的嗜酸乳杆菌发酵液体饲料的制备方法，其特征在于，在所述步骤4)中，混合后静置发酵，发酵温度25～35℃，发酵时间6～10h。
9.根据权利要求1所述的嗜酸乳杆菌发酵液体饲料的制备方法，其特征在于，在所述步骤4)中，混合后静置发酵，发酵温度25～35℃，发酵时间6～8h。
10.根据权利要求1所述的嗜酸乳杆菌发酵液体饲料的制备方法，其特征在于，在所述步骤4)中，制得的液态发酵饲料，pH值为3.8～4.3，嗜酸乳杆菌活菌含量1.0～4.0×109CFU/mL，乳酸含量17.00～22.00mg/mL。
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