CN101918550B - 用于检测人***瘤病毒的引物组和探针 - Google Patents

用于检测人***瘤病毒的引物组和探针 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是以高特异性和高灵敏度检测两种或更多种HPV类型。本发明提供：引物组1～23(各引物组如说明书中所记载)，探针1～23(各探针如说明书中所记载)，以及包含所述引物组和所述探针的试剂盒，它们所有都用于HPV的型特异性检测。

Description

用于检测人***瘤病毒的引物组和探针
技术领域
本发明涉及用于特异性检测人***瘤病毒的引物组和探针。本发明还涉及使用所述引物组和探针特异性检测人***瘤病毒的方法。 
背景技术
人***瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是在基因组中具有约8000碱基对的环状双链DNA的小型病毒，可引起人类特异性感染。据报道，存在多达100多种HPV亚型，主要分为在皮肤病变例如疣等中检出的亚型(嗜皮肤性HPV(skin tropic HPV))，以及在黏膜病变中检出的亚型(嗜黏膜性HPV)。此外，嗜黏膜性HPV被分成涉及例如***、肛周癌、***癌等癌症的高危型(HPV16、HPV18等)以及涉及良性***等的低危型(HPV6、HPV11等)。WHO估计，全球女性恶性肿瘤的11％涉及HPV感染，即大约有45万人受累于HPV感染，全球有3亿HPV感染携带者，说明HPV是一种常见的病毒。特别是***患者中几乎总是检出HPV。 
***位居全球人数最多的女性癌症的第二位，全球每年大约有25万人，日本每年大约有2500人死于***。因此，***的预防、诊断和治疗一直被视作是对女性健康十分重大的问题。幸运的是，预防***是可能的。其原因是通过细胞学诊断等，可以发现作为***癌前期病变的发育异常，而且通过简单治疗就可以治愈这种发育异常。由于发育异常是由HPV感染引起的，因此越来越多地认识到对HPV遗传筛查的重要性，这样就能够更早更准确地发现***或癌前期病变。 
HPV遗传筛查方法主要被分成包括直接检测HPV DNA的方法和 包括在检测DNA前通过聚合酶链式反应(PCR)使HPV DNA扩增的方法。 
一种无需采用PCR的代表性方法是杂交俘获方法(hybrid capturemethod)。在这种方法中，使RNA探针与样品中的HPV DNA杂交，采用抗体通过免疫测定法来检测所得到的DNA/RNA杂合体。由于方便，因此该方法目前是HPV遗传筛查的主要方法。另一方面，该方法由于使用RNA探针而导致的灵敏度低，稳定性低，而且污染的可能性无法排除，因此其可靠性低。此外，即使可以采用该方法鉴定出感染的HPV是高危型还是低危型，却都无法鉴定其亚型。 
在采用PCR的方法中，通过包括用限制性内切酶切割和用电泳检测条带的方法，或者包括与DNA微阵列上的探针杂交的检测方法，来检测扩增的DNA。前一种利用电泳的检测方法可在普通实验室设备上进行，在经济实用方面具有优势。然而缺点是需要复杂的步骤，而且鉴定的亚型不完全。另一方面，后一种利用与探针杂交的检测方法具有亚型鉴定的检测灵敏度高和特异性高。然而，在快速和经济实用方面存在问题。 
至于通过PCR的DNA扩增，使用型特异性引物(type-specificprimer)使HPV基因进行型特异性扩增的方法和使用随机引物或非型特异性引物(non-type-specific primer)使HPV基因进行非型特异性扩增的方法是已知的。 
在专利文献1和2所公开的方法中，使用型特异性引物通过PCR使DNA扩增。使用扩增的双链DNA本身作为探针，将扩增的DNA与专利文献1中的DNA微阵列进行杂交，并进行专利文献2中的电泳以检测HPV DNA的存在与否。这些方法通过使用型特异性引物实现了高特异性和高灵敏度的扩增。甚至当使用引物的混合物时，也能够特异性地检出特定的HPV类型。 
另一方面，在专利文献3所公开的方法中，使用非型特异性引物使HPV DNA扩增，并使用短的单链寡聚DNA作为探针与DNA微阵 列杂交以检测HPV DNA。由于该方法使用了普通引物，因此这在合成成本和设计简易性上是有利的。然而，即使通过使用短探针提高杂交的特异性，在某种程度上可以克服PCR中的低特异性和低灵敏度，但是总体灵敏度仍很低。即使按照专利文献4所公开的方法制备各种HPV类型的引物，由于相应的引物序列几乎相同，因此引物的制备方法仍被视为与专利文献3的方法几乎相同。 
在此情况下，需要开发在快速、方便和经济实用方面具有优势、能够以高特异性和高灵敏度检测多种HPV类型的方法。 
[专利文献1]JP-A-2004-121240 
[专利文献2]JP-A-2006-345800 
[专利文献3]专利申请公布号2005-503177 
[专利文献4]专利申请公布号2005-519611 
发明内容
发明要解决的技术问题 
本发明旨在提供用于以高特异性和高灵敏度检测多种HPV类型的引物组和探针。本发明还旨在提供使用上述引物组和探针以高特异性和高灵敏度检测多种HPV类型的方法。 
解决技术问题采用的技术方案 
在尝试解决上述技术问题时，本发明的发明人注意到一种检测HPV基因的方法，并进行了广泛深入的研究，该方法包括使用型特异性引物通过PCR使HPV基因扩增，使PCR扩增产物与用于检测的DNA微阵列杂交。因此，本发明的发明人发现通过使用本发明的引物组和探针，可以方便快速地以高特异性和高灵敏度检测多种HPV类型，这导致了本发明的完成。 
因此，本发明提供下列方面。 
[1]一种用于扩增人***瘤病毒(HPV)基因的PCR引物组，所述 引物组是至少一种选自以下的引物组： 
(1)引物组1，由包含SEQ ID NO：1所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：1所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ IDNO：2所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：2所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(2)引物组2，由包含SEQ ID NO：3所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：3所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ IDNO：4所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：4所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(3)引物组3，由包含SEQ ID NO：5所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：5所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ IDNO：6所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：6所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(4)引物组4，由包含SEQ ID NO：7所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：7所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ IDNO：8所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：8所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(5)引物组5，由包含SEQ ID NO：9所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：9所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ ID NO：10所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：10所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(6)引物组6，由包含SEQ ID NO：11所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：11所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQID NO：12所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：12所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(7)引物组7，由包含SEQ ID NO：13所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：13所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQID NO：14所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：14所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(8)引物组8，由包含SEQ ID NO：15所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：15所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQID NO：16所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：16所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(9)引物组9，由包含SEQ ID NO：17所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：17所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQID NO：18所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：18所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(10)引物组10，由包含SEQ ID NO：19所示碱基序列的引物或 其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：19所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ ID NO：20所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：20所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(11)引物组11，由包含SEQ ID NO：21所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：21所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ ID NO：22所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：22所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(12)引物组12，由包含SEQ ID NO：23所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：23所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ ID NO：24所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：24所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(13)引物组13，由包含SEQ ID NO：25所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：25所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ ID NO：26所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：26所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(14)引物组14，由包含SEQ ID NO：27所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：27所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ ID NO：28所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：28所示碱基序列互补的碱基序列 杂交的碱基序列的变异体组成， 
(15)引物组15，由包含SEQ ID NO：29所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：29所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ ID NO：30所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：30所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(16)引物组16，由包含SEQ ID NO：31所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：31所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ ID NO：32所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：32所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(17)引物组17，由包含SEQ ID NO：33所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：33所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ ID NO：34所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：34所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(18)引物组18，由包含SEQ ID NO：35所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：35所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ ID NO：36所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：36所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(19)引物组19，由包含SEQ ID NO：37所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：37所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含 SEQ ID NO：38所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：38所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(20)引物组20，由包含SEQ ID NO：39所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：39所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ ID NO：40所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：40所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(21)引物组21，由包含SEQ ID NO：41所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：41所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ ID NO：42所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：42所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(22)引物组22，由包含SEQ ID NO：43所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：43所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ ID NO：44所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：44所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成，和 
(23)引物组23，由包含SEQ ID NO：45所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：45所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ ID NO：46所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：46所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成。 
[2]一种用于检测人***瘤病毒(HPV)的探针，所述探针是至少 一种选自以下的探针： 
(1)包含SEQ ID NO：49所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：49所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：49所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：49所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针1)， 
(2)包含SEQ ID NO：50所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：50所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：50所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：50所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针2)， 
(3)包含SEQ ID NO：51所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：51所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：51所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：51所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针3)， 
(4)包含SEQ ID NO：52所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：52所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：52所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：52所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针4)， 
(5)包含SEQ ID NO：53所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：53所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：53 所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：53所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针5)， 
(6)包含SEQ ID NO：54所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：54所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：54所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：54所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针6)， 
(7)包含SEQ ID NO：55所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：55所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：55所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：55所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针7)， 
(8)包含SEQ ID NO：56所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：56所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：56所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：56所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针8)， 
(9)包含SEQ ID NO：57所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：57所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：57所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：57所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针9)， 
(10)包含SEQ ID NO：58所示碱基序列的探针或其同样具有作 为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：58所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：58所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：58所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针10)， 
(11)包含SEQ ID NO：59所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：59所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：59所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：59所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针11)， 
(12)包含SEQ ID NO：60所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：60所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：60所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：60所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针12)， 
(13)包含SEQ ID NO：61所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：61所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：61所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：61所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针13)， 
(14)包含SEQ ID NO：62所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：62所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：62所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：62所示碱基序列杂交的碱基序 列的变异体(探针14)， 
(15)包含SEQ ID NO：63所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：63所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：63所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：63所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针15)， 
(16)包含SEQ ID NO：64所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：64所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：64所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：64所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针16)， 
(17)包含SEQ ID NO：65所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：65所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：65所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：65所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针17)， 
(18)包含SEQ ID NO：66所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：66所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：66所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：66所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针18)， 
(19)包含SEQ ID NO：67所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：67所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO： 67所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：67所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针19)， 
(20)包含SEQ ID NO：68所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：68所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：68所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：68所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针20)， 
(21)包含SEQ ID NO：69所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：69所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：69所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：69所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针21)， 
(22)包含SEQ ID NO：70所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：70所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：70所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：70所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针22)，和 
(23)包含SEQ ID NO：71所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：71所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：71所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：71所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针23)。 
[3]一种用于检测人***瘤病毒(HPV)的试剂盒，所述试剂盒包 含： 
(1)引物组1和探针1的组合，(2)引物组2和探针2的组合，(3)引物组3和探针3的组合，(4)引物组4和探针4的组合，(5)引物组5和探针5的组合，(6)引物组6和探针6的组合，(7)引物组7和探针7的组合，(8)引物组8和探针8的组合，(9)引物组9和探针9的组合，(10)引物组10和探针10的组合，(11)引物组11和探针11的组合，(12)引物组12和探针12的组合，(13)引物组13和探针13的组合，(14)引物组14和探针14的组合，(15)引物组15和探针15的组合，(16)引物组16和探针16的组合，(17)引物组17和探针17的组合，(18)引物组18和探针18的组合，(19)引物组19和探针19的组合，(20)引物组20和探针20的组合，(21)引物组21和探针21的组合，(22)引物组22和探针22的组合及(23)引物组23和探针23的组合，以及任选(24)引物组24和探针24的组合。 
[4]上述[3]的试剂盒，所述试剂盒包含两种或更多种选自上述组合(1)～(23)的组合。 
[5]上述[3]或[4]的试剂盒，所述试剂盒包含引物组3和探针3的组合及引物组4和探针4的组合，以及任选引物组24和探针24的组合。 
[6]上述[3]或[4]的试剂盒，所述试剂盒包含引物组3和探针3的组合、引物组4和探针4的组合、引物组5和探针5的组合、引物组6和探针6的组合、引物组7和探针7的组合、引物组9和探针9的组合、引物组10和探针10的组合、引物组13和探针13的组合、引物组14和探针14的组合、引物组15和探针15的组合、引物组18和探针18的组合、引物组19和探针19的组合、引物组20和探针20的组合及引物组23和探针23的组合，以及任选引物组24和探针24的组合。 
[7]上述[3]或[4]的试剂盒，所述试剂盒包含引物组1和探针1的组合、引物组2和探针2的组合、引物组3和探针3的组合、引物组 4和探针4的组合、引物组5和探针5的组合、引物组6和探针6的组合、引物组7和探针7的组合、引物组8和探针8的组合、引物组9和探针9的组合、引物组10和探针10的组合、引物组11和探针11的组合、引物组12和探针12的组合、引物组13和探针13的组合、引物组14和探针14的组合、引物组15和探针15的组合、引物组16和探针16的组合、引物组17和探针17的组合、引物组18和探针18的组合、引物组19和探针19的组合、引物组20和探针20的组合、引物组21和探针21的组合、引物组22和探针22的组合及引物组23和探针23的组合，以及任选引物组24和探针24的组合。 
[8]一种通过使用上述[3]～[7]中任一项的试剂盒以型特异性方式检测样品中HPV存在与否的方法，所述方法包括使用前述引物组和从样品中提取的DNA作为模板进行PCR的步骤，以及检测扩增DNA产物的步骤。 
[9]一种通过使用上述[3]～[7]中任一项的试剂盒以型特异性方式检测样品中HPV存在与否的方法，所述方法包括使用前述引物组和从样品中提取的DNA作为模板进行PCR的步骤，处理扩增DNA产物以具有单链的步骤，以及使单链DNA与前述探针杂交后进行检测的步骤。 
[10]一种用于检测HPV的DNA微阵列，其中将至少一种选自上述[2]中所述的探针1～23的探针固定化。 
[11]上述[10]的DNA微阵列，其中将两种或更多种选自上述[2]中所述的探针1～23的探针固定化。 
[12]上述[10]或[11]的DNA微阵列，其中将探针24固定化。 
发明的有益效果 
本发明提供能够方便快速地以高特异性和高灵敏度检测多种HPV类型的引物组和探针。本发明还提供通过使用前述引物组和探针能够方便快速地以高特异性和高灵敏度检测多种HPV类型的方法。 
附图简述 
图1表示使用磁珠分离单链DNA的步骤(反义链DNA的分离)的概念图。 
图2表示扩增DNA产物的琼脂糖凝胶电泳的结果。 
图3表示制备的DNA微阵列上的点配置。 
图4扫描影像表示检测经分离的标记单链DNA与DNA微阵列杂交的结果。 
图5表示使用磁珠进行与不进行单链DNA分离步骤之间HPV检测灵敏度的差异。 
实施发明的最佳方式 
本发明提供用于扩增HPV基因的PCR引物组，特别是型特异性引物组。引物组的实例包括下列(1)～(23)所示的引物组。 
(1)引物组1，由包含SEQ ID NO：1所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：1所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ IDNO：2所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：2所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(2)引物组2，由包含SEQ ID NO：3所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：3所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ IDNO：4所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：4所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(3)引物组3，由包含SEQ ID NO：5所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：5所示 碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ IDNO：6所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：6所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(4)引物组4，由包含SEQ ID NO：7所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：7所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ IDNO：8所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：8所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(5)引物组5，由包含SEQ ID NO：9所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：9所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ IDNO：10所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：10所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(6)引物组6，由包含SEQ ID NO：11所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：11所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQID NO：12所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：12所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(7)引物组7，由包含SEQ ID NO：13所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：13所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQID NO：14所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：14所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(8)引物组8，由包含SEQ ID NO：15所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：15所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQID NO：16所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：16所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(9)引物组9，由包含SEQ ID NO：17所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：17所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQID NO：18所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：18所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(10)引物组10，由包含SEQ ID NO：19所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：19所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ ID NO：20所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：20所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(11)引物组11，由包含SEQ ID NO：21所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：21所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ ID NO：22所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：22所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(12)引物组12，由包含SEQ ID NO：23所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：23所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ ID NO：24所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且 包含在严格条件下与同SEQ ID NO：24所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(13)引物组13，由包含SEQ ID NO：25所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：25所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ ID NO：26所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：26所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(14)引物组14，由包含SEQ ID NO：27所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：27所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ ID NO：28所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：28所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(15)引物组15，由包含SEQ ID NO：29所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：29所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ ID NO：30所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：30所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(16)引物组16，由包含SEQ ID NO：31所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：31所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ ID NO：32所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：32所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(17)引物组17，由包含SEQ ID NO：33所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：33 所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ ID NO：34所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：34所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(18)引物组18，由包含SEQ ID NO：35所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：35所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ ID NO：36所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：36所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(19)引物组19，由包含SEQ ID NO：37所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：37所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ ID NO：38所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：38所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(20)引物组20，由包含SEQ ID NO：39所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：39所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ ID NO：40所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：40所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(21)引物组21，由包含SEQ ID NO：41所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：41所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ ID NO：42所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：42所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成， 
(22)引物组22，由包含SEQ ID NO：43所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：43所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ ID NO：44所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：44所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成，和 
(23)引物组23，由包含SEQ ID NO：45所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：45所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，以及包含SEQ ID NO：46所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：46所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成。 
引物组1中的“包含SEQ ID NO：1所示碱基序列的引物”和“包含SEQ ID NO：2所示碱基序列的引物”表示的含义分别与“包含SEQID NO：1所示碱基序列的寡核苷酸”和“包含SEQ ID NO：2所示碱基序列的寡核苷酸”相同，下文亦分别简称为“SEQ ID NO：1的引物”和“SEQ ID NO：2的引物”。 
“其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ IDNO：1所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体”是在严格条件下与包含同SEQ ID NO：1所示碱基序列互补的碱基序列的上述寡核苷酸杂交、且具有作为类似于包含SEQ ID NO：1所示碱基序列的寡核苷酸的引物的功能的寡核苷酸，所述功能即能够通过与包含SEQ ID NO：2所示碱基序列的引物混合，使HPV6基因的特定区域进行PCR扩增的功能。在下文中，该变异体亦简称为“SEQ ID NO：1的引物变异体”。同样，“其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：2所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体”是在严格条件下与包含同SEQ ID NO：2所示碱基序列互补的碱基序列的上述寡核苷酸杂交、且具有作为类似于包含SEQ ID NO：2所示碱基序列的寡核苷酸的引物的功能的寡核苷酸，所述功能即能够通过与包含SEQ ID NO：1所示碱基序列的引物混合，使HPV6基因的特定区域进行PCR扩增的功能。在下文中，亦简称为“SEQ IDNO：2的引物变异体”。“变异体”是在保持其作为引物的功能不变的范围内，原寡核苷酸中取代、缺失、***或添加一个或多个核苷酸。 
已知杂交中的严格性是温度、盐浓度、引物链长、引物核苷酸序列的GC含量和杂交缓冲液中离液剂浓度的函数。至于严格条件，可采用例如以下文献描述的条件：Sambrook，J.等(1998)MolecularCloning：A Laboratory Manual(第二版)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York等。严格温度条件约为30℃以上，更优选约37℃以上，最优选约42℃以上。其它条件为杂交时间、去污剂(例如SDS)浓度、载体DNA存在与否等，通过综合这些条件可设置各种严格性。本领域普通技术人员可适当地确定各条件以获得具有作为PCR引物的功能以扩增所需HPV基因的变异体。 
引物组1由“SEQ ID NO：1的引物”或“SEQ ID NO：1的引物变异体”和“SEQ ID NO：2的引物”或“SEQ ID NO：2的引物变异体”组成，优选由“SEQ ID NO：1的引物”和“SEQ ID NO：2的引物”组成。 
可按照与引物组1相同的方式定义引物组2～引物组23的每个引物。具体来讲，引物组2由“SEQ ID NO：3的引物”或“SEQ ID NO：3的引物变异体”和“SEQ ID NO：4的引物”或“SEQ ID NO：4的引物变异体”组成，优选由“SEQ ID NO：3的引物”和“SEQ ID NO：4的引物”组成，并且可以扩增HPV11基因的特定区域， 
引物组3由“SEQ ID NO：5的引物”或“SEQ ID NO：5的引物变异体”和“SEQ ID NO：6的引物”或“SEQ ID NO：6的引物变异体”组成，优选由“SEQ ID NO：5的引物”和“SEQ ID NO：6的引物”组成，并且可以扩增HPV16基因的特定区域， 
引物组4由“SEQ ID NO：7的引物”或“SEQ ID NO：7的引物 变异体”和“SEQ ID NO：8的引物”或“SEQ ID NO：8的引物变异体”组成，优选由“SEQ ID NO：7的引物”和“SEQ ID NO：8的引物”组成，并且可以扩增HPV18基因的特定区域， 
引物组5由“SEQ ID NO：9的引物”或“SEQ ID NO：9的引物变异体”和“SEQ ID NO：10的引物”或“SEQ ID NO：10的引物变异体”组成，优选由“SEQ ID NO：9的引物”和“SEQ ID NO：10的引物”组成，并且可以扩增HPV30基因的特定区域， 
引物组6由“SEQ ID NO：11的引物”或“SEQ ID NO：11的引物变异体”和“SEQ ID NO：12的引物”或“SEQ ID NO：12的引物变异体”组成，优选由“SEQ ID NO：11的引物”和“SEQ ID NO：12的引物”组成，并且可以扩增HPV31基因的特定区域， 
引物组7由“SEQ ID NO：13的引物”或“SEQ ID NO：13的引物变异体”和“SEQ ID NO：14的引物”或“SEQ ID NO：14的引物变异体”组成，优选由“SEQ ID NO：13的引物”和“SEQ ID NO：14的引物”组成，并且可以扩增HPV33基因的特定区域， 
引物组8由“SEQ ID NO：15的引物”或“SEQ ID NO：15的引物变异体”和“SEQ ID NO：16的引物”或“SEQ ID NO：16的引物变异体”组成，优选由“SEQ ID NO：15的引物”和“SEQ ID NO：16的引物”组成，并且可以扩增HPV34基因的特定区域， 
引物组9由“SEQ ID NO：17的引物”或“SEQ ID NO：17的引物变异体”和“SEQ ID NO：18的引物”或“SEQ ID NO：18的引物变异体”组成，优选由“SEQ ID NO：17的引物”和“SEQ ID NO：18的引物”组成，并且可以扩增HPV35基因的特定区域， 
引物组10由“SEQ ID NO：19的引物”或“SEQ ID NO：19的引物变异体”和“SEQ ID NO：20的引物”或“SEQ ID NO：20的引物变异体”组成，优选由“SEQ ID NO：19的引物”和“SEQ ID NO：20的引物”组成，并且可以扩增HPV39基因的特定区域， 
引物组11由“SEQ ID NO：21的引物”或“SEQ ID NO：21的引 物变异体”和“SEQ ID NO：22的引物”或“SEQ ID NO：22的引物变异体”组成，优选由“SEQ ID NO：21的引物”和“SEQ ID NO：22的引物”组成，并且可以扩增HPV40基因的特定区域， 
引物组12由“SEQ ID NO：23的引物”或“SEQ ID NO：23的引物变异体”和“SEQ ID NO：24的引物”或“SEQ ID NO：24的引物变异体”组成，优选由“SEQ ID NO：23的引物”和“SEQ ID NO：24的引物”组成，并且可以扩增HPV42基因的特定区域， 
引物组13由“SEQ ID NO：25的引物”或“SEQ ID NO：25的引物变异体”和“SEQ ID NO：26的引物”或“SEQ ID NO：26的引物变异体”组成，优选由“SEQ ID NO：25的引物”和“SEQ ID NO：26的引物”组成，并且可以扩增HPV45基因的特定区域， 
引物组14由“SEQ ID NO：27的引物”或“SEQ ID NO：27的引物变异体”和“SEQ ID NO：28的引物”或“SEQ ID NO：28的引物变异体”组成，优选由“SEQ ID NO：27的引物”和“SEQ ID NO：28的引物”组成，并且可以扩增HPV51基因的特定区域， 
引物组15由“SEQ ID NO：29的引物”或“SEQ ID NO：29的引物变异体”和“SEQ ID NO：30的引物”或“SEQ ID NO：30的引物变异体”组成，优选由“SEQ ID NO：29的引物”和“SEQ ID NO：30的引物”组成，并且可以扩增HPV52基因的特定区域， 
引物组16由“SEQ ID NO：31的引物”或“SEQ ID NO：31的引物变异体”和“SEQ ID NO：32的引物”或“SEQ ID NO：32的引物变异体”组成，优选由“SEQ ID NO：31的引物”和“SEQ ID NO：32的引物”组成，并且可以扩增HPV53基因的特定区域， 
引物组17由“SEQ ID NO：33的引物”或“SEQ ID NO：33的引物变异体”和“SEQ ID NO：34的引物”或“SEQ ID NO：34的引物变异体”组成，优选由“SEQ ID NO：33的引物”和“SEQ ID NO：34的引物”组成，并且可以扩增HPV54基因的特定区域， 
引物组18由“SEQ ID NO：35的引物”或“SEQ ID NO：35的引 物变异体”和“SEQ ID NO：36的引物”或“SEQ ID NO：36的引物变异体”组成，优选由“SEQ ID NO：35的引物”和“SEQ ID NO：36的引物”组成，并且可以扩增HPV56基因的特定区域， 
引物组19由“SEQ ID NO：37的引物”或“SEQ ID NO：37的引物变异体”和“SEQ ID NO：38的引物”或“SEQ ID NO：38的引物变异体”组成，优选由“SEQ ID NO：37的引物”和“SEQ ID NO：38的引物”组成，并且可以扩增HPV58基因的特定区域， 
引物组20由“SEQ ID NO：39的引物”或“SEQ ID NO：39的引物变异体”和“SEQ ID NO：40的引物”或“SEQ ID NO：40的引物变异体”组成，优选由“SEQ ID NO：39的引物”和“SEQ ID NO：40的引物”组成，并且可以扩增HPV59基因的特定区域， 
引物组21由“SEQ ID NO：41的引物”或“SEQ ID NO：41的引物变异体”和“SEQ ID NO：42的引物”或“SEQ ID NO：42的引物变异体”组成，优选由“SEQ ID NO：41的引物”和“SEQ ID NO：42的引物”组成，并且可以扩增HPV61基因的特定区域， 
引物组22由“SEQ ID NO：43的引物”或“SEQ ID NO：43的引物变异体”和“SEQ ID NO：44的引物”或“SEQ ID NO：44的引物变异体”组成，优选由“SEQ ID NO：43的引物”和“SEQ ID NO：44的引物”组成，并且可以扩增HPV66基因的特定区域， 
引物组23由“SEQ ID NO：45的引物”或“SEQ ID NO：45的引物变异体”和“SEQ ID NO：46的引物”或“SEQ ID NO：46的引物变异体”组成，优选由“SEQ ID NO：45的引物”和“SEQ ID NO：46的引物”组成，并且可以扩增HPV68基因的特定区域。 
各引物组的一个实例见表1。如稍后所述，在本发明中，可以任选使用用作内标以扩增G3PDH(甘油醛三磷酸脱氢酶)基因的引物组。用于扩增G3PDH基因的引物组(引物组24)由包含SEQ ID NO：47所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：47所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列 的变异体，以及包含SEQ ID NO：48所示碱基序列的引物或其同样具有作为引物的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：48所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体组成。 
[表1-1] 
Figure GPA00001077518700261
[表1-2] 
(续) 
Figure GPA00001077518700271
*F表示正向引物，R表示反向引物。 
**位置(nt)表示基因组上引物5’端与之结合的位置。 
在上述表1中，各个病毒类型基因组和G3PHD上各引物与之结合的位置(nt)，是表2所示的各基因在GenBank(美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI))登录号下的基因序列上的位置。 
[表2] 
  基因名称   GenBank登录号
  HPV6   AF092932
  HPV11   M14119
  HPV16   NC_001526
  HPV18   X05015
  HPV30   X74474
  HPV31   J04353
  HPV33   M12732
  HPV34   X74476
  HPV35   M74117
  HPV39   M62849
  HPV40   X74478
  HPV42   M73236
  HPV45   X74479
  HPV51   M62877
  HPV52   X74481
  HPV53   X74482
  HPV54   U37488
  HPV56   X74483
  HPV58   D90400
  HPV59   X77858
  HPV61   U31793
  HPV66   U31794
  HPV68   M73258
  G3PDH   DQ894744
本发明的引物被设计成提高对各个HPV基因的特异性(100％互补性)且与其它HPV类型不具有高度同源性的序列，并且引物组之间的Tm值较接近。因此，当在一个试管中进行这些引物的混合物的多重PCR时，可以特异性地扩增存在于样品中HPV基因的特定类型。 
可以根据表1所述的每个引物的信息来设计每个引物的变异体序列。准确地讲，设计SEQ ID NO：1的引物变异体以提供使其和SEQ ID NO：2的引物(或SEQ ID NO：2的引物变异体)进行PCR反应得到的 PCR产物、与SEQ ID NO：1的引物和SEQ ID NO：2的引物进行PCR反应得到的PCR产物具有相同或较高的同源性。同源性水平至少为80％，优选至少90％，特别优选至少95％。SEQ ID NO：1引物的5’端与HPV6(GenBank登录号：AF092932)基因组上的第7251位结合。与±50位、优选±20位、特别优选±10位结合的引物，也属于本发明SEQ ID NO：1的引物变异体的范围。 
作为初始设置，可应用常规用于本领域的同源性检索程序(例如BLAST、FASTA等)来确定同源性(％)。另一方面，可运用本领域已知的任何算法确定同源性(％)，例如Needleman等(1970)(J.Mol.Biol.48：444-453)、Myers和Miller(CABIOS，1988，4：11-17)的算法等。Needleman等人的算法已被合编到GCG软件包的GAP程序(可获自www.gcg.com)中，可应用例如BLOSUM 62矩阵或PAM250矩阵；空位权重(gap weight)：16、14、12、10、8、6或4；以及长度权重：1、2、3、4、5或6中的任一个，来确定同源性(％)。另外，Myers和Miller的算法被合编到GCG序列比对软件包的组成部分ALIGN程序中。例如，当运用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表(weight residue table)、空位长度罚分(gap length penalty)12、和空位罚分4。 
可以使用例如通用DNA合成仪(例如由Applied Biosystems制造的394型)，经化学方法合成本发明引物组中的各个核苷酸。还可采用本领域众所周知的任何其它方法来合成寡核苷酸。 
本发明还提供与前述PCR扩增产物特异性杂交的探针。该探针是每个PCR扩增产物的碱基序列中包含的单链DNA，可以是有义链DNA或反义链DNA。其具体实例包括下列探针(1)～(23)。 
(1)包含SEQ ID NO：49所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：49所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：49所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：49所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针1)， 
(2)包含SEQ ID NO：50所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：50所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：50所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：50所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针2)， 
(3)包含SEQ ID NO：51所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：51所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：51所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：51所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针3)， 
(4)包含SEQ ID NO：52所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：52所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：52所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：52所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针4)， 
(5)包含SEQ ID NO：53所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：53所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：53所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：53所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针5)， 
(6)包含SEQ ID NO：54所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：54所示碱基序列互 补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：54所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：54所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针6)， 
(7)包含SEQ ID NO：55所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：55所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：55所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：55所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针7)， 
(8)包含SEQ ID NO：56所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：56所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：56所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：56所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针8)， 
(9)包含SEQ ID NO：57所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：57所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：57所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：57所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针9)， 
(10)包含SEQ ID NO：58所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：58所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：58所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：58所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针10)， 
(11)包含SEQ ID NO：59所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：59所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：59所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：59所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针11)， 
(12)包含SEQ ID NO：60所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：60所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：60所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：60所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针12)， 
(13)包含SEQ ID NO：61所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：61所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：61所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：61所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针13)， 
(14)包含SEQ ID NO：62所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：62所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：62所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：62所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针14)， 
(15)包含SEQ ID NO：63所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：63所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：63所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功 能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：63所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针15)， 
(16)包含SEQ ID NO：64所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：64所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：64所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：64所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针16)， 
(17)包含SEQ ID NO：65所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：65所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：65所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：65所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针17)， 
(18)包含SEQ ID NO：66所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：66所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：66所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：66所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针18)， 
(19)包含SEQ ID NO：67所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：67所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：67所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：67所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针19)， 
(20)包含SEQ ID NO：68所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：68所示碱基序列 互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：68所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：68所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针20)， 
(21)包含SEQ ID NO：69所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：69所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：69所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：69所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针21)， 
(22)包含SEQ ID NO：70所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：70所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：70所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：70所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针22)，和 
(23)包含SEQ ID NO：71所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：71所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：71所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：71所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体(探针23)。 
在探针1中的“包含SEQ ID NO：49所示碱基序列的探针”表示的含义与“包含SEQ ID NO：49所示碱基序列的寡核苷酸”相同，下文亦简称为“SEQ ID NO：49的探针”。 
“其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ IDNO：49所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体”是在严格条件下与包含同SEQ ID NO：49所示碱基序列互补的碱基序列的 上述寡核苷酸杂交、且具有作为类似于包含SEQ ID NO：49所示碱基序列的寡核苷酸的探针的功能的寡核苷酸，所述功能即能够检测HPV6基因的特定区域。在下文中，该变异体亦简称为“SEQ ID NO：49的探针变异体”。“变异体”是在保持其作为探针的功能的范围内，原寡核苷酸中取代、缺失、***或添加一个或多个核苷酸。 
“包含与SEQ ID NO：49所示碱基序列互补的碱基序列的探针”表示的含义与“包含与SEQ ID NO：49所示碱基序列互补的碱基序列的寡核苷酸”相同，下文亦简称为“与SEQ ID NO：49互补的探针”。 
“其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与SEQ ID NO：49所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体”是在严格条件下与包含SEQ ID NO：49所示碱基序列的上述寡核苷酸杂交、且具有作为类似于包含与SEQ ID NO：49所示碱基序列互补的碱基序列的寡核苷酸的探针的功能的寡核苷酸，所述功能即能够检测HPV6基因的特定区域。在下文中，该变异体亦简称为“与SEQ ID NO：49互补的探针变异体”。“变异体”是在保持其作为探针的功能的范围内，原寡核苷酸中取代、缺失、***或添加一个或多个核苷酸。 
已知杂交中的严格性是温度、盐浓度、探针链长、探针核苷酸序列的GC含量和杂交缓冲液中离液剂浓度的函数。至于严格条件，可采用例如下列文献所描述的条件：Sambrook，J.等(1998)MolecularCloning：A Laboratory Manual(第二版)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York等。严格温度条件约为30℃以上，更优选约37℃以上，最优选约42℃以上。其它条件为杂交时间、去污剂(例如SDS)浓度、载体DNA存在与否等，综合这些条件可设置各种严格性。本领域普通技术人员可适当地确定各条件以获得具有作为探针的功能以检测所需HPV基因的变异体。 
探针1是“SEQ ID NO：49的探针”、“SEQ ID NO：49的探针变异体”、“与SEQ ID NO：49互补的探针”和“与SEQ ID NO：49互补的探针变异体”中的任一个，优选“SEQ ID NO：49的探针”或 “与SEQ ID NO：49互补的探针”。 
可按照与探针1相同的方式定义探针2～探针23。具体来讲， 
探针2是“SEQ ID NO：50的探针”、“SEQ ID NO：50的探针变异体”、“与SEQ ID NO：50互补的探针”和“与SEQ ID NO：50互补的探针变异体”中的任一个，优选“SEQ ID NO：50的探针”或“与SEQ ID NO：50互补的探针”，并且可以检测HPV11基因的特定区域， 
探针3是“SEQ ID NO：51的探针”、“SEQ ID NO：51的探针变异体”、“与SEQ ID NO：51互补的探针”和“与SEQ ID NO：51互补的探针变异体”中的任一个，优选“SEQ ID NO：51的探针”或“与SEQ ID NO：51互补的探针”，并且可以检测HPV16基因的特定区域， 
探针4是“SEQ ID NO：52的探针”、“SEQ ID NO：52的探针变异体”、“与SEQ ID NO：52互补的探针”和“与SEQ ID NO：52互补的探针变异体”中的任一个，优选“SEQ ID NO：52的探针”或“与SEQ ID NO：52互补的探针”，并且可以检测HPV18基因的特定区域， 
探针5是“SEQ ID NO：53的探针”、“SEQ ID NO：53的探针变异体”、“与SEQ ID NO：53互补的探针”和“与SEQ ID NO：53互补的探针变异体”中的任一个，优选“SEQ ID NO：53的探针”或“与SEQ ID NO：53互补的探针”，并且可以检测HPV30基因的特定区域， 
探针6是“SEQ ID NO：54的探针”、“SEQ ID NO：54的探针变异体”、“与SEQ ID NO：54互补的探针”和“与SEQ ID NO：54互补的探针变异体”中的任一个，优选“SEQ ID NO：54的探针”或“与SEQ ID NO：54互补的探针”，并且可以检测HPV31基因的特定区域， 
探针7是“SEQ ID NO：55的探针”、“SEQ ID NO：55的探针 变异体”、“与SEQ ID NO：55互补的探针”和“与SEQ ID NO：55互补的探针变异体”中的任一个，优选“SEQ ID NO：55的探针”或“与SEQ ID NO：55互补的探针”，并且可以检测HPV33基因的特定区域， 
探针8是“SEQ ID NO：56的探针”、“SEQ ID NO：56的探针变异体”、“与SEQ ID NO：56互补的探针”和“与SEQ ID NO：56互补的探针变异体”中的任一个，优选“SEQ ID NO：56的探针”或“与SEQ ID NO：56互补的探针”，并且可以检测HPV34基因的特定区域， 
探针9是“SEQ ID NO：57的探针”、“SEQ ID NO：57的探针变异体”、“与SEQ ID NO：57互补的探针”和“与SEQ ID NO：57互补的探针变异体”中的任一个，优选“SEQ ID NO：57的探针”或“与SEQ ID NO：57互补的探针”，并且可以检测HPV35基因的特定区域， 
探针10是“SEQ ID NO：58的探针”、“SEQ ID NO：58的探针变异体”、“与SEQ ID NO：58互补的探针”和“与SEQ ID NO：58互补的探针变异体”中的任一个，优选“SEQ ID NO：58的探针”或“与SEQ ID NO：58互补的探针”，并且可以检测HPV39基因的特定区域， 
探针11是“SEQ ID NO：59的探针”、“SEQ ID NO：59的探针变异体”、“与SEQ ID NO：59互补的探针”和“与SEQ ID NO：59互补的探针变异体”中的任一个，优选“SEQ ID NO：59的探针”或“与SEQ ID NO：59互补的探针”，并且可以检测HPV40基因的特定区域， 
探针12是“SEQ ID NO：60的探针”、“SEQ ID NO：60的探针变异体”、“与SEQ ID NO：60互补的探针”和“与SEQ ID NO：60互补的探针变异体”中的任一个，优选“SEQ ID NO：60的探针”或“与SEQ ID NO：60互补的探针”，并且可以检测HPV42基因的特定 区域， 
探针13是“SEQ ID NO：61的探针”、“SEQ ID NO：61的探针变异体”、“与SEQ ID NO：61互补的探针”和“与SEQ ID NO：61互补的探针变异体”中的任一个，优选“SEQ ID NO：61的探针”或“与SEQ ID NO：61互补的探针”，并且可以检测HPV45基因的特定区域， 
探针14是“SEQ ID NO：62的探针”、“SEQ ID NO：62的探针变异体”、“与SEQ ID NO：62互补的探针”和“与SEQ ID NO：62互补的探针变异体”中的任一个，优选“SEQ ID NO：62的探针”或“与SEQ ID NO：62互补的探针”，并且可以检测HPV51基因的特定区域， 
探针15是“SEQ ID NO：63的探针”、“SEQ ID NO：63的探针变异体”、“与SEQ ID NO：63互补的探针”和“与SEQ ID NO：63互补的探针变异体”中的任一个，优选“SEQ ID NO：63的探针”或“与SEQ ID NO：63互补的探针”，并且可以检测HPV52基因的特定区域， 
探针16是“SEQ ID NO：64的探针”、“SEQ ID NO：64的探针变异体”、“与SEQ ID NO：64互补的探针”和“与SEQ ID NO：64互补的探针变异体”中的任一个，优选“SEQ ID NO：64的探针”或“与SEQ ID NO：64互补的探针”，并且可以检测HPV53基因的特定区域， 
探针17是“SEQ ID NO：65的探针”、“SEQ ID NO：65的探针变异体”、“与SEQ ID NO：65互补的探针”和“与SEQ ID NO：65互补的探针变异体”中的任一个，优选“SEQ ID NO：65的探针”或“与SEQ ID NO：65互补的探针”，并且可以检测HPV54基因的特定区域， 
探针18是“SEQ ID NO：66的探针”、“SEQ ID NO：66的探针变异体”、“与SEQ ID NO：66互补的探针”和“与SEQ ID NO：66 互补的探针变异体”中的任一个，优选“SEQ ID NO：66的探针”或“与SEQ ID NO：66互补的探针”，并且可以检测HPV56基因的特定区域， 
探针19是“SEQ ID NO：67的探针”、“SEQ ID NO：67的探针变异体”、“与SEQ ID NO：67互补的探针”和“与SEQ ID NO：67互补的探针变异体”中的任一个，优选“SEQ ID NO：67的探针”或“与SEQ ID NO：67互补的探针”，并且可以检测HPV58基因的特定区域， 
探针20是“SEQ ID NO：68的探针”、“SEQ ID NO：68的探针变异体”、“与SEQ ID NO：68互补的探针”和“与SEQ ID NO：68互补的探针变异体”中的任一个，优选“SEQ ID NO：68的探针”或“与SEQ ID NO：68互补的探针”，并且可以检测HPV59基因的特定区域， 
探针21是“SEQ ID NO：69的探针”、“SEQ ID NO：69的探针变异体”、“与SEQ ID NO：69互补的探针”和“与SEQ ID NO：69互补的探针变异体”中的任一个，优选“SEQ ID NO：69的探针”或“与SEQ ID NO：69互补的探针”，并且可以检测HPV61基因的特定区域， 
探针22是“SEQ ID NO：70的探针”、“SEQ ID NO：70的探针变异体”、“与SEQ ID NO：70互补的探针”和“与SEQ ID NO：70互补的探针变异体”中的任一个，优选“SEQ ID NO：70的探针”或“与SEQ ID NO：70互补的探针”，并且可以检测HPV66基因的特定区域， 
探针23是“SEQ ID NO：71的探针”、“SEQ ID NO：71的探针变异体”、“与SEQ ID NO：71互补的探针”和“与SEQ ID NO：71互补的探针变异体”中的任一个，优选“SEQ ID NO：71的探针”或“与SEQ ID NO：71互补的探针”，并且可以检测HPV68基因的特定区域。 
各探针当为有义链DNA时的一个实例见表3。如稍后所述，在本发明中，可以任选使用用作内标以检测G3PDH基因的探针。用于检测G3PDH基因的探针(探针24)为包含SEQ ID NO：72所示碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能且包含在严格条件下与同SEQ ID NO：72所示碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的变异体，或者包含与SEQ ID NO：72所示碱基序列互补的碱基序列的探针或其同样具有作为探针的功能的变异体且包含在严格条件下与SEQID NO：72所示碱基序列杂交的碱基序列的变异体。 
各探针的碱基序列、Tm值、大小和在基因组上位置见表3。 
[表3-1] 
Figure 401455DEST_PATH_GSB00000220020800011
[表3-2] 
(续表) 
Figure GPA00001077518700411
探针(有义链DNA)的位置(nt)用在各病毒类型基因组和G3PDH上的位置(5’→3’)表示。位置对应于表2中所示各基因在GenBank登录号下基因序列中的位置。 
探针的长度相对较短，为69～71bp，且设计成与其它类型的HPV不具有高同源性的序列。因此，它与各PCR扩增产物杂交的特异性极高。例如，通过使PCR扩增产物与用于检测的DNA微阵列杂交，可以检测样品中各HPV的存在与否，其中将各HPV的特异性探针固定在支持体上。 
可根据表3中所示的各探针的信息，来设计各探针变异体的序列。具体来讲，将SEQ ID NO：49的探针变异体设计成具有高同源性的寡核苷酸，以允许在严格条件下与包含同HPV6基因组上7519位～7588位碱基序列互补的碱基序列的寡核苷酸杂交。同源性水平至少为80％， 优选至少90％，特别优选至少95％。SEQ ID NO：49的探针对应于HPV6(GenBank登录号：AF092932)基因组上的7519位～7588位区域。只要可以特异性地检测HPV6基因，5’末端侧和3’末端侧则可变动±50位，优选±20位，特别优选±10位。 
当探针是反义链DNA时，可根据与表3所示各HPV基因特异性序列互补的序列，来设计所需要的HPV型特异性探针。 
作为初始设置，可应用常规用于本领域的同源性检索程序(例如BLAST、FASTA等)来确定同源性(％)。另一方面，可运用本领域已知的任何算法确定同源性(％)，例如Needleman等(1970)(J.Mol.Biol.48：444-453)、Myers和Miller(CABIOS，1988，4：11-17)的算法等。Needleman等人的算法已被合编到GCG软件包的GAP程序(可获自www.gcg.com)中，可应用例如BLOSUM 62矩阵或PAM250矩阵；空位权重：16、14、12、10、8、6或4；以及长度权重：1、2、3、4、5或6中的任一个，来确定同源性(％)。另外，Myers和Miller的算法被合编到GCG序列比对软件包的组成部分ALIGN程序中。例如，当运用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。 
可以使用例如通用DNA合成仪(例如由Applied Biosystems制造的394型)，经化学方法合成探针的各个核苷酸。可采用本领域众所周知的任何其它方法合成寡核苷酸。 
在本发明的一个方面，提供用于HPV检测的试剂盒，其含有一种或多种、优选两种或更多种组合的HPV型特异性引物组和探针。使用试剂盒检测HPV包括使用型特异性引物组扩增相应型的HPV基因的PCR，以及用与各扩增产物特异性杂交的探针检测HPV的存在。本发明的引物组被设计成具有近似的Tm值，因此，特别优选用于使用多个引物组混合物的多重PCR反应。 
由引物组1～23获得的PCR扩增产物各自用探针1～23进行型特异性检测。例如，当使用引物组1时，则使用探针1对其PCR扩增 产物进行检测。 
对于使用本发明试剂盒检测HPV，可提取样品中的DNA，使用前述引物组对DNA进行PCR。至于样品，可以使用获自疑似感染HPV的受试者的组织样品、活检样品、涂片等。此外，可将从通过密度梯度离心操作所采集的细胞中浓缩出普遍感染了HPV的宫颈鳞状细胞并使用。或者，可以使用培养的细胞，例如HeLa细胞等。对于根据本发明检出HPV基因的存在是有益的目标疾病包括疣、上皮内赘生物、皮肤癌、口腔/口咽癌、生殖器赘生物、***、湿疣、***瘤等。 
从样品中提取DNA的方法是本领域众所周知的，可用例如苯酚和氯仿进行抽提，或者使用市售DNA提取试剂进行提取。或者，可使用柱试剂盒(column kit)(GENERATION(注册商标)Capture ColumnKit Gentra)进行抽提。 
使用如此从样品中提取的DNA作为模板，并使用前述引物组，通过PCR扩增各种类型的HPV基因。PCR法本身是本领域众所周知的(Saiki等，Science，239：487-491，1988)，在这些引物、模板DNA(即HPV基因)和耐热DNA聚合酶存在下，使用与有义链杂交的引物(反向引物)和与反义链杂交的引物(正向引物)，通过使退火、延伸和变性步骤的循环重复大约20次～40次来进行RCR。在使用本发明试剂盒的HPV检测中，例如FastStart Taq DNA聚合酶(Roche)、Ex Taq(注册商标，Takara)、Z-Taq、AccuPrime Taq DNA聚合酶、装于M-PCR试剂盒(QIAGEN)中的聚合酶等可用作如上所述的DNA聚合酶。基于引物Tm值选择合适PCR反应条件的方法是本领域众所周知的，本领域普通技术人员可以根据引物长度、GC含量、目标特异性和灵敏度、所使用的聚合酶性质等，选出最佳条件。例如，下列实施例中，通过95℃4分钟，然后95℃30秒钟，60℃30秒钟和72℃1分钟，循环30次，然后72℃7分钟，来进行PCR。另外，可适当调整PCR溶液中所含引物的量，以达到所需检测灵敏度，并减少检测灵敏度依赖于病毒类型的变化。 
以相应的型特异性方式，使用能够检测HPV的本发明探针，使由PCR扩增的DNA产物进行杂交反应。通过例如使用标记探针和微阵列，可方便且高准确性地进行杂交。准确地讲，作为使用标记DNA探针的杂交方法，可采用例如等位基因特异性寡核苷酸探针法(Allele-specific Oligonucleotide Probe method)、寡核苷酸连接测定法(Oligonucleotide Ligation Assay method)、侵入物法(Invader method)等已知方法。另外，可通过微阵列进行诊断，例如如下文中所述。具体来讲，使用各种型特异性引物组，使从受试者的生物样品(例如血等)分离的DNA通过PCR扩增(DNA扩增产物)。在此情况下，掺入标记的dNTP，得到标记的DNA。使标记DNA与微阵列接触，检测与预先固定在微阵列上的探针杂交的DNA。可将标记DNA的水溶液分配到0.2ml或1.5ml塑料管中，将该溶液点滴到微阵列上，来进行杂交。点滴量可大致为5-100μl。杂交优选在室温～70℃的温度范围内进行0.5-20小时。杂交完成后，通过用表面活性剂和缓冲液的混合溶液洗涤，除去未反应的标记DNA。优选使用十二烷基硫酸钠(SDS)或聚乙烯(20)失水山梨醇醚单月桂酸酯(吐温20)作为表面活性剂。可以使用柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、Good缓冲液等作为缓冲液，优选柠檬酸盐缓冲液。 
可以使用例如JP-B-3860174中披露的方法，作为使多种DNA扩增产物与探针生物聚合物同时杂交的方法。 
本发明提供一种用于检测HPV的DNA微阵列，其中使至少一种、优选两种或更多种选自探针1～23的探针固定化。DNA微阵列可含有作为内标固定化的探针24。 
至于微阵列的制备方法，包括在支持体表面上直接合成寡核苷酸的方法(单芯片法(on-chip method))以及包括将预先制备的寡核苷酸固定在支持体表面的方法是已知的。虽然本发明的微阵列可按照这些方法中的任一种制备，但方便的方法是后者。至于单芯片方法，可进行以下方法，即包括结合使用可通过光照射选择性脱去的保护基与用于 半导体制造的光刻技术及固相合成技术，在小矩阵的指定区域上选择性地进行合成(掩蔽技术(masking technique)：例如Fodor，S.P.A.Science 251：767，1991)等。另一方面，当预先制备的寡核苷酸被固定在固相载体表面时，将寡核苷酸点滴到表面经处理的离子键结合或共价键结合的支持体表面上(例如Lamture，J.B.等，Nucl.Acids Res.22：2121-2125，1994；Guo，Z.等，Nucl.Acids Res.22：5456-5465，1994)。寡核苷酸一般通过间隔基(spacer)或交联剂共价结合在表面经处理的支持体上。一种包括将小块聚丙烯酰胺凝胶排列在玻璃表面上以及使合成寡核苷酸与之共价结合的方法也是已知的(Yershov，G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4913，1996)。 
另外，涂覆有聚-L-赖氨酸或氨基丙基硅烷的玻璃表面也可用作支持体。支持体的实例包括尼龙膜、硝化纤维素膜、玻璃、硅片等。此外，探针可通过本领域所用的任何方法固定化，一般可用点样器(spotter)等将DNA固定在支持体上。 
当使用本发明的试剂盒将DNA微阵列用于检测HPV时，优选在进行杂交之前对扩增DNA产物预先进行标记，特别优选在扩增期间进行标记。标记方法的实例包括以下两种方法：一种方法包括制备作为DNA聚合酶底物用于产生PCR扩增产物的4种脱氧核苷酸ATCG(dATP、dCTP、dGTP、dTTP：统称为dNTP)和标记的脱氧核苷酸(例如Cy3-dUTP)，调节各dNTP的最终浓度至同一水平，将标记的脱氧核苷酸掺到要制备的扩增产物中，另一种方法包括使用预先标记的引物以标记DNA的PCR反应。 
出于检测灵敏度和标记方便性方面的考虑，标记物质优选含有荧光物质和生物素中的任一种。荧光物质的优选实例包括FITC、FAM、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、TAMRA、Dabcyl、ROX、TET、罗丹明、德克萨斯红、HEX、Cyber Green等，特别优选的荧光物质是Cy3。在生物素和洋地黄毒苷的情况下，各种生物素结合的标记酶蛋白起反应，可利用这类标记酶蛋白的酶活性为指标来进行检测。通过采用光 学检测手段，观察源于这类荧光物质的荧光强度，能够以高灵敏度检测被用于荧光标记的各种荧光物质。另外，当酶活性是利用各种显色反应检测时，前述使用标记酶蛋白的酶活性作为指标的检测方法也可采用光学检测手段，并能够以高灵敏度进行检测。使用聚焦、非共焦激光扫描仪或CCD扫描仪为光学检测手段，可读取荧光强度值。 
当扩增产物与DNA微阵列杂交时，双链DNA产物可与DNA微阵列进行杂交反应，或者可以增加在杂交反应之前由扩增的双链DNA产物中分离出单链DNA的步骤。出于检测灵敏度方面的考虑，优选增加分离单链DNA的步骤。 
由双链DNA分离出单链DNA的方法并无特别的限制，可能提及的有例如公开于JP-A-2006-230342的方法。具体来讲，可通过下列步骤分离单链DNA。将在非检测一侧上合成标签链的引物5’端用生物素标记。扩增之后，使生物素与链霉抗生物素固定化磁珠结合，形成扩增DNA产物-磁珠复合物。使该复合物与碱溶液(例如NaOH水溶液等)反应，由此使扩增DNA产物的双链解离成为单链。之后，使磁珠吸附到磁体上，由此可选择性地只分离出通过未用生物素标记的引物延伸的单链DNA。使用磁珠分离反义链DNA的步骤的概要图见图1。图1所示步骤中，当使用具有生物素修饰的5’端的反向引物而不是具有生物素修饰的5’端的正向引物时，也可按同样方式，使用磁珠分离出有义链DNA。 
因为HPV遗传筛查是使用临床样品的试验，所以实验准确性控制极其重要。因此，需要设置作为内标的基因(内标基因)。本说明书的内标基因是与得自样品的DNA一起进行多重PCR、与识别扩增产物的探针杂交并检测假阴性反应的基因。为此目的，通常采用持家基因，该基因在细胞中以相对较高的量表达，且其变异较少。具体实例包括G3PDH、β-肌动蛋白等。 
本发明的试剂盒采用了G3PDH作为内标，任选含有用于G3PDH的引物组(引物组24)和探针(探针24)的组合(参见上表1和表3)。设计 引物组和探针的组合，以按与各种类型的HPV基因的扩增反应或杂交反应相同的效率同时进行扩增或杂交。 
在一个实施方案中，本发明的试剂盒含有从前述24种引物组和探针的组合之中选出的引物组3和探针3的组合及引物组4和探针4的组合，以及任选引物组24和探针24的组合。这样，该试剂盒便可检出HPV16和HPV18。这些HPV亚型对***发生具有特别高的风险。 
在另一个实施方案中，本发明的试剂盒含有从前述24种引物组和探针的组合之中选出的引物组3和探针3的组合、引物组4和探针4的组合、引物组5和探针5的组合、引物组6和探针6的组合、引物组7和探针7的组合、引物组9和探针9的组合、引物组10和探针10的组合、引物组13和探针13的组合、引物组14和探针14的组合、引物组15和探针15的组合、引物组18和探针18的组合、引物组19和探针19的组合、引物组20和探针20的组合、引物组23和探针23的组合，以及任选引物组24和探针24的组合。这样，该试剂盒便可检出HPV16、HPV18、HPV30、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59和HPV68。这些HPV亚型被归类为对***发生具有高风险。 
在进一步的实施方案中，本发明的试剂盒含有所有前述23种用于检测HPV的引物组和探针的组合，以及任选引物组24和探针24的组合。 
除各前述引物组和探针的组合外，本发明的试剂盒可含有所有下列试剂或其任选组合和其它试剂的组合：缓冲液、耐热DNA聚合酶、阳性对照HPV DNA、非HPV DNA、内标G3PDH DNA、dNTP、荧光染料标记的碱基(例如Cy3-dUTP)和链霉抗生物素固定化磁珠。 
作为本发明的另一方面，提供使用前述本发明的试剂盒以型特异性方式检测样品中HPV存在与否的方法。该方法包括使用从样品中提取的DNA(作为模板)和前述引物组进行PCR的步骤，以及检测扩 增DNA产物的步骤。 
在另一个实施方案中，该方法包括使用从样品中提取的DNA(作为模板)和前述引物组进行PCR的步骤，分离扩增DNA产物作为单链的步骤，通过单链DNA与前述探针进行杂交的检测步骤。虽然不特别限制各个步骤的实际方法，但适当时，优选采用试剂盒说明书所描述的方法。 
虽然下文中参照实施例对本发明进行更详细的说明，但是本发明绝不局限于下面的实施例等。 
实施例
除非另有说明，否则用于实施例的各种试剂(缓冲液、酶、溶液、化合物等)是本领域通常使用的试剂，且是市售的或可通过以前报道的方法制备。 
实施例1引物的设计和特异性的确认 
由公共数据库获取HPV和用作内标的G3PDH(甘油醛三磷酸脱氢酶)的基因序列。用于本发明的24种基因序列的GenBank登录号见表2。 
根据各个基因的序列，设计出满足下列标准的引物组：解链温度(Tm)的范围为60～70℃(当采用最近邻法时。Na+浓度：50mM)；扩增产物长度的范围为100～500bp；GC含量的范围为50～60％；它不含与其它HPV种类具有高度同源性的序列；而且它在分子内不形成二级结构；引物彼此间不杂交。这样，设计出对HPV和G3PDH中的每一个都具有特异性的引物组。 
根据表1所示引物组的序列，用DNA合成仪合成寡核苷酸DNA。 
将HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV30、HPV31、HPV33、HPV34、HPV35、HPV39、HPV40、HPV42、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV54、HPV56、HPV58、HPV59、HPV61、HPV66或HPV68 的编码DNA分别导入质粒pUC18中，得到用于23种模板的质粒。 
然后，使用按照上述方法制备的每个引物组，将23种用于HPV模板的质粒的各DNA和得自Jurkat细胞(人白血病T淋巴瘤)的基因组分别进行PCR反应。反应溶液的组成如下： 
[表4] 
10×PCR缓冲液                 2μL 
2.5mM dNTP                    0.4μL 
引物F(4μM)                   0.5μL 
引物R(4μM)                   0.5μL 
DNA Taq聚合酶                 0.16μL 
DDW(双蒸水)                   15.44μL 
模板(1×106个拷贝)            1μL 
合计                          20μL 
所采用的PCR反应条件如下：95℃4分钟，然后95℃30秒钟，60℃30秒钟和72℃1分钟，30次循环，然后72℃7分钟，接着在4℃下保存。所得到的扩增DNA产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离。得到每种引物组的具有预期长度的扩增产物，证实不存在由非特异性杂交引起的污染扩增产物。 
然后，使用24种引物组的混合物，分别使23种用于HPV模板的质粒和由Jurkat细胞提取的基因组进行PCR反应。引物组以两种浓度形式混合，使得每个引物组的扩增效率几乎为同一水平。反应溶液的组成如下。 
[表5] 
10×PCR缓冲液                2μL 
2.5mM dNTP                   0.4μL 
引物混合物                   1μL 
(最终浓度：0.05μM或0.1μM) 
DNA Taq聚合酶                0.16μL 
DDW                          15.44μL 
模板(1×106个拷贝)           1μL 
合计                         20μL 
所采用的PCR反应条件如下：95℃4分钟，然后95℃30秒钟，60℃30秒钟和72℃1分钟，30次循环，然后72℃7分钟，接着在4℃下保存。所得到的扩增DNA产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离。结果见图2。得到每个模板的具有预期长度的扩增产物，因此证实，即使当引物混合时，也不存在由非特异性杂交引起的污染扩增产物。 
实施例2探针的设计 
设计在23种HPV和G3PDH的各个PCR扩增区内满足下列标准的探针(有义链DNA)：解链温度(Tm)在72～78℃范围内(当采用GC％方法时。Na+浓度：50mM)；探针长度的范围为69～71bp；GC含量在45～55％的范围内；它不含与其它HPV种类具有高度同源性的序列，而且它在分子内不形成二级结构。这样，设计出对HPV和G3PDH中的每一个都具有特异性的引物组(表3)。 
根据表3所示探针的序列，用DNA合成仪合成寡核苷酸DNA。 
实施例3DNA微阵列的制备 
将实施例2中合成的24种探针的每一种按表6所示的组成进行混合，用市售接触型或非接触型点样器(SpotArray或Piezorray：PerkinElmer)按图3的排列方式，点在涂覆有聚-L-赖氨酸的玻璃基底上(每种探针2个点)，得到用于检测的DNA微阵列。 
[表6] 
探针(100μm)            5μL 
20×SSC                 3.75μL 
DDW                     16.25μL 
合计                    25μL 
实施例4HPV的扩增和检测 
(1)HPV和G3PDH的扩增与标记 
按表7所示反应混合物的组成，采用24种引物组的混合物(引物混合物)，分别使23种用于HPV模板的质粒和由Jurkat细胞提取的基因组进行PCR反应。24种引物组以两种浓度形式混合，使得每个引物组的扩增效率几乎为同一水平。为了检测表现为DNA微阵列上荧光强度的HPV感染存在与否，将荧光染料标记的碱基(Cy3-dUTP：GEHealthcare Bio-Sciences Corp.)同时加到PCR反应溶液中。 
[表7] 
10×PCR缓冲液              2μL 
dCTP、dGTP、dATP(各2.5mM)  0.4μL 
dTTP(1mM)                  0.8μL 
Cy3-dUTP(1mM)              0.2μL 
引物混合物                 1μL 
(最终浓度：0.05μM或0.1μM) 
DNA Taq聚合酶              0.16μL 
DDW                        14.44μL 
模板(1×104个拷贝)         1μL 
合计                       20μL 
所采用的PCR反应条件如下：95℃4分钟，然后95℃30秒钟，60℃30秒钟和72℃1分钟，30次循环，然后72℃7分钟，接着在4℃下保存。 
如上获得Cy3标记的扩增DNA产物。 
PCR反应后，使用纯化Cy3标记的扩增DNA产物的市售PCR纯化柱，除去反应中未使用的过量酶、荧光染料标记的碱基和引物。 
(2)使用DNA微阵列检测HPV 
将纯化的Cy3标记的扩增DNA产物与表8中所述的杂交溶液混合，在95℃加热2分钟使之变性，将混合物在冰上静置3分钟，使用8μL与DNA微阵列杂交。 
[表8] 
Cy3标记的扩增DNA产物        3.1μL 
20×SSC                     2.5μL 
50×Denhardt溶液            0.8μL 
4％吐温溶液                 0.5μL 
DDW                         3.1μL 
合计                        10μL 
按照JP-B-3860174中所述方法，在65℃恒温槽中进行杂交反应1小时。 
杂交反应后，DNA微阵列分别用2×SSC-0.1％SDS溶液和0.2×SSC-0.1％SDS溶液洗涤5分钟，用0.2×SSC和0.05×SSC漂洗后，用氮气空***或载玻片离心机干燥。 
用市售微阵列扫描仪(GenePix4000B：Axon Instruments)进行扫描。由532nm波长下样点的荧光强度值和样点周围的背景值，对检测进行了评价。 
任何模板都未检出由非特异性杂交引起的荧光点，结果证实可以HPV类型特异性的方式检测荧光点。 
实施例5HPV的检测额外包括使用磁珠分离单链DNA的步骤(参见图1) 
在实施例1中设计的引物组中，仅引物F是将生物素加到5’端而新产生的。将实际合成的定单发给DNA合成承包制造商，引物使用通用DNA合成仪经化学方法合成。按同样的方式，使用引物进行如实施例4(1)中所述HPV和G3PDH的扩增和标记步骤，得到Cy3标记的扩增DNA产物。 
然后，在1.5mL管中，使Cy3标记的扩增DNA产物溶液与链霉抗生物素固定化磁珠(Dynabeads MyOne Streptavidin C1，Invitrogen)反应15分钟，形成扩增DNA产物-磁珠复合物。反应溶液的组成如下： 
[表9] 
Cy3标记的扩增DNA产物          10μL 
*2×B&W缓冲液                 10μL 
磁珠                          3.5-6×107个磁珠 
合计                          20μL 
*2×B&W缓冲液的组成为：10mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM EDTA、2.0M NaCl。 
之后，充分除去反应溶液，同时使复合物吸附到磁体上。然后，除去磁体，将0.1N NaOH(碱)溶液(10μL)加到复合物中，使混合物反应10分钟，使扩增DNA产物的双链解离成为单链。之后，仅将表1的PCR反应中由引物F延伸的有义链(单链)DNA再次吸附到磁体上，收获碱溶液，从而仅PCR反应中由引物R延伸的反义链DNA被选择性地分离出来。分离的反义链(单链)DNA用3M乙酸钠(1μL)中和后，在冰上静置5分钟。 
然后，将分离的反义链(单链)DNA用于与实施例4(2)中所述的DNA微阵列进行杂交反应。按照与实施例4(2)同样的方法进行反应，只是用反义链(单链)DNA替换表8中所列的反应组成中的Cy3标记的扩增DNA产物。 
扫描影像见图4。对于任何模板都未检出由非特异性杂交引起的荧光点，这就证实了可HPV类型特异性的方式检测荧光点。此外，这可以证实，与实施例4相比，以较高灵敏度检测任何模板是可行的，这是由附加使用磁珠分离单链DNA的步骤导致的(图5)。 
上述结果表明，使用本发明的引物组和探针以及本发明的HPV检测方法，可以高特异性和高灵敏度检测HPV。 
工业实用性 
本发明提供可方便快速地以高特异性和高灵敏度检测多种HPV类型的引物组和探针。本发明还提供使用前述引物组和探针，能够方便快速地以高特异性和高灵敏度检测多种HPV类型的方法。 
本申请以在日本申请的专利申请号2007-203677(申请日为2007年8月3日)为基础，该申请的内容通过引用全文结合到本文中。 
[序列表自由文本] 
SEQ ID NO：1：用于HPV6基因扩增的正向PCR引物 
SEQ ID NO：2：用于HPV6基因扩增的反向PCR引物 
SEQ ID NO：3：用于HPV11基因扩增的正向PCR引物 
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SEQ ID NO：46：用于HPV68基因扩增的反向PCR引物 
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SEQ ID NO：72：用于G3PDH基因检测的探针 
序列表
<110>仓敷纺绩株式会社(KURASHIKI BOSEKI KABUSHIKI KAISHA)
<120>用于检测人***瘤病毒的引物组和探针
<130>091283
<150>JP 2007-203677
<151>2007-08-03
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<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于检测HPV40基因的探针。
<400>59
cggcaccaca tacactggag acaccacata cactagagac accactggac actactgatg    60
ccctgtttga                                                           70
<210>60
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于检测HPV42基因的探针。
<400>60
actgtgcatg tgggccctga tttatctgtt gtggaccacc catgggacag taccccaacg    60
tctgtaatgc                                                           70
<210>61
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于检测HPV45基因的探针。
<400>61
gtgctacaaa tgatagtgac ctgtttgatg tatatgcaga cttcccacct cctgcgtcca    60
ctacacctag                                                           70
<210>62
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于检测HPV51基因的探针。
<400>62
gatgggcaac atggcggttc acagaacagt gtgtgtagta gcgggggggg cagtgttatg    60
gatgtggaaa                                                           70
<210>63
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于检测HPV52基因的探针。
<400>63
caagcagtcc ggaaagtgct gggcaagatg gtgtagaaaa acatggtagt ccgcgtgcaa    60
aacacatttg                                                           70
<210>64
<211>69
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于检测HPV53基因的探针。
<400>64
cacccaggac atccatggat cgtcagttat ttgaaaatac agaagagcga ccacgtacat    60
tgcaccagc                                                            69
<210>65
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于检测HPV54基因的探针。
<400>65
gtgtatatag tgaggtatgt atggtgagta tggtagtgag tgcatgcagg cctgcagtga    60
ctgaggtgag                                                           70
<210>66
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于检测HPV56基因的探针。
<400>66
gaggtacagg gacgtgggtg cgggaataca caaaatggag gctcacaaaa cagtacctat    60
agtaacaata                                                           70
<210>67
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于检测HPV58基因的探针。
<400>67
atatgtgccc cttggtagta ccccaccgtc tgaggctata cctttacagc ccatacgtcc    60
cccagttacc                                                           70
<210>68
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于检测HPV59基因的探针。
<400>68
gaggctgaaa ccaagacacc gttacatgag ctgctgatac gctgttatag atgcctaaaa    60
cctctatgtc c                                                         71
<210>69
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于检测HPV61基因的探针。
<400>69
tatgctgacc ctgaggtgtt ggatcttcct gcacaacata cacaacccac acttacagta    60
cagggccctt                                                           70
<210>70
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于检测HPV66基因的探针。
<400>70
gcaccagcat taggggaaca ttggactaag ggcgcggtgt gtaagtctac accaggtaat    60
acaggggat t                                                          70
<210>71
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于检测HPV68基因的探针。
<400>71
tgttgtgtta ccagcaacgt ctccacagtt gcctttaaca ccctctacac caattgatac    60
aacctatgcc                                                           70
<210>72
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于检测G3PDH基因的探针。
<400>72
aaacctgcca aatatgatga catcaagaag gtggtgaagc aggcgtcgga gggccccctc    60
aagggcatcc                                                           70

Claims (10)

1.一种用于检测人***瘤病毒HPV的试剂盒，所述试剂盒包含：
(3)引物组3和探针3的组合，所述引物组3的组成如下：由SEQID NO：5所示碱基序列构成的引物和由SEQ ID NO：6所示碱基序列构成的引物；所述探针3的组成如下：SEQ ID NO：51所示碱基序列或与SEQ ID NO：51所示碱基序列互补的碱基序列。
2.权利要求1的试剂盒，所述试剂盒还包含一种或多种选自下述的组合：
(4)引物组4和探针4的组合，所述引物组4的组成如下：由SEQID NO：7所示碱基序列构成的引物和由SEQ ID NO：8所示碱基序列构成的引物；所述探针4的组成如下：SEQ ID NO：52所示碱基序列或与SEQ ID NO：52所示碱基序列互补的碱基序列，
(6)引物组6和探针6的组合，所述引物组6的组成如下：由SEQID NO：11所示碱基序列构成的引物和由SEQ ID NO：12所示碱基序列构成的引物；所述探针6的组成如下：SEQ ID NO：54所示碱基序列或与SEQ ID NO：54所示碱基序列互补的碱基序列，
(7)引物组7和探针7的组合，所述引物组7的组成如下：由SEQID NO：13所示碱基序列构成的引物和由SEQ ID NO：14所示碱基序列构成的引物；所述探针7的组成如下：SEQ ID NO：55所示碱基序列或与SEQ ID NO：55所示碱基序列互补的碱基序列，
(9)引物组9和探针9的组合，所述引物组9的组成如下：由SEQID NO：17所示碱基序列构成的引物和由SEQ ID NO：18所示碱基序列构成的引物；所述探针9的组成如下：SEQ ID NO：57所示碱基序列或与SEQ ID NO：57所示碱基序列互补的碱基序列，
(10)引物组10和探针10的组合，所述引物组10的组成如下：由SEQ ID NO：19所示碱基序列构成的引物和由SEQ ID NO：20所示碱基序列构成的引物；所述探针10的组成如下：SEQ ID NO：58所示碱基序列或与SEQ ID NO：58所示碱基序列互补的碱基序列，
(13)引物组13和探针13的组合，所述引物组13的组成如下：由SEQ ID NO：25所示碱基序列构成的引物和由SEQ ID NO：26所示碱基序列构成的引物；所述探针13的组成如下：SEQ ID NO：61所示碱基序列或与SEQ ID NO：61所示碱基序列互补的碱基序列，
(14)引物组14和探针14的组合，所述引物组14的组成如下：由SEQ ID NO：27所示碱基序列构成的引物和由SEQ ID NO：28所示碱基序列的引物；所述探针14的组成如下：SEQ ID NO：62所示碱基序列或与SEQ ID NO：62所示碱基序列互补的碱基序列，
(15)引物组15和探针15的组合，所述引物组15的组成如下：由SEQ ID NO：29所示碱基序列构成的引物和由SEQ ID NO：30所示碱基序列构成的引物；所述探针15的组成如下：SEQ ID NO：63所示碱基序列或与SEQ ID NO：63所示碱基序列互补的碱基序列，
(18)引物组18和探针18的组合，所述引物组18的组成如下：由SEQ ID NO：35所示碱基序列构成的引物和由SEQ ID NO：36所示碱基序列构成的引物；所述探针18的组成如下：SEQ ID NO：66所示碱基序列或与SEQ ID NO：66所示碱基序列互补的碱基序列，
(19)引物组19和探针19的组合，所述引物组19的组成如下：由SEQ ID NO：37所示碱基序列构成的引物和由SEQ ID NO：38所示碱基序列构成的引物；所述探针19的组成如下：SEQ ID NO：67所示碱基序列或与SEQ ID NO：67所示碱基序列互补的碱基序列，
(20)引物组20和探针20的组合，所述引物组20的组成如下：由SEQ ID NO：39所示碱基序列构成的引物和由SEQ ID NO：40所示碱基序列构成的引物；所述探针20的组成如下：SEQ ID NO：68所示碱基序列或与SEQ ID NO：68所示碱基序列互补的碱基序列，
(22)引物组22和探针22的组合，所述引物组22的组成如下：由SEQ ID NO：43所示碱基序列构成的引物和由SEQ ID NO：44所示碱基序列构成的引物；所述探针22的组成如下：SEQ ID NO：70所示碱基序列或与SEQ ID NO：70所示碱基序列互补的碱基序列，
(23)引物组23和探针23的组合，所述引物组23的组成如下：由SEQ ID NO：45所示碱基序列构成的引物和由SEQ ID NO：46所示碱基序列构成的引物；所述探针23的组成如下：SEQ ID NO：71所示碱基序列或与SEQ ID NO：71所示碱基序列互补的碱基序列，
(1)引物组1和探针1的组合，所述引物组1的组成如下：由SEQID NO：1所示碱基序列构成的引物和由SEQ ID NO：2所示碱基序列构成的引物；所述探针1的组成如下：SEQ ID NO：49所示碱基序列或与SEQ ID NO：49所示碱基序列互补的碱基序列，
(2)引物组2和探针2的组合，所述引物组2的组成如下：由SEQID NO：3所示碱基序列构成的引物和由SEQ ID NO：4所示碱基序列构成的引物；所述探针2的组成如下：SEQ ID NO：50所示碱基序列或与SEQ ID NO：50所示碱基序列互补的碱基序列，
(5)引物组5和探针5的组合，所述引物组5的组成如下：由SEQID NO：9所示碱基序列构成的引物和由SEQ ID NO：10所示碱基序列构成的引物；所述探针5的组成如下：SEQ ID NO：53所示碱基序列或与SEQ ID NO：53所示碱基序列互补的碱基序列，
(8)引物组8和探针8的组合，所述引物组8的组成如下：由SEQID NO：15所示碱基序列构成的引物和由SEQ ID NO：16所示碱基序列构成的引物；所述探针8的组成如下：SEQ ID NO：56所示碱基序列或与SEQ ID NO：56所示碱基序列互补的碱基序列，
(11)引物组11和探针11的组合，所述引物组11的组成如下：由SEQ ID NO：21所示碱基序列构成的引物和由SEQ ID NO：22所示碱基序列构成的引物；所述探针11的组成如下：SEQ ID NO：59所示碱基序列或与SEQ ID NO：59所示碱基序列互补的碱基序列，
(12)引物组12和探针12的组合，所述引物组12的组成如下：由SEQ ID NO：23所示碱基序列构成的引物和由SEQ ID NO：24所示碱基序列构成的引物；所述探针12的组成如下：SEQ ID NO：60所示碱基序列或与SEQ ID NO：60所示碱基序列互补的碱基序列，
(16)引物组16和探针16的组合，所述引物组16的组成如下：由SEQ ID NO：31所示碱基序列构成的引物和由SEQ ID NO：32所示碱基序列构成的引物；所述探针16的组成如下：SEQ ID NO：64所示碱基序列或与SEQ ID NO：64所示碱基序列互补的碱基序列，
(17)引物组17和探针17的组合，所述引物组17的组成如下：由SEQ ID NO：33所示碱基序列构成的引物和由SEQ ID NO：34所示碱基序列构成的引物；所述探针17的组成如下：SEQ ID NO：65所示碱基序列或与SEQ ID NO：65所示碱基序列互补的碱基序列，以及
(21)引物组21和探针21的组合，所述引物组21的组成如下：由SEQ ID NO：41所示碱基序列构成的引物和由SEQ ID NO：42所示碱基序列构成的引物；所述探针21的组成如下：SEQ ID NO：69所示碱基序列或与SEQ ID NO：69所示碱基序列互补的碱基序列。
3.权利要求2的试剂盒，所述试剂盒包含：引物组3和探针3的组合、以及引物组4和探针4的组合。
4.权利要求3的试剂盒，所述试剂盒还包含：引物组6和探针6的组合、引物组7和探针7的组合、引物组9和探针9的组合、引物组10和探针10的组合、引物组13和探针13的组合、引物组14和探针14的组合、引物组15和探针15的组合、引物组18和探针18的组合、引物组19和探针19的组合、引物组20和探针20的组合、引物组22和探针22的组合、以及引物组23和探针23的组合。
5.权利要求4的试剂盒，所述试剂盒还包含：引物组1和探针1的组合、引物组2和探针2的组合、引物组5和探针5的组合、引物组8和探针8的组合、引物组11和探针11的组合、引物组12和探针12的组合、引物组16和探针16的组合、引物组17和探针17的组合、以及引物组21和探针21的组合。
6.引物组3和探针3的组合在制备用于以型特异性方式检测样品中HPV存在与否的试剂或试剂盒中的应用，所述引物组3的组成如下：由SEQ ID NO：5所示碱基序列构成的引物和由SEQ ID NO：6所示碱基序列构成的引物；所述探针3的组成如下：SEQ ID NO：51所示碱基序列或与SEQ ID NO：51所示碱基序列互补的碱基序列。
7.一种用于扩增人***瘤病毒HPV基因的PCR引物组，所述引物组包含：
(3)引物组3，其组成如下：由SEQ ID NO：5所示碱基序列构成的引物和由SEQ ID NO：6所示碱基序列构成的引物。
8.一种用于检测人***瘤病毒HPV的探针，所述探针包含：
(3)探针3，其组成如下：SEQ ID NO：51所示碱基序列或与SEQID NO：51所示碱基序列互补的碱基序列。
9.一种用于检测HPV的DNA微阵列，其中将探针3固定化，所述探针3的组成如下：SEQ ID NO：51所示碱基序列或与SEQ ID NO：51所示碱基序列互补的碱基序列。
10.权利要求9的DNA微阵列，其中还将一种或多种选自下述探针1、2和4～23的探针固定化：
(1)探针1，其组成如下：SEQ ID NO：49所示碱基序列或与SEQID NO：49所示碱基序列互补的碱基序列，
(2)探针2，其组成如下：SEQ ID NO：50所示碱基序列或与SEQID NO：50所示碱基序列互补的碱基序列，
(4)探针4，其组成如下：SEQ ID NO：52所示碱基序列或与SEQID NO：52所示碱基序列互补的碱基序列，
(5)探针5，其组成如下：SEQ ID NO：53所示碱基序列或与SEQID NO：53所示碱基序列互补的碱基序列，
(6)探针6，其组成如下：SEQ ID NO：54所示碱基序列或与SEQID NO：54所示碱基序列互补的碱基序列，
(7)探针7，其组成如下：SEQ ID NO：55所示碱基序列或与SEQID NO：55所示碱基序列互补的碱基序列，
(8)探针8，其组成如下：SEQ ID NO：56所示碱基序列或与SEQID NO：56所示碱基序列互补的碱基序列，
(9)探针9，其组成如下：SEQ ID NO：57所示碱基序列或与SEQID NO：57所示碱基序列互补的碱基序列，
(10)探针10，其组成如下：SEQ ID NO：58所示碱基序列或与SEQ ID NO：58所示碱基序列互补的碱基序列，
(11)探针11，其组成如下：SEQ ID NO：59所示碱基序列或与SEQ ID NO：59所示碱基序列互补的碱基序列，
(12)探针12，其组成如下：SEQ ID NO：60所示碱基序列或与SEQ ID NO：60所示碱基序列互补的碱基序列，
(13)探针13，其组成如下：SEQ ID NO：61所示碱基序或与SEQID NO：61所示碱基序列互补的碱基序列，
(14)探针14，其组成如下：SEQ ID NO：62所示碱基序列或与SEQ ID NO：62所示碱基序列互补的碱基序列，
(15)探针15，其组成如下：SEQ ID NO：63所示碱基序列或与SEQ ID NO：63所示碱基序列互补的碱基序列，
(16)探针16，其组成如下：SEQ ID NO：64所示碱基序列或与SEQ ID NO：64所示碱基序列互补的碱基序列，
(17)探针17，其组成如下：SEQ ID NO：65所示碱基序列或与SEQ ID NO：65所示碱基序列互补的碱基序列，
(18)探针18，其组成如下：SEQ ID NO：66所示碱基序列或与SEQ ID NO：66所示碱基序列互补的碱基序列，
(19)探针19，其组成如下：SEQ ID NO：67所示碱基序列或与SEQ ID NO：67所示碱基序列互补的碱基序列，
(20)探针20，其组成如下：SEQ ID NO：68所示碱基序列或与SEQ ID NO：68所示碱基序列互补的碱基序列，
(21)探针21，其组成如下：SEQ ID NO：69所示碱基序列或与SEQ ID NO：69所示碱基序列互补的碱基序列，
(22)探针22，其组成如下：SEQ ID NO：70所示碱基序列或与SEQ ID NO：70所示碱基序列互补的碱基序列，以及
(23)探针23，其组成如下：SEQ ID NO：71所示碱基序列或与SEQ ID NO：71所示碱基序列互补的碱基序列。
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