CN104561385A - 检测***瘤状病毒hpv6型的pcr试剂盒 - Google Patents

检测***瘤状病毒hpv6型的pcr试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开用于检测青少年复发性呼吸道***瘤HPV6亚型的高度特异性引物对，和用于青少年复发性呼吸道***瘤HPV6亚型一步法TapMan 荧光定量PCR检测试剂盒。发明的用于检测青少年复发性呼吸道***瘤状病毒的高度特异性引物对序列分别为SEQ ID No.1和 SEQ ID No.2，检测试剂盒内还有序列为 SEQ ID No.3的探针。发明可对青少年复发性呼吸道***瘤HPV6亚型定量扩增、检测，可减少污染、提高了检测的精准度、操作简单快捷，在评价青少年复发性呼吸道***瘤状病毒HPV6亚型的临床病程的发展趋势上及流行病学调查中的十分适用。

Description

检测***瘤状病毒HPV6型的PCR试剂盒
技术领域
本发明涉及一种病毒TapMan荧光定量检测试剂盒，确切讲是一种用于检测青少年复发性呼吸道***瘤HPV6亚型一步法TapMan 荧光定量PCR检测试剂盒。
背景技术
青少年复发性呼吸道***瘤状瘤（juvenile-onset recurrent respiratory papilloma,JO-RRP）特指发生于上下呼吸道的***瘤病，是一种由***瘤状病毒（human papillomavirus,HPV）病毒引起的具有高度复发性及侵袭性的疾病，除时常累积喉部之外，还可以侵犯呼吸道其他部位和消化道。RRP的病程表现多样，个别患儿可以自发缓解，多数则呈现侵润生长并需要多次手术甚至出现喉、气管狭窄梗阻窒息死亡，临床治疗十分棘手。
HPV是一种嗜上皮小型DNA病毒，具有宿主和组织特异性，只感染人的皮肤和黏膜，经密切接触可传染他人，人***瘤状病毒感染的部位与HPV类型及抗体因素有关。目前已发现100种以上已知的HPV基因型，国际癌症研究中心根据HPV致病力的大小分为两型，即引起良性增生的低危险型（包括HPV6、11、40、42-45、54、61、70、72、81型）及与人类多种组织恶性肿瘤密切相关的高危型（包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59等），与JORRP发病有关的是HPV6和11型。
研究认为HPV的亚型与病情严重程度和临床经过相关，而且亚型之间存在毒力和组织嗜性差异，因此临床上建立能够快速检测青少年复发性呼吸道***瘤状病毒HPV6亚型的方法显得尤为重要。但至今尚无用于检测病毒的检测试剂盒，常规常规PCR方法检测灵敏度不高，且易出现假阳性。
发明内容
本发明提供一种可检测青少年复发性呼吸道***瘤HPV6亚型病毒的高度特异性引物对，以及包括有这一高度特异性引物对及探针的可特异、敏感、快速和便捷的用于定量检测青少年复发性呼吸道***瘤HPV6亚型的试剂盒。
本发明的可检测青少年复发性呼吸道***瘤HPV6亚型病毒的高度特异性引物对基因序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。
本发明的可检测青少年复发性呼吸道***瘤HPV6亚型病毒的试剂盒，内包括有基因序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的高度特异性引物对和基因序列为SEQ ID No.3的探针引物。为方便使用，本发明的试剂盒内除含有特异性引物SEQ ID No.1，SEQ ID No.2和特异性探针SEQ ID No.3外，还含有其它的附属物如：2×One Step RT-PCR BufferⅢ (含dNTP Mixture，Mg2+)、TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)、PrimeScript RT Enzyme MixⅡ等扩增所需要的所有实验试剂，检测时只需按照说明加入检测样品即可。以及不含青少年复发性呼吸道***瘤HPV6亚型的DNA阴性样品和作为阳性对照的含有青少年复发性呼吸道***瘤HPV6亚型的DNA样品。
使用本发明所述的SEQ ID No.1和SEQ ID No.2引物对扩增条件为： 95℃ 10sec，1个循环→95℃ 10sec，55℃ 30sec，72℃ 30sec，40个循环；进行一步法TapMan荧光定量PCR扩增时荧光信号收集放置在每个循环的72℃ 30sec末端。
本发明中样品DNA的提取用Omega DNA提取试剂盒(货号：D3096)提取，取提取的DNA样品取2μL可直接加入分装于8连管中的反应液中（23μL），这样可直接用于定量检测。
本发明的试剂盒是一种可对青少年复发性呼吸道***瘤HPV6亚型病毒进行一步法TapMan 荧光定量PCR检测的试剂盒，其优点在于于根据青少年复发性呼吸道***瘤HPV6亚型流行株的L1基因保守涉及到两条高度特异性引物和探针，在该病毒DNA提取的基础上，对组织样品进行荧光定量PCR扩增，实现对青少年复发性呼吸道***瘤HPV6亚型的定量检测。
一步法TapMan 荧光定量PCR检测法是使用5`端带有荧光物质，3`端带有淬灭物质的TapMan探针进行荧光检测，当探针完整时，5`端荧光物质受到3`端淬灭物质的制约，不能发出荧光。而当TapMan探针被分解后，5`端的荧光物质便会游离出来，发出荧光。在PCR反应中探针和模板杂交，延伸是聚合酶活性可以分解与模板杂交的荧光探针，游离荧光物质发出荧光。通过检测反应体系中的荧光强度，从而可以达到检测PCR产物扩增量的目的。在PCR使用本试剂盒进行Real Time PCR反应可在同一反应管内连续进行，操作简单，并能有效防止污染。
本发明用到的TaqMan探针法为针对青少年复发性呼吸道***瘤状病毒HPV6亚型特异的核苷酸序列设计的探针，探针与模板是高度特异性结合，特异性和敏感性均高。在评价青少年复发性呼吸道***瘤状病毒HPV6亚型的临床病程的发展趋势上及快速检测上填补了空白
本发明的试剂盒可使检测PCR扩增一步完成，简化了操作步骤，减少污染几率，并能提高了检测的精准度，一步法TapMan荧光定量在扩增完成后可直接进行标准曲线定量起始病毒拷贝数，同时其操作简单快捷，在评价青少年复发性呼吸道***瘤状病毒HPV6亚型的临床病程的发展趋势上及流行病学调查中的十分适用。
附图说明
图1：含青少年复发性呼吸道***瘤HPV6亚型L1基因序列重组质粒酶切鉴定电泳图，
其中：M:2000bp DNA Marker
1: 重组质粒pMD-Hpv6-L1双酶切鉴定
2：重组质粒pMD- Hpv6-L1单酶切线性化
图2：HPV6一步法TapMan 荧光定量PCR的扩增曲线，其中：纵坐标代表荧光量，横坐标代表循环数扩增曲线从左到右表示目的DNA的拷贝数分别为3.11×108-3.11×103；
图3：HPV6病毒一步法TapMan 荧光定量PCR检测标准曲线，其中：纵坐标代表Ct值。横坐标代表样品的拷贝数，相关系数R2：0.999，扩增效率Eff：98.6%；
图4：是检测方法特异性的扩增曲线；
图5：是检测方法敏感性的扩增曲线，其中：纵坐标代表荧光量，横坐标代表循环数，扩增曲线自左到右的DNA的拷贝数分别为1×108-1×100。
具体实施方式
以下结合具体实例和附图说明对本发明做进一步说明
实施例1.青少年复发性呼吸道***瘤HPV6亚型荧光定量PCR引物的设计与合成
利用已知的青少年复发性呼吸道***瘤HPV6亚型L1基因序列比对后，根据保守区域利用Primer Express3.0软件设计引物和探针，送宝生物工程（大连）有限公司合成。上下游引物及探针分别为：
SEQ ID No.1：（Hpv6-F）5’- TCCTCCTAACCCTGTATC -3’
SEQ ID No.2：（Hpv6-R）5’- TGCTGGCATGATAAAATATG -3’
SEQ ID No.3：(Hpv6-Probe) 5’- CCACGGATGCTTATGTTACTCGCT -3’（5′FAM, 3′TAMRA）
实施例2.标准品的制备
参考青少年复发性呼吸道***瘤HPV6亚型在NCBI上登陆的序列，通过比较分析后，设计出能扩增L1基因的部分序列的上下游引物，送宝生物工程（大连）有限公司合成。上下游引物分别为：SEQ ID No.4：（Hpv6-5674-F）5’- TGGACGACCAGCTCTTCCTTAAACAC-3’ SEQ ID No.5：（Hpv6-6807-R）5’-AGTGCAAGTCTGGGTTGCAGCCAACA-3’。
取呼吸道***瘤组织在生物安全柜中，研磨稀释后，按照Omega DNA提取试剂盒(货号：D3096)说明书提取组织的DNA（用过的器皿和耗材需严格消毒），然后使用TaKaRa公司一步法PCR试剂盒操作如下：
以DNA提取物为模板进行PCR扩增配制25μl体系，
2×1 step buffer （含dNTP) 13μL
PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1μL
上游引物（Hpv6-5674-F） 0.5μL
下游引物（Hpv6-6807-R） 0.5μL
DNA提取物（模版） 1μL
DNAse Free dH2O 9μL
混匀、低速离心后置PCR自动扩增仪中，按照如下程序扩增：50℃ 30min，94℃ 2min一个循环→94℃ 30sec，52℃ 30sec，72℃ 45sec 35个循环。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳纯化回收，利用T4连接酶与pMD-20-T Vector 16℃过夜连接，转化DH5α感受态细胞，挑单克隆斑于LB（Amp+）中扩大培养，用质粒提取试剂盒提纯质粒pMD-Hpv6-L1，通过SpeI/EcoRI酶切鉴定，确定阳性质粒，见附图1。再通过测序鉴定，将成功构建的阳性质粒pMD-Hpv6-L1大量提取后用EcoRI单酶切将其线性化，纯化测定浓度后于-80℃冻存。利用公式：(copies/μL)=[(ng数×10-9)×(6.02×1023) ]÷(碱基数×340)换算出目的DNA的拷贝数。
实施例3.标准曲线的建立
根据定量后得到的拷贝数，将标准样品制成等6个梯度稀释的检测标准品，为降低误差，提高实验的可重复性，每个稀释度样品都设有三个重复孔，确定Ct值（Ct即cycle threshold，指反应管中的荧光信号达到设定的阈值时的所经历的循环数），从而确定扩增效果最好的标准曲线。
（1）荧光定量PCR扩增
扩增体系为25μL，其中包含2×One Step RT-PCR BufferⅢ (含dNTP Mixture，Mg2+)、TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)、PrimeScript RT Enzyme MixⅡ、DNAse Free dH2O、上游引物SEQ1、下游引物SEQ2
探针SEQ ID No.3、和稀释好 的标准品2μL。
PCR扩增采用Agilent Techologies-Mx3005pPCR扩增仪，程序为： 95℃ 10sec，1个循环（反转录）
95℃ 10sec，55℃ 30sec，72℃30sec，40个循环（PCR扩增）
其中荧光信号收集设置在每一循环的72℃30sec末。
（2）标准曲线的制备
PCR荧光信号的分析采用安捷伦公司MxPro软件，所得到的荧光定量PCR扩增曲线以及相应的标准曲线分别见附图2、3。
实施例4.特异性的检测
用下属常见疫病病原：黏膜低危险型HPV11、黏膜高危险型HPV16、皮肤低危险型HPV1、皮肤高危险型HPV5，检测已建立方法的特异性，所得到的荧光定量PCR结果见附图4。结果显示该方法只能特异性的扩增出猪青少年复发性呼吸道***瘤HPV6亚型DNA阳性对照，特异性好。
实施例5.敏感性的检测
将标准样品制成1×108-1×101（copies/μL）8个稀释度，检测已建立方法的敏感性，所得到的荧光定量PCR结果见附图5。为确保检测的准确性，设置高压灭菌水为本底值对照，将≤34个循环的且曲线有明显的指数增长期的样品判定为阳性，此荧光定量检测方法能准确检测到约10个拷贝的病原，而普通PCR智能检测到1×104个拷贝，由此可见本发明的荧光定量PCR的检测敏感性是普通PCR的103倍，敏感性好。
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 检测***瘤HPV6亚型病毒的实时荧光定量检测试剂盒
<160> 5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（正向引物 Hpv6-F）
<400>
aaccctgtatc caaagttg 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（反向引物 Hpv6-R）
<400>
ccaccttaaa taccctgta 19
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（探针引物 Hpv6--Probe）
<400>
ccacggatgc ttatgttact cgct 24
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（扩增L1基因的部分序列的上游引物 Hpv6-5674-F）
<400>
tggacgacca gctcttcctt aaacac 26
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（扩增L1基因的部分序列的下游引物 Hpv6-6807-R）
<400>
agtgcaagtc tgggttgcag ccaaca 26

Claims (4)

1.一种可检测青少年复发性呼吸道***瘤HPV6亚型病毒的高度特异性引物对，其特征是引物对基因序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。
2.一种可检测青少年复发性呼吸道***瘤HPV6亚型病毒的试剂盒，其特征在于试剂盒内包括有基因序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的高度特异性引物对和基因序列为SEQ ID No3的探针引物。
3.根据权利要求2所述的可检测青少年复发性呼吸道***瘤HPV6亚型病毒的试剂盒，其特征在于试剂盒内还有本发明的试剂盒其特征在于试剂盒内还含有RT-PCR BufferⅢ、TaKaRa Ex Taq HS、PrimeScript RT Enzyme MixⅡ，以及不含青少年复发性呼吸道***瘤HPV6亚型的DNA样品和作为阳性对照的含有青少年复发性呼吸道***瘤HPV6亚型的DNA样品。
4.使用权利要求1或2或3所述的SEQ ID No.1和SEQ ID No.2引物对扩增条件为： 95℃ 10sec，1个循环→95℃ 10sec，55℃ 30sec，72℃ 30sec，40个循环；进行一步法TapMan荧光定量PCR扩增时荧光信号收集放置在每个循环的72℃ 30sec末端。
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