CN109112184A - 一种hpv基因芯片及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种HPV基因芯片,该基因芯片能单独或同时对一种或多种HPV亚型准确检测、筛选和分型,且有人基因组β珠蛋白和HPV引物扩增质控点来监控整个检测过程,该HPV基因芯片能够具有高灵敏度和特异性;本发明还公开了该HPV基因芯片的制备方法,利用PCR反向点杂交法筛选特异性强的探针,通过对HPV基因芯片的点样探针浓度优化,提高了杂交的质量和效率,并用临床样品进一步验证了优化好条件的基因芯片。本发明的HPV基因芯片具有较好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域,具体涉及一种HPV基因芯片及其制备方法和应用。
背景技术
***是女性疾病常见的恶性肿瘤之一,其发病率占全球女性肿瘤第四位。据近年来数据统计发现,我国***患者越来越年轻化,且其发病率和死亡率仍保持在较高水平,因此***前病变的早期筛查,对***的预防有很大作用,从而引起了研究者对***早期筛查的的极高重视。1983年,德国科学家Hausen提出了HPV是***病因的学说,此后很多国内外研究学者做了大量关于***与HPV感染的关系研究,并取得了大量的收获。大量数据研究表明,高危型HPV持续性感染是导致***发生的必要因素。已有研究结果显示,大约有30种高危型HPV能引起宫颈病变,尤其是HPV16亚型和HPV18亚型。
HPV是一种双链环状无包膜的DNA病毒,属于乳多空病毒(papovaviridae)的***瘤空泡病毒A属,其基因组长约8000bp。按照HPV功能划分为3个区域,分别是长控制区(LCR)、早期转录区(E区)和晚期转录区(L区)。E区包括E1~E7,负责编码病毒相关蛋白;L区包括L1和L2,编码病毒的主要衣壳蛋白(L1)和次要衣壳蛋白(L2),L1约占衣壳蛋白的80%,序列高度保守,L2含量较少,变异较多;LCR区含有基因组的复制起点和表达所需的调控元件,参与调控病毒的转录与复制。
由于HPV L1区域是HPV基因组中最为保守的一段序列,因此可根据病毒开放阅读框基因编码核甘酸序列的同源性差异来对病毒进行分型,按照HPV导致***风险的高低将其分为高危型HPV(HRHPV)和低危型HPV(LRHPV),高危型HPV主要有以下类型,如HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、67、68、69、73等型别;低危型HPV包括HPV6、11、40、42、43、44、54、55、57、61、71、81、83等型别,其中低危型HPV主要导致湿疣类病变,而高危型HPV可能导致***的发生。大量研究表明,HPV感染与***变有着密切的关系。由于HPV可在体内潜伏10年甚至更长时间,且不出现任何临床症状,人们很容易忽略HPV检测,这就导致了***前病变发展到***的过程极为漫长。因此,在临床上将HPV检测作为常规筛查的一部分十分重要,通过早期检查提高HPV早期检出率,从而提高***前病变的治愈率,最终预防***的发生,降低***的发病率。HPV检测及分型在***筛查、早期预防、临床诊断及后期治疗等方面具有十分重要的价值。
目前尚未出现HPV体外培养的方法,HPV检测方法主要是细胞学和分子生物学检测法。传统的细胞学检测方法如巴氏涂片法检测的准确率、灵敏度和重复率低,且假阴性率和假阳性率极高,不能对HPV分型。随着人们对HPV检测及分型方法的深入研究,HPV DNA/RNA检测对宫颈病变早期筛查的作用日益显现,相比传统的细胞学检测方法更为灵敏、准确。目前HPV分子生物学诊断方法可以分为3类:核酸杂交法,信号放大技术和核酸扩增技术。荧光原位杂交法能定位,假阳性率低,但是其检测灵敏度低,操作繁琐,费时耗力,并不适合大通量临床样品的筛选。1999年杂交捕获二代技术(HCⅡ)批准用于HPV检测,该技术由美国Digene公司推出,是最早获得美国食品药物管理局(FDA)批准,世界应用最广泛的HPV检测技术,虽然HCⅡ检测特异性好且灵敏度高,但是HCⅡ存在不能进行分型检测,费用成本高,且无内质控等缺陷。2011年美国FDA批准了Cobas 4800HPV技术的一线初筛,该技术能定性检测14种高危型的HPV,且有β珠蛋白作为内质控,但其检测HPV类型仅限于这14种高危类型。近年来,HPV检测方法在临床上的应用仍然存在一些缺陷,如不能对HPV多种亚型进行一次性检测,操作过程繁琐,检测费用高,且耗时耗力等。虽然许多公司关于***筛查研制出了很多HPV检测试剂盒,但这些试剂盒多少存在一些缺陷,所以在确保HPV检测全面的同时,保证HPV检测试剂盒的质量更为重要。由于HPV基因型具有不同的潜在致癌性,所以对临床可疑标本进行具体的分型有助于准确分析和治疗。因此,建立一种新型的HPV基因芯片,能快速准确地对HPV进行检测及分型十分重要。
生物芯片(biochip或bioarray)是采用微缩技术,将不连续的分析过程集成于固相载体的微型分析***,能够实现对样品组分的高通量检测。基因芯片与DNA微阵列技术都属于生物芯片,均是采用阵列方式设定在平面基质载体上,并行处理生物样本中多个基因信息的微处理单元,生物芯片具有微型化和并行处理大量临床样本的特征。鉴于基因芯片技术的优势,采用基因芯片技术,实现大量临床样本平行检测及高通量分析。基因芯片工作原理是将特异性探针点在膜上,制备基因芯片,与被特定标记物标记的DNA扩增产物进行杂交和显色,经过扫描分析检测样本HPV型别。基因芯片技术是目前临床诊断运用最广泛的技术,它在HPV检测方法上起到了关键性的作用,为***患者的诊断带来了福音。近年来基因芯片技术作为一项低消耗、高灵敏度、高通量检测方法,已经被广泛应用于医学研究领域,对HPV的检测及分型具有十分广阔的临床应用前景,因此,研发一种新型的HPV检测方法对HPV的检测及精准分型有着非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于通过运用基因芯片技术,制备一种新型的HPV基因芯片,该基因芯片能一次性检测30种HPV亚型,其中涵盖了19种高危型HPV和11种低危型HPV,且有人基因组β珠蛋白作为质控点来监控整个检测过程,使得该HPV基因芯片能够具有高灵敏度和特异性,并能够运用在临床上。
为达到上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种HPV基因芯片,以Biodyne C膜为载体,膜上包含一个以上HPV亚型检测点和两个阳性质控点,其中两个阳性质控点分别检测人基因组β珠蛋白基因和HPV引物扩增。
前述的HPV基因芯片中,所述的两个阳性质控点中的检测人基因组β珠蛋白基因的探针序列如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:5中任一所示,并且在5’端标记氨基,即PC(PositiveControl)阳性质控点;检测HPV引物扩增的探针序列如SEQ ID NO:6~SEQ ID NO:10中任一所示,并且在5’端标记氨基,即QC(Quality Control)阳性质控点。
前述的HPV基因芯片中,所述HPV亚型检测点包括高危型HPV和/或低危型HPV检测点。
前述的HPV基因芯片中,所述高危型HPV包含HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、67、68、69和73亚型中的一种或几种;所述低危型HPV包含HPV6、11、34、40、42、43、44、54、55、57和62亚型中的一种或几种。
前述的HPV基因芯片中,所述HPV6亚型的探针序列如SEQ ID NO:11~SEQ ID NO:15中任一所示;所述HPV11亚型的探针序列如SEQ ID NO:16~SEQ ID NO:20中任一所示;所述HPV16亚型的探针序列如SEQ ID NO:21~SEQ ID NO:25中任一所示;所述HPV18亚型的探针序列如SEQ ID NO:26~SEQ ID NO:30中任一所示;所述HPV26亚型的探针序列如SEQ IDNO:31~SEQ ID NO:35中任一所示;所述HPV31亚型的探针序列如SEQ ID NO:36~SEQ IDNO:40中任一所示;所述HPV33亚型的探针序列如SEQ ID NO:41~SEQ ID NO:45中任一所示;所述HPV34亚型的探针序列如SEQ ID NO:46~SEQ ID NO:50中任一所示;所述HPV35亚型的探针序列如SEQ ID NO:51~SEQ ID NO:55中任一所示;所述HPV39亚型的探针序列如SEQ ID NO:56~SEQ ID NO:60中任一所示;所述HPV40亚型的探针序列如SEQ ID NO:61~SEQ ID NO:65中任一所示;所述HPV42亚型的探针序列如SEQ ID NO:66~SEQ ID NO:70中任一所示;所述HPV43亚型的探针序列如SEQ ID NO:71~SEQ ID NO:75中任一所示;所述HPV44亚型的探针序列如SEQ ID NO:76~SEQ ID NO:80中任一所示;所述HPV45亚型的探针序列如SEQ ID NO:81~SEQ ID NO:85中任一所示;所述HPV51亚型的探针序列如SEQ IDNO:86~SEQ ID NO:90中任一所示;所述HPV52亚型的探针序列如SEQ ID NO:91~SEQ IDNO:95中任一所示;所述HPV53亚型的探针序列如SEQ ID NO:96~SEQ ID NO:100中任一所示;所述HPV54亚型的探针序列如SEQ ID NO:101~SEQ ID NO:105所示;所述HPV55亚型的探针序列如SEQ ID NO:106~SEQ ID NO:110中任一所示;所述HPV56亚型的探针序列如SEQID NO:111~SEQ ID NO:115中任一所示;所述HPV57亚型的探针序列如SEQ ID NO:116~SEQ ID NO:120中任一所示;所述HPV58亚型的探针序列如SEQ ID NO:121~SEQ ID NO:125中任一所示;所述HPV59亚型的探针序列如SEQ ID NO:126~SEQ ID NO:130中任一所示;所述HPV62亚型的探针序列如SEQ ID NO:131~SEQ ID NO:135中任一所示;所述HPV66亚型的探针序列如SEQ ID NO:136~SEQ ID NO:140中任一所示;所述HPV67亚型的探针序列如SEQID NO:141~SEQ ID NO:145中任一所示;所述HPV68亚型的探针序列如SEQ ID NO:146~SEQ ID NO:150中任一所示;所述HPV69亚型的探针序列如SEQ ID NO:151~SEQ ID NO:155中任一所示;所述HPV73亚型的探针序列如SEQ ID NO:156~SEQ ID NO:160所示;并且在5’端均标记氨基。
前述的HPV基因芯片的制备方法,包括以下步骤:(1)HPV检测标准品的制备;(2)HPV L1区DNA片段靶标的扩增;(3)HPV引物及探针设计及合成;(4)HPV基因芯片的制备。
前述的HPV基因芯片的制备方法中,所述步骤(2)HPV L1区DNA片段靶标的扩增中使用的4条正向引物为det-1A、det-1B、det-1C和det-1D,其中det-1A的序列如SEQ ID NO:161~SEQ ID NO:165中任一所示,det-1B的序列如SEQ ID NO:166~SEQ ID NO:170中任一所示,det-1C的序列如SEQ ID NO:171~SEQ ID NO:175中任一所示,det-1D的序列如SEQID NO:176~SEQ ID NO:180中任一所示,4条反向引物为GP-1A、GP-1B、GP-1C和GP-1D,其中GP-1A的序列如SEQ ID NO:181~SEQ ID NO:185中任一所示,GP-1B的序列如SEQ ID NO:186~SEQ ID NO:190中任一所示,GP-1C的序列如SEQ ID NO:191~SEQ ID NO:195中任一所示,GP-1D的序列如SEQ ID NO:196~SEQ ID NO:200中任一所示,其中4条反向引物5’末端均用生物素标记,并加入人基因组β珠蛋白基因扩增引物一同扩增,HPV扩增引物与人基因组β珠蛋白基因扩增引物的浓度比为1:6~1:4,所述人基因组β珠蛋白基因扩增引物PC04和GH20序列如SEQ ID NO:201和SEQ ID NO:202所示,并且PC045’末端用生物素标记。
前述的HPV基因芯片的制备方法中,所述步骤(4)HPV基因芯片的制备步骤如下:
(4.1)将Biodyne C膜裁剪成膜条;
(4.2)将裁剪的膜条放置0.1mol/L HCl溶液中浸泡后,转移膜条至20%EDC溶液中激活,用无菌双蒸水简单漂洗,室温晾干;
(4.3)用0.1mol/L pH=8.4的Na2CO3/NaHCO3缓冲液将氨基标记的HPV探针、氨基标记的人基因组中的β珠蛋白基因探针和氨基标记的HPV引物扩增探针稀释,取探针稀释液有序地固定于Biodyne C膜上,使氨基标记探针与Biodyne C膜上激活的羧基共价键结合;
(4.4)待Biodyne C膜条风干后,取0.1mol/L NaOH中和,之后用无菌水清洗,于室温风干过夜即得HPV基因芯片。
前述的HPV基因芯片的制备方法中,所述步骤(4)HPV基因芯片的制备步骤如下:
(4.1)将Biodyne C膜裁剪成膜条;
(4.2)将裁剪的膜条放置0.1mol/L HCl溶液中浸泡1min后,转移膜条至20%EDC溶液中激活15min,用无菌双蒸水简单漂洗30s,室温晾干1h;
(4.3)用0.1mol/L pH=8.4的Na2CO3/NaHCO3缓冲,将氨基标记的HPV探针和氨基标记的人基因组中的β珠蛋白基因探针稀释至0.5~8pmol/L和氨基标记的HPV引物扩增探针稀释至0.05pmol/L,取每个探针稀释液3μL有序地固定于Biodyne C膜上,使氨基标记探针与Biodyne C膜上激活的羧基共价键结合;
(4.4)待Biodyne C膜条风干15min后,取0.1mol/L NaOH中和10min,之后用无菌水清洗4遍,每遍30s,于室温风干过夜即得HPV基因芯片。
前述的HPV基因芯片在HPV检测和分型上的应用。
前述的HPV基因芯片作为宫颈疾病或湿疣类疾病筛查或预测工具的应用。
前述的HPV基因芯片的应用,包括如下步骤:
(S1)PCR反向点杂交:
(S1.1)待测样品制备:提取样本DNA进行扩增,得到PCR产物;
(S1.2)将杂交液Ⅰ和杂交液Ⅱ放置水浴锅中预热至45℃备用;
(S1.3)提前设置恒温摇床温度为45℃,使摇床里的温度达到45℃的最适杂交温度;
(S1.4)将步骤(S1.1)所得PCR产物煮沸变性后,立即置于冰上孵育;
(S1.5)用无菌镊子镊取HPV基因芯片膜条放入离心管中,加入预热杂交液Ⅰ,备用;
(S1.6)将步骤(S1.4)所得的变性的PCR产物加入步骤(S1.5)所得放有膜条的离心管中,于100rpm、45℃恒温摇床里杂交;
(S1.7)弃杂交液Ⅰ,取膜条放入离心管中,加入10mL预热杂交液Ⅱ,于100rpm、45℃恒温摇床里洗膜;
(S1.8)弃杂交液Ⅱ,将离心管倒置于吸水纸上,吸干管底液体,加入20mL HRP稀释液,室温下于振荡摇床上以50rpm避光反应10min;
(S1.9)弃结合液,将离心管倒置于吸水纸上,吸干管底液体,加入20mL杂交液Ⅰ室温0下于振荡摇床上洗膜;
(S1.10)弃杂交液Ⅰ,将吸水纸搁置与桌子上,将离心管倒置在上面,吸干管底液体,加入20mL TMB显色液,常温避光反应;显色结束后,立即弃显色液,加入20mL无菌蒸馏水,摇床上洗膜后取出,用吸水纸吸去膜表面水分并于室温晾干;
(S2)结果判读:待膜干后于扫描仪上扫描芯片,对HPV基因芯片上的阳性杂交信号进行信号强度采集分析。
前述的HPV基因芯片的应用,包括如下步骤:
(S1)PCR反向点杂交:
(S1.1)待测样品制备:提取样本DNA并采用权利要求7中所述的4条正向引物和4条反向引物以及人基因组β珠蛋白基因扩增引物进行扩增,HPV扩增引物与人基因组β珠蛋白基因扩增引物的浓度比为1:6~1:4,得到PCR产物;
(S1.2)将杂交液Ⅰ和杂交液Ⅱ放置水浴锅中预热至45℃备用,其中杂交液Ⅰ成分为2×SSC和0.1%SDS,杂交液Ⅱ成分为0.5×SSC和0.1%SDS;
(S1.3)提前设置恒温摇床温度为45℃,使摇床里的温度达到45℃的最适杂交温度;
(S1.4)将步骤(S1.1)所得PCR产物于98℃煮沸变性后,立即置于冰上孵育2min以上;
(S1.5)用无菌镊子镊取HPV基因芯片膜条放入离心管中,加入5mL预热杂交液Ⅰ,备用;
(S1.6)将步骤(S1.4)所得的变性的PCR产物加入步骤(S1.5)所得放有膜条的离心管中,于100rpm、45℃的恒温摇床里杂交15min~1h;
(S1.7)弃杂交液Ⅰ,取膜条放入离心管中,加入10mL预热杂交液Ⅱ,于100rpm、45℃的恒温摇床里洗膜10~30min,总共洗两遍;
(S1.8)弃杂交液Ⅱ,将离心管倒置于吸水纸上,吸干管底液体,加入20mL HRP稀释液,其中HRP稀释液为体积比HRP:弃杂交液Ⅰ=1:2000~8000现配,室温下于振荡摇床上以50rpm的转速避光反应10min;
(S1.9)弃结合液,将离心管倒置于吸水纸上,吸干管底液体,加入20mL杂交液Ⅰ室温下于振荡摇床上洗膜两次,每次洗膜2min;
(S1.10)弃杂交液Ⅰ,将吸水纸搁置与桌子上,将离心管倒置在上面,吸干管底液体,加入20mL TMB显色液,其中TMB显色液为体积比20×TMB-A:1×TMB-B=1:30~100混匀制成,常温避光反应5min,显色结束后,立即弃显色液,加入20mL无菌蒸馏水,摇床上洗膜3min后取出,重复洗膜一遍,用吸水纸吸去膜表面水分并于室温晾干;
(S2)结果判读:待膜干后于扫描仪上扫描芯片,对HPV基因芯片上的阳性杂交信号进行信号强度采集分析。
为验证本发明所制得HPV基因芯片的特异性、检测质量和检测结果,发明人进行了以下实验:
1、用HPV重组质粒扩增的靶标DNA检测基因芯片杂交反应特异性
采用前述步骤(1)所得的30种HPV重组质粒标准品DNA对本发明制备的HPV基因芯片进行特异性检测,待膜干后于扫描仪上扫描芯片,采用Image J软件对HPV基因芯片上的阳性杂交信号进行信号强度采集。阳性杂交信号强度用靶点信号Intensity Value值(INS值)表示。采用IBM SPSS 22.0软件计算HPV基因芯片的特异性、灵敏度和符合率。计算公式:特异性=真阴性的位点数/(真阴性的位点数+假阳性的位点数)×100%、灵敏度=真阳性位点数/(真阳性位点数+假阴性位点数)×100%。
芯片的杂交图如图1结果所示。A是30种HPV型别探针点样矩阵示意图,B、C、D分别是HPV16、HPV18、HPV11靶标DNA标准品与制备的HPV基因芯片杂交显色结果,其余的27种HPV重组质粒杂交结果均产生阳性杂交信号,如图2所示,且每种HPV标准品都只在HPV芯片点阵上相应位点上显色。基因芯片上同一探针位点经过3次杂交后,3次阳性杂交信号强度呈现一致性。杂交结果说明探针具有较好的特异性和灵敏性,计算HPV基因芯片灵敏度、特异性,结果为特异性93.5%,灵敏度100%,且3次独立重复实验均可获得稳定一致的结果,说明30种亚型HPV探针的可重复性良好。
2、用HPV重组质粒DNA验证基因芯片的检测效应
模拟真实的检测情形,将前述步骤(1)所得HPV重组质粒DNA和人β珠蛋白基因DNA进行共同扩增,扩增产物与本发明制备好HPV基因芯片杂交显色,结果如图3所示,A是HPV基因芯片,B、C、D分别是HPV16重组质粒、HPV58重组质粒和HPV11重组质粒分别加入β珠蛋白基因DNA进行共同扩增,取PCR产物与基因芯片点杂交显色,杂交结果显示,HPV检测点、PC和QC质控点均产生阳性杂交信号,其他HPV检测点不产生阳性杂交信号。结果,说明HPV基因芯片在阳性质控点的监控下,具有高特异性和高灵敏度。以人基因组中最广泛的β珠蛋白基因作为基因芯片的阳性质控点,可以监控DNA提取、PCR扩增和分子杂交的整个实验过程,保证了HPV基因芯片检测质量。
本发明的有益效果在于:
本发明运用基因芯片技术,制备了一种新型的HPV分型检测芯片。该基因芯片工作原理是将HPV特异性探针点样并固化在Biodyne C膜上,按照矩阵点样制备成基因芯片,进行检测的时候,用生物素标记PCR引物扩增样本的DNA,然后利用扩增DNA产物上样到基因芯片上,进行杂交孵育,特异性的扩增产物DNA会与相应的探针互补连接成双链,然后加入亲和素标记的辣根过氧化物酶(HRP)与扩增产物上的生物素偶联,加入辣根过氧化物酶的显色底物,显色底物在酶的催化作用下,形成蓝色的阳离子产物,从而在杂交反应的部位产生显色沉淀,经过扫描获取显色位点,与芯片设计的阵列进行对比,从而分析出样本HPV型别。
本发明HPV引物和探针的设计是选定HPV基因组L1区域保守区作为靶基因区,根据L1区域内HPV序列间存在的恒定区和可变区设计引物和探针,采用序列比对软件对各个亚型的HPV L1区域的基因序列进行比对分析,从而选择恒定区设计PCR引物;选择各个亚型HPV L1区变异较大区域设计各型HPV的探针。使用该引物扩增HPV靶基因序列,将设计的各亚型HPV探针点在Biodyne C膜上,制备基因芯片。利用临床样品HPV的DNA扩增制备HPV标准品,如果缺乏某些亚型HPV的临床样本,可在NCBI核酸数据库中查找DNA序列,然后进行合成获得。通过HPV靶标的DNA标准品,进行杂交检测,评价芯片检测的特异性,结果显示相应靶点杂交处有阳性杂交信号,而非特异性的靶点无杂交信号,结果说明HPV探针的独立设计具有高特异性。以HPV基因组L1区作为靶基因区设计引物和探针的方法符合基因芯片大规模、高通量、平行化检测的要求,可以将设计成功的探针点样成芯片,用引物扩增的产物来验证探针的特异性。为HPV检测分型及检测芯片的研发提供了很好的技术储备。
为了保证基因芯片数据的可靠性,基因芯片中还需要加上管家基因作为对照。本发明在芯片上设计了阳性质控点,选择广泛存在于人体细胞中的人β珠蛋白的基因作为阳性对照,选择稀释探针的NaHCO3作为空白对照。阳性质控点可以监控DNA提取、PCR扩增和分子杂交的各个实验过程,有利于芯片检测的质量控制。倘若阳性质控点呈现阳性杂交信号,且该信号强度与HPV检测点的阳性杂交信号强度一致,说明了此次杂交过程没有污染,结果准确;相反,如果阳性质控点没有出现阳性杂交信号,而HPV检测点呈现阳性杂交信号,说明此次杂交结果为假阳性;如果阳性质控点呈现阳性杂交信号但HPV检测点没有杂交信号出现,说明此次杂交结果为假阴性,很可能是杂交过程出现了污染。通过对阳性质控点的全程监控,可以排除HPV检测中的假阳性和假阴性结果,提高基因芯片检测结果的可靠性。
由于临床样本存在双重及多重HPV感染,直接将多重感染的临床样本扩增后与芯片杂交,对HPV特异性探针的筛选不准确。虽然将多重感染的每个HPV单克隆都进行测序分析理论上是可以做到的,但是存在很大困难,因此本发明通过对HPV各种亚型引物的设计及基因克隆,构建HPV重组质粒,制备成HPV标准品。由于构建成功的重组质粒只含有一种HPV亚型,不存在2种或2种以上其他HPV亚型,将制备成功的HPV标准品扩增,与芯片进行杂交,检测结果就不会受到其他类型的HPV影响。HPV检测结果理论上只有检测点有阳性杂交信号,其他点是不显色的。若芯片上只有HPV检测点有阳性杂交信号,说明该亚型的HPV探针特异性好,若还存在检测点以外的阳性杂交信号,说明该亚型的HPV探针特异性不好,考虑重新设计探针。经验证,本发明所制得HPV基因芯片具有良好的特异性。
本发明通过HPV扩增引物和HPV特异性探针的独立设计,HPV探针点样浓度以及PCR反向点杂交显色最适条件的优化,使得HPV基因芯片具有足够高的灵敏度和特异性,临床样本进一步验证了HPV基因芯片能对30种HPV类型进行检测及分型。在本发明中成功收集30种HPV亚型临床样品,通过HPV通用引物的扩增及基因克隆,成功构建30种HPV类型重组质粒。以HPV重组质粒为模板,高效率扩增HPV基因组L1区短基因片段。根据HPV基因组设计30种HPV特异性探针,将30种HPV特异性探针点在膜上,制备HPV基因芯片,利用PCR反向点杂交法筛选特异性强的探针。通过对HPV基因芯片的点样探针浓度优化,提高了杂交的质量和效率,并用临床样品进一步验证了优化好条件的基因芯片。在实际使用时,可以根据需要选择采用30种HPV特异性探针中的某一种或者几种采用同样的制备方法制备成HPV基因芯片,而针对性的进行某种HPV亚型的检测和筛选或者较小范围HPV亚型的检测和筛选。
综上所述,本发明的HPV基因芯片灵敏度高,特异性强,能单独或同时对一种或多种HPV亚型准确检测、筛选和分型,具有较好的临床应用前景。
附图说明
图1为HPV16、HPV18、HPV11靶标DNA标准品与制备的HPV基因芯片杂交显色结果。
图2为其余27种HPV重组质粒与HPV基因芯片杂交结果。
图3为用HPV11、16和58重组质粒DNA验证基因芯片的检测效应杂交结果。
图4为各型HPV L1区DNA扩增产物电泳图。
图5为各型HPV菌落PCR产物电泳图。
图6为各型HPV质粒电泳图。
图7为HPV标准品电泳图。
图8为HPV探针点样浓度对芯片显色灰度值的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明技术方案进行进一步的说明。
1.实验材料
1.1标本来源
40例门诊女性HPV感染患者标本(宫颈刮片脱落细胞)取材于贵阳清镇市第一人民医院,年龄为21-67岁,平均年龄为37.9岁。40例标本均由人***瘤病毒基因分型检测试剂盒(中山大学达安基因股份有限公司)或基因测序检测,已确定40例标本的HPV型别。
在40例HPV临床标本中,检测出30种亚型的HPV,其扩增产检测结果如图4所示,30种HPV检测目的基因均约500bp大小,条带大小与预计相符,提示30种HPV临床标本的扩增产物可用于下一步研究。
1.2主要仪器
微量移液器:德国Eppendorf;
电泳仪电源:北京六一仪器厂,型号是DYY-6C;
PCR扩增仪:美国应用生物***公司,型号是ABI9700;
凝胶成像仪:英国Syngene,型号是BOXEF2;
高速离心机:安徽中科中佳科学仪器有限公司,型号是HC-2062;
恒温孵育摇床:杭州米欧仪器有限公司,型号是ES-60;
水平电泳槽:北京六一生物科技有限公司,型号是DYCP-31DN;
1.3主要试剂
C膜:Pall Life Science;
HPV探针:天一辉远生物科技有限公司;
HPV引物:天一辉远生物科技有限公司;
Streptavidin-POD:碧云天生物科技有限公司;
pMD18-T simple vector:宝生物(大连)有限公司;
Taq DNA聚合酶:宝生物(大连)有限公司;
DNA Marker系列:宝生物(大连)有限公司;
辣根过氧化物酶(HRP):康为世纪生物科技有限公司
TMB显色液:康为世纪生物科技有限公司;
DNA Clean-up Kit:康为世纪生物科技有限公司;
质粒(小量)抽提试剂盒:天根生化科技有限公司;
EDC:北京百林威科技有限公司;
1.4主要试剂的配制
杂交液Ⅰ2×SSC(0.1%SDS):称取柠檬酸钠1.76g、SDS 0.2g、NaCl 3.5g,加100mL超纯水溶解,溶解完全后,用超纯水定容至200mL,室温保存。
杂交液Ⅱ0.5×SSC(0.1%SDS):称取柠檬酸钠0.44g、SDS 0.2g、NaCl 0.875g,加100mL超纯水溶解,溶解完全后,用超纯水定容至200mL,室温保存。
DNA提取液:称取EDTA 9.3g、SDS 5g、NaCl 14.6g、Tris 24.2g,加800mL超纯水溶解,溶解完全后,用超纯水定容至1L,室温保存。
20%EDC:称取1g EDC,溶于5mL高压冷却的超纯水中,现配现用。
大肠杆菌DH5α菌株由贵州医科大学分子生物学重点实验室提供。
2.制备HPV基因芯片
2.1HPV检测标准品的制备
2.1.1HPV临床样本DNA的提取
1)HPV感染临床样本由清镇市第一人民医院提供,将收集的宫颈脱落细胞以10000rpm转速于离心机离心5min,弃上清液;
2)用移液枪取50μL DNA提取液于离心管中,轻轻吹打管底沉淀物至混匀,放置100℃沸水浴中孵育10min;
3)孵育完成后于离心机中以10000rpm转速离心5min,保留上清液,提取的DNA样品立即使用或放置于-20℃保存。
2.1.2HPV临床样本的扩增
参考Gravitt等使用改进的位于HPV基因组L1区域保守区中的PGMY09引物(RahmanM,Sasagawa T,Yamada R,et al.High prevalence of intermediate‐risk humanpapillomavirus infection in uterine cervices of kenyan women infected withhuman immunodeficiency virus[J].Journal of Medical Virology,2011,83(11):1988-1996.),设计HPV通用引物,扩增HPV临床样品。按下列表1体系和表2条件进行PCR扩增:
表1临床样品中HPV基因L1区DNA扩增PCR反应体系
表2临床样品HPV L1区DNA扩增PCR反应条件
通过琼脂糖凝胶电泳检测;电泳结束后,放入EB染色池中染色;染色结束后,将凝胶放入核酸紫外成像***中进行拍照,分析结果。
2.1.3PCR产物的纯化
使用DNA Clean-up Kit试剂盒按照操作说明纯化阳性PCR产物。
2.1.4重组质粒的转化和涂板
1)将HPV纯化DNA按表3连接体系(10μL)混匀,放置16℃水浴锅中连接过夜:
表3 HPV***片段DNA与质粒载体的连接体系
2)将感受态细胞DH5α从-80℃取出放置冰上解冻,用加样器吸取50μL感受态菌液至连接产物中,小心吹打混匀后放置冰上孵育30min;
3)将上述溶液放入42℃水浴锅中水浴75s后迅速取出置于冰上孵育5min;
4)将热击转化产物转移至装有600μL LB培养基的1.5mL离心管中,于37℃,200rpm条件下的恒温摇床里复苏30min;
6)将转化产物置于离心机以4000rpm转速离心3min,弃大部分上清液,保留100μL左右上清液重悬菌液,重悬菌液转移至含Amp的LB平板上,用无菌涂布棒均匀涂布重悬菌液,倒置上述平板于37℃恒温培养箱中培养过夜;
7)观察过夜培养平板是否长出菌落,若未长出菌落,考虑感受态细胞是否出问题或者目的基因与载体未连接,重新转化涂板;若长出单克隆菌落,进一步对单克隆菌落PCR和琼脂糖凝胶电泳检测,检测目的基因是否转化成功。
纯化的HPV产物连接pMD18-T后挑取单克隆进行菌落PCR和琼脂糖凝胶电泳检测,检测结果如图5所示,30种HPV类型菌落PCR产物的长度在500bp左右,提示HPV L1区DNA与空载体质粒连接成功。
2.1.7单克隆质粒鉴定
1)以单克隆DH5α的质粒作为模版,采用质粒试剂盒中的引物(M13-47和M13-RM)进行PCR扩增,扩增的位点起始于***位点的上下游。若HPV L1区DNA与空载体质粒连接成功,PCR产物的长度大约在500bp左右;如果是空质粒,PCR产物仅为70-80bp;
2)取过夜培养平板,使用无菌牙签挑取平板上的单克隆,无菌牙签在下述PCR体系(10μL)蘸一下之后放入装有600μL含Amp的LB培养基中,振荡牙签,使牙签上的菌掉落进入培养基中,于37℃、200rpm条件的恒温摇床中振荡培养,将菌液振荡培养至对数期中期(OD=0.4-0.6);
3)按下列表4体系和表5条件进行PCR:
表4 PCR反应体系
表5 PCR反应条件
通过琼脂糖凝胶电泳检测;电泳结束后,将凝胶放入EB染色池中染色;染色结束后,将凝胶放入核酸紫外成像***中进行拍照,分析结果。
将检测结果为阳性的单克隆菌液扩大培养,提取质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测,检测结果如图6所示,30种HPV类型重组质粒条带大小与预计的大小相符;进一步验证HPVL1区DNA与pMD18T载体连接成功。
2.1.8基因测序验证
为进一步验证构建的单克隆质粒的正确性,挑选阳性结果对应的菌液样品进行测序,根据菌液测序结果,保留测序正确的单克隆于甘油菌,作为标准品,-20℃保存。
纯化的HPV产物连接pMD18-T后挑取单克隆测序,HPV***的全基因组序列长度约为500bp。HPV重组质粒测序结果与HPV基因芯片结果符合率达到96.7%。经重组克隆测序验证,成功构建30种HPV重组质粒。
2.1.9HPV重组质粒的提取
使用质粒小提试剂盒按(离心柱型)按照操作说明提取阳性HPV重组菌液。
2.2HPV L1区DNA片段靶标的扩增
靶标片段的DNA在L1区当中,是鉴定HPV分型的关键位点,基因芯片的探针和引物设计都来源于此处。
2.2.1重组质粒DNA的制备
1)经测序验证重组质粒正确后,用无菌接种环将甘油菌接种到装有600μL含氨苄的LB培养基中,于37℃、200rpm条件的恒温摇床复苏过夜;
2)使用质粒小提试剂盒按(离心柱型)按照操作说明提取上述HPV重组菌液,以此HPV重组质粒为模板进行扩增。
2.2.2HPV重组质粒的扩增
1)为了提高PCR扩增效率和杂交结果的质量,在HPV基因组的L1区内设计4条正向引物和4条反向引物,所设计的4条反向引物5’末端均用生物素标记,如表8所示,作为显色基团的连接分子。利用兼并引物原理,扩增HPV重组质粒L1区的靶标DNA序列,PCR体系和条件如表6和表7所示:
表6 HPV靶标DNA片段的PCR反应体系
表7 HPV标准品靶标DNA片段的PCR反应条件
通过琼脂糖凝胶电泳;电泳结束后把凝胶放入EB染色池中染色;染色结束后,将凝胶放入核酸紫外成像***中进行拍照,分析结果。
靶标片段的DNA在L1区当中,是鉴定HPV分型的关键位点,基因芯片的探针和引物设计都来源于此处。本发明利用兼并引物原理,高效率扩增HPV L1区DNA靶标片段,该靶标片段的理论长度在160-200bp左右。用琼脂糖凝胶电泳进行检测,发现扩增的片段约为180bp大小的扩增条带,其大小与预计相符,如图7所示,提示重组质粒里含有HPV L1区靶标DNA序列,而且PCR产物的长度准确,可用于杂交,作为检测基因芯片的标准品。
2.3HPV引物及探针设计
根据HPV基因组L1区的恒定区设计通用引物,保证HPV L1区扩增产物的特异性;再根据HPV L1区的靶标片段DNA序列的变异区域设计各类型探针,保证亚型探针的特异性;根据人β珠蛋白特征性区域的DNA序列设计内对照探(PC),保证样品来源的有效性和PCR反应的有效性;在探针的5’端均标记氨基,用于探针与固相基质连接而固化,如表8所示,其中序列与SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:168170相同,表8中1、2为PC和QC探针序列,3~32为30中HPV亚型探针序列,33~40为HPV L1区DNA片段靶标的扩增中使用的4条正向引物和4条反向引物序列,并在4条反向引物5’端标记生物素,41和42为人基因组β珠蛋白基因扩增引物序列,并合成引物和探针。
表8HPV探针序列、HPV型扩增正向引物和反向引物以及人基因组β珠蛋白基因扩增引物序列
2.4HPV基因芯片的制备
HPV基因芯片的设计为3×11的阵列,探针点阵列共包括32个点,2个阳性质控点和30个HPV型检测点,32种探针排列顺序如图1中A所示。阵列的左上角和右下角各有PC和QC两个点,PC(Positive Control)为阳性质控点,检测人基因组中的β珠蛋白基因,监控样本DNA的提取和PCR扩增过程的有效性;QC(Quality Control)为阳性质控点,监控HPV引物扩增;其余30个点为30种HPV亚型检测点。
1)在HPV探针点样前,将Biodyne C膜裁剪成膜条;
2)将裁剪的膜条放置0.1mol/L HCl溶液中浸泡1min后,转移膜条至20%EDC溶液中激活15min,用无菌双蒸水简单漂洗30s,室温晾干1h;
3)用0.1mol/L Na2CO3/NaHCO3缓冲液(pH=8.4),将氨基标记的HPV探针和人基因组中的β珠蛋白基因探针稀释至0.5~8pmol/L,每个探针取3μL稀释液有序地固定于Biodyne C膜上,使氨基标记探针与Biodyne C膜上激活的羧基共价键结合,每个样品间隔1cm;
4)待Biodyne C膜条风干15min后,取0.1mol/L NaOH中和10min,之后用无菌水清洗4遍,每遍30s,于室温风干过夜,即得HPV基因芯片。
探针的点样浓度会影响到基因芯片对HPV样品PCR产物检测的灵敏度,用0.1mol/LNaHCO3溶液分别将30种亚型的HPV探针稀释成0.5pmol/L,1pmol/L,2pmol/L,4pmol/L和8pmol/L的浓度,对照组为0.1mol/L NaHCO3溶液。按照设计的点阵安排,将不同探针浓度以相同的点样量点样于Biodyne C膜上制备成基因芯片,用相应HPV标准品进行杂交。对不同探针点样浓度的HPV基因芯片进行杂交检测和灰度值分析,将显色图像转化为INS数据,得到探针浓度与检测灰度值的关系图,如图8所示。结果显示HPV杂交信号的强度会随着探针浓度的增大而增强,当绝大多数亚型的HPV探针的点样浓度达到2pmol/L时,杂交显色灰度值曲线趋于平缓,说明HPV探针的最佳点样浓度约为2pmol/L。
3.PCR反向点杂交
1)提取样本DNA并采用表8中所述的4条正向引物和4条反向引物进行扩增,得到PCR产物,备用;
2)将杂交液Ⅰ(2×SSC;0.1%SDS)和杂交液Ⅱ(0.5×SSC;0.1%SDS)放置水浴锅中预热至45℃备用;
3)提前设置恒温摇床温度为45℃,并按确认键,使摇床里的温度达到45℃的最适杂交温度。
4)PCR产物于98℃煮沸8min变性后,立即置于冰上孵育2min以上;
5)用无菌镊子镊取预杂交的Biodyne C膜条放入15mL离心管中,加入5mL预热杂交液Ⅰ,备用;
6)将变性的PCR产物加入放有膜条的离心管中,于100rpm,45℃的恒温摇床里杂交15min~1h;
7)弃杂交液Ⅰ,镊取膜条放入50mL离心管中,加入10mL预热杂交液Ⅱ,于100rpm,45℃的恒温摇床里洗膜10~30min,总共洗两遍;
8)弃杂交液Ⅱ,将离心管倒置于吸水纸上,吸干管底液体,加入20mL HRP稀释液(HRP:弃杂交液Ⅰ=1:2000~8000现配),室温下于振荡摇床上以50rpm的转速避光反应10min;
9)弃结合液,将离心管倒置于吸水纸上,吸干管底液体,加入20mL杂交液Ⅰ室温下于振荡摇床上洗膜两次,每次洗膜2min;
10)弃杂交液Ⅰ,将吸水纸搁置与桌子上,将离心管倒置在上面,吸干管底液体,加入20mL TMB显色液(现配,体积比20×TMB-A:1×TMB-B=1:30~100),常温避光反应5min;显色结束后,立即弃显色液,加入20mL无菌蒸馏水,摇床上洗膜3min后取出,重复洗膜一遍,用吸水纸吸去膜表面水分并于室温晾干。
4结果判读
待膜干后于扫描仪上扫描芯片,采用Image J软件对HPV基因芯片上的阳性杂交信号进行信号强度采集。阳性杂交信号强度用靶点信号Intensity Value值(INS值)表示。结果判读时,HPV检测点为清晰可见的蓝紫色斑点,同时QC和PC阳性质控点均呈阳性,实验结果有效。
序列表
<110> 贵州医科大学
<120> 一种HPV基因芯片及其制备方法和应用
<141> 2018-08-20
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<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
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tttttttttt tttttaacta aatatgatgc acgtgaaatc aatca 45
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<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
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tttttttttt tttttattaa ctaaatatga tgcacgtgaa atca 44
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<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
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tttttttttt tttttacatt aactaaatat gatgcacgtg aaatc 45
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<212> DNA
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tttttttttt tttttctaaa tatgatgcac gtgaaatcaa tcaa 44
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tttttttttt tttttaaaaa tcagaggcta catacaaaaa tgaa 44
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tttttttttt tttttaatca gaggctacat acaaaaatga aaact 45
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tttttttttt tttttctact actgaatcag ctgtaccaaa tatt 44
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tttttttttt tttttatctg catctgccac ttttaaacca tca 43
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tttttttttt tttttgcatc tgccactttt aaaccatcag atta 44
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tttttttttt tttttatctg ccacttttaa accatcagat tata 44
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tttttttttt ttttttgtaa tcagaggcta catacaaaaa tgaa 44
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tttttttttt tttttaggct acatacaaaa atgaaaacta attga 45
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tttttttttt tttttaatca gaggctacat acaaaaatga aaact 45
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gcncaaggnc agaataatgg 20
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gcncaaggnc acaagaatgg 20
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gaaaaataaa ctgtaaatca tattcgtc 28
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gaaaaataaa ctgtaactca tattcttc 28
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gaaaaataaa ctgtaaatca tattcttc 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
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gaaaaataaa ctgtaattca aattcttc 28
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gaaaaataaa ctgtaattca tattcatc 28
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gaaaaataaa ctgtaattca aattcatc 28
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gaaaaataaa ctgtaattca cattcttc 28
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gaaaaataaa ctgtaattca tattcttc 28
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gaaaaataaa ctgtaaatca cattcctc 28
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gaaaaataaa ctgtaaatca tattcctc 28
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gaaaaataaa ctgtaaatca cattcgtc 28
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gaaaaataaa ctgtaaatca cattcttc 28
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<213> 人工序列(未知)
<400> 198
gaaaaataaa ctgtaaatca gattcctc 28
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 199
gaaaaataaa ctgtaattca gattcttc 28
<210> 200
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 200
gaaaaataaa ctgtaaatca aattcttc 28
<210> 201
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 201
caacttcatc cacgttcacc 20
<210> 202
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 202
gaagagccaa ggacaggtac 20
Claims (13)
1.一种HPV基因芯片,其特征在于,以Biodyne C膜转印膜为载体,膜上包含一个以上HPV亚型检测点和两个阳性质控点,其中两个阳性质控点分别检测人基因组β珠蛋白基因和HPV引物扩增。
2.根据权利要求1所述的HPV基因芯片,其特征在于,所述的两个阳性质控点中的检测人基因组β珠蛋白基因的探针序列如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:5中任一所示,检测HPV引物扩增的探针序列如SEQ ID NO:6~SEQ ID NO:10中任一所示,并且在5’端均标记氨基。
3.根据权利要求1或2所述的HPV基因芯片,其特征在于,所述HPV亚型检测点包括高危型HPV和/或低危型HPV检测点。
4.根据权利要求3所述的HPV基因芯片,其特征在于,所述高危型HPV包含HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、67、68、69和73亚型中的一种或几种;所述低危型HPV包含HPV6、11、34、40、42、43、44、54、55、57和62亚型中的一种或几种。
5.根据权利要求4所述的HPV基因芯片,其特征在于,所述HPV6亚型的探针序列如SEQID NO:11~SEQ ID NO:15中任一所示;所述HPV11亚型的探针序列如SEQ ID NO:16~SEQID NO:20中任一所示;所述HPV16亚型的探针序列如SEQ ID NO:21~SEQ ID NO:25中任一所示;所述HPV18亚型的探针序列如SEQ ID NO:26~SEQ ID NO:30中任一所示;所述HPV26亚型的探针序列如SEQ ID NO:31~SEQ ID NO:35中任一所示;所述HPV31亚型的探针序列如SEQ ID NO:36~SEQ ID NO:40中任一所示;所述HPV33亚型的探针序列如SEQ ID NO:41~SEQ ID NO:45中任一所示;所述HPV34亚型的探针序列如SEQ ID NO:46~SEQ ID NO:50中任一所示;所述HPV35亚型的探针序列如SEQ ID NO:51~SEQ ID NO:55中任一所示;所述HPV39亚型的探针序列如SEQ ID NO:56~SEQ ID NO:60中任一所示;所述HPV40亚型的探针序列如SEQ ID NO:61~SEQ ID NO:65中任一所示;所述HPV42亚型的探针序列如SEQ IDNO:66~SEQ ID NO:70中任一所示;所述HPV43亚型的探针序列如SEQ ID NO:71~SEQ IDNO:75中任一所示;所述HPV44亚型的探针序列如SEQ ID NO:76~SEQ ID NO:80中任一所示;所述HPV45亚型的探针序列如SEQ ID NO:81~SEQ ID NO:85中任一所示;所述HPV51亚型的探针序列如SEQ ID NO:86~SEQ ID NO:90中任一所示;所述HPV52亚型的探针序列如SEQ ID NO:91~SEQ ID NO:95中任一所示;所述HPV53亚型的探针序列如SEQ ID NO:96~SEQ ID NO:100中任一所示;所述HPV54亚型的探针序列如SEQ ID NO:101~SEQ ID NO:105所示;所述HPV55亚型的探针序列如SEQ ID NO:106~SEQ ID NO:110中任一所示;所述HPV56亚型的探针序列如SEQ ID NO:111~SEQ ID NO:115中任一所示;所述HPV57亚型的探针序列如SEQ ID NO:116~SEQ ID NO:120中任一所示;所述HPV58亚型的探针序列如SEQID NO:121~SEQ ID NO:125中任一所示;所述HPV59亚型的探针序列如SEQ ID NO:126~SEQ ID NO:130中任一所示;所述HPV62亚型的探针序列如SEQ ID NO:131~SEQ ID NO:135中任一所示;所述HPV66亚型的探针序列如SEQ ID NO:136~SEQ ID NO:140中任一所示;所述HPV67亚型的探针序列如SEQ ID NO:141~SEQ ID NO:145中任一所示;所述HPV68亚型的探针序列如SEQ ID NO:146~SEQ ID NO:150中任一所示;所述HPV69亚型的探针序列如SEQID NO:151~SEQ ID NO:155中任一所示;所述HPV73亚型的探针序列如SEQ ID NO:156~SEQ ID NO:160所示;并且在5’端均标记氨基。
6.权利要求1~5任一所述的HPV基因芯片的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)HPV检测标准品的制备;(2)HPV L1区DNA片段靶标的扩增;(3)HPV引物及探针设计及合成;(4)HPV基因芯片的制备。
7.根据权利要求6所述的HPV基因芯片的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)HPV L1区DNA片段靶标的扩增中使用的4条正向引物为det-1A、det-1B、det-1C和det-1D,其中det-1A的序列如SEQ ID NO:161~SEQ ID NO:165中任一所示,det-1B的序列如SEQ ID NO:166~SEQ ID NO:170中任一所示,det-1C的序列如SEQ ID NO:171~SEQ ID NO:175中任一所示,det-1D的序列如SEQ ID NO:176~SEQ ID NO:180中任一所示,4条反向引物为GP-1A、GP-1B、GP-1C和GP-1D,其中GP-1A的序列如SEQ ID NO:181~SEQ ID NO:185中任一所示,GP-1B的序列如SEQ ID NO:186~SEQ ID NO:190中任一所示,GP-1C的序列如SEQ ID NO:191~SEQ ID NO:195中任一所示,GP-1D的序列如SEQ ID NO:196~SEQ ID NO:200中任一所示,其中4条反向引物5’末端均用生物素标记,并加入人基因组β珠蛋白基因扩增引物一同扩增,HPV扩增引物与人基因组β珠蛋白基因扩增引物的浓度比为1:6~1:4,所述人基因组β珠蛋白基因扩增引物PC04和GH20序列如SEQ ID NO:201和SEQ ID NO:202所示,并且PC04 5’末端用生物素标记。
8.根据权利要求6所述的HPV基因芯片的制备方法,其特征在于,所述步骤(4)HPV基因芯片的制备步骤如下:
(4.1)将Biodyne C膜裁剪成膜条;
(4.2)将裁剪的膜条放置0.1mol/L HCl溶液中浸泡后,转移膜条至20%EDC溶液中激活,用无菌双蒸水简单漂洗,室温晾干;
(4.3)用0.1mol/L pH=8.4的Na2CO3/NaHCO3缓冲液将氨基标记的HPV探针、氨基标记的人基因组中的β珠蛋白基因探针和氨基标记的HPV引物扩增探针稀释,取探针稀释液有序地固定于转印膜上,使氨基标记探针与Biodyne C膜上激活的羧基共价键结合;
(4.4)待Biodyne C膜条风干后,取0.1mol/L NaOH中和,之后用无菌水清洗,于室温风干过夜即得HPV基因芯片。
9.根据权利要求8所述的HPV基因芯片的制备方法,其特征在于,所述步骤(4)HPV基因芯片的制备步骤如下:
(4.1)将Biodyne C膜裁剪成膜条;
(4.2)将裁剪的膜条放置0.1mol/L HCl溶液中浸泡1min后,转移膜条至20%EDC溶液中激活15min,用无菌双蒸水简单漂洗30s,室温晾干1h;
(4.3)用0.1mol/L pH=8.4的Na2CO3/NaHCO3缓冲,将氨基标记的HPV探针和氨基标记的人基因组中的β珠蛋白基因探针稀释至0.5~8pmol/L和氨基标记的HPV引物扩增探针稀释至0.05pmol/L,取每个探针稀释液3μL有序地固定于Biodyne C膜上,使氨基标记探针与Biodyne C膜上激活的羧基共价键结合;
(4.4)待Biodyne C膜条风干15min后,取0.1mol/L NaOH中和10min,之后用无菌水清洗4遍,每遍30s,于室温风干过夜即得HPV基因芯片。
10.权利要求1~5所述的HPV基因芯片在HPV检测和分型上的应用。
11.权利要求1~5所述的HPV基因芯片作为宫颈疾病或湿疣类疾病筛查或预测工具的应用。
12.根据权利要求10或11所述的HPV基因芯片的应用,其特征在于,包括如下步骤:
(S1)PCR反向点杂交:
(S1.1)待测样品制备:提取样本DNA进行扩增,得到PCR产物;
(S1.2)将杂交液Ⅰ和杂交液Ⅱ放置水浴锅中预热至45℃备用;
(S1.3)提前设置恒温摇床温度为45℃,使摇床里的温度达到45℃的最适杂交温度;
(S1.4)将步骤(S1.1)所得PCR产物煮沸变性后,立即置于冰上孵育;
(S1.5)用无菌镊子镊取HPV基因芯片膜条放入离心管中,加入预热杂交液Ⅰ,备用;
(S1.6)将步骤(S1.4)所得的变性的PCR产物加入步骤(S1.5)所得放有膜条的离心管中,于100rpm、45℃恒温摇床里杂交;
(S1.7)弃杂交液Ⅰ,取膜条放入离心管中,加入10mL预热杂交液Ⅱ,于100rpm、45℃恒温摇床里洗膜;
(S1.8)弃杂交液Ⅱ,将离心管倒置于吸水纸上,吸干管底液体,加入20mL HRP稀释液,室温下于振荡摇床上以50rpm避光反应10min;
(S1.9)弃结合液,将离心管倒置于吸水纸上,吸干管底液体,加入20mL杂交液Ⅰ室温0下于振荡摇床上洗膜;
(S1.10)弃杂交液Ⅰ,将吸水纸搁置与桌子上,将离心管倒置在上面,吸干管底液体,加入20mL TMB显色液,常温避光反应;显色结束后,立即弃显色液,加入20mL无菌蒸馏水,摇床上洗膜后取出,用吸水纸吸去膜表面水分并于室温晾干;
(S2)结果判读:待膜干后于扫描仪上扫描芯片,对HPV基因芯片上的阳性杂交信号进行信号强度采集分析。
13.根据权利要求12所述的HPV基因芯片的应用,其特征在于,包括如下步骤:
(S1)PCR反向点杂交:
(S1.1)待测样品制备:提取样本DNA并采用权利要求7中所述的4条正向引物和4条反向引物以及人基因组β珠蛋白基因扩增引物进行扩增,HPV扩增引物与人基因组β珠蛋白基因扩增引物的浓度比为1:6~1:4,得到PCR产物;
(S1.2)将杂交液Ⅰ和杂交液Ⅱ放置水浴锅中预热至45℃备用,其中杂交液Ⅰ成分为2×SSC和0.1%SDS,杂交液Ⅱ成分为0.5×SSC和0.1%SDS;
(S1.3)提前设置恒温摇床温度为45℃,使摇床里的温度达到45℃的最适杂交温度;
(S1.4)将步骤(S1.1)所得PCR产物于98℃煮沸变性后,立即置于冰上孵育2min以上;
(S1.5)用无菌镊子镊取预杂交的HPV基因芯片膜条放入离心管中,加入5mL预热杂交液Ⅰ,备用;
(S1.6)将步骤(S1.4)所得的变性的PCR产物加入步骤(S1.5)所得放有膜条的离心管中,于100rpm、45℃的恒温摇床里杂交15min~1h;
(S1.7)弃杂交液Ⅰ,取膜条放入离心管中,加入10mL预热杂交液Ⅱ,于100rpm、45℃的恒温摇床里洗膜10~30min,总共洗两遍;
(S1.8)弃杂交液Ⅱ,将离心管倒置于吸水纸上,吸干管底液体,加入20mL HRP稀释液,其中HRP稀释液为体积比HRP:弃杂交液Ⅰ=1:2000~8000现配,室温下于振荡摇床上以50rpm的转速避光反应10min;
(S1.9)弃结合液,将离心管倒置于吸水纸上,吸干管底液体,加入20mL杂交液Ⅰ室温下于振荡摇床上洗膜两次,每次洗膜2min;
(S1.10)弃杂交液Ⅰ,将吸水纸搁置与桌子上,将离心管倒置在上面,吸干管底液体,加入20mL TMB显色液,其中TMB显色液为体积比20×TMB-A:1×TMB-B=1:30~100混匀制成,常温避光反应5min,显色结束后,立即弃显色液,加入20mL无菌蒸馏水,摇床上洗膜3min后取出,重复洗膜一遍,用吸水纸吸去膜表面水分并于室温晾干;
(S2)结果判读:待膜干后于扫描仪上扫描芯片,对HPV基因芯片上的阳性杂交信号进行信号强度采集分析。
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