KR101239387B1 - 인유두종바이러스의 유전자형 분석용 ｄｎａ 칩, 이를 포함하는 키트 및 유전자형 분석방법 - Google Patents

인유두종바이러스의 유전자형 분석용 ｄｎａ 칩, 이를 포함하는 키트 및 유전자형 분석방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자궁경부암의 주원인이자 성교전파성질환의 가장 흔한 원인인 HPV 44종(type)의 핵산과 상보적으로 결합하는 프로브가 집적된 DNA 칩(또는, DNA 마이크로어레이), 이를 포함하는 유전자형 분석키트, 및 이를 이용한 분석방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하면 성기를 침범하는 44개 유형의 HPV를 모두 파악할 수 있고, 하나 이상의 HPV형에 의한 복합감염도 정확하게 진단하며, HPV 유전자형의 진단 민감도와 특이도가 모두 100%에 가깝도록 높으며, 다수의 검체를 신속하게 검사할 수 있으며, 자궁경부의 암과 전암 병변을 예측하는 데에 매우 유용하다.

Description

인유두종바이러스의 유전자형 분석용 ＤＮＡ 칩, 이를 포함하는 키트 및 유전자형 분석방법{DNA CHIP FOR GENOTYPING OF HUMAN PAPILLOMA VIRUS, KIT COMPRISING THE SAME, AND METHOD FOR GENOTYPING HPV}
본 발명은 인유두종바이러스(human papillomaviruis, HPV)의 유전자형 분석용 DNA 칩, 이를 포함하는 키트 및 유전자형 분석방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 자궁경부암의 주원인이자 성교전파성질환의 가장 흔한 원인인 HPV 44종(type)의 핵산과 상보적으로 결합하는 프로브가 집적된 DNA 칩(또는, DNA 마이크로어레이), 이를 포함하는 유전자형 분석키트, 및 이를 이용한 유전자형 분석방법에 관한 것이다.
인유두종바이러스(HPV)는 성적 접촉에 의해 인체에 전파되는 바이러스로 두가지 관점에서 매우 중요하다.
첫째, HPV 감염은 인간에서 가장 흔한 성전파성 감염(Sexually transmitted infection)이다. 인유두종바이러스 감염은 단일 요인으로 볼때 가장 유병율 (prevalence rate)이 높은 성감염으로, 미국의 14세에서 59세 사이 여성의 26.8%에서 HPV감염이 발견되며, 전체 여성 중 80%가 일생에 한번 이상 감염되는 것으로 보고되고 있다. 무엇보다 성적 활동기, 가임기의 여성에서 호발하며, 현재 발병율이 증가하는 것으로 추측되고 있다. 이 때문에 성인 여성에서 주기적인 HPV검사는 필수적이며, 성감염 검사시 HPV 검사는 기본적으로 포함된다(U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, Centers for Disease Control and Prevention National Center for HIV/AIDS, Viral Hepatitis, STD, and TB. Prevention Division of STD Prevention. Sexually Transmitted Disease Surveillance 2008. Division of STD Prevention. 2009: November; Tchernev G. Sexually transmitted papillomavirus infections: epidemiology pathogenesis, clinic, morphology, important differential diagnostic aspects, current diagnostic and treatment options. An Bras Dermatol. 2009; 84(4): 377-89).
둘째, HPV는 인체 감염 부위에 종양을 일으킬 수 있으며, 암을 유발함이 명백하게 입증된 바이러스이다. HPV는 인간의 접촉부위 상피세포에 감염이 된 후 과잉증식(hyperproliferation)을 일으킨다. 이때의 과잉증식은 단순한 피부의 사마귀(wart)나 외성기, 항문 주위의 곤지름 혹은 첨규콘딜롬(condyloma accuminata)과 같은 양성종양인 경우가 대부분이다. 그러나 HPV는 발암의 원인이 될 수도 있으며, 실제 거의 모든 자궁경부암(uterine cervix cancer or cervical cancer)과 구강암이나 인두암, 후두암의 상당수, 그리고 다수의 항문암(anal cancer)이 HPV에 의해 발병함이 확인되고 있다. HPV는 암을 유발하여 생명을 앗아갈 수 있다는 점에서 그 중요성이 더할 나위 없이 크며, 한편으로는 HPV를 검사하면 자궁경부 및 항문 등의 암과 전암병변을 조기 진단할 수 있다. 실제 HPV 검사는 자궁경부암 조기검진의 표준검사인 Papanicolaou 세포검사(Pap smear) 보다 자궁경부암의 예측 민감도가 더 우수함이 밝혀지고 있고, 이에 따라 미국 FDA 등 여러 국가에서 자궁경부암 선별검사로 인정되고 있다(Howley PM. Virology.　 Vol 2, 1996, 2045-2109; Murinoz N et al., N Engl J Med, 2003, 348:518-27; Parkin M, F. Bray F, J. Ferlay J and P. Pisani P. Global cancer statistics, 2002. C.A. Cancer J. Clin. 2005; National Network of STD/HIV Prevention Training Center. Genital human papillomavirus infection. Feb 2008). 이러한 이유들 때문에 HPV 관련분야의 시장은 매우 크며, HPV검사의 경제적 가치도 매우 크다.
자궁경부암은 전 세계적으로 유방암 다음으로 두 번째로 많은 여성 암이고, 나아가 특히 개발도상국 여성에서 주된 암사망 원인 중 하나이다. 전 세계적으로 매년 약 44만명의 환자가 새로 발생하며, 27만명이 사망한다고 보고되고 있다. 특히 개발도상국 여성에서 주요 사망 원인 중 하나이다. 국내 여성의 경우 자궁경부암 (10.6%)은 장기별 발생 빈도상 위암(15.8%)과 유방암(15.1%)에 이어 3위를 차지하고 있다. 특히 최근에는 20∼30대 젊은 여성에서 인유두종 바이러스의 감염율이 크게 늘어 전체 성교전파성질환 환자의 32%를 차지하는 등 국민 보건상 심각한 문제로 대두되고 있다. 2002년 한국 중앙 암 등록 사업보고서에 의하면 우리나라는 2002년 한 해에 3,979명의 질환이 발생하는 등 서구 선진국에 비하여 아직은 높은 발생률을 보인다. 여성에서 발생하는 전체 악성 종양 중에는 9.1%로 유방암, 위암, 대장암, 갑상선암에 이어 5위를 차지하고 있으며, 그 중에 40대가 29.3%로 가장 많이 차지하고 있다. 국내 여성에서 주요 부위별 암등록 건수 추이를 보면 암의 전단계인 자궁경부의 상피내암을 포함한 경우 여성의 암에서 2위를, 상피내암을 제외시킨 경우 5위를 차지한다. 그러나, 암통계에 등록되지 않는 자궁경부상피 이형성증까지 포함한다면 아직도 가장 중요한 여성암이다. 또한 전에는 자궁암의 거의 90% 이상이 자궁경부암이었으나 근간에는 자궁체부암의 발생 빈도가 높아지고 자궁경부암의 빈도는 낮아지고 있다. 현재는 자궁경부암과 자궁체부의 비율이 약 5:1의 비율을 나타내고 있다 (http://www.ncc.re.kr:9000/nciapps/user/basicinfo/each_info.jsp?grpcode=1H00).
　　자궁경부암의 발생원인과 관련된 역학적 연구에 의하면 교육수준 또는 경제적 수준이 낮거나 불결한 위생 상태, 어린 나이에 성적 경험을 시작한 여성에서, 출산 경험이 많은 여성에서, 성적으로 문란한 배우자를 가진 여성에서 그리고 인유두종 바이러스 검사에서 양성으로 진단 받은 여성에서 자궁경부암에 걸릴 위험도가 높은 것으로 알려져 있다. 이러한 요인들은 자궁경부암과 성감염(sexually transmitted infection)의 관련성이 매우 높다는 것을 암시하며, 특히 자궁경부암의 발생의 원인 인자로써 인유두종 바이러스가 중요한 역할을 한다는 것이 널리 인정되고 있다(김재원, 노주원, 김문홍, 박노현, 한국여성의 자궁경부 조직에서 발견되는 인유두종 바이러스 16형의 E7 유전자 다형성, J Korean Cancer Assoc. 2000; 32(5) 875-883).
HPV는 현재까지 그 아형(subtype) 내지 유전자형(genotype)에 따라 약 120여개의 형이 알려져 있고 이중 83개는 전체 유전자의 염기서열과 구조가 모두 밝혀져 있다. 40여종의 HPV는 항문과 음부, 즉 질과 자궁경부, 요도, 음경의 피부 및 점막을 침범하는 소위 항문성기형 또는 성기형 HPV(anogenital or genital type HPV) 이다. HPV 감염의 대부분은 증상이 없이 잠복되어 있으나, 일부는 사마귀(wart)를 유발한다. 또 다른 일부는 고등급 편평상피내 병변(high grade squamous intraepithelial lesion, HSIL)이나 경부상피내종양(cervical intraepithelial neoplasm)과 같은 전암병변을 유발하며, 이 중 일부는 다시 암으로 진행한다. 전암병변과 암을 유발하는 HPV형을 고위험형(high risk type) HPV라고 하며, 그렇지 않은 HPV형을 저위험형(low risk type) HPV라고 한다. 연구자에 따라서는 HPV를 고위험군, 중위험군, 저위험군으로 구분하기도 한다. 고위험형 HPV로는 HPV type 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 및 82이 포함된다. 이에 대해 저위험형 HPV로는 HPV type 6, 11, 34, 40, 42, 43, 44, 54, 55, 61, 62, 72 및 81이 포함된다. 고위험으로 의심되나 아직 확립되지 않은 형(probable high risk type)으로 HPV type 26, 53, 66, 67, 69, 70 및 73이 있다. 그 외에 정확하게 분류되지 않은 기타 형으로 HPV type 7, 10, 27, 30, 32, 57, 83, 84 및 91이 있다. 전 세계적으로 자궁경부암 환자의 49.9%가 HPV 16형에, 13.7%가 HPV 18형에, 7.2%가 HPV 31, 33, 35형에, 그리고 8.4%가 HPV 45형에 감염되어 있다고 보고되고 있다.
머크사의 보고에 따르면 HPV 16형 및 18형이 특히 중요하며, 이들 두 유형의 HPV가 자궁경부암과 자궁경부상피내종양(CIN), 그리고 전암병변인 HSIL의 약 60-70%를 유발하며 HPV 6 및 11형은 성기 사마귀의 약 90%를 일으킨다고 한다. 그러나 각 인종과 국가에 따라 각 HPV의 유형별 역학에는 차이가 있다. 실제 본 명세서에서도 후술하는 바와 같이, 한국의 자료는 타국가의 그것과 다소 차이가 있다. 한편 또 다른 국내 연구에 따르면 인유두종바이러스중에서도 자궁경부암을 발생시키는 HPV 고위험군으로는 HPV 16, 18형을, 중등위험군으로는 HPV 31, 33, 35, 45, 52형을, 저위험군으로 HPV 6, 11형이 보고되고 있으며, 이들 유전자형의 HPV를 검사하면 자궁경부암의 조기 검진(screening) 내지 진단이 가능한다고 주장하고 있다(김재원, 노주원, 김문홍, 박노현, 한국여성의 자궁경부 조직에서 발견되는 인유두종 바이러스 16형의 E7 유전자 다형성, J Korean Cancer Assoc. 2000; 32(5) 875-883; (http://www.cmcbaoro.or.kr/guide/ guide02_02.jsp?dtno=209&dcno= 411; Munoz N, Bosch FX, de Sanjose S, Herrero R, Castellsague X, Shah KV, Snijders PJ, Meijer CJ and International Agency for Research on Cancer Multicenter Cervical Cancer Study Group. Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer. New England Journal of Medicine. 2003; 348: 518-527; Koutsky LA et al., N Engl J Med, 2002, 347:1645-51; http://www.bosa.co.kr/news_board/view.asp ? news_pk=82896).
HPV는 유전체의 크기가 약 8∼10kb이며, 이중나선 형태의 DNA로 되어 있으며, 이를 외피가 덮고 있는 구조를 가진 바이러스로 골프공 모양을 하고 있다. HPV의 게놈 구조는 크게 초기전사부위 E(early gene region)와 후기전사부위 L(late gene region), 그리고 발현되지 않는 부위인 LCR(long control region)으로 나뉜다. HPV의 게놈 구조는 그 HPV의 발병 양상과 위험, 예후에 큰 영향을 미친다. 특히 E 부위 중 E6와 E7 유전자는 감염 세포의 게놈 내로 들어가 머물러 있으면서 발현되어 발암에 가장 중요한 역할을 한다. HPV 16형과 HPV 18형 등의 고위험형 HPV의 E6와 E7 유전자는 각각 인체 내 가장 중요한 종양억제유전자(tumor suppresasor gene)인 p53과 E6AP, 그리고 Rb(retinoblastoma, P105RB) 및 P107, P130 등과 각각 반응하여 이들을 무력화(비활성화)시킨다. 그 결과 세포주기의 조절과 고사(apoptosis) 조절 기전에 장애가 오면서 세포는 암세포로 전환되게 된다. 자궁경부암의 경우 99% 이상이 고위험형 HPV에 의해 발병하며, 거의 항상 암세포의 유전체 내에서 E6/E7 등 HPV의 유전자 조각이 발견된다. 이에 대해 저위험형의 HPV의 경우 p53이나 Rb 종양억제유전자와 반응하여 이들을 비활성화시키는 능력이 낮고, 이 때문에 자궁경부암을 유발하기 어렵다. 한편 HPV의 유전자 중 가장 크기가 큰 것은 L1이다. L1은 대부분의 HPV 형에서 염기서열이 비슷하게 보존되어 나타난다. L1은 HPV의 캡시드 단백질의 대부분을 차지하며, 가장 항원성이 높은 부위이기도 하다.
HPV에 의해 일단 악성 전환(transformation)된 자궁경부 세포는 전암 병변 내지 암전구병변인 이형성(dysplasia)이나 자궁상피내종양(cervical intraepithelial neoplasma, CIN), 혹은 편평상피내병변(squamous intraepithelial lesion, SIL)을 거쳐 암의 형태를 갖춘 소위 상피내암(carcinoma in situ)으로 진행되며, 상피내암이 자궁경부 상피 밑의 기저층으로 침범하게 되면 이것이 암(carcinoma), 혹은 침윤성 암(invasive carcinoma)이 된다. 인유두종 바이러스에 감염된 여성 중 대다수인 90%는 체내 면역기전의 작용에 의해 인유두종 바이러스가 자연 소실된다. 그러나 고위험형 인유두종 바이러스에 감염된 여성 중 약 10%는 인유두종 바이러스가 지속되면서 전암병변을 유발한다(Wallin KL, Winklund F, Angstrim T, et al: Type-specific persistence of human papillomavirus DNA before the development of invasivecancer. N Engl J Med 1999341:1633; Bosch FX, Lorincz A, Munoz N, Meijer CJ, Shah KV. The causal relation between human papilomavirus and cervical cancer. J Clin Pathol 2002;55:244-65). 전암 병변 중 약 8%가 상피내암으로 진행이 되며, 상피내암 중 약 20%가 암으로 발전한다. 즉 인유두종 바이러스 감염환자 중 고위험군 감염이 10∼20년 이상 지속되는 경우 자궁경부암으로 진행이 되며, 그 빈도는 약 0.16%로 추산되고 있다. 전암병변 중 약 8%가 상피내암으로 진행이 되며, 상피내암 중 약 20%가 암으로 발전한다. 즉 HPV 감염 환자 중 고위험형의 HPV 감염이 10∼20년 이상 지속되는 경우에 자궁경부암으로 진행이 되며, 그 빈도는 약 0.16%로 추산되고 있다. 이렇게 자궁경부암의 발병에는 장기간의 시간이 소요되며, 단계적으로 발생하기 때문에 발병 중간단계에서 전암병변을 조기 진단하여 치료하면 치유나 예방이 가능하다. 즉, 자궁경부의 전암병변을 보존적 수술로 제거함으로서 암발병을 차단할 수 있다.
HPV 감염은 배양이나 염색, 조직검사, 면역학적 검사로는 진단이 어렵고, 오로지 유전자검사로만 정확한 진단이 가능하다. HPV의 유전자검사에는 3가지 종류가 있다. 첫째는 단순히 HPV의 존재 유무를 확인하는 검사이다. 대표적인 예로 HPV의 유전자의 콘센선스 시퀀스(consensus sequence), 즉 변함없는 부위 염기서열을 PCR로 증폭한 뒤 전기영동 등으로 확인하는 방법이 있다. 둘째는 HPV의 존재 유무 뿐 아니라 그 형(type)을 함께 확인하는 소위 유전자형 분석 검사(genotyping analysis)이다. 이의 소위 황금표준율적 검사(golden standard test)는 PCR 후 그 산물을 자동염기서열분석 혹은 시퀀싱(sequencing)으로 유전자형을 분석하는 방법이다. 그러나 이는 비용과 시간, 인력이 너무 많이 소요됨에 따라 최근에 와서 HPV DNA 마이크로어레이로 대치되는 경향이다. 이는 다수의 HPV 형에 특이한 프로브를 집적한 고형지지체 위에 검체 DNA의 PCR산물을 올려 놓고 하이브리다이제이션 반응을 수행하여 스캐너로 분석하는 방법이다. 셋째는 양자의 중간쯤 되는 검사로, Hybrid Capture Assay(Digene Corporation, Gaithersburg, MD, USA)가 이에 해당된다. 이는 HPV의 존재 파악을 하며, 나아가 존재하는 HPV가 고위험군인지 저위험군인지를 알아낸다. 그러나 정확한 유전자형은 확인할 수 없다는 단점이 있다. 아울러 13개의 고위험형 HPV와 7개의 저위험형 HPV만 분석하므로, 이에 포함되지 않는 20여개 형의 HPV는 파악할 수 없다(Kim KH, Yoon MS, Na YJ, Park CS, Oh MR, Moon WC. Development and evaluation of a highly sensitive human papillomavirus genotyping DNA chip. Gynecol Oncol. 2006; 100(1):38-43; Selva L, Gonzalez-Bosquet E, Rodriguez-Plataa MT, Esteva C, Sunol M and Munoz-Almagro C. Detection of human papillomavirus infection in women attending a colposcopy clinic. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 2009; 64: 416-421).
HPV와 관련하여 또 하나 중요한 사실은, 최근 백신이 개발됨에 따라 바이러스의 예방과 함께 나아가, 바이러스로 인한 암의 예방이 가능해지고 있다는 것이다. 현재 시판되는 HPV 예방 백신에는 2종류가 있다. 하나는 Gardasil? (Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, NJ, USA)로, 이는 HPV 16, 18, 6, 11형의 4종의 HPV를 예방하기 위해 만들어진 4가 백신이다. 또 다른 하나는 Cervarix? (GlaxoSmithKline Biologicals, Rixensart, Belgium)로 types 16과 18의 2종의 HPV를 예방하기 위해 만들어진 2가 백신이다. 이들 백신은 성관계를 갖기 전의 청소년 여성에 가장 효과적이며, 이전에 HPV 16형이나 HPV 18형에 감염된 적이 있는 여성의 경우 효과가 떨어진다. 이 때문에 성인 여성에 대한 적응 여부에 논란이 있으나, HPV에 감염된 적이 있더라도 그 형이 type 16이나 18이 아닌 경우 HPV 백신이 적응가능할 수도 있다. 따라서 HPV의 감염 유무 뿐 아니라 그 형(type)도 정확히 아는 것이 더욱 더 중요해지고 있다 (Selva L, Gonzalez-Bosquet E, Rodriguez-Plataa MT, Esteva C, Sunol M and Munoz-Almagro C. Detection of human papillomavirus infection in women attending a colposcopy clinic. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 2009; 64: 416-421; Reynales-Shigematsu LM, Rodrigues ER, Lazcano-Ponce E. Cost-effectiveness analysis of a quadrivalent human papilloma virus vaccine in Mexico. Arch Med Res. 2009 Aug;40(6):503-13).
과거 자궁경부암의 1차 선별검사(Primary screening test)로서 자궁경부의 세포를 검사하는 세포진 검사, 일명 파파니콜로 도말표본(Papanicolaous smear 또는 Pap smear)검사가 이용되어 왔다. 그러나 본 세포진검사는 주관적 검사이어서 흔히 가양성이 있고, 이 때문에 자궁경부암검진에 실패하는 일이 흔하고, 이에 따라 이를 보완하는 검사가 필요시되어 왔다. 실제 Pap smear를 이용한 세포학적 검사는 자궁경부암 발생의 가장 중요한 원인이 되는 인유두종 바이러스 감염의 진단에는 효과적이지 못하며, 이상 병변이 보일 때 이것이 자연 소멸할 것인지 혹은 암으로 진행할 것인지에 대한 예측이 어렵다. 실제 현미경하의 세포 형태학적인 검사만으로는 문제가 되는 무증상 감염 혹은 잠재적인 감염을 진단할 수 없으며, 특히 고위험군의 인유두종 바이러스 유전자형과 저위험군의 유전자형의 감염을 구분하는 것은 불가능하다. 따라서 자궁경부암의 발생빈도를 줄이기 위해서는 HPV 감염과 위험도 및 유전자형을 추적 관리할 수 있는 진단 방법이 필요하다.
상기한 문헌 분석에 따라 볼 때 HPV의 존재 여부와 나아가 그 유전자형을 정확하고 신속하며, 최소비용으로, 그리고 대단위로 검색이 가능하며, 검사하기 편리한 검사가 절실함을 알 수 있고, 이를 위해 가장 유망한 검사는 DNA 마이크로어레이(칩) 기술이다.
외국에서 사용되는 HPV 진단제품으로 Hybrid Capture II (Qiagen, Germany)-FDA 승인, Cervista™ HPV HR test (HOLOGIC Womens health co.) 14 high Risk-FDA 승인, Roche AMPLICOR? HPV Test (Roche Molecular Systems, USA)-CE 마킹, PapilloCheck? HPV-Screening Test Kit (Greiner Bio-One GmbH, Germany): 18 high-risk and 6 low-risk types-CE 마킹, digene HPV Genotyping RH Test (Qiagen)-18 high risk-CE 마킹을 받은 제품들이 있다.
그러나, 상기의 상업화된 HPV 유전자 분석형(genotyping) DNA 칩은 다음과 같은 문제점들이 있다.
첫째, 검사할 수 있는 HPV의 유전자형의 수가 제한되어 있다.
둘째, HPV 프로브의 디자인이 실제 임상검체에서의 HPV 유전체의 유전자염기서열 정보에 입각하여 결정되어야 하나, 대부분의 HPV DNA 칩이 문헌이나 미국 gene bank에 보고되고 있는 HPV의 표준적 유전자 염기서열 정보에 입각하여 고안되어 있다. 그러나 실제 HPV의 유전체의 DNA염기서열에는 수없이 많은 변형이 존재하며, 이를 고려하지 않고 프라이머나 프로브를 획일적으로 만들어서 사용하면 PCR증폭과 하이브리디제이션이 제대로 이루어지지 않고, 놓칠 위험이 따른다.
셋째, 내부참고 유전자(대조 유전자)를 고려하지 않고 있으며, 이 때문에 검사 결과가 음성으로 나올 때 이것이 진성 음성(true negative)인지 가음성(false negative)인지를 알기 힘들다.
넷째, 모든 유전자형의 HPV의 존재 여부를 모두 검사할 수 있는 소위 유니버셜 프로브(universal probe)에 대한 고려가 없다. 이 때문에 조사하려는 유전자형의 HPV가 모두 음성으로 나올 경우 이것이 그 검체 내에 HPV가 전혀 존재하지 않음을 가리키는지, 혹은 별개의 유전자형(other type)의 HPV가 존재하는지를 감별해야 하나, 이에 대한 고려를 찾기 힘들다.
다섯째, HPV DNA 분석 전에 가장 중요한 단계는 PCR인 바, 그 조건 또한 표준화되어 있지 않다.
여섯째, HPV DNA칩과 이를 이용한 HPV 유전자형 검사가 표준화되기 위해서는 각 유전자형의 HPV 별로 그 유전자 클론의 표준물질이 모두 준비되어야 하나, 이에 대한 고려를 찾기 힘들다.
일곱째, 기왕에 HPV DNA진단키트가 여러개 나와 있으나, 그것이 과연 표준검사에 비해 얼마나 정확한지, 그리고 자궁경부의 암과 전암병변의 검색에 얼마나 유용한지 대단위의 검사와 상대 비교가 필요함에도 이를 찾아보기 힘들다.
이에, 본 발명자들은 수년동안 25만건 이상의 다양한 검체를 대상으로 PCR후 시퀀싱과 DNA 마이크로어레이, 유형별 PCR(HPV-type specific PCR) 등의 방법으로 항문성기형(anogenital type) HPV의 존재 여부와 그 유형, HPV의 유전자 염기서열 등을 연구한 바, 이 경험과 상업화된 HPV DNA 진단키트들의 특성을 분석한 결과, 종래기술이 보완해야 할 문제점들을 발견하고 새로운 HPV DNA 마이크로어레이를 발명하게 되었다. 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
1. 성기 및 항문형 HPV 유형의 종류와 수
종래 문헌에 따르면 자궁경부 등 성기와 항문 부위를 침범할 수 있는 HPV 유형은 40여종 될 것으로 추정되고 있으나 명확하게 밝혀져 있지 않다. 모든 유형의 성기형 HPV를 모두 정확하게 파악하기 위해서는 성기형 HPV의 전체 유형을 다수의 검체에서 검사하는 것이 선결 과제이다. 그러나 전 세계적으로 이러한 자료는 찾기 힘들다.
이에 본 발명자들은 약 16,000례의 한국 여성의 자궁경부 검체에서 HPV의 L1, L2, E6/E7 유전자에 대해 PCR을 한 후 그 산물의 염기서열을 모두 분석하였다. 이 자료에 근거를 두고, 나아가 미국 등 여타 국가의 보고를 참조하여 새로운 HPV DNA칩에 포함되어야 할 HPV유형을 결정하였다. 그 수는 모두 43종이었고, 이에 따라 43종의 성기형 HPV에 대해 이를 모두 분석할 수 있는 DNA 칩을 발명하게 되었다. 이에 대해서는 실시예 1에서 상술한다.
2. 표준물질
HPV 유전자형 분석에 있어서 기본적 과제 중 하나는 각 유전자형 별로 표준물질(reference material)이 모두 준비되어야 한다는 것이다. 이는 HPV의 바이러스 일수도 있고, 혹은 HPV의 전체 게놈 혹은 HPV의 핵심유전자 자체, 또는 플라스미드 클론일 수도 있다. 문헌들에 나와 있고, Gene Bank에 공탁되어 있는 성기형 HPV의 표준물질의 종류와 수는 매우 제한되어 있다.
이에 발명자들은 앞에서 기술하였듯이 15,000개 이상의 한국 여성의 자궁경부 검체에서 HPV의 L1, L2, E6/E7 유전자에 대해 PCR을 한 후 그 산물의 염기서열을 모두 분석하고, 이에 따라 43종의 성기형 HPV의 각 유형별로 L1, L2, E6/E7유전자의 전체 내지 부분을 크로닝하여 플라스미드 DNA 클론을 얻었다. 아울러 HPV L1유전자의 특정 부위를 표적으로 하여 검색함으로써 43종의 HPV의 유전자형을 식별하기로 결정하였으며, 각 유형별로 HPV L1 유전자 클론의 플라스미드 표준물질을 수립하였다. 이를 이후의 DNA칩 개발과 품질 관리(quality control, QC)에 사용하였다. 이에 대해서는 실시예 2에서 상술한다.
3. PCR 증폭
HPV DNA 칩 분석이 정확하고 민감하게 이루어지기 위해서는 사전에 PCR 증폭이 적절하게 이루어지는 것이 중요하다. 이에 따라, 본 발명의 HPV DNA칩에서 하이브리디제이션 분석을 하게 될 HPV L1 유전자를 증폭하는 PCR의 조건이 최적상태로 이루어져야 하며, 무엇보다 PCR의 프라이머가 적절하게 고안되어야 한다. 아울러 가급적 HPV L1과 참조 및 대조 유전자와 하나의 튜브 내에서 동일 조건하에 듀플렉스(duplex PCR)로, 그리고 한번의 PCR로 증폭이 이루어져야 한다. 문헌에 보고되는 HPV PCR의 조건이나 혹은 여타 상업화된 HPV DNA 칩에서 권유되는 PCR 방법은 흔히 이중 PCR(nested PCR)이어서 불편하고 오염의 위험이 더 커지며, 특정 유형의 HPV는 증폭이 잘되나 다른 유형의 HPV는 증폭이 안 되는 등의 문제점이 있고, 흔히 참고 유전자와 동시 PCR 증폭시 서로 간섭이 일어나는 등의 문제점도 발견되었다.
이에 발명자들은 앞에서 얻어진 43가지 유형의 HPV L1의 염기서열과 표준물질에 의거하여, 그리고 반복된 실험을 통해 PCR의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 염기서열과 증폭 조건을 새로 수립하였다. 그 결과 HPV L1과 참조 유전자의 증폭이 듀플렉스(duplex PCR)로, 그리고 한번의 PCR로 이루어지도록 하였다. 이에 대해서는 실시예 3에서 상술한다.
4. 대조 유전자
HPV DNA칩 분석시 지켜야 할 기본 조건 중 하나는 표적 물질 뿐 아니라 이에 대비한 참고물질(internal reference) 또는 대조물질(control)의 유전자도 함께 검색해야 한다는 것이다. 이는 DNA 칩의 시그널의 정상화 분석 (normalization analysis)에 필수적이며, 가음성과 가양성을 파악하기 위해 필수적이다. 그럼에도 불구하고 상당수의 DNA 칩은 대조물질 없이 검사되고 있다.
본 발명자들은 기왕에 대조 유전자로 인간 베타글로빈(human beta-globin) 유전자를 사용해 왔으며, 이에 나아가 또 다른 하우스키핑 유전자인 베타엑틴(beta-actin) 유전자로 바꾸는 것이 더 적합함을 발견하여 이를 새로이 HPV DNA 칩에 추가하였다. 이에 대해서는 실시예 4 내지 6에서 상술한다.
5. 프로브의 골격
HPV 유전자형 분석 DNA 마이크로어레이의 가장 중요한 과정은 하이브리디제이션이 적절하게 이루어져 각 유전자형 별로 HPV가 명확하게 식별되는 데 있다. 이를 위해 가장 중요한 핵심은 프로브이다. 발명자들은 앞에서 기술한 대로 15,000개 이상의 한국 여성의 자궁경부 검체에서 HPV의 L1 유전자에 대해 PCR을 한 후 그 산물의 염기서열을 모두 분석하여 43종의 성기형 HPV의 각 유형별로 그 염기서열자료를 수립하고, 플라스미드 DNA 클론 표준물질을 수립하였으며, 이러한 실제 자료에 의거하여 HPV DNA 칩의 올리고뉴클레오티드의 기본 골격을 수립하였다. 이는 짧게는 18개, 길게는 30개 염기쌍(base pair, bp)으로 되어 있다. 이에 대해서는 실시예 5에 상술한다.
6. 프로브의 최종 디자인과 생산
올리고뉴클레오티드 프로브는 통상 20∼30bp에 C6 형태의 링커가 붙어 있는 형태로 만들어진다. 그러나 본 발명자들의 경험에 의하면, 이는 유리슬라이드 위에 집적시 공간적으로 불안정하여 문제를 일으킬 수 있음을 발견하였다.
이에 본 발명자들은 상기 올리고뉴클레오티드 프로브 골격에 C6 형태의 링커에서 더 나아가 C20 형태의 긴 프로브를 디자인하였다. 이에 대해서는 실시예 5에 상술한다. 아울러 줄기(stem) 부위를 넣어서 d자형의 프로브를 디자인하였다. 이에 대해서는 실시예 6에 상술한다.
7. DNA 마이크로어레이(칩)의 제작
디자인된 프로브에 따라 그리드(grid)를 고안한 후 적정 버퍼(buffer)에 혼합한 프로브를 현미경용 유리슬라이드 위에 집적하였다. 이에 대해서는 실시예 7에 상술한다.
8. DNA 마이크로어레이(칩)에서 반응
HPV의 각 유형별 클론을 하나, 혹은 두개 내지 세 개까지 다양한 조합과 농도로 조성한 100개의 인공 표준 검체를 주물로 하여 HPV L1과 베타엑틴의 유전자를 PCR 증폭한 후　제작된 칩위에 올려 놓고 하이브리디제이션 반응을 3차례 이상 수행한 후 형광스캐너로 분석하여 적정 조건을 수립하였다. 이에 대해서는 실시예 8에 상술한다.
9. DNA 마이크로어레이(칩)의 정확도 평가
상기한 새로운 방법에 따라 만들어진 새로운 DNA칩의 정확도를 표준 검사인 시퀀싱 방법 내지 HPV 유형별 PCR(HPV-type specific PCR)의 그것과 비교 분석하여 본 발명의 HPV DNA칩의 정확도와 민감도 및 특이도를 조사하였다. 아울러 본 HPV DNA 칩이 자궁경부 세포 등 임상 검체에서 HPV의 유무와 그 유전자형을 검사하는 데 사용할 수 있을지를 점검하였다. 이에 대해서는 실시예 9에 기술하였다. 종래의 HPV DNA칩은 이러한 자료 자체가 없는 실정이다.
10. 자궁경부암의 조기검진 정확도 평가
상기한 새로운 방법에 따라 만들어진 신규의 DNA칩을 기존의 방법인 Hybrid capture assay-2(HCA-2)의 그것과 비교 분석하여, 본 발명의 HPV DNA칩의 자궁경부암 및 전암병변의 예측 정확도와 민감도 및 특이도를 조사하였다. 아울러 본 발명의 HPV DNA 칩이 자궁경부 세포 등 임상 검체에서 자궁경부암과 전암병변을 예측하는 데 사용할 수 있을지를 점검하였다. 이에 대해서는 실시예 10에 기술하였다. 종래의 HPV DNA칩은 이러한 자료가 없는 바, 이점 본 발명의 HPV DNA칩은 달리하여 임상적 유용성을 확인하였다.
본 발명의 목적은, 종래 HPV DNA칩의 문제점을 보완하여 44종의 성기형 HPV 감염을 동시에 정확하고 신속하게 진단할 수 있는 HPV 진단분석용 DNA 칩을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 44종의 성기형 HPV를 높은 특이도 및 민감도로 정확하게 검색할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 및 PCR 프라이머를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 HPV DNA 칩과, PCR 프라이머 및 표지수단 등을 올인원("all in one")으로 제공하는 44종의 HPV의 유전자형 분석 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명에 있어서 검체의 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 분석용 DNA 칩은 서열번호 6 내지 109의 염기서열을 갖는 직선형 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함한다.
본 발명에 있어서 검체의 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 분석용 DNA 칩은 서열번호 110 내지 213의 염기서열을 갖는 d형 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함한다.
본 발명의 DNA 칩은 고위험군 HPV로서 HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-68a, HPV-68b 및 HPV-82; 중위험군 HPV로서 HPV-26, HPV-53, HPV-66, HPV-67, HPV-69, HPV-70 및 HPV-73; 저위험군 HPV로서 HPV-6, HPV-11, HPV-34, HPV-40, HPV-42, HPV-43, HPV-44, HPV-54, HPV-55, HPV-61, HPV-62, HPV-72 및 HPV-81; 나머지 군의 HPV로서 HPV-90, HPV-10, HPV-27, HPV-30, HPV-32, HPV-57, HPV-83, HPV-84 및 HPV-91을 포함하는 44종의 HPV 유전자형을 동시분석할 수 있다.
본 발명의 DNA 칩에 있어서, 서열번호 6 내지 97, 및 서열번호 110 내지 201의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브는 HPV의 각 유형(type)에 특이적인 L1 유전자 부위와 상보적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 DNA 칩에 있어서, 서열번호 98 내지 105, 및 서열번호 202 내지 209의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브는 HPV의 모든 유형(type)에 공통으로 존재하는 L1 유전자 부위와 상보적으로 결합하는 유니버셜 프로브일 수 있다.
본 발명의 DNA 칩에 있어서, 서열번호 106 내지 109, 및 서열번호 210 내지 213의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브는, 양성 대조군으로서 인체형 베타엑틴 유전자와 상보적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 DNA 칩은 프로브를 집적할 수 있는 웰(well)이 8개 내지 24개로 구획되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 DNA 칩에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프로브의 농도는 38pmol 이상인 것이 바람직하다.
본 발명의 DNA 칩에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프로브에 링커로서 C6의 아민 변형된 디데옥시티미딘을 결합시켜, 수퍼알데히드기(superaldehyde)로 코팅된 지지체 위에 집적시킨 것이 바람직하다.
본 발명의 DNA 칩에 있어서, 상기 지지체는 유리슬라이드, 페이퍼, 니트로셀룰로오스막, 마이크로플레이트 웰, 플라스틱, 실리콘, DVD 및 비드로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 DNA 칩에 있어서, 검체는 자궁경부 및 질의 스왑, 자궁경부의 조직, 남성 성기의 조직, 소변, 항문, 직장, 인두, 구강 및 두경부로 이루어진 군에서 선택할 수 있다.
또한, 본 발명의 DNA 칩에 있어서, 검체는 남성 성기의 암, 남성 요로의 암, 항문암, 두경부암 및 이들의 전암 세포로 이루어진 군에서 선택할 수 있다.
본 발명의 DNA 칩은 HPV 백신의 투여 여부를 결정하는 데 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 인유두종바이러스(HPV)의 유전자형 분석용 키트는 상기 DNA 칩, 타겟 유전자를 PCR 증폭하기 위한 프라이머, 및 증폭된 DNA를 검출하기 위한 표지수단을 포함한다.
본 발명의 분석용 키트에 있어서, 프라이머는 서열번호 1 및 2의 염기서열을 갖는 인체형 베타엑틴 유전자 증폭용 프라이머; 및 서열번호 3 내지 5의 염기서열을 갖는 HPV L1 유전자 증폭용 프라이머인 것이 바람직하다.
본 발명의 분석용 키트에 있어서, 표지수단은 Cy3, Cy5, Cy5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, Orange green 488X, Orange green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665, Calfluor Orange 546, Calfluor red 610, Quasar 670, 비오틴, Au, Ag 및 폴리스티렌으로 이루어지는 군으로부터 하나 이상 선택될 수 있다.
본 발명의 인유두종바이러스(HPV)의 유전자형 분석방법은, 하기의 단계를 포함하여 이루어진다.
(a) 서열번호 1 내지 5에서 선택되는 프라이머를 이용하여 검체의 타겟 유전자를 단일(single), 듀플렉스(duplex) 또는 네스티드(nested) PCR 방법에 의해 증폭하는 단계;
(b) 상기 증폭된 PCR 산물을 DNA 칩의 올리고뉴클레오티드 프로브에 하이브리드시키는 단계;
(c) 상기 하이브리드에 의해 얻어진 혼성화물의 PCR 산물을 표지하는 단계; 및
(d) 상기 표지를 검출하는 단계.
본 발명의 유전자형 분석방법에 있어서, 표지 단계 (b)는 Cy3, Cy5, Cy5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, Orange green 488X, Orange green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665, Calfluor Orange 546, Calfluor red 610, Quasar 670 및 비오틴으로 이루어진 군에서 선택되는 물질로 표지할 수 있다.
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본 발명의 유전자형 분석방법에 있어서, 표지 단계 (b)는 타겟 프로브에 Au 나노입자를 1차 표지한 후 은염색(silver staining)하여 2차 표지한 것을 DNA 칩의 올리고뉴클레오티드 프로브에 상보적으로 결합시키는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 유전자형 분석방법에 있어서, 표지 단계 (b)는 타겟 프로브에 Au 나노입자를 1차 표지한 후 은 쉘(silver shell)을 더 형성시켜 2차 표지한 것을 DNA 칩의 올리고뉴클레오티드 프로브에 상보적으로 결합시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 유전자형 분석방법에 있어서, 타겟 프로브는 서열번호 214 및 215의 염기서열을 가지며, 3' 말단쪽에 차례로 C18 링커, A10 및 티올기가 결합되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 유전자형 분석방법은, 하기 표 1의 65개 유형의 HPV의 L1 유전자를 삽입한 플라스미드 벡터들을 양성 대조군 클론으로 이용하여 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 유전자형 분석방법에 있어서, 검체는 자궁경부 및 질의 스왑, 자궁경부의 조직, 남성 성기의 조직, 소변, 항문, 직장, 인두, 구강 및 두경부로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명의 유전자형 분석방법에 있어서, 검체는 남성 성기의 암, 남성 요로의 암, 항문암, 두경부암 및 이들의 전암 세포로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 HPV의 올리고뉴클레오티드 프로브, 이를 포함하는 DNA 칩과 진단 키트 및 이를 이용한 HPV 유전자형 분석 방법은 다음과 같이 9 단계로 완성되었다.
1. 표준 및 대조군 검체의 준비
본 발명자들은 약 16,000례의 한국 여성의 자궁경부 검체에서 HPV의 L1, L2, E6/E7 유전자에 대해 PCR을 한 후 그 산물의 염기서열을 모두 분석하였다. 이 자료를 기초로 하고 나아가 미국 등 다른 국가의 보고를 참조하여 새로운 HPV DNA칩에 포함되어야 할 HPV 유형을 결정하였다. 그 수는 모두 43종이었고, 이에 따라 43종의 성기형 HPV에 대해 이를 모두 분석할 수 있는 DNA 칩을 발명하였다.
2. DNA 분리
상기 단계 1에서 얻은 각종 검체로부터 적정 방법을 수립하여 DNA를 분리하였다.
3. 듀플렉스(Duplex) PCR
HPV의 L1 유전자와 인체형 베타엑틴 유전자의 증폭을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머(oligonucleotide primer)를 고안하고 적정 PCR 조건을 수립하였다. PCR은 듀플렉스(duplex PCR)로 하였으며, 각 유전자의 프라이머 농도 비율을 달리하여 각각의 조건을 수립하였다. 아울러 상기 단계 2에서 분리된 DNA를 주형으로 하여 HPV L1 유전자와 인체형 베타엑틴 유전자에 대해 PCR을 수행하여 그 산물을 얻었다.
4. 시퀀싱 분석 및 클론 확보
상기 PCR 후 시퀀싱반응으로 HPV L1의 염기서열을 분석하고 그 자료를 정리하여 데이터베이스를 구축하였다. 아울러 각 HPV형이 확인된 PCR 산물은 플라스미드 벡터에 클로닝(cloning) 하였다. 이 클론은 이후 본 발명의 DNA칩의 반응조건 수립시 표준 및 대조군 검체로 사용하였다. HPV 유전자형이 확인된 임상 DNA 검체는 보관해 두었다가 본 발명의 DNA칩의 정확도 분석에 사용하였다.
5. DNA칩의 프로브 디자인
상기 단계 4의 한국인의 자궁경부 세포 및 암조직의 HPV 유전자형 분석에서 나타난 시퀀스 데이터베이스와 외국의 HPV 관련 데이터베이스에 따라 인체 자궁경부를 침범할 수 있는 43가지의 모든 유형의 HPV의 L1 유전자와 인체 베타엑틴 유전자에 대해 상보적이며, DNA 칩 위에서 하이브리디제이션 반응으로 파악할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 고안하였다. 아울러 구조상 줄기(stem)를 가진 d자형의 올리고뉴클레오티드 브로브도 고안하였다.
6. DNA칩의 제작　
상기 단계 5에서 디자인된 프로브를 집적할 그리드(Grid)를 고안하였다. 이에 따라 적정 버퍼(buffer)에 혼합한 프로브를 현미경용 유리슬라이드 위에 집적(arraying or spotting) 하였다. 이후 적정 처리를 거쳐 안정화시키고 품질관리를 거쳐 검사시까지 보관하였다.
7. DNA 칩에서 반응 및 분석 조건 수립
상기 단계 4에서 얻은 HPV의 각 유형별 클론을 하나, 혹은 두개 내지 세개까지 다양한 조합과 농도로 조성한 표준 검체를 주형으로 하여 HPV L1과 베타엑틴의 유전자를 듀플렉스 PCR로 증폭한 후 그 산물을 DNA칩 위에 올려 놓고 하이브리디제이션 반응을 여러 차례 수행한 후 형광스캐너로 분석하여 적정 조건을 수립하였다.
8. DNA 칩에서 임상 검체 분석
상기 단계 3 및 단계 4에서 PCR후 시퀀싱 반응으로 HPV의 유무와 그 유형이 확인된 바 있는 임상 검체의 DNA를 대상으로 다시 듀플렉스 PCR을 수행한 후 그 PCR 산물을 상기 단계 6에서 제작된 DNA 칩 위에 올려 놓고 상기 단계 7에서 수립된 조건하에서 하이브리디제이션 반응을 수행한 후 세척을 거쳐 형광스캐너로 분석하였다. 이로서 본 발명의 DNA 칩의 민감도와 특이도, 재현성을　분석하였으며, HPV의 유전자형의 진단을 위한 본 발명의 DNA 칩의 최적조건을 다시 수립하였다.
9. DNA 칩에서 임상 검체 분석 후 임상자료와의 상관관계 분석
상기 단계 8에서 PCR후 DNA 칩으로 분석한 결과를 자궁경부 세포진 검사 등 임상자료와 비교하여 상관관계를 조사하였으며, 본 발명의 DNA칩으로 자궁경부의 암이나 전암병변의 예측에 유용한지를 분석하였다. 이로서 본 발명의 DNA 칩이 HPV의 유전자형의 분석뿐 아니라 자궁경부암의 선별(screening)에도 유용함이 확인되었다.
한편, 본 발명의 DNA칩을 이용한 진단 키트는 1) 자궁경부의 스왑 또는 파라핀 절편 등의 검체로부터의 DNA 추출 시약, 2) HPV의 L1과 베타엑틴 유전자의 PCR 증폭 관련 시약, 3) HPV 유전자 증폭시에 양성 대조군으로 사용할 플라스미드 DNA 클론, 4) HPV 유전자형 검사용 올리고 DNA 칩, 5) 상기 DNA 칩을 이용한 하이브리디제이션 반응에 필요한 반응액과 반응 후의 세척액을 모두 포함하는 올인원("all in one")으로 제공된다.
본 발명에 의하면 성기를 침범하는 44개 유형의 HPV를 모두 파악할 수 있고, 하나 이상의 HPV형에 의한 복합감염도 정확하게 진단하며, HPV 유전자형의 진단 민감도와 특이도가 모두 100%에 가깝도록 높으며, 다수의 검체를 신속하게 검사할 수 있으며, 자궁경부의 암과 전암 병변을 예측하는 데에 매우 유용하다.
특히, 본 발명의 HPV 유전자형 분석용 DNA 칩과 이를 이용한 키트에 의하면, 자궁경부 및 질 스왑이나 소변, 항문, 구강, 인두 등의 검체에서 HPV의 감염 유무와 그 유전자형을 신속정확하게 대단위로 자동 분석하는 데 매우 유용하다. 또한 자궁경부 Pap 세포진 검사와 병용하여, 혹은 단독으로 사용하여 자궁경부암과 그 전구병변의 선별에 널리 이용될 수 있이며, 기존의 HPV검사를 대치시키고, 검사 비용과 인력 및 시간을 절감시키는 효과가 있다. 또한, HPV 감염시 그 정확한 유전자형을 분석하여 이를 치료하는 맞춤식 백신을 적용코자 할 때도 유용하다.
따라서, 본 발명은 HPV관련 암의 발병율과 사망률을 감소시킴으로써 국민 건강 증진과 복지에 크게 기여하며, 경제적으로 지대한 기여를 할 수 있어 의료 산업 상 매우 유용한 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 HPV 유전자형 분석 DNA 마이크로어레이(칩)의 그리드(grid)를 나타낸다. 1개의 DNA칩 위에 8개의 웰(well)을 두고, 각각의 웰에 각 유형 별로 HPV L1 유전자에 특이한 프로브나 모든 유형의 HPV L1에 공통된 유니버셜 프로브(universal probe), 그리고 대조 또는 참고 유전자(control 또는 reference gene)의 프로브를 집적시켰다. 도 1에서 빨간색의 스팟(spot)은 암발병 고위험군의 HPV 들로서 여기에는 HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 82형의 총 14개 타입이 포함된다. 분홍색의 스팟은 아직 명확히 밝혀지지는 않았으나 암발병 고위험형일 가능성이 있는 유형의 HPV들로, 여기에는 HPV 26, 53, 66, 67,69, 70, 73형의 총 14개 타입이 포함된다. 하늘색 스팟은 암발병 위험이 낮은 저위험군의 HPV들로 여기에는 HPV 6, 11, 34, 40, 42, 43, 44, 54, 55, 61, 62, 72, 81, 90형의 총 14개 타입이 포함된다. 노란색 스팟은 아직 암발병 위험에 대해 밝혀져 있지 않는 기타 유형의 HPV들로서, 여기에는 HPV 10, 27, 30, 32, 57, 83, 84, 91형의 총 8개 타입이 포함된다. 보란색 스팟은 유니버셜 프로브로 HPV가 검체 내에 존재하면 그 유형에 관계없이 항상 양성으로 나오게 되는 스팟이다. 녹색 스팟은 코너마커 역할과 함께 대상 시료에서 DNA가 제대로 추출되었음을 확인하기 위한 지표역할을 하는 대조 유전자의 프로브가 집적된다. 본 발명에서는 대조유전자로 소위 하우스키핑유전자(house keeping) 중 하나인 인체 베타엑틴(ACTB) 유전자를 사용하였다.
도 2는 본 발명의 표적유전자인 HPV의 L1 유전자와 대조유전자인 인체 베티엑틴 유전자를 함께 듀플렉스(duplex)로 PCR 증폭하기 위해 HPV L1 프라이머 대비 ACTB 프라이머의 적정 농도비를 설정하기 위한 실험결과를 나타내는 전기영동 사진이다. 여기에서 HPV L1 프라이머는 My11, GP6-1 & GP6+를 사용하였고 베타엑틴의 프라이머는 ACTBF와 ACTBR을 사용하였다. Lane M은 100bp size marker이고, Lane 1에서 5까지는 HPV L1 프라이머를 10 pmole, ACTB 프라이머를 10 pmole로 한 것이며, Lane 6에서 10까지는 HPV L1 프라이머를 10 pmole, ACTB 프라이머를 5 pmole로 한 것이고, Lane 11에서 15까지는 HPV L1 프라이머를 10 pmole, ACTB 프라이머를 1 pmole로 한 것이다. 각각에서 검체 1은 HPV type 56이 양성인 인체 자궁경부 스왑 (cervical swab) 검체이고, 검체 2는 HPV type 16이 양성인 인체 자궁경부스왑 검체, 검체 3과 4는 HPV에 감염되지 않은 자궁경부스왑 검체, 검체 5는 유전체(genome)에 HPV type 18의 유전자가 들어가 있는 HeLa 자궁경부암세포주 시료로 양성 표준물질이다. Lane 6에서 10까지의 조건이 듀플렉스 PCR에 가장 좋은 조건임을 확인하였다.
도 3은 도 2의 듀플렉스 PCR 산물 중에서 Lane 6에서 10까지의 검체를 본 발명인 HPV DNA 칩 위에 올려 놓고 하이브리디제이션 반응을 수행한 후 형광스캐너 (fluorescence scanner)를 사용하여 635nm의 파장에서 스캐닝하여 본 이미지이다.　
도 4는 기존의 방식대로 HPV L1 유전자와 베타글로빈 유전자를 각각 따로 single PCR한 후 DNA칩으로 분석시 HPV가 감염되지 않은 음성 검체에서 비특이적으로 낮은 시그날로 반응을 보여 판독에 오류를 일으켰던 검체를 가지고, 본 발명의 방식대로 듀플렉스 PCR한 후 본 발명의 HPV 칩에 반응을 하여 스캐닝한 후 양자의 결과를 비교한 실험결과이다. 검체 1과 2는 HPV에 감염되지 않은 음성 대조군으로 HEK 세포주의 gDNA 시료이며, 검체 3은 외관상 점액성이 많았고 HPV type 35, HPV 39, HPV 53, HPV 58, HPV 72, HPV 66이 다중 감염된 자궁경부 스왑검체이다.
도 5는 한국 성인여성의 자궁경부 및 질 스왑검체에서 DNA를 추출한 후 본 발명의 듀플렉스 PCR을 수행하여 얻어진 HPV L1과 베타엑틴의 증폭 산물을 본 발명의 HPV DNA 칩에 올려 놓고 하이브리디제이션 반응을 한 후 세척을 거쳐 형광스캐너로 스캐닝하여 얻은 결과의 실례 중 하나다. 본 검체는 HPV type 6의 L1에 특이한 프로브와 유니버셜 프로브, 그리고 베타엑틴 프로브에 함께 양성으로 나타나서 HPV type 6에 감염된 것으로 판독되었다. 여기에서 유니버셜 프로브와 베타엑틴 프로브 양자에 대해서도 양성으로 나타나므로 가양성(false positive result)이 아닌 진양성(true positive result)으로 판독된다. 이 결과는 시퀀싱분석에서도 확인되었다.
도 6은 한국 성인여성의 자궁경부 및 질 스왑검체에서 DNA를 추출한 후 본 발명의 듀플렉스 PCR을 수행하여 얻어진 HPV L1과 베타엑틴의 증폭 산물을 본 발명의 HPV DNA 칩에 올려 놓고 하이브리디제이션 반응을 한 후 세척을 거쳐 형광스캐너로 스캐닝하여 얻은 결과의 실례 중 다른 하나다. 본 검체는 HPV type 39의 L1에 특이한 프로브와 유니버셜 프로브, 그리고 베타엑틴 프로브에 함께 양성으로 나타나서 HPV type 39에 감염된 것으로 판독되었다. 이 결과는 시퀀싱분석에서도 확인되었다.
도 7은 한국 성인여성의 자궁경부 및 질 스왑검체에서 DNA를 추출한 후 본 발명의 듀플렉스 PCR을 수행하여 얻어진 HPV L1과 베타엑틴의 증폭 산물을 본 발명의 HPV DNA 칩에 올려 놓고 하이브리디제이션 반응을 한 후 세척을 거쳐 형광스캐너로 스캐닝하여 얻은 결과의 실례 중 다른 하나다. 본 검체는 HPV type 11의 L1에 특이한 프로브와 유니버셜 프로브, 그리고 베타엑틴 프로브에 함께 양성으로 나타나서 HPV-11에 감염된 것으로 판독되었다. 이 결과는 시퀀싱분석에서도 확인되었다
도 8은 한국 성인여성의 자궁경부 및 질 스왑검체에서 DNA를 추출한 후 본 발명의 듀플렉스 PCR을 수행하여 얻어진 HPV L1과 베타엑틴의 증폭 산물을 본 발명의 HPV DNA 칩에 올려 놓고 하이브리디제이션 반응을 한 후 세척을 거쳐 형광스캐너로 스캐닝하여 얻은 결과의 실례 중 다른 하나다. 본 검체는 HPV type 6의 L1에 특이한 프로브와 HPV type 43의 L1에 특이한 프로브, 유니버셜 프로브, 그리고 베타엑틴 프로브에 함께 양성으로 나타나서 HPV-6와 HPV-43에 복합 감염(mixed infection)된 것으로 판독되었다. 이 결과는 시퀀싱분석에서도 확인되었다.
도 9는 한국 성인여성의 자궁경부 및 질 스왑검체에서 DNA를 추출한 후 본 발명의 듀플렉스 PCR을 수행하여 얻어진 HPV L1과 베타엑틴의 증폭 산물을 본 발명의 HPV DNA 칩에 올려 놓고 하이브리디제이션 반응을 한 후 세척을 거쳐 형광스캐너로 스캐닝하여 얻은 결과의 실례 중 다른 하나다. 본 검체는 HPV type 6의 L1에 특이한 프로브와 HPV type 11의 L1에 특이한 프로브, 유니버셜 프로브, 그리고 베타엑틴 프로브에 함께 양성으로 나타나서 HPV-6와 HPV-11에 복합 감염된 것으로 판독되었다. 이 결과는 시퀀싱분석에서도 확인되었다.
도 10은 한국 성인여성의 자궁경부 및 질 스왑검체에서 DNA를 추출한 후 본 발명의 듀플렉스 PCR을 수행하여 얻어진 HPV L1과 베타엑틴의 증폭 산물을 본 발명의 HPV DNA 칩에 올려 놓고 하이브리디제이션 반응을 한 후 세척을 거쳐 형광스캐너로 스캐닝하여 얻은 결과의 실례 중 다른 하나다. 본 검체는 HPV type 52의 L1에 특이한 프로브와 유니버셜 프로브, 그리고 베타엑틴 프로브에 함께 양성으로 나타나서 HPV-52에 감염된 것으로 판독되었다. 이 결과는 시퀀싱분석에서도 확인되었다.
도 11은 한국 성인여성의 자궁경부 및 질 스왑검체에서 DNA를 추출한 후 본 발명의 듀플렉스 PCR을 수행하여 얻어진 HPV L1과 베타엑틴의 증폭 산물을 본 발명의 HPV DNA 칩에 올려 놓고 하이브리디제이션 반응을 한 후 세척을 거쳐 형광스캐너로 스캐닝하여 얻은 결과의 실례 중 다른 하나다. 본 검체는 HPV type 33의 L1에 특이한 프로브와 유니버셜프로브, 그리고 베타엑틴 프로브에 함께 양성으로 나타나서 HPV-33에 감염된 것으로 판독되었다. 이 결과는 시퀀싱분석에서도 확인되었다.
도 12는 한국 성인여성의 자궁경부 및 질 스왑검체에서 DNA를 추출한 후 본 발명의 듀플렉스 PCR을 수행하여 얻어진 HPV L1과 베타엑틴의 증폭 산물을 본 발명의 HPV DNA 칩에 올려 놓고 하이브리디제이션 반응을 한 후 세척을 거쳐 형광스캐너로 스캐닝하여 얻은 결과의 실례 중 다른 하나다. 본 검체는 HPV type 6의 L1에 특이한 프로브와 HPV type 56의 L1에 특이한 프로브, 유니버셜 프로브, 그리고 베타엑틴 프로브에 함께 양성으로 나타나서 HPV-6와 HPV-56에 복합 감염된 것으로 판독되었다. 이 결과는 시퀀싱분석에서도 확인되었다.
도 13은 한국 성인여성의 자궁경부 및 질 스왑검체에서 DNA를 추출한 후 본 발명의 듀플렉스 PCR을 수행하여 얻어진 HPV L1과 베타엑틴의 증폭 산물을 본 발명의 HPV DNA 칩에 올려 놓고 하이브리디제이션 반응을 한 후 세척을 거쳐 형광스캐너로 스캐닝하여 얻은 결과의 실례 중 다른 하나다. 본 검체는 HPV type 6의 L1에 특이한 프로브와 HPV type 30의 L1에 특이한 프로브, 유니버셜 프로브, 그리고 베타엑틴 프로브에 함께 양성으로 나타나서 HPV-6와 HPV-30에 복합 감염된 것으로 판독되었다. 이 결과는 시퀀싱분석에서도 확인되었다.
도 14는 자궁경부에 고등급편평상피내병변이 세포조직학적으로 확인된 한국 성인여성의 자궁경부 스왑검체에서 DNA를 추출한 후 본 발명의 듀플렉스 PCR을 수행하여 얻어진 HPV L1과 베타엑틴의 증폭 산물을 본 발명의 HPV DNA 칩에 올려 놓고 하이브리디제이션 반응을 한 후 세척을 거쳐 형광스캐너로 스캐닝하여 얻은 실례의 사진이다. 본 검체는 HPV type 16의 L1에 특이한 프로브와 HPV type 81의 L1에 특이한 프로브, 유니버셜 프로브, 그리고 베타엑틴 프로브에 함께 양성으로 나타나서 HPV-16와 HPV-81에 복합 감염된 것으로 판독되었다. 이 결과는 시퀀싱분석에서도 확인되었다.
도 15는 칩 위에 집적된 프로브와 PCR 산물이 하이브리디제이션된 후 AuNP로 1차 표지를 하고 은으로 2차 표지하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 16은 HPV6-AuNP-Ag enhancement 칩을 스캐닝한 이미지로 좌측은 전체 8개의 웰을 모두 스캐닝한 것이고 오른쪽의 이미지는 각각의 웰안에 스파팅된 스팟의 이미지를 나타낸 것이다.
도 17은 HPV6-AuNP-Coreshell 칩을 스캐닝한 이미지로 좌측은 전체 8개의 웰을 모두 스캐닝한 것이고 오른쪽의 이미지는 각각의 웰안에 스파팅된 스팟의 이미지를 나타낸 것이다. 은염색(Ag staining)한 도 16의 이미지와 달리 각 스팟의 이미지가 상당히 뚜렷함을 확인할 수 있었다.
도 18은 각 스팟과 백그라운드를 HPV6-AuNP-Ag staining하여 표지한 칩의 각 스팟과 백그라운드(BG)를 SEM으로 분석한 것으로 스팟안에 금나노입자가 고밀도로 존재함을 확인하였다.
도 19는 각 스팟과 백그라운드를 HPV6-AuNP-Ag coreshell로 표지한 칩의 각 스팟과 백그라운드(BG)를 SEM으로 분석한 것으로 스팟안에 금나노입자가 고밀도로 존재함을 확인하였다.
도 20은 HPV6-AuNP-Ag enhancement 스팟과 HPV6-AuNP-Ag coreshell로 표지한 스팟을 SEM으로 측정한 그림이다. 그림에서와 같이 Ag 염색을 한 것 보다는 Ag 쉘(shell)로 표지한 것이 훨씬 더 안정적으로 나타난 것을 확인할 수 있었다. 특히 Ag 염색을 한 경우는 비특이적으로 은이 염색되었음을 확인할 수 있었다.
도 21은 HPV-6 타입의 PCR 산물과 타겟 프로브(LTP)에 AuNP를 표지시킨 것 (HPV 6-AuNP)과 HPV-6 타입의 PCR 산물과 타겟 프로브(LTP)에 AuNP를 표지시킨 후 반응된 칩 위에 silver enhancement를 시킨 것(HPV6-AuAg staining), 그리고 HPV 6 타입의 PCR 산물과 타겟 프로브(LTP)에 Au을 1차 표지시킨 후 Ag coreshell을 2차로 표지시킨 (HPV 6-AuAg Coreshell) 칩에 여러가지 농도의 주형에 따라 PD가 장착된 스캐너로 스캐닝하여 각 스팟의 반사율을 SBR 값으로 비교한 그림이다.
도 22는 DNA 칩에 이용되는 d자형 프로브의 구조를 예로서 나타낸 모식도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명하나, 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1:　 대조군 검체의 준비 및 DNA 추출
본 발명의 표준물질이 될 검체를 준비하고 이로부터 DNA를 추출하였다.
우선, 종래에 HPV에 감염이 되어 있는지 여부와 그 HPV의 타입이 밝혀져 있으며, HPV 유전자형 연구에 널리 사용되어온 인체 자궁경부암 세포주를 미 ATCC 사(Manassas, VA20108, USA)와 한국 세포주은행(KCLB)(서울대학교 의과대학 암연구소, KOREA)으로부터 구입한 후 단층(monolayer)으로 배양하여 이로부터 게놈 DNA를 분리하여 사용하였다.
두번째 검체로는 자궁경부암이나 자궁경부의 상피내암 병변으로 생검 및 수술을 받고 확진된 한국인 여성 100명의 CIN 자궁경부 조직을 얻어 사용하였다. 포르말린 고정 후 파라핀포매 상태(formalin-fixed, paraffin-embedded status)로 보관되어 있던 조직을 10μm의 두께의 절편으로 5-10개씩 얻은 후 현미경용 유리슬라이드위에 붙여 놓고 암세포만 미세박리(microdissection) 하였다. 이들 자궁경부암 병변 100례 중 98례는 상피내암(cervical intraepithelial neoplasma, CIN)의 증례이었다.
세번째 검체로는 2005년부터 2007년 1월까지 함춘진단센터(서울, 대한민국)와 한국부인암재단(서울, 대한민국)을 통해 국내 산부인과 클리닉에 내원하여 자궁경부의 스왑(swab) 및 세포진 검사를 받은 15,708명의 자궁경부 검체를 얻었다. 이들의 연령 분포는 16세에서 80세로 평균연령 47세이었다.
상기에서 수집한 검체들로부터 DNA를 다음과 같은 방법으로 분리하였다.　
세포주와 자궁경부 스왑 및 파라핀 절편 검체로부터 DNA를 추출하기 위해서Labo Pass™ Tissue min 키트(제품번호 CME0112, (주)코스모진텍, 한국)를 이용하여 DNA를 농축, 정제하였으며 그 방법은 다음과 같다.
가. 세포주로부터의 게놈 DNA 분리
단층으로 배양된 세포주를 분리하여 50ml 원심분리튜브에 넣고 3500rpm 에서 30분간 원심분리하여, 상층액을 버리고 PBS 용액 500㎕로 펠렛(pellet)을 풀어서 1.5ml 원심분리튜브에 옮긴 후, 다시 12,000rpm에서 2분간 원심 분리후 세척하여 남아 있는 배지의 잔액을 제거한 후 게놈 DNA를 추출하였다.
나. 자궁경부에서 채취한 검체로부터의 게놈 DNA 분리
1) 1.5 ㎖ 튜브에 채취한 검체용액을 1.5 ㎖을 옮겨 미세원심 분리기에 넣고, 13,500 ×g에서 2 분간 원심 분리하여 세포를 가라앉힌다.
2) 상층용액을 제거하고 500 ㎕ 1×PBS로 첨가한다.
3) 교반기(Vortex)를 이용하여 세포를 용액과 잘 섞어 준다.
4) 13,500 ×g에서 2 분간 원심 분리하여 상층용액을 제거한다.
5) 200 ㎕ 완충용액 TL를 첨가한다.
6) 20 ㎕ 프로테이나제 K를 첨가한 후, 교반기(vortex)를 이용하여 잘 혼합하여 준다.
7) 항온수조 56 ℃에서 30분간 정치 반응한다.
8) 반응이 끝난 튜브는 6,000 ×g이상에서 10 초 정도 원심분리하여 뚜껑에 묻어 있는 용액을 떨군다.
9) 400 ㎕ 완충용액 TB를 첨가하고, 잘 혼합하여 준다. 6,000 ×g이상에서 10초 정도 원심분리하여 뚜껑에 묻어있는 용액을 떨군다.
10) 스핀 컬럼을 수거용 튜브에 장착한 후, 위의 반응용액을 스핀 컬럼에 넣는다.
11) 6,000 ×g에서 1분간 원심분리한다.
12) 컬럼을 통과한 여과액은 버리고 다시 수거용 튜브를 장착한다.
13) 700 ㎕ 완충용액 BW를 첨가하고 6,000 ×g에서 1분간 원심 분리한다.
14) 컬럼을 통과한 여과액은 버리고 다시 수거용 튜브를 장착한다.
15) 500 ㎕ 완충용액 NW를 첨가하고 13,500 ×g에서 3분간 원심 분리한다.
16) 컬럼을 통과한 여과액은 버리고 새로운 1.5 ml 튜브를 장착한다.
17) 200 ㎕ 완충용액 AE 나 정제수를 컬럼의 중앙에 첨가하고, 2분간 실온에 방치한다.
18) 6,000 ×g에서 1 분간 원심분리한다.
19) 추출된 게놈 DNA는 곧바로 PCR에 사용 가능하며, 장기간 보존 시에는 -20 ℃에 보관할 수 있다.
20) 추출된 게놈 DNA는 0.8% 한천 젤에 전기 영동하여 UV하에서 확인 가능하다.
다. 파라핀 고정 검체로부터의 게놈 DNA 분리
1) 파라핀으로 고정된 검체를 마이크로 절단기를 이용하여 20 ㎛ 두께로 잘라내어서 이용할 수 있으며, 일반 수술용 칼을 사용하여 얇게 저미듯이 박리하여 사용할 수 있다.
2) 1.5 ㎖ 튜브에 위의 검체를 옮긴다.
3) 1.2 ㎖ 자일렌을 첨가하여 2 분간 vortex로 강하게 섞어 준다.
4) 13,500 ×g에서 5 분간 원심 분리하여 상층용액을 제거한다.
5) 1.2 ㎖ 에탄올을 첨가하여 2분간 vortex로 강하게 섞어 준다.
6) 13,500 ×g에서 5 분간 원심 분리하여 상층용액을 제거한다.
7) 파라핀을 완전히 녹여 내기 위해서 과정 3)에서 5)을 반복한다.
8) 검체가 든 튜브를 37 ℃에서 15 분간 방치하여 에탄올을 증발시킨다.
9) 튜브에 남겨진 검체에 200 ㎕ 완충용액 TL를 첨가한다.
10) 20 ㎕ 프로테이나제 K를 첨가한 후, vortex를 이용하여 잘 혼합하여 준다.
11) 항온수조 56 ℃에서 30 분간 정치 반응한다.
12) 400 ㎕ 완충용액 TB를 첨가하고, 잘 혼합하여 준다. 6,000 ×g이상에서 10 초 정도 원심분리하여 뚜껑에 묻어 있는 용액을 떨군다.
13) 스핀 컬럼을 수거용 튜브에 장착한 후, 위의 반응용액을 스핀 컬럼에 넣는다.
14) 6,000 ×g에서 1 분간 원심 분리한다.
15) 컬럼을 통과한 여과액은 버리고 다시 수거용 튜브를 장착한다.
16) 700 ㎕ 완충용액 BW를 첨가하고 6,000 ×g에서 1 분간 원심 분리한다.
17) 컬럼을 통과한 여과액은 버리고 다시 수거용 튜브를 장착한다.
18) 500 ㎕ 완충용액 NW를 첨가하고 13,500 ×g에서 3 분간 원심 분리한다.
19) 컬럼을 통과한 여과액은 버리고 새로운 1.5 ml 튜브를 장착한다.
20) 200 ㎕ 완충용액 AE 나 정제수를 컬럼의 중앙에 첨가하고, 2 분간 실온에 방치한다.
21) 6,000 ×g에서 1분간 원심 분리한다.
22) 추출된 게놈 DNA는 곧바로 PCR에 사용 가능하며, 장기간 보존 시에는 -20 ℃에 보관할 수 있다.
23) 추출된 게놈 DNA는 0.8% 한천 젤에 전기영동 하여 UV하에서 확인 가능하다.
실시예 2:　 표준 및 대조군 검체의 준비
이후의 유전자형 검사와 분석에 표준 물질이 될 HPV의 L1 유전자의 플라스미드 DNA 클론을 준비하였다.
첫째, 상기 인체 자궁경부암 세포주를 구입하여 DNA추출 후 HPV의 L1유전자의 PCR산물을 얻었다. 둘째, 한국 식품의약품안전청(KFDA)으로부터 42개의 HPV L1유전자의 PCR 산물을 얻었다. 셋째, 상기 한국인 여성 100명의 자궁경부암 조직과 15,708명의 자궁경부 스왑검체에서 HPV의 PCR산물을 얻었다. 이들에서 각각 PCR후 시퀀싱반응으로 HPV L1유전자의 유전자형을 확인한 후 PCR 산물을 pGEMT easy vector에 클로닝하여 각 HPV 유전자형별로 L1의 클론을 확보하였다. 이 클론은 이후 본 발명의 DNA칩의 반응조건 수립시 표준 및 대조군 검체로 사용하였다. 클로닝 방법은 다음과 같다.
1) 상기에서 PCR 증폭된 L1 유전자의 PCR 산물을 아가로즈 겔에서 Gel recovery kit (Zymo Research, USA)를 이용하여 분리한 후, 그 농도를 분광광도계나 아가로스 겔 상에서 측정하였다.
2) -20℃에 보관되어 있던 pGEM-T Easy Vector (Promega, A1360, USA)와 2 x Rapid Ligation Buffer는 녹여 손끝으로 튜브를 살짝 흔들어 섞어준 후, 약하게 원심분리를 하여 클로닝 하고자 하는 삽입(insert) DNA와 함께 다음의 비율로 혼합하여 0.5ml 튜브에 넣고 연결반응(ligation)을 준비하였다.　
Figure 112010039063837-pat00001
3) 각 반응액을 피펫으로 잘 섞어 준 후, 실온에서 한 시간 정도 연결 반응을 시켰다. 다수의 산물을 원할 경우에는 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다.
4) 이렇게 연결된 샘플은 영하 70℃에 보관된 JM109 competent cell(≥1x108 cfu/㎍ DNA) 50㎕를 이용하여 형질전환(transformation)을 하였다.
5) 우선 1.5ml 튜브에 상기에서 연결시킨 산물 2㎕를 넣고, 직전에 얼음탕 (ice bath)에서 녹인 4)의 competent cell 50㎕를 넣어, 잘 섞어 준 후 얼음에서 20분간 반응을 한다.
6) 42℃ 항온수조에서 45-50초간 열쇼크를 주고, 즉시 다시 얼음탕 속에 넣어 2 분간 방치를 한다
7) 여기에 실온으로 맞춰진 SOC 배지 950㎕를 넣어, 37℃의 진탕기에서 약 1시간 반 정도를 배양한다.
8) 이 가운데 약 100㎕를 LB/ampicillin/IPTG/X-Gal plate에 깔아 준 다음, plate를 뒤집어서 37℃ 진탕기에서 16-24 시간 정도 배양을 해 준 후, 콜로니 계수(colony counting)를 한후, 백색 콜로니만을 선택해서 3ml LB/ampicillin broth에서 배양한 후 플라스미드 DNA를 미니프렙(mini prep) 하여 PCR 이나 혹은 제한효소를 이용하여 삽입 DNA가 제대로 들어갔는지를 확인하고, 더 정확히 하기 위해 상기에서 얻어진 클론 모두를 자동염기서열 분석기를 이용하여 분석하였다. 이들의 양성 대조군 클론은 표 1과 같다.
표 1. 양성 대조군 클론
Figure 112010039063837-pat00002
Figure 112010039063837-pat00003

실시예 3: PCR 증폭
HPV의 유전자형을 검사하기 위해서 먼저 HPV의 L1 유전자와 내부 대조유전자(internal control)로 인체형 베타엑틴 유전자를 증폭하였다.
이들 PCR 증폭을 위하여 올리고뉴클레오티드 프라이머를 먼저 선택 및 고안하였다. 상기 프라이머는 HPV의 L1 유전자를 검출하는 MY11와 GP6-1 및 GP6+ 프라이머(서열번호 1 내지 3), 그리고 DNA의 추출과 PCR의 효율을 확인하기 위해 사용된 인체의 베타엑틴 유전자의 ACTB F(Forward)/ACTB R(Reverse) 프라이머로 구성되어 있다. GP6-1, ACTBF와 ACTBR 프라이머는 고안된 것이고 나머지 프라이머는 공지된 프라이머들 중에서 선택된 것이다. HPV의 L1 유전자의 PCR은 185bp 그리고 베타엑틴 유전자의 PCR은 102bp 길이의 산물을 각각 증폭한다. 각 유전자 별 PCR 프라이머의 염기서열은 하기 표 2에 나타낸다.
표 2. PCR용 프라이머
Figure 112010039063837-pat00004
(상기 염기서열중에 M은 A 또는 C; W는 A 또는 T ; Y는 C 또는 T를 의미함)
PCR은 듀플렉스(duplex)로 각각에 대해 적정 조건을 수립하였다. 이에 따라 실시예 2에서 분리된 DNA를 주형으로 하여 HPV L1과 인체 베타엑틴 유전자에 대해 PCR을 수행하였다. PCR의 방법은 다음과 같다.
HPV 감염 여부 검출을 위한 PCR 반응조성은 슈퍼바이오사(Super Bio, 서울, 대한민국)로부터 구입한 SuperTaq plus pre-mix(10 ×buffer 2.5㎕, 10 mM MgCl2 3.75㎕, 10 mM dNTP 0.5㎕, Taq 중합효소 0.5㎕) 15㎕을 기초로 하고, 여기에 표 2에 기재된 대로 MY11/GP6-1 & GP6+과 ACTBF/ACTBR의 프라이머를 각각 1㎕(10 pmoles): 1㎕(8 pmoles): 1㎕(8 pmoles)과 1㎕(5 pmoles):1㎕(5 pmoles)씩 넣었으며, 여기에 검체의 주형 DNA 4 ㎕(150ng/㎕)를 첨가하고 증류수로 전체 반응액을 총 30㎕로 조정하였다.　
Duplex PCR을 위해 각각의 프라이머가 들어간 반응액은 95℃에서 5분간 예비변성(predenaturation)을 한 후, 95℃ 30초, 50℃ 30초, 72℃ 30초로 40주기(cycles) 동안 반복하고, 72℃에서 5분간 연장(extension)하여 수행하였다.　　　　　　
본 실험의 결과는 도 2에 예시하였다. HPV의 듀플렉스 PCR의 조건이 적절하게 수립되었음을 확인할 수 있었고, 자궁경부 스왑 검체와 파라핀 포매 자궁경부암 조직에서도 PCR이 잘 이루어짐을 알 수 있다.
자궁경부세포의 임상 검체 15,708례에 대한 HPV의 L1 유전자의 PCR 결과는 표 3에 나타냈다. 7,371례에서 PCR이 양성으로 나왔으며, 특히 그 중 GP6-1 프라이머가 증폭시키기 힘든 HPV-11이나 HPV-56 타입의 경우는 GP6+ 프라이머가 보완을 해주며, 또한 DNA 농도가 너무 낮은 경우 PCR 반응이 비특이적으로 일어나는 것은 듀플렉스 PCR을 수행함으로서 극복할 수 있어 본 발명의 독자적인 HPV 유전자형 DNA 칩을 고안하게 된 중요한 근거가 되었다.
표 3. 한국인의 자궁경부세포 검체의 HPV에 대한 PCR 결과
Figure 112010039063837-pat00005

또한, 본 발명의 duplex PCR 방법은 기존 칩에서 사용하였던 단일 PCR 방법으로 HPV 음성 검체의 낮은 농도의 DNA를 사용할 경우 비특이적으로 칩 반응이 일어나는 현상을 제거해 주었다. 이러한 현상을 위해 기존의 43종 HPV DNA genotyping chip (L1 유전자 프로브 & HBB 유전자 프로브)을 사용하여 단일 PCR과　본 발명의 duplex PCR 산물을 이용하여 각각 칩반응을 수행한 후 스캐닝하여 칩 이미지를 비교하였다(도 4 참조). 도 4와 같이 기존의 단일 PCR에서 볼 수 있었던 비특이적 반응이 duplex PCR 산물에서는 제거되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 duplex PCR 방법이 단일 PCR 방법보다 훨씬 더 효과적임을 알 수 있다.
실시예 4:　 시퀀싱 분석 및 데이터베이스 구축
실시예 3의 PCR 증폭후 PCR 산물을 가지고 자동 시퀀싱 분석(automated sequencing analysis)을 수행하여 HPV L1의 염기서열을 분석하고 그 자료를 정리하여 데이터베이스를 구축하였다. 아울러 HPV 유전자형이 확인된 임상 DNA 검체는 보관해 두었다가 이후 본 발명의 DNA칩의 정확도 분석에　사용하였다. 시퀀싱 반응의 방법은 ABI 3130XL 장비와 BigDye terminator V.2를 사용하여 공지의 방법을 사용하여 진행하였다.
먼저 파라핀에 포매된 자궁경부암 조직 100례와 정상 자궁경부 조직 50례의 검체에서 본 발명의 DNA 칩과 시퀀싱법으로 HPV 유형을 분석하였다. 본 분석 결과 자궁경부암 조직 100례 중 98례에서 고위험형의 HPV이 발견되었다. 이에 대해 정상 자궁경부 조직의 경우 고위험형의 HPV는 전혀 발견되지 않았다(표 4).
표 4. 100 CIN 검체를 이용한 HPV 지노타이핑 결과
Figure 112010039063837-pat00006

즉, 자궁경부암 검체의 DNA 칩 분석 결과 전체 100례 중 98례(98%) 모두에서 HPV가 발견되었다. 그 중 HPV　16형이 42례, 58형이 18례, 31형이 14례, 18형과 35형이 각각 5례, 33형이 5례로　이들 7가지 형이 98%를 차지하였다. 본 발명의 DNA 칩 방법과 달리 PCR 시퀀싱에서는 89개의 검체(90.8%)에서만 분석이 가능하였으며, 특히 복합 감염형은 PCR 시퀀싱으로 발견할 수 없었다. 이와 같은 결과는 본 발명의 HPV DNA 칩이 자궁경부의 병태를 예측하며, 특히 자궁경부암 및 자궁경부 상피내암의 선별검사에 유용함을 가리킨다. 아울러 시퀀싱으로 판독이 불가능하였던 복합 HPV 감염의 경우에도 정확히 판독할 수 있음을 재확인하였다.
실시예 5: DNA 칩의 프로브 고안
DNA 칩 위에 고정할 올리고뉴클레오티드 프로브를 고안하기 위해, 상기 실시예 4와 5에서 한국인의 양성 및 악성 자궁경부 검체에서 DNA를 분리하여 PCR후 시퀀싱으로 확인된 98례의 HPV의 L1의 염기서열에 대한 방대한 데이터베이스와 미국의 HPV 데이터베이스를 분석한 후, 각 인종에 따른 HPV 유전형의 빈도 수와 유전형에 따른 각각의 유전자에 존재하는 변형(intra variant) 염기서열도 분석하였다. 이에 따라 자궁경부를 침범하는 성기형(genital type) HPV의 43개 유형을 선정하고 이의 유전자형의 검색을 위한 올리고프로브를 고안하였다(표 5).
프로브 디자인은 본 발명의 목적에 따라 43가지 유형의 다양한 HPV의 L1 유전자의 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 유전자형 특이적 프로브(genotype specific probe)로서의 올리고뉴클레오티드를 설계하였다.
(1) 미국 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 HPV 데이터베이스, (2) 미 국립 로스 알라모스 HPV 데이터베이스, 및 (3) 실시예 4의 국내 여성의 자궁경부에서 발견된 45개 유형의 HPV의 데이터베이스를 모두 종합하여 HPV-1a, -2a, -3, -4, -5, -6b, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -15, -16, -16r, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, -28, -29, -30, -31, -32, -33, -34, -35, -35h, -36, -37, -38, -39, -40, -41, -42, -44, -45, -47, -48, -49, -50, -51, -52, -53, -54, -55, -56, -57, -58, -59, -60, -61, -63, -65, -66, -67, -68a, -68b, -70, -72, -73, -75, -76, -77, -80, -90, -91, MM4(82), MM7(83), MM8(84), CP8304의 총 79가지 HPV 유형의 게놈 DNA 염기서열을 확보하였다. 확보한 DNA 서열을 컴퓨터 프로그램 DNASTAR(MegAlignTM 5, DNASTAR Inc.)을 활용하여 ClustalW 방법으로 쌍정렬(pairwise alignment) 및 다중서열정렬(multiple sequence alignment)을 실행한 후 분류계통도(Phylogenetic tree)를 작성하고 각 그룹별 유형 특이적 염기서열을 선별한 다음, 다시 컴퓨터 프로그램 프라이머 프리미어 5(primer premier 5, PREMIER Biosoft International Co.)를 활용하여 유전자형 특이적 프로브를 설계하였다.
이때, 프로브의 길이는 20±2 및 18±2 bp의 올리고뉴클레오티드로 설정하여 110종의 유형 특이적 프로브를 1차 설계하였다. 본 발명에 의한 HPV의 유전자형 진단 DNA칩과 키트는, 상기 DNA 프로브가 14개의 고 위험성 HPV의 L1유전자, 22개의 저 위험형 HPV의 L1유전자, 7개의 중정도 위험형 HPV의 L1유전자까지 총 43종의 HPV의 L1 유전자를 검색 표적으로 한다. 여기에서 고위험형 HPV로는 HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52 HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-68, HPV-82, HPV-26, HPV-53, HPV-66, HPV-67, HPV-69, HPV-70, HPV-73이 포함되어 있으며, 저위험형 HPV로는 HPV-6, HPV-11, HPV-34, HPV-40, HPV-42, HPV-43, HPV-44, HPV-54, HPV-55 HPV-61, HPV-62, HPV-72, HPV-81, HPV-90, HPV-10, HPV-27, HPV-30, HPV-32, HPV-57, HPV-83, HPV-84, HPV-91이 선택되었다.
상기 과정에서 설계한 총 110종의 프로브를 대상으로 컴퓨터 프로그램(Amplify 1.2, University of Wisconsin)을 사용하여 설계 과정에서 이미 확보한 총 76가지의 다른 HPV 유형을 대상으로 가상 결합능을 분석하였다. 본 실시예에서는 한국인에서 흔하며 자궁경부암과 직접 관련된 HPV-16, HPV-58, HPV-31, HPV-33 프로브를 디자인하였다. 그 다음은 HPV-18과 HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52 HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-68, HPV-82, HPV-26, HPV-53, HPV-66, HPV-67, HPV-69, HPV-70, HPV-73이 포함되어 있으며, 저위험형 HPV로는 HPV-6, HPV-11, HPV-34, HPV-40, HPV-42, HPV-43, HPV-44, HPV-54, HPV-55 HPV-61, HPV-62, HPV-72, HPV-81, HPV-90, HPV-10, HPV-27, HPV-30, HPV-32, HPV-57, HPV-83, HPV-84, HPV91에 대해 각각 HPV 유형과 특이적으로 결합할 수 있는 것에 우선 순위를 두고 선택하였다. 직선형 올리고뉴클레오티드 프로브의 명칭과 서열번호 및 유형은 표 5에 정리하였다.
표 5. 직선형 올리고뉴클레오티드 프로브
Figure 112010039063837-pat00007
Figure 112010039063837-pat00008
Figure 112010039063837-pat00009
Figure 112010039063837-pat00010
(상기 염기서열중 D는 G, A 또는 T; K는 G 또는 T; Y는 C 또는 T를 의미함)
실시예 6: d자형 프로브의 고안
본 실시예에서는 내부에 줄기구조를 가지는 d자 형태의 올리고뉴클레오티드프로브를 고안하였다. 본 발명의 d자형 프로브는 5'->3'의 방향으로 그리고 좌측 상방에서 우측 상방의 방향으로 차례로, (1) 좌측 줄기 부위, (2) 링커 부위, (3) 우측 줄기 부위, 및 (4) 우측 프로브 부위로 이루어진다(도 22 참조). 본 발명에서 HPV의 L1 유전자와 인체형 베타엑틴 유전자의 d자형 프로브의 염기서열은 하기 표 6에 나타내었다.
(1) 줄기 부위(stem part)
본 발명의 d자형 프로브가 적합하게 자리잡기 위해서는 이를 뒷받침하는 줄기부분이 우선 적절하게 만들어져야 한다. 줄기는 서로 상보성의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드가 결합한 구조로 되어 있으며, 단단하게 결합하기 위해서는 C-G 염기가 절반이상을 차지해야 하며, 그 사이 사이에 T 또는 A 염기가 끼어 들어 있는 것이 좋다. 생체 내에 자연으로 존재하는 텔로미어 (telomere)를 이용하는 것이 좋다. 유핵생물의 염색체 끝에는 반복된 염기서열로 이루어진 텔로미어가 존재하며, 그 서열은 인간 등 포유류의 경우 TTAGGG나 TTTAGGG, 혹은 T1-3(T/A)G3-가 반복되어 있으며, 기타 생물의 경우 TTGGGG나 TTTTGGGG가 반복되는 구조를 보인다 (Balagurumoothy P, Brahmachari SK, Mohnaty D, Bansal M and Sasisekharan V. Hairpin and parallel quartet structures for telomeric sequences. Nucleic Acids Research. 1992; 20(15): 4061-4067; Balagurumoothy P and Brahmachari SK. Structure and stability of human telomeric sequence. Journal of Biochemistry. 1994; 269(34): 21858-21869). 이에 따라 본 발명의 d자형 프로브의 줄기부위는 다음과 같이 그 한쪽의 나선에 다음에 기재된 염기가 한번 또는 두번 이상 반복되는 구조로 만드는 것이 바람직하다.　
예)　
1. TTGGG
2. TAGGG
3. TTGGGG
4. TTTGGG
5. TTAGGG
6. TTTGGGG
7. TTTAGGG
8. TTTTGGGG
9. TTTAGGGG
즉, 짧게는 5개 내지 9개의 올리고뉴클레오티드가 상보적으로 결합한 것이 되며, 이를 늘려 나갈 수 있다. 경제적 비용과 효율을 따져 볼 때, TTAGGG-AATCCC의 염기서열로 이루어진 인체의 텔로미어의 최소단위를 이용하면 간편하다. 그러나 그 길이는 얼마든지 변형이 가능하다.
(2) 링커 부위(Linker part)
본 발명에서는 탄소의 수(n)가 최소 3개에서 60개까지인 아미노 변형 디데옥시티미딘(dideoxythymidine)(internal amino modifier CndT; iAmMCnT)을 넣게 된다. 경제적 효율에 따라 탄소수가 6개로 짧은 iAmMC6T를 사용해도 무방하다. 이때 iAmMC6dT의 5' 말단에는 좌측 줄기(left stem)의 변형시킨 C6 아민 링커가 글라스 슬라이드 표면에 코팅된 알데하이드기와 3' 말단의 A 염기와 우측 줄기(right stem)의 5' 말단의 T 염기와 결합을 하며, iAmMC6dT의 리보스에 결합하여 칩 위에 d형 프로브를 고정시킨다.
(3) 우측 프로브 부위(Right probe part)
우측 프로브 부위는 검사하고자 하는 표적 유전자에 상보성이 되게 디자인하며, 어떤 염기 서열도 가능하다. 단 우측 프로브의 올리고뉴클레오티드의 염기서열과 길이를 적절하게 디자인하는 것이 필수적이고, 이차 구조를 만들지 않도록 주의해야 한다. 우측 프로브 부위의 길이는 통상 15 내지 75bp 정도가 바람직하나, 용도에 따라 150bp 내외까지 길어지거나 혹은 역으로 15bp 미만으로 짧아질 수도 있다. 검체가 본 발명에서와 같이 PCR 산물이고, 그 산물에서 특정 염기서열의 존재를 찾아서 HPV 바이러스 감염의 정확한 종과 아종의 유전자형을 분석하고자 할 때는 프로브 길이를 20개 내외로 하며, 최소 3염기 이상이 특히 중심부에 차이가 있게 선택한다.
표 6. d형 올리고뉴클레오티드 프로브의 염기서열
Figure 112010039063837-pat00011

Figure 112010039063837-pat00012

Figure 112010039063837-pat00013

Figure 112010039063837-pat00014
(본 명세서에 첨부된 서열목록상의 n은 iAmMC6T를 의미한다. 이하 같다)
실시예 7: DNA칩의 제작
실시예 6에서 디자인된 프로브에 따라 그리드(Grid)를 고안한 후 적정 버퍼에 혼합한 프로브를 현미경용 유리슬라이드 위에 집적하였다. 이후 적정 처리를 거쳐 안정화시키고 품질관리를 거쳐 검사시까지 보관하였다. DNA칩의 제작 과정은 구체적으로 다음과 같다.
1. DNA 칩 위에 올릴 HPV 유전자형 분석 프로브의 순서 그리드 작성
본 발명에서는 하나의 칩 위에서 HPV 유전형에 따른 검색된 유전형이 고위험형인지, 중정도 위험형인지 아니면 저위험형인지를 바로 쉽게 알 수 있게 그룹화 하여 그리드(grid)를 작성하였다. 그 순서는 도 1과 같다. 도 1에 따르면 좌측 첫 번째와 두 번째 라인에는 HPV 고위험형 14가지 유형의 프로브와 그 하단에는 HPV 중정도 위험형의 L1의 프로브를 집적시켰으며, 세 번째 라인에는 HPV 저위험형 14 와 우측 라인에는 다른 타입인 8가지 유형과 유니버셜 L1 프로브를 집적시켰다. 이 때 HPV-68의 경우에는 HPV 68a와 68b 프로브를 1:1로 섞은 것을 집적하였다. 또한 코너 마커(corner marker)와 DNA 분리 및 PCR 증폭과정의 적정성 여부를 점검(quality control, QC)하기 위한 인체형 베타엑틴 유전자에 특이한 올리고뉴클레오티드 프로브는 11 x 11 그리드의 각각의 L1 프로브 사이에 위치하도록 총 12개 스팟을 집적하였다.
상기 인체형 베타엑틴 유전자 외에도 글로빈 및 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)유전자 등을 기준마커 프로브로 사용할 수도 있다.
각각의 올리고뉴클레오티드 프로브는 어레이어(arrayer)를 이용하여 직접하였다. 이 때 동일한 프로브를 이중(duplicate)으로 집적하여 각각의 HPV의 유전자형이 최소 2번씩 나오도록 고안하였다.
2. 올리고뉴클레오티드 프로브를 칩위에 스파팅할 용액의 제조와 마스터 플레이트(master plate)로의 분주
실시예 6에 따라 5' C6아민을 붙여 합성한 프로브를 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 정제한 후, 멸균된 3차 증류수에 최종 농도가 200pM이 되도록 녹였다. 이렇게 준비된 프로브들을 스파팅 용액인 마이크로 스팟팅 용액과 4.3배 비율로 섞어 최종 농도가 38pM이 되게 하였다. 이렇게 준비된 혼합물은 각각 순서대로 384웰 마스터 플레이트에 분주하였다.
3. 프로브의 집적 및 고정화
Q 어레이어2(Genetixs, UK)나 이에 준하는 어레이어 장비를 이용하여 상기 마스터 플레이트로부터 프로브 함유 스파팅 용액을 옮겨서 알데하이드기로 코팅된 유리슬라이드 위에 하나의 프로브 당 이중(duplicate, double hit)으로 집적하였다. 이때의 유리슬라이드로는 Luminano aldehyde LSAL-A 또는 실리콘 wafer 제품이나 혹은 이에 상응하는 제품이면 충분하다. 하나의 스팟의 크기는 10μm 내지 200μm 정도로 집적이 가능하다. 상기한 대로 유리슬라이드에 프로브를 집적하여 제작한 DNA 칩을 습도 80%로 유지되는 유리단지(glass jar) 내에 넣고 15분간 실온에서 반응시킨 후 공지의 방법을 사용하여 후처리를 하였다(Zammatteo, N., L. Jeanmart, S. Hamels, S. Courtois, P. Louette, L. Hevesi, and J. Remacle. 2000. Comparison between different strategies of covalent attachment of DNA to glass surfaces to build DNA microarrays. Anal. Biochem. 280:143-150.)
4. 마이크로어레이의 세척 및 보관
가. 시약준비
1) 10 % 도데실 설페이트 나트륨(SDS) (100 ㎖): 도데실 설페이트 나트륨(Sigma, L4509-1KG) 시약을 저울을 이용하여 10g을 500 ㎖ 비이커에 넣고 최종 부피 100 ㎖을 증류수(초순수물)를 첨가하여 용해한 후 밀폐용기에 담아 실온에 보관한다.
2) 0.1 % 도데실 설페이트 나트륨 (4 L): 1L 용기 각각 4개에　10 ㎖의 10 % 도데실설페이트나트륨을 담고 최종 부피 1L을 증류수(초순수물)를 첨가하여 섞어서 밀폐용기에 담아 실온에 보관한다.
3) 1M 에탄올아민(ethanolamine) 용액(300 ㎖): 500mL 용기에 16.6M 에탄올아민(Sigma, E0135) 용액을 18.3 ㎖넣고 최종 부피 300 ㎖을 증류수(초순수물)를 첨가하여 섞어서 밀폐용기에 담아 실온에 보관한다. 단, 빛에 민감하므로 빛은 차단해준다.
4) Blocking 용액(425 ㎖): Blocking 용액은 사용하기 직전에 만들며, 1X PBS 300 ㎖, 100% 에탄올 100 ㎖, 1M 에탄올아민 25 ㎖을 첨가하여 섞는다.
5) 1×인산완충용액: PBS 5알(Sigma, P4417)을 증류수(초순수물)를 0.9 L를 첨가하여 녹이고 10N HCl을 이용하여 pH 7.4에 맞추어 최종 부피 1 L가 되게 맞춘다.
6) 25% 에탄올 용액: 1L용기에 100% 에탄올 (Merck, 1.00983.2511) 250 ㎖을 담고 최종 부피 1L를 증류수(초순수물)에 첨가하여 섞어서 밀폐용기에 담아 실온에 보관한다.
나. 마이크로어레이의 세척　
1) 반응 용기와 세척용기와 사용할 시약(0.1% 도데실 설페이트 나트륨 (SDS), 1M 에탄올아민, 1×인산 완충 용액, 100% 에탄올, 25% 에탄올 용액)를 준비한다.
2) 300 ㎖의 0.1% 도데실 설페이트 나트륨용액을 세척 용기에 담고, 위 과정을 거친 슬라이드를 수평왕복교반기(reciprocating shaker)에서 2 분간 150 rpm에서 세척한다. 이 과정은 2 회 반복한다.
3) 3차 증류수를 이용하여 수평왕복교반기에서 2 분간 150 rpm에서 세척한다. 이 과정은 2회 반복한다.
4) 미리 가열하고 있는 전기 포트의 증류수를 증류수 전용 세척 용기에 담고 칩을 물에서 3 분간 방치한다.
5) 실온의 3차 증류수에 1 분간 방치한다.
6) Blocking 용액을 사용 직전 준비한다.
7) 위 과정에서 준비한 Blocking 용액에 30 분간 칩을 정치 반응시킨다.
8) 300 ㎖의 25% 에탄올 용액을 세척용기에 담고, 슬라이드를 수평왕복교반기에서 2 분간 150 rpm으로 세척한다. 이 과정은 1 회만 수행한다.
9) 3차 증류수를 이용하여 수평교반기에서 2 분간 수평왕복교반기에서 2 분간 150 rpm으로 세척한다. 이 과정은 2 회 반복한다.
10) 세척이 끝난 칩은 천천히 마지막 세척용액(물)에서 들어올린다.
11) 원심분리기(MF-600, 한일과학)을 이용하여 1,000 rpm, 3 분간 원심 분리하여 물기를 제거한다.
12) 일시 보관용 박스에 넣어서 다음 공정까지 데시케이터에서 보관한다.
이상의 과정을 거쳐서 제작된 본 발명의 DNA 칩은 다음의 실시예 8에 기술된 것과 같은 방법을 이용하여 하이브리디제이션 반응을 수행하였다.
실시예 8:　DNA 칩에서 하이브리디제이션 반응 및 분석 조건 수립
상기 실시예 5에서 수립된 HPV의 각 유형별 클론을 하나, 혹은 두개 내지 세 개까지 다양한 조합과 농도로 조성한 100개의 인공 표준 검체를 주형으로 하여 HPV L1과 베타엑틴의 유전자를 PCR 증폭한 후, 실시예 6과 7에 따라 제작된 칩위에 올려 놓고 하이브리디제이션 반응을 3차례 이상 수행한 후 형광스캐너로 분석하여 적정 조건을 수립하였다. 그 방법은 순서대로 다음과 같다.
1. Duplex PCR　
HPV의 L1과 인체 베타엑틴 유전자의 PCR은 상기 실시예 3의 방법을 따랐으며, 단 프라이머 조합 중 역방향의 프라이머, 즉 GP6-1와 GP6+, ACTBR의 경우 Cy-5 형광을 표지한 올리고뉴클레오티드를 사용하였다.
상기 표지수단으로는 Cy3, Cy5, Cy5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, Orange green 488X, Orange green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665, Calfluor Orange 546, Calfluor red 610, Quasar 670, 비오틴, 및 AuNP(금나노입자로서 직경 5nm, 10nm, 20nm, 또는 50nm 가운데 하나를 사용해도 무방하다)과 silver coreshell이나 silver enhancement 방법을 사용하는 것도 가능하다. 특히 AuNP나 Silver coreshell을 표지수단으로 사용하고자 하는 경우에는, PCR 산물을 칩의 프로브와 하이브리디제이션 시킬때 PCR 산물에 금나노입자를 결합시켜야 하므로 PCR 산물에 상보적으로 결합이 가능한 타겟 프로브를 3' 말단에 티올기가 결합되도록 합성하여 금나노입자와 결합시켜서, 최종 하이브리디제이션이 된 후에 silver enhancement를 시키는 방법을 사용하거나, 또는 금나노입자와 결합된 타겟 프로브에 silver shell 을 만들어 하이브리디제이션하는 방법을 사용한다. 이렇게 반응된 칩은 검출기로 PMT를 사용하는 일반 형광 스캐너가 아닌 PD방식의 스캐너를 사용하여 반사율로 측정하거나 SEM을 찍어 판독을 한다.
2. 하이브리디제이션 반응
다양한 HPV 올리고뉴클레오티드 프로브를 고정시킨 슬라이드 기판에 PCR에 의하여 증폭된 HPV PCR 산물을 올려 놓고 하이브리디제이션 반응을 실시한다. 이 때 100㎕ 용량의 8웰 구획 챔버(perfusion 8 wells chamber, Schleicher & Schuell BioScience, German)를 하이브리디제이션 반응실(Hybridization reaction chamber)로 이용하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다.
1) 반응할 검체 수만큼 새로운 1.5 ㎖ 혹은 200 ㎕ 용량의 튜브를 준비한다.
2) 위 튜브에 50 ㎕씩 정제수를 분주한다.
3) Duplex PCR산물인 L1과 ACTB 유전자의 증폭산물을 15 ㎕씩 첨가하여 잘 섞는다.
4) 위 튜브를 95 ℃로 준비한 Heat block에 3분간 방치한다.
5) 위 튜브를 바로 얼음에서 5 분간 방치한다.
6) 반응 튜브를 원심분리기를 이용하여 30 초간 원심분리하여 용액을 떨군다.
7) 위 튜브에 HYB I 용액 (2 ㎖ 20×SSC, 6.3 ㎖ 5×인산완충용액와 90% 1.7 ㎖ 글리세롤을 넣어 최종 10㎖ 로 만들어서 조성함)을 65 ㎕를 첨가하여 피펫으로 잘 섞어 준다.
8) 준비한 반응용액을 칩 표면에 부착된 커버 슬립 위에 있는 주입구(구멍)에 천천히 주입한다. 이때 칩과 반응 커버웰 사이에 기포가 있는지 부착이 잘 되어있는지를 확인한다. 혹시 기포가 있다면 글러브를 낀 손으로 기포를 밀어내듯이 쓸어 내어 기포를 제거한다.
9) 48 ℃ 반응조에서 30 분간 칩을 교잡 반응시킨다.
3. 세척 (Washing)
1) 교잡 반응이 끝나면, 칩에서 커버웰을 제거한다.
2) 미리 준비한 세척 용액 1을 세척용 용기에 반응할 칩이 잠길 수 있게 붓고 반응한 칩을 수평왕복교반기를 이용하여 실온에서 2 분간, 8 oscillation의 속도로 세척한다. 만약 반응 칩이 1 개라면, 50 ㎖ 원추형 튜브에 40 ㎖의 세척 용액을 넣고 반응한 칩을 넣은 후, 상하로 2 분간, 분당 50 회의 속도로 흔들어 세척할 수 있다. 수평왕복교반기를 이용하지 않고 수동으로 세척할 경우 세척용기에 세척용액을 반응한 칩이 잠길 수 있게 붓고, 실험대에서 손으로 좌우로 2 분간 분당 50회의 속도로 세척용기를 흔들어 세척 한다.
3) 사용한 세척 용액을 버리고 새로이 세척 용액 1를 넣어 다시 2 분간 세척한다.
4) 사용한 세척 용액을 버리고 새로이 세척 용액 1를 넣어 다시 2 분간 세척한다.
5) 사용한 세척 용액을 버리고 새로이 세척 용액 2를 넣어 다시 2 분간 세척한다.
6) 세척 후에도 칩에 남은 버퍼를 제거하기 위해 스핀 드라이기나 공기 컴프레서를 사용할 수 있다.
4.　 스캐닝 분석(Scanning)
하이브리디제이션 후 세척을 거쳐 비특이적인 신호는 제거한 후 건조된 슬라이드는 스캐너를 이용하여 칩 이미지를 분석하였다. 사용이 가능한 스캐너로는 Genepix 4000B, Easy Scan-1, Affymetrix 428 Array Scanner(Affymetrix, USA)나 ScanArray Lite(Packard Bioscience, USA), 또는 이에 준하는 장비이면 적합하다.
실시예 9: DNA 칩을 이용하여 자궁경부의 임상 검체에서 분석
상기 실시예 3과 4에서 PCR 후 시퀀싱 반응으로 HPV의 유무와 그 유형이 확인된 바 있는 자궁경부의 임상 검체의 DNA를 대상으로 실시예 3에서 기술된 방법대로 다시 듀플렉스 PCR을 수행한 후 그 PCR 산물을 상기 실시예 6과 7에 따라 제조된 DNA 칩 위에 올려 놓고 실시예 8의 방법에 따라 하이브리디제이션 반응을 수행한 후 세척을 거쳐 형광스캐너로 분석하였다. 이로써, 본 DNA 칩의 민감도와 특이도, 재현성을 분석하였으며, HPV의 유전자형의 진단을 위한 본 발명의 DNA 칩의 최적조건을 다시 점검 하였다. 그 결과의 실례를 도 5 내지 도 13에 나타내었다.　
도 5 내지 도 13은 본 발명의 DNA칩에 집적된 45개조의 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 다양한 유형의 HPV를 가진 검체를 대상으로 하여 하이브리디제이션 반응을 한 결과를 나타낸다. 플라스미드 DNA 증폭산물에 기인한 하이브리디제이션 반응 결과 상호간에 교차-하이브리디제이션 반응을 일으키지 않고 각각 고유의 프로브에서만 유형 특이적으로 깨끗하게 발현됨을 관찰할 수 있었다.
즉, 본 발명에서 제작한 DNA 칩내 45개조의 각 HPV 유형별 프로브들은 각각 특정 HPV 유형의 DNA에 대해 특이적으로 결합하며 프로브들간에 교차 하이브리디제이션 반응을 나타내지 않았다. 아울러 하나 이상의 유형의 HPV가 혼합된 복합 감염 검체도 모두 정확하게 진단해 냈다. 즉 단일 내지 복합 감염 HPV의 유전자형 진단에 있어서 본 발명의 DNA 칩은 100%의 민감도와 100%의 특이도를 나타내었다. 아울러 시간 간격을 두고 서로 다른 검사자가 3차례 이상 반복 검사하였을 때 모두 동일한 결과를 보여 100%의 재현성을 보였다. 본 발명에서 합성한 45개조의 프로브들은 DNA 마이크로어레이 하이브리디제이션 반응시 종래에 다루지 못한 수많은 HPV 유형의 조합에 대해서도 모두 정확하게 분석할 수 있다.　　　
특히, 도 14는 자궁경부에 고등급편평상피내병변이 확인된 한국 성인여성의 자궁경부 스왑검체에서 추출한 DNA를 이용하여 HPV의 L1 유전자 및 인체 베타엑틴 유전자를 멀티플렉스로 PCR하여 본 발명의 HPV 유전자형 분석용 DNA 칩을 이용하여 분석한 스캐닝 이미지의 사진이다.
본 발명에서 제작한 DNA칩은 임상에서 자궁경부 스왑검체로부터 각 유형의 HPV를 정확하게 판별함을 알 수 있었다. 각 HPV 유형별 프로브들은 임상 검체에서 각각 특정 HPV 유형의 DNA에 대해 특이적으로 결합하며 프로브들간에 교차 하이브리디제이션 반응을 나타내지 않았다. 아울러 직접 시퀀싱으로는 진단이 어렵고 클로닝 후 다수의 시퀀싱 분석을 해야 알 수 있는, 하나 이상의 유형의 HPV가 혼합된 복합 감염 검체도 본 발명의 DNA칩은 모두 정확하게 진단해냈다. 즉 단일 내지 복합 감염 HPV의 유전자형 진단에 있어서 본 발명의 DNA 칩은 각각 100%의 민감도와 거의 100%의 특이도를 나타내었다. 아울러 시간 간격을 두고 서로 다른 검사자가 3차례 이상 반복 검사하였을 때 모두 동일한 결과를 보여 100%의 재현성을 보였다.
실시예 10: DNA 칩을 이용하여 자궁경부의 임상 검체에서 분석한 임상 진단과의 상관 관계 분석
상기 실시예 9에서 PCR후 DNA 칩으로 분석한 결과를 자궁경부의 조직 검사 및 자궁경부의 세포진 검사 등 임상자료와 비교하여 양자의 상관관계를 조사하였으며, 본 발명의 DNA칩으로 자궁경부의 암이나 전암병변의 예측에 유용한지를 분석하였다. 이로써, 본 발명의 DNA 칩이 HPV의 유전자형의 분석뿐 아니라 자궁경부암의 스크리닝에도 유용함을 입증하였다.　
한국의 일반 성인여성의 자궁경부세포 검체 15,708례 중　7,371례에서 최종적으로 HPV 감염이 확인되었으며, 그 빈도는 463.93%이었다. 발견된 HPV의 형에는 45가지가 있다. 발견된 HPV의 유형을 볼 때 빈도상 역시 HPV 16형이 가장 흔하고, 그 다음으로는 HPV-53이 가장 흔하며 다음으로 HPV-39, HPV-56, HPV-58, HPV-52, HPV-70, HPV- 84, HPV-18, HPV-68, HPV-35 순으로 나타났다. 이러한 자료는 구미의 경우 HPV-16가 가장 흔하고 그 다음으로는 HPV-18이 가장 흔하며, 그 다음이 HPV 45, 52, 31, 33, 58의 순서인 것과는 뚜렷한 차이가 있다(Murinoz N et al., N Engl J Med , 2003, 348:518-27).
또한, 본 발명에서 높은 비율로 나타난 HPV 53은 구미의 HPV 발병율과 달리 국내에서 주로 발견되었다. 따라서 HPV 53 타입이 한국인의 자궁경부암 발병에 중요한 역할을 하는 것일 수 있다.　
실시예 11: 본 발명의 DNA 칩을 이용한 자궁경부 검체 진단
본 실시예에서는 본 발명의 HPV DNA 칩을 자궁경부 검체의 진단에 적용한 두 번째 실례로 그 목적은 첫째, 본 HPV DNA칩이 HPV 감염의 유무 진단과 유전자형 파악에 얼마나 정확한 지를 파악하고, 둘째, 암과 전암병변 등의 중한 자궁경부 병변을 예측하는데 얼마나 도움이 되는 지를 파악하는 데 있다. 이를 위해 자궁경부의 HPV감염 및 병변이 의심되어 세포병리학적 진단이 내려진 한국여성의 자궁경부 스왑(cervical swab) 검체를 대상으로 하여 검체에서 DNA를 분리하고, (1) 본 발명의 HPV DNA 마이크로어레이 검사, (2) HPV의 L1 유전자의 PCR 후 그 산물의 염기서열분석(automated sequencing analysis), 및 (3) 미국 FDA 공인 HPV DNA 검사인 Hybrid Capture Assay-II(HCA-II, Digene Corporation)의 3가지 검사로 비교 분석하였다.
본 발명의 HPV에 대한 DNA 칩은 인체의 자궁경부나 항문, 구강 등을 침범하는 43개 종류의 HPV를 모두 발견하는 검사로서, HCA-II는 12가지의 고위험형 HPV를 파악하는 검사이다. 비교분석은 (1) HPV 감염의 유무의 진단 민감도와 특이도, (2) HPV 유전자형의 진단 정확도, 그리고 (3) 자궁경부의 암과 전암 병변 등 중증 병변의 예측 정확도의 3가지 측면에 촛점을 맞추어서 하였다. HPV DNA 마이크로어레이 분석의 방법은 상기 실시예 2와 8의 방법을 사용하였고, PCR 및 염기서열분석은 공지의 방법을 사용하였다(Kim KH, Yoon MS, Na YJ, Park CS, Oh MR, Moon WC. Development and evaluation of a highly sensitive human papillomavirus genotyping DNA chip. Gynecol Oncol. 2006; 100(1):38-43). HCA-II 검사는 시판사의 매뉴얼에 따라 시행하였다.
본 비교연구의 대상 201명의 연령은 18세에서 81세, 평균 연령 52.4세이었다. 표준 검사인 HPV L1 유전자의 PCR 결과는 상기 표 3과 같다. 201례 중 191례에서 HPV 감염이 확인되었으며, 그 중 149례는 고위험군의 HPV를 보였고, 72례는 한 종류 이상의 HPV에 의한 혼합 감염을 나타내었다.
본 발명의 HPV DNA 칩의 분석 결과를 Hybrid Capture Assay(HCA)-II 분석 결과와 비교하였다(표 7 내지 10). 본 발명의 HPV DNA 칩 분석에서 HPV 감염 양성례 191례는 모두(100%) 정확하게 진단되었다. 그 중 174례(91.1%)에서는 HPV의 유전자형 분석(genotyping)이 정확하게 이루어 졌다. 고위험군 149례는 모두 정확하게 파악하였으나, 본 발명의 칩에 포함되지 않은 드문 형의 HPV는 파악하지 못했다. 이에 대해 HCA-II는 191례의 HPV 양성 검체 중 40례에서 HPV를 발견하지 못했으며, 149개의 고위험 HPV감염 검체 중에 12례(8.1%)를 놓치고 검출하지 못하였다. 본 발명의 HPV DNA 칩은 암과 전암 병변인 고도의 상피내 종양(cervical intraepithelial neoplasm, CIN) 및 고등급편평상피내병터(HSIL)을 포함하여 고위험형 자궁경부 병변 모두를 정확하게 예측할 수 있었다. 이에 대해 HCA-II검사는 자궁경부암 8례 중 1례를 놓치고, HSIL 12례 중 1례를 검출하지 못하였다. 아울러 본 발명의 HPV 칩이 HCA-II보다 저등급 SIL 검출에도 더 우수함을 알 수 있었다(92.2% : 56.9%, p<0.05).
이상의 결과는 본 발명의 HPV DNA칩이 HPV 감염의 유무 진단과 유전자형 파악, 특히 고위험군 HPV 파악에 있어 100%에 가까운 민감도를 가지는 검사이자, 자궁경부암과 전암병변을 예측하는 데에도 탁월한 검사임을 입증하는 것이다. 아울러 기존의 HCA-II 검사보다 더 우수함을 알 수 있다.
표 7. 본 발명의 DNA 칩에 의한 HPV의 유전자형 분석 결과
Figure 112010039063837-pat00015

표 8. 본 발명의 HPV DNA 칩과 Hybrid Capture Assay(HCA)-II 의 비교
Figure 112010039063837-pat00016
* 이들 17 검체의 경우는 HPV DNA 칩에 없는 타입임
표 9. HCA-II 방법으로 검출에 실패한 경우의 분석
Figure 112010039063837-pat00017

표 10. 자궁경부암과 전암병변에서 본 발명의 HPV DNA 칩과 HCA-II 의 비교
Figure 112010039063837-pat00018

실시예 12: HPV DNA 칩을 이용하여 항문 및 두경부 검체에서 분석
HPV는 성기외에 다른 장기와 조직에서도 발암의 원인이 될 수도 있으며, 실제 구강암이나 인두암, 후두암과 다수의 항문암(anal cancer)이 HPV에 의해 발병함이 확인되고 있다. 따라서 본 발명의 HPV DNA 칩을 사용하여 항문 등의 암과 전암병변에서의 HPV 감염 결과를 분석하였다. 본 실험을 위해 한국인의 Tonsil 조직과 치질조직으로부터 얻어진 각각의 검체 24례와 179례를 본 발명의 칩을 사용하여 검사하였다.
이비인후과에서 얻어진 총24례의 tonsil 조직 가운데 13례가 HPV 양성을 보였으며, 19례는 HPV음성으로 판독되었다. 13례의 양성 검체 가운데 단일감염이 5례였고 복합 감염이 8례였으며, 특이한 사항은 13례의 양성 검체 모두에서 고위험군의 HPV 타입이 감염되었음을 확인하였으며, 고위험군이 HPV 16타입이 26%, HPV 56 타입과 HPV 33타입이 각각 13%, HPV 52 타입이 8%의 감염율을 보였다.
179례의 치질조직은 27세부터 83세(평균 40세)까지의 성인 여성 치질조직 19례와 남성 치질조직 160례를 서울대 병원과 아산병원으로부터 제공받아 본 발명의 DNA 칩으로 검사를 한 결과, 63례의 HPV 양성감염이 확인이 되었으며, 그 가운데 여성이 10례이고 남성은 53례의 HPV 감염을 확인하였다. 총 63례의 양성 검체 가운데 단일 감염이 44례였으며 복합감염이 19례였다. 특히, 63례의 양성 검체 가운데 고위험군 HPV 감염이 49례(단일 및 복합감염)였고 저위험군 감염이 14례로 나타났다. 총 63례의 환자의 HPV 타입을 확인한 결과, 가장 많이 나타난 것이 고위험군인 HPV 16과 HPV 18로 각각 21%였으며, 다음으로 많이 나타난 것이 고위험군인 HPV 68이 8%로 나타났다.
이상, 본 발명의 DNA 칩이 자궁경부암을 유발하는 HPV 감염뿐 아니라 항문이나 후두암을 유발하는 HPV 감염도 진단할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 13: 금나노입자를 이용한 표지
상기 실시예 8에서 하이브리디제이션 반응을 위해 PCR후 표지수단으로 AuNP(금나노입자, 직경 20nm, BBI)과 silver shell이나 silver enhancement 방법을 사용하였다. 즉, PCR 산물을 프로브와 하이브리디제이션시키고 PCR 산물에 금나노입자를 결합시켜야 하므로 PCR 산물에 상보적으로 결합이 가능한 타겟 프로브를 3'말단에 티올기가 결합되도록 합성하여 금나노입자와 결합시켜서 최종 하이브리디제이션이 된 후에 silver enhancement를 시키는 방법을 사용하거나, 또는 금나노입자와 결합된 타겟 프로브에 silver shell을 만들어 하이브리디제이션하는 방법을 사용한다. 이렇게 반응된 칩은 검출기로 PMT를 사용하는 일반 형광 스캐너가 아닌 PD방식의 스캐너를 사용하여 반사율로 측정하거나 SEM을 찍어 판독을 한다. 구체적인 방법은 다음과 같다.
1. 타겟 프로브 디자인
금나노입자를 표지하기 위한 타겟 프로브 디자인은 우선 칩위에 집적된 프로브가 순방향이라면 보통 PCR 산물의 역방향이 결합하므로, 타겟 프로브는 칩 위의 프로브와 결합된 PCR 산물의 가닥과 상보적으로 결합이 가능한 시퀀스를 디자인한다. 즉, ACTB의 프로브와 결합하는 PCR 산물의 말단은 통상적으로 역방향 프라이머 부분이기에 타겟 프로브는 역방향 프라이머에 상보적인 시퀀스로 합성을 하는데, 이때 타겟 프로브의 말단이 AuNP (직경 20nm)와 결합을 해야하므로 상보적인 염기서열 뒤에 내부 C18 링커와 아데닌 10개를 합성한 후 3' 말단에 티올기가 오도록 합성하였다. 이렇게 디자인된 타겟 프로브는 표 11과 같다. 이때, LTP는 HPV의 L1 유전자 PCR 산물의 타겟 프로브이고, ATP는 베타액틴의 ACTB 유전자 PCR 산물의 타겟 프로브이다.
표 11. 타겟 프로브 서열
Figure 112010039063837-pat00019

2. PCR 산물에 금나노입자의 부착
칩 위에 집적된 올리고뉴클레오티드 프로브와 하이브리디제이션 반응으로 결합된 PCR 산물에 AuNP를 표지하기 위해서는 다음의 2가지 방법을 사용한다(도 15 ). 그 가운데 하나가 silver enhancement(통상적인 실버 염색) 방법이며, 다른 하나가 하기와 같은 방법을 사용하여 타겟 프로브에 AuNP를 표지하고 표지된 AuNP를 seed로 하여 그 위에 2차로 은으로 표지하여 silver shell을 만들어 준 후 Silver shell 타겟 프로브를, 프로브와 하이브리디제이션된 PCR 산물에 결합시키는 것이다. 보다 자세한 과정은 다음과 같다.
I. 티올기 변형된 올리고뉴클레오티드의 디설파이드 기능기 절단 반응
금나노입자와 타겟 프로브를 결합시키기 위해서는 반드시 타겟 프로브의 티올기를 활성화시켜야 한다.
1) 상기 표 11과 같이 합성한 올리고뉴클레오티드 프로브를 Quick spin 후 증류수 1,517㎕를 넣어 잘 혼합하여 녹인다.
2) 0.1M DTT 15.4mg에 디설파이드 절단 버퍼(pH8.0, 170nM phosphate buffer; 11.468g Na2HPO4, 0.509g NaH2PO4, 500ml Nano Pure water) 1㎖을 넣어 녹여 준비한다.
3) 상기의 0.1M DTT 100㎕를 1.5ml 튜브에 넣고, 녹인 올리고뉴클레오티드 프로브 100㎕ (10nM)를 넣은 후 잘 섞은 다음 실온에서 2시간 동안 반응시킨다.
4) NAP-5 칼럼 (Sephadex G-25 DNA grade, GE healthcare, cat. no. 17-0853-02)을 스탠드에 고정하여 준비한다.
5) 바닥에 Waste rack을 두고 팁과 캡을 열어 버퍼를 버리고, 상층까지squeeze bottle을 이용하여 DW를 채워서 칼럼을 세척해 준다. 이런 과정을 3회 반복하여 충분히 세척해주고, 사용 전까지 캡을 막아 준비한다.
6) DTT로 반응이 끝난 올리고뉴클레오티드 프로브 총 200㎕를 NAP-5 칼럼의 캡을 열고, 칼럼 중간 막 위에 버블이 생기지 않도록 넣고, 용액이 다 내려가면 (약 1분 25초 소요) 이어서 증류수 450㎕를 넣어주고 다시 용액이 다 내려가면 (약 1분 28초 소요), 미리 준비해둔 1.5ml 튜브(7개)의 뚜껑을 열어 준비하고 있다가 950㎕의 DW를 넣어주면서 하나의 튜브에 4방울씩 받는다.
II. 올리고 농도 측정 및 산출
1) 이렇게 얻어진 용액의 1, 2, 5번 튜브의 용액을 각각 70㎕ 사용하여 A260nm에서 Spectrophotometer로 각 용액 내의 올리고뉴클레오티드 프로브 농도를 측정한다.
2) 상기의 튜브 1-5를 2번 튜브에 모아 혼합후 다시 정량한다.
3) 공식 C= A/ε에 따라 몰농도를 산출한다.
4) 상기의 공식에 따라 사용하고자 하는 AuNP 크기 (예. 20nm 또는 50nm)를 설정하고 그에 따라 사용하고자 하는 올리고뉴클레오티드 프로브 농도와 AuNP 농도를 산출한다.
III. 타겟 프로브 - AuNP 표지 반응
1) 상기에서 산출된 값에 따라, 2ml AuNP (20nm)를 15ml conical 튜브에 넣고, 올리고뉴클레오티드 프로브 543㎕를 넣어 잘 섞어 준 후, 25℃로 설정된 진탕 배양기에서 20분간 반응한다.
2) 상기의 용액에 100mM PBS (Na2HPO4 0.562g + NaH2PO4 0.125g+ H20 50ml) 254.356㎕를 넣고, 혼합후 20분간 다시 반응한다.
3) 상기의 용액에 10% SDS 2.797㎕를 넣고, 혼합후 20분간 다시 반응한다.
4) 상기의 용액에 2M NaCl 140.035㎕를 넣고, 혼합후 20분간 반응 후 다시 1회 더 반복한다.
5) 상기의 용액에 2M NaCl 70.0179㎕를 넣고, 혼합후 20분간 다시 반응 후, 1회 더 반복하여 혼합후 밤새 반응한다.
6) 밤새 반응이 끝난 용액을 1.5ml 튜브(2개)에 1.5ml 씩 나눠 담고, 10,000rpm/20분간 원심분리를 수행하고, 펠렛에 다시 0.3M PBS (10mM PB, 40ml + 2M NaCl 6ml)에 0.01% SDS를 넣어 만든 용액 1ml을 넣어 풀어준 후 다시 10,000rpm/20분간 원심분리를 수행하고, 펠렛에 0.3M PBS (NaCl, 8.766g + Na2HPO4, 0.562g, NaH2PO4, 0.25g + DW 500ml)를 1ml 씩 넣어 재혼탁시킨다(총 2ml).
3. 타겟 프로브에 표지된 금나노입자를 씨드로 하여 Silver shell (core shell)로 2차 표지
상기 2단계에서 표지시킨 타겟 프로브-AuNP의 흡광도값을 기준으로 silver shell 두께를 결정하고 그에 따른 Ag (은) 전체 필요량을 다음 표 12의 데이터를 이용하여 첨가할 시약의 양을 결정한다.
표 12. 은쉘(Silver shell) 7ml에 필요한 시약의 양
Figure 112010039063837-pat00020

1) 첨가할 시약의 양에 따라 DNA-AuNP, 1% PVP, 10-1M L-SA, 10-3M AgNO3 를 차례로 넣어주고 잘 혼합한 후 150rpm로 흔들면서 밤새 배양한다.
2) 밤새 반응이 끝난 용액을 1.5ml 튜브에 나누어 담고 8,000rpm에서 20분간 원심분리한다.
3) 상층액을 제거하고 0.3M PBS 1ml을 넣고 다시 섞어 준 후 다시 10,000rpm에서 20분간 원심분리한다.
4) 원심분리 후 다시 상층액을 제거하고, 총량을 처음 넣어준 AuNP양에 맞춰서 0.3M PBS를 넣고 잘 섞어준다. 바로 펠렛이 풀리지 않으면 위와 동일하게 60℃ 워터베이스에서 보존한 후 재현탁한다.
5) 재현탁한 DNA-AuNP-core shell의 흡광도(λ=260)를 측정한다.
4. 하이브리디제이션 및 세척
1) 냉장 보관한 AuNP 표지의 타겟 프로브는 60℃의 수조에서 넣어 덩어리를 풀어준 다음 칩위에 100㎕를 넣어 실온에서 4시간 반응한다.
2) 이렇게 반응시킨 칩에 0.3M PBS를 사용하여 2회 세척한 다음 건조시킨다.
상기의 과정을 본 발명의 프로브를 이용하여 실험한 결과를 도 16 내지 21에 나타내었다. 도 16과 도 17의 경우, HPV6-AuNP-Ag enhancement과 HPV6-AuNP-Coreshell 처리된 칩을 스캐닝한 이미지로서, 좌측은 전체 8개의 웰을 모두 스캐닝한 것이고 오른쪽의 이미지는 각각의 웰안의 스파팅된 스팟의 이미지를 나타낸 것이다. 은염색한 도 16의 이미지와 달리 각 스팟의 이미지가 상당히 또렷함을 확인할 수 있었다.
도 18과 도 19의 경우, HPV6-AuNP-Ag 염색한 것과 HPV6-AuNP-Ag coreshell로 표지한 칩의 각 스팟과 백그라운드를 SEM으로 분석한 것으로, 스팟 안에 두 가지 방법 모두 백그라운드보다 HPV6 프로브 스팟 안에 금나노입자이 고밀도로 존재함을 확인하였다.
도 20의 경우, HPV6-AuNP-Ag enhancement한 스팟과 HPV6-AuNP-Ag coreshell로 표지한 스팟을 SEM으로 측정한 것으로 Ag 염색을 한 것 보다는 Ag coreshell로 표지 한 것이 훨씬 더 안정적으로 나타난 것을 확인할 수 있었으며, 또한 Ag 염색을 한 경우는 비특이적으로 은이 염색되었음을 확인할 수 있었다.
도 21의 경우, HPV 6 타입의 PCR 산물과 타겟 프로브 (LTP)에 AuNP를 표지 시킨 것(HPV 6-AuNP)과, HPV 6 타입의 PCR 산물과 타겟 프로브 (LTP)에 AuNP를 표지 시킨 후 반응된 칩 위에 silver enhancement를 시킨 것 (HPV6-AuAg staining), 그리고 HPV 6 타입의 PCR 산물과 타겟 프로브 (LTP)에 AuN를 1차 표지시킨 후 Silver core shell을 2차로 표지시킨 것(HPV 6-AuAg Coreshell)의 칩에 여러가지 농도의 주형에 따라 PD가 장착된 스캐너로 스캐닝하여 각 스팟의 반사율을 SBR 값으로 비교한 결과, 주형이 1pmole일 경우 SBR 값이 가장 높게 나타나며, 특히 HPV6-AuNP < HPV6-AuAg staining < HPV60AuAg core shell 순으로서 Silver core shell 방법으로 2차 표지를 한 것이 반사율이 가장 높게 나왔음을 확인할 수 있다. 따라서, 나노입자를 사용한 표지방법도 본 발명의 칩에 사용이 가능함을 확인할 수 있었다.
이상의 실시예를 통해, 본 발명의 HPV DNA 칩이 인체의 성기와 항문 및 두경부를 침범하는 HPV 43종 모두가 존재하는지 유무와 유전자형 분석에 유용하며, 나아가 자궁경부암과 전암병변의 검진에도 효율적이어서, 기존의 진단제품보다 훨씬 우수함을 알 수 있다.　
<110> GOODGENE INC. MOON, Woo Chul <120> DNA CHIP FOR GENOTYPING OF HUMAN PAPILLOMA VIRUS, KIT COMPRISING THE SAME, AND METHOD FOR GENOTYPING HPV <130> KR10P0531 <160> 213 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACTB Forward Primer <400> 1 gcaccacacc ttctacaatg a 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACTB Reverse Primer <400> 2 gtcatcttct cgcggttggc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV L1 Primer <400> 3 gcmcagggwc ataayaatgg 20 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV L2 Primer <400> 4 aataaactgt aaatcatatt cctc 24 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV GP6+ Primer <400> 5 gaaaaataaa ctgtaaatca tattc 25 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 6 Probe 1 <400> 6 gcatccgtaa ctacatcttc ca 22 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 6 Probe 2 <400> 7 tgtgcatccg taactacatc ttcca 25 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 7 Probe 1 <400> 8 acaccaacac catatgacaa t 21 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 7 Probe 2 <400> 9 cgcccacacc aacaccatat gacaata 27 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 10 Probe 1 <400> 10 cctcccctgc cactacg 17 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 10 Probe 2 <400> 11 tctgagcctc ccctgccact acg 23 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 11 Probe 1 <400> 12 atttgctggg gaaaccac 18 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 11 Probe 2 <400> 13 tatttgctgg ggaaaccact 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 Probe 1 <400> 14 tgccatatct acttcagaaa ct 22 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 Probe 2 <400> 15 tgtgctgcca tatctacttc agaaact 27 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 Probe 1 <400> 16 tctacacagt ctccgtacct g 21 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 Probe 2 <400> 17 aatatgtcta cacagtctcc gtacctg 27 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 26 Probe 1 <400> 18 attatctgca gcatctgcat cc 22 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 26 Probe 2 <400> 19 tagtacatta tctgcagcat ctgcatcc 28 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 27 Probe 1 <400> 20 cagctgaggt gtctgataat actaat 26 <210> 21 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 27 Probe 2 <400> 21 gtgtgcagct gaggtgtctg ataatactaa t 31 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 30 Probe 1 <400> 22 aaccacacaa acgttatcca 20 <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 30 Probe 2 <400> 23 atctgcaacc acacaaacgt tatcca 26 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 31 Probe 1 <400> 24 ctgcaattgc aaacagtgat ac 22 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 31 Probe 2 <400> 25 tttgtgctgc aattgcaaac agtgatac 28 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 32 Probe 1 <400> 26 gacacataca agtctactaa cttta 25 <210> 27 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 32 Probe 2 <400> 27 actgaagaca catacaagtc tactaacttt a 31 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 33 Probe 1 <400> 28 gcacacaagt aactagtgac agtac 25 <210> 29 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 33 Probe 2 <400> 29 ctttatgcac acaagtaact agtgacagta c 31 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 34 Probe 1 <400> 30 ccacaagtac aactgcacc 19 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 34 Probe 2 <400> 31 caatccacaa gtacaactgc acc 23 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 35 Probe 1 <400> 32 tctgctgtgt cttctagtga cagta 25 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 35 Probe 2 <400> 33 tgtgttctgc tgtgtcttct agtgacagta 30 <210> 34 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 39 Probe 1 <400> 34 acctctatag agtcttccat accttctac 29 <210> 35 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 39 Probe 2 <400> 35 ttatctacct ctatagagtc ttccatacct tctac 35 <210> 36 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 40 Probe 1 <400> 36 agtcccccac accaac 16 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 40 Probe 2 <400> 37 ccacacagtc ccccacacca ac 22 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 42 Probe 1 <400> 38 cactgcaaca tctggtga 18 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 42 Probe 2 <400> 39 gtgtgccact gcaacatctg gtga 24 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 43 Probe 1 <400> 40 gcccagtaca tatgacaatg ca 22 <210> 41 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 43 Probe 2 <400> 41 tactgtgccc agtacatatg acaatgca 28 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 44 Probe 1 <400> 42 tacacagtcc cctccgtc 18 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 44 Probe 2 <400> 43 tgccactaca cagtcccctc cgtc 24 <210> 44 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 45 Probe 1 <400> 44 cacaaaatcc tgtgccaag 19 <210> 45 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 45 Probe 2 <400> 45 cctctacaca aaatcctgtg ccaag 25 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 51 Probe 1 <400> 46 ggtttcccca acatttactc 20 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 51 Probe 2 <400> 47 tgcggtttcc ccaacattta ctc 23 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 52 Probe 1 <400> 48 gctgaggtta aaaaggaaag ca 22 <210> 49 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 52 Probe 2 <400> 49 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98 ttgttgggdt aatcagttgt ttgttactgt 30 <210> 99 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV Universal Probe 2 <400> 99 tttgttactg ttgtagatac tactcgcagt ac 32 <210> 100 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV Universal Probe 3 <400> 100 ttgttgggdt aatcarttrt ttgttacdgt 30 <210> 101 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV Universal Probe 4 <400> 101 tttkttachg tkgtdgatac yac 23 <210> 102 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV Universal Probe 5 <400> 102 tgtttrttac tgttgtdgay acyac 25 <210> 103 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV Universal Probe 6 <400> 103 tatttgtaac tgttgtggat accac 25 <210> 104 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV Universal Probe 7 <400> 104 tttrttactg ttgtdgayac yac 23 <210> 105 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV Universal Probe 8 <400> 105 tatttrttac tgttgtdgay acyac 25 <210> 106 <211> 22 <212> DNA <213> 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type Probe 1 <400> 126 ccctaaccct aanttagggt tagggaacca cacaaacgtt atcca 45 <210> 127 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 30 d type Probe 2 <400> 127 ccctaaccct aanttagggt tagggatctg caaccacaca aacgttatcc a 51 <210> 128 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 31 d type Probe 1 <400> 128 ccctaaccct aanttagggt tagggctgca attgcaaaca gtgatac 47 <210> 129 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 31 d type Probe 2 <400> 129 ccctaaccct aanttagggt tagggtttgt gctgcaattg caaacagtga tac 53 <210> 130 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 32 d type Probe 1 <400> 130 ccctaaccct aanttagggt taggggacac atacaagtct actaacttta 50 <210> 131 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 32 d type Probe 2 <400> 131 ccctaaccct aanttagggt tagggactga agacacatac aagtctacta acttta 56 <210> 132 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 33 d type Probe 1 <400> 132 ccctaaccct aanttagggt 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type Probe 2 <400> 145 ccctaaccct aanttagggt tagggtactg tgcccagtac atatgacaat gca 53 <210> 146 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 44 d type Probe 1 <400> 146 ccctaaccct aanttagggt tagggtacac agtcccctcc gtc 43 <210> 147 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 44 d type Probe 2 <400> 147 ccctaaccct aanttagggt tagggtgcca ctacacagtc ccctccgtc 49 <210> 148 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 45 d type Probe 1 <400> 148 ccctaaccct aanttagggt tagggcacaa aatcctgtgc caag 44 <210> 149 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 45 d type Probe 2 <400> 149 ccctaaccct aanttagggt tagggcctct acacaaaatc ctgtgccaag 50 <210> 150 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 51 d type Probe 1 <400> 150 ccctaaccct aanttagggt tagggggttt ccccaacatt tactc 45 <210> 151 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 51 d type Probe 2 <400> 151 ccctaaccct aanttagggt tagggtgcgg tttccccaac 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Sequence <220> <223> HPV 55 d type Probe 1 <400> 158 ccctaaccct aanttagggt tagggctaca actcagtctc catctacaa 49 <210> 159 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 55 d type Probe 2 <400> 159 ccctaaccct aanttagggt taggggtgct gctacaactc agtctccatc tacaa 55 <210> 160 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 56 d type Probe 1 <400> 160 ccctaaccct aanttagggt taggggacta ttagtactgc tacagaacag ttaagtaaa 59 <210> 161 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 56 d type Probe 2 <400> 161 ccctaaccct aanttagggt tagggtactg ctacagaaca gttaagtaaa 50 <210> 162 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 57 d type Probe 1 <400> 162 ccctaaccct aanttagggt tagggccact gtaaccacag aaactaatt 49 <210> 163 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 57 d type Probe 2 <400> 163 ccctaaccct aanttagggt taggggtgtg ccactgtaac cacagaaact aatt 54 <210> 164 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 58 d type Probe 1 <400> 164 ccctaaccct aanttagggt tagggtgcac tgaagtaact aaggaagg 48 <210> 165 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 58 d type Probe 2 <400> 165 ccctaaccct aanttagggt taggggacat tatgcactga agtaactaag gaagg 55 <210> 166 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 59 d type Probe 1 <400> 166 ccctaaccct aanttagggt tagggtctat tcctaatgta tacacaccta ccag 54 <210> 167 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 59 d type Probe 2 <400> 167 ccctaaccct aanttagggt tagggcttct tctattccta atgtatacac acctaccag 59 <210> 168 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 61 d type Probe 1 <400> 168 ccctaaccct aanttagggt tagggtgcta catccccccc tgtat 45 <210> 169 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 61 d type Probe 2 <400> 169 ccctaaccct aanttagggt tagggtttgt actgctacat ccccccctgt at 52 <210> 170 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 62 d type Probe 1 <400> 170 ccctaaccct aanttagggt 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177 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 68b d type Probe 2 <400> 177 ccctaaccct aanttagggt tagggtttgt ctactactac tgaatcagct gtaccaaata 60 t 61 <210> 178 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 68a d type Probe 1 <400> 178 ccctaaccct aanttagggt tagggcagac tctactgtac cagctg 46 <210> 179 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 68a d type Probe 2 <400> 179 ccctaaccct aanttagggt tagggtacag actctactgt accagctg 48 <210> 180 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 68a d type Probe 3 <400> 180 ccctaaccct aanttagggt tagggtacta cagactctac tgtaccagct g 51 <210> 181 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 68a d type Probe 4 <400> 181 ccctaaccct aanttagggt tagggcagac tctactgtac cagctgtg 48 <210> 182 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 69 d type Probe 1 <400> 182 ccctaaccct aanttagggt tagggcacaa tctgcatctg ccacttttaa 50 <210> 183 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 69 d type Probe 2 <400> 183 ccctaaccct aanttagggt taggggtatc tgcacaatct gcatctgcca cttttaa 57 <210> 184 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 70 d type Probe 1 <400> 184 ccctaaccct aanttagggt tagggccgaa acggccatac ct 42 <210> 185 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 70 d type Probe 2 <400> 185 ccctaaccct aanttagggt tagggctgca ccgaaacggc catacct 47 <210> 186 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 72 d type Probe 1 <400> 186 ccctaaccct aanttagggt tagggcacag cgtcctctgt atcaga 46 <210> 187 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 72 d type Probe 2 <400> 187 ccctaaccct aanttagggt tagggtactg ccacagcgtc ctctgtatca ga 52 <210> 188 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 73 d type Probe 1 <400> 188 ccctaaccct aanttagggt tagggaggta cacaggctag tagctctact ac 52 <210> 189 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 73 d type Probe 2 <400> 189 ccctaaccct aanttagggt tagggtgtag gtacacaggc tagtagctct actac 55 <210> 190 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 81 d type Probe 1 <400> 190 ccctaaccct aanttagggt taggggctac atctgctgct gcaga 45 <210> 191 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 81 d type Probe 2 <400> 191 ccctaaccct aanttagggt tagggtttgc acagctacat ctgctgctgc aga 53 <210> 192 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 82 d type Probe 1 <400> 192 ccctaaccct aanttagggt tagggctcca gcaaacttta agca 44 <210> 193 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 82 d type Probe 2 <400> 193 ccctaaccct aanttagggt tagggctcca gcaaacttta agcaataca 49 <210> 194 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 83 d type Probe 1 <400> 194 ccctaaccct aanttagggt tagggtgctg ctacacaggc taatga 46 <210> 195 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 83 d type Probe 2 <400> 195 ccctaaccct aanttagggt tagggtcagc tgctgctaca caggctaatg a 51 <210> 196 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 84 d type Probe 1 <400> 196 ccctaaccct aanttagggt tagggaccga atcagaatat aaacctacca at 52 <210> 197 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 84 d type Probe 2 <400> 197 ccctaaccct aanttagggt tagggcaaca ccgaatcaga atataaacct accaat 56 <210> 198 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 90 d type Probe 1 <400> 198 ccctaaccct aanttagggt tagggacaaa caccctctga cacataca 48 <210> 199 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 90 d type Probe 2 <400> 199 ccctaaccct aanttagggt tagggccaca caaacaccct ctgacacata ca 52 <210> 200 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 91 d type Probe 1 <400> 200 ccctaaccct aanttagggt tagggtctgt gctacctact acatatgaca aca 53 <210> 201 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 91 d type Probe 2 <400> 201 ccctaaccct aanttagggt tagggactga gtctgtgcta cctactacat atgacaaca 59 <210> 202 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV Universal d type Probe 1 <400> 202 ccctaaccct aanttagggt tagggttgtt gggdtaatca gttgtttgtt actgt 55 <210> 203 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV Universal d type Probe 2 <400> 203 ccctaaccct aanttagggt tagggtttgt tactgttgta gatactactc gcagtac 57 <210> 204 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV Universal d type Probe 3 <400> 204 ccctaaccct aanttagggt tagggttgtt gggdtaatca rttrtttgtt acdgt 55 <210> 205 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV Universal d type Probe 4 <400> 205 ccctaaccct aanttagggt tagggtttkt tachgtkgtd gatacyac 48 <210> 206 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV Universal d type Probe 5 <400> 206 ccctaaccct aanttagggt tagggtgttt rttactgttg tdgayacyac 50 <210> 207 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV Universal d type Probe 6 <400> 207 ccctaaccct aanttagggt tagggtattt gtaactgttg tggataccac 50 <210> 208 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV Universal d type Probe 7 <400> 208 ccctaaccct aanttagggt tagggtttrt tactgttgtd gayacyac 48 <210> 209 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV Universal d type Probe 8 <400> 209 ccctaaccct aanttagggt tagggtattt rttactgttg tdgayacyac 50 <210> 210 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACTB-1 d type Probe <400> 210 ccctaaccct aanttagggt tagggacccc gtgctgctga ccgaggc 47 <210> 211 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACTB-2 d type Probe <400> 211 ccctaaccct aanttagggt tagggcaccc cgtgctgctg accg 44 <210> 212 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACTB-3 d type Probe <400> 212 ccctaaccct aanttagggt tagggcaccc cgtgctgctg accgaggc 48 <210> 213 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACTB-4 d type Probe <400> 213 ccctaaccct aanttagggt taggggctgc gtgtggctcc cgagg 45

Claims (25)

  1. 삭제
  2. 서열번호 110 내지 213의 염기서열을 갖는 d형 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는, 검체의 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 분석용 DNA 칩.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 DNA 칩은 고위험군 HPV로서 HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-68a, HPV-68b 및 HPV-82; 중위험군 HPV로서 HPV-26, HPV-53, HPV-66, HPV-67, HPV-69, HPV-70 및 HPV-73; 저위험군 HPV로서 HPV-6, HPV-11, HPV-34, HPV-40, HPV-42, HPV-43, HPV-44, HPV-54, HPV-55, HPV-61, HPV-62, HPV-72 및 HPV-81; 나머지 군의 HPV로서 HPV-90, HPV-10, HPV-27, HPV-30, HPV-32, HPV-57, HPV-83, HPV-84 및 HPV-91을 포함하는 44종의 HPV 유전자형의 동시분석용인 것을 특징으로 하는 DNA 칩.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 서열번호 110 내지 201의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브는 HPV의 각 유형(type)에 특이적인 L1 유전자 부위와 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 DNA 칩.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 서열번호 202 내지 209의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브는 HPV의 모든 유형(type)에 공통으로 존재하는 L1 유전자 부위와 상보적으로 결합하는 유니버셜 프로브인 것을 특징으로 하는 DNA 칩.
  6. 제 3 항에 있어서, 상기 서열번호 210 내지 213의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브는, 양성 대조군으로서 인체형 베타엑틴 유전자와 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 DNA 칩.
  7. 제 2 항에 있어서, 상기 DNA 칩은 프로브를 집적할 수 있는 웰(well)이 8개 내지 24개로 구획되어 있는 것을 특징으로 하는 DNA 칩.
  8. 제 2 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브의 농도는 38pmol 이상인 것을 특징으로 하는 DNA 칩.
  9. 제 2 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브에 링커로서 C6의 아민 변형된 디데옥시티미딘을 결합시켜, 수퍼알데히드기(superaldehyde)로 코팅된 지지체 위에 집적시킨 것을 특징으로 하는 DNA 칩.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 지지체는 유리슬라이드, 페이퍼, 니트로셀룰로오스막, 마이크로플레이트 웰, 플라스틱, 실리콘, DVD 및 비드로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 DNA 칩.
  11. 제 2 항에 있어서, 상기 검체는 질의 스왑, 자궁경부의 조직, 남성 성기의 조직, 소변, 항문 조직, 직장 조직, 인두 조직, 구강 조직 및 두경부 조직으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 DNA 칩.
  12. 제 2 항에 있어서, 상기 검체는 남성 성기의 암, 남성 요로의 암, 항문암, 두경부암 및 이들의 전암 세포로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 DNA 칩.
  13. 제 2 항에 있어서, 상기 DNA 칩은 HPV 백신의 투여 여부를 결정하는 데 이용되는 것을 특징으로 하는 DNA 칩.
  14. 제 2 항에 따른 DNA 칩, 타겟 유전자를 PCR 증폭하기 위한 프라이머, 및 증폭된 DNA를 검출하기 위한 표지수단을 포함하는, 인유두종바이러스(HPV)의 유전자형 분석용 키트.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2의 염기서열을 갖는 인체형 베타엑틴 유전자 증폭용 프라이머; 및 서열번호 3 내지 5의 염기서열을 갖는 HPV L1 유전자 증폭용 프라이머인 것을 특징으로 하는 키트.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 표지수단은 Cy3, Cy5, Cy5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, Orange green 488X, Orange green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665, Calfluor Orange 546, Calfluor red 610, Quasar 670, 비오틴, Au, Ag 및 폴리스티렌으로 이루어지는 군으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
  17. 다음의 단계를 포함하는, 인유두종바이러스(HPV)의 유전자형 분석방법:
    (a) 서열번호 1 내지 5에서 선택되는 프라이머를 이용하여 검체의 타겟 유전자를 단일(single), 듀플렉스(duplex) 또는 네스티드(nested) PCR 방법에 의해 증폭하는 단계;
    (b) 상기 증폭된 PCR 산물을 제 2 항에 따른 DNA 칩의 올리고뉴클레오티드 프로브에 하이브리드시키는 단계;
    (c) 상기 하이브리드에 의해 얻어진 혼성화물의 PCR 산물을 표지하는 단계; 및
    (d) 상기 표지를 검출하는 단계.
  18. 삭제
  19. 제 17 항에 있어서, 상기 표지 단계 (c)는, 상기 PCR 산물에 상보적인 타겟 프로브에 Au 나노입자를 1차 표지한 후 은염색(silver staining)하여 2차 표지한 것을 상기 혼성화물의 PCR 산물에 결합시키는 것에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  20. 제 17 항에 있어서, 상기 표지 단계 (c)는, 상기 PCR 산물에 상보적인 타겟 프로브에 Au 나노입자를 1차 표지한 후 은 쉘(silver shell)을 더 형성시켜 2차 표지한 것을 상기 혼성화물의 PCR 산물에 결합시키는 것에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  21. 제 19 항에 있어서, 상기 타겟 프로브는 서열번호 214 및 215의 염기서열을 가지며, 3' 말단쪽에 차례로 C18 링커, A10 및 티올기가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  22. 제 20 항에 있어서, 상기 타겟 프로브는 서열번호 214 및 215의 염기서열을 가지며, 3' 말단쪽에 차례로 C18 링커, A10 및 티올기가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  23. 제 17 항에 있어서, 하기 표 1의 65개 유형의 HPV의 L1 유전자를 삽입한 플라스미드 벡터들을 양성 대조군 클론으로 이용하여 분석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분석방법. No. HPV 아형 플라즈미드 벡터 크기(Kb) 1 6B pUC19 10.6 2 6 pGEMTeasy 3.85 3 10 pGEMTeasy 3.85 4 11 pBR322 12.2 5 11 pGEMTeasy 3.85 6 16 pBluescript 10.9 7 16 pGEMTeasy 3.85 8 18 pBR322 12.2 9 18 pGEMTeasy 3.85 10 26 pGEMTeasy 3.85 11 27 pGEMTeasy 3.85 12 30 pGEMTeasy 3.85 13 31 pBR322 12.2 14 31 pGEMTeasy 3.85 15 32 pGEMTeasy 3.85 16 33 pBR322 12.2 17 33 pGEMTeasy 3.85 18 34 pGEMTeasy 3.5 19 34 pGEMTeasy 3.85 20 35 pT713 10.7 21 35 pGEMTeasy 3.85 22 39 pSP65 10.8 23 39 pGEMTeasy 3.85 24 40 pGEMTeasy 3.5 25 40 pGEMTeasy 3.85 26 42 pBluescript 10.9 27 42 pGEMTeasy 3.85 28 43 pGEMTeasy 3.5 29 43 pGEMTeasy 3.85 30 44 pT713 10.6 31 44 pGEMTeasy 3.85 32 45 pGEMTeasy 3.6 33 45 pGEMTeasy 3.85 34 51 pGEMTeasy 3.5 35 51 pGEMTeasy 3.85 36 52 pUC19 10.6 37 52 pGEMTeasy 3.85 38 53 pGEMTeasy 3.85 39 54 pGEMTeasy 3.85 40 55 pGEMTeasy 3.85 41 56 pT713 10.7 42 56 pGEMTeasy 3.85 43 57 pGEMTeasy 3.85 44 58 plink322 11.6 45 58 pGEMTeasy 3.85 46 59 pUC9 10.6 47 59 pGEMTeasy 3.85 48 61 pGEMTeasy 3.85 49 62 pGEMTeasy 3.85 50 66 pBR322 12.2 51 66 pGEMTeasy 3.85 52 67 pGEMTeasy 3.85 53 68 pGEMTeasy 3.5 54 68 pGEMTeasy 3.85 55 69 pBluescript 10.8 56 69 pGEMTeasy 3.85 57 70 pGEMTeasy 3.85 58 72 pGEMTeasy 3.85 59 73 pGEMTeasy 3.85 60 81 pGEMTeasy 3.85 61 82 pGEMTeasy 3.85 62 83 pGEMTeasy 3.85 63 84 pGEMTeasy 3.85 64 90 pGEMTeasy 3.85 65 91 pGEMTeasy 3.85
  24. 제 17 항에 있어서, 상기 검체는 질의 스왑, 자궁경부의 조직, 남성 성기의 조직, 소변, 항문 조직, 직장 조직, 인두 조직, 구강 조직 및 두경부 조직으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  25. 제 17 항에 있어서, 상기 검체는 남성 성기의 암, 남성 요로의 암, 항문암, 두경부암 및 이들의 전암 세포로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분석방법.


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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101413702B1 (ko) 2012-11-05 2014-07-01 (주)다이오진 이중­다중 역전사 중합효소 연쇄반응에 의한 종양원성 인유두종 바이러스 유형 동정 방법
WO2018084403A1 (ko) * 2016-11-04 2018-05-11 주식회사 퀀타매트릭스 인유두종바이러스 유전자형 검출용 조성물

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101951172B1 (ko) * 2014-11-07 2019-02-22 주식회사 파나진 인유두종바이러스의 유전자형 검출을 위한 ρνα 프로브, 키트 및 방법
CN104673756A (zh) * 2015-03-18 2015-06-03 厦门大学 一种n4短尾病毒及玫瑰杆菌dfl12基因芯片
US11001900B2 (en) 2015-06-30 2021-05-11 Psomagen, Inc. Method and system for characterization for female reproductive system-related conditions associated with microorganisms
CN105861748A (zh) * 2016-05-03 2016-08-17 深圳市华中生物药械有限公司 一种用于hpv分型检测的方法
KR102010632B1 (ko) * 2016-05-03 2019-08-13 에이비온 주식회사 인간과 마우스 관련 유전자 오염진단 시약, 이를 포함하는 분석 키트 및 오염 분석방법
CN105861750A (zh) * 2016-05-11 2016-08-17 港龙生物技术（深圳）有限公司 一种高通量检测人***癌病毒分型的基因芯片及试剂盒
KR20200047626A (ko) * 2017-08-28 2020-05-07 소마젠 인크 미생물과 관련된 여성 생식계통-관련 컨디션에 대한 특성화를 위한 방법 및 시스템
CN108676797B (zh) * 2018-06-07 2019-04-26 迈基诺（重庆）基因科技有限责任公司 用于检测人***瘤病毒的成套试剂与方法
CN109112184B (zh) * 2018-08-20 2022-04-05 贵州医科大学 一种hpv基因芯片及其制备方法和应用
CN115354086A (zh) * 2019-01-03 2022-11-18 杭州诺辉健康科技有限公司 检测人***瘤病毒的组合物和方法
CN109917132A (zh) * 2019-03-22 2019-06-21 安徽深蓝医疗科技股份有限公司 针对hpv 16和hpv 18基因型的引物对、双重侧向流层析试纸条及检测方法
US11149322B2 (en) 2019-06-07 2021-10-19 Chapter Diagnostics, Inc. Methods and compositions for human papillomaviruses and sexually transmitted infections detection, identification and quantification
CN111607667B (zh) * 2020-06-04 2021-03-02 昆明寰基生物芯片产业有限公司 人***瘤病毒基因分型核酸标记试剂盒及使用方法
CN116042920A (zh) * 2022-12-20 2023-05-02 南京世和基因生物技术股份有限公司 一种基于靶向hpv的***患者治疗后的微小残留病灶的ngs检测方法及试剂盒

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100452163B1 (ko) * 2001-09-14 2004-10-12 주식회사 바이오메드랩 인유두종 바이러스의 감염을 진단하기 위한 유전형 분석키트
WO2003087829A2 (en) * 2002-04-16 2003-10-23 Dot Diagnostics B.V. Human papilloma virus detection with dna microarray
US7670774B2 (en) * 2004-10-04 2010-03-02 Goodgene Inc. Probe of human papillomavirus and DNA chip comprising the same
KR100633525B1 (ko) * 2004-10-04 2006-10-16 굿젠 주식회사 인체유두종바이러스의 프로브, 이를 포함하는올리고뉴클레오티드 마이크로어레이, 진단키트 및 이를이용한 유전자형 분석방법
KR100702415B1 (ko) * 2006-03-03 2007-04-09 안웅식 올리고 핵산 탐침 비드 어레이를 이용한 인유두종바이러스검출 키트 및 방법
JP5302519B2 (ja) * 2007-08-03 2013-10-02 倉敷紡績株式会社 ヒトパピローマウイルスを検出するためのプライマーセット及びプローブ

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
APMIS, Vol. 118, No. 5, pp 346-352 (2010.05.) *
Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc, Vol. 3, pp 1953-1955 (2004.) *
J Phys Chem B, Vol. 105, No. 33, pp 7871-7873 (2001.08.23.) *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101413702B1 (ko) 2012-11-05 2014-07-01 (주)다이오진 이중­다중 역전사 중합효소 연쇄반응에 의한 종양원성 인유두종 바이러스 유형 동정 방법
WO2018084403A1 (ko) * 2016-11-04 2018-05-11 주식회사 퀀타매트릭스 인유두종바이러스 유전자형 검출용 조성물

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