CN101896499B - 使用前胰岛肽及其类似物的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

实施方案涉及表现出提高了的稳定性和效力的前胰岛肽(优选HIP)和使用所述前胰岛肽治疗与受损的胰腺功能相关联的病症(包括1型和2型糖尿病及其症状)的方法。

Description

使用前胰岛肽及其类似物的组合物和方法
相关申请的交叉引用：本申请要求2007年8月30日递交的美国临时申请号60/969019、2007年10月12日递交的美国临时申请号60/979526、2007年12月3日递交的美国临时申请号60/991964和2008年2月26日递交的美国临时申请号61/031479的利益。
政府利益：不适用
联合研究协议的各方：不适用
通过引用在光盘上递交的材料并入：
不适用
背景：不适用
1.领域：不适用
2.相关技术的说明：不适用
简要概述
本文所公开的实施方案提供前胰岛肽的制剂、衍生物和修饰形式及其使用方法，所述制剂、衍生物和修饰形式被设计以提高其溶解度、生物利用度和对蛋白酶切割的血清中抗性，从而改善它们作为治疗剂的有效性。
在一个实施方案中，以N末端的乙酰基基团和C末端的酰胺基团封闭前胰岛肽和其衍生物。
在一个实施方案中，以N末端的乙酰基基团和C末端的酰胺基团封闭HIP和其衍生物(HIP3Blocked(SEQ ID NO：5)、HIP1Blocked(SEQ ID NO：6)和HIP2Blocked(SEQID NO：7))。这样的修饰形式看来使序列比较不易受血清中的由通常识别自由端的那些蛋白酶带来的蛋白酶切割的影响，从而有效地提高所述肽的Tmax和生物利用度。以这种方式修饰的肽表现出提高了的效力，从而在通过例如静脉内的(IV)、肌肉内的(IM)、皮下的或腹膜内的途径给予时需要减少的剂量。
在另一个实施方案中，通过在所述肽的N末端加入半胱氨酸残基来修饰前胰岛肽和其衍生物。
在另一个实施方案中，通过将半胱氨酸残基添加到HIP(HIP3Cys(SEQ ID NO：8)、HIP1Cys(SEQ ID NO：9)和HIP2Cys(SEQ ID NO：10))的C末端来修饰HIP和其衍生物，结果得到能够在溶液中形成二聚物(HIP3CysDimer(SEQ ID NO：11)、HIP1CysDimer(SEQ ID NO：12)和HIP2CysDimer(SEQ ID NO：13))的化合物。这样的修饰形式通过避开识别单体形式中的HIP或HIPCys变异体的那些蛋白酶，看上去提高了HIPCys变异体的稳定性。
在另一个实施方案中，以N末端的乙酰基基团和C末端的酰胺基团封闭半胱氨酸前胰岛肽变异体。
在另一个实施方案中，以N末端的乙酰基和C末端的酰胺基封闭HIPCys变异体(HIP3CysBlocked(SEQ ID NO：14)、HIP1CysBlocked(SEQ ID NO：15)和HIP2CysBlocked(SEQ ID NO：16))。这样的修饰形式看上去使序列比较不易受血清中的由通常识别自由端的那些蛋白酶带来的蛋白酶切割的影响，结果得到能够在溶液中形成二聚物(HIP3CysBlockedDimer(SEQ ID NO：17)、HIP1CysBlockedDimer(SEQ ID NO：18)和HIP2CysBlockedDimer(SEQ ID NO：19))的化合物，从而通过避开那些识别单体形式中的HIP或HIPCysBlocked变异体的蛋白酶，提高HIPCysBlocked变异体的稳定性。
在另一个实施方案中，通过在C末端的半胱氨酸残基上共价结合由二聚马来酰亚胺活化的40Kd PEG结构来修饰所述半胱氨酸前胰岛肽变异体。
在另一个实施方案中，通过在C末端的半胱氨酸残基上共价结合由二聚马来酰亚胺活化的40Kd PEG结构来修饰HIPCys变异体(HIP3CysPEG(SEQ ID NO：20)、HIP1CysPEG(SEQ ID NO：21)和HIP2CysPEG(SEQ ID NO：22))。这样的修饰形式看上去改善了HIPCys在血清中的稳定性，导致在针对体内刺激胰岛新生并且逆转糖尿病的治疗策略中，HIPCys变异体的提高的生物利用度和定量给药效力。
在另一个实施方案中，通过共价结合由二聚马来酰亚胺活化的40Kd PEG结构来修饰所述CysBlocked前胰岛肽变异体。
在另一个实施方案中，通过共价结合由二聚马来酰亚胺活化的40Kd PEG结构来修饰HIPCysBlocked变异体(HIP3CysBlockedPEG(SEQ ID NO：23)、HIP1CysBlockedPEG(SEQIDNO：24)和HIP2CysBlockedPEG(SEQ IDNO：25))。这样的修饰形式看上去改善了HIPCysBlocked变异体在血清中的稳定性，导致在针对体内刺激胰岛新生并且逆转糖尿病的治疗策略中，HIPCysBlocked变异体的提高的生物利用度和定量给药效力。
进一步的实施方案提供给予优化的前胰岛肽化合物的方法，所述优化的前胰岛肽化合物包括单独的或与其他用于刺激胰岛细胞新生的治疗剂组合的优化的HIP(SEQ ID NO：5-25)。在各种实施方案中，本文所公开的方法可以通过治疗有效量的单独的、与胰岛素组合的、与胰岛素和另一种试剂组合的，以及与除胰岛素外的一种或更多种试剂组合的优化的前胰岛肽的给予来实施。
其他的实施方案提供优化的前胰岛肽化合物(包括优化的HIP)的药物制剂和单位剂型。在一个实施方案中，所提供的药物制剂含有单独的或与一种或更多种其他活性药物成分(APIs)组合的优化的HIP。在一个实施方案中，所述API为在可溶性脂质体制备剂中的一种或更多种试剂，所述可溶性脂质体制备剂允许优化的HIP通过多种途径被给予，包括通过皮下、肌肉内、静脉内以及甚至通过口腔，取决于所选择的剂型。在一个实施方案中，所述制剂用于一般的全身给予，但是在其他实施方案中，所述制剂包含用于对受试者内特定部位、受体、细胞、组织、器官或器官***靶向的给予的靶向试剂。
在其他实施方案中，所提供的是在需要这样的治疗的受试者中治疗与受损的胰腺功能相关联的病症(pathology)的方法。所述方法可以包括以下步骤：除所述优化的前胰岛肽化合物(包括优化的HIP)之外，给予一种或更多种用于刺激胰岛细胞再生的试剂。在本实施方案的一个方面，所述试剂选自除优化的HIP之外的HIP或与HIP相关的肽、胰淀素/普兰林肽(SYMLINTM)、exendin-4(EXENATIDETM)、GIP、GLP-1、GLP-1受体激动剂、GLP-1类似物、仓鼠INGAP肽和相关的肽、利拉鲁肽(NN2211)和阻滞GLP-1的降解的二肽基肽酶抑制剂。
在另一个实施方案中，提供在需要这样的治疗的受试者中的治疗与受损的胰腺功能相关联的病症的方法。所述方法可以包括以下步骤的一个或更多个：(1)强化糖血控制；(2)给予口服维生素D3(胆骨化醇)或维生素D2(麦角骨化醇)，以维持25-羟基维生素水平在40ng/mL以上；(3)给予一种或更多种用于保护新胰岛细胞形成的免疫治疗，包括给予免疫抑制试剂；(4)给予优化的前胰岛肽化合物，包括与胰岛素组合的优化的HIP，但是随时间推移减少胰岛素的给予；以及(5)除给予优化的HIP的步骤之外，重复地给予用于保护胰岛的治疗，优选3到24个月，取决于所选择的免疫治疗。
在另一个实施方案中，提供在需要这样的治疗的受试者中治疗与受损的胰腺功能相关联的病症的方法。所述方法可以包括以下步骤的一个或更多个：(1)强化糖血控制；(2)给予口服维生素D3(胆骨化醇)以维持25-羟基维生素水平在40ng/mL以上；(3)除优化的前胰岛肽化合物(包括优化的HIP)之外，给予用于刺激胰岛再生的试剂，包括但不限于不同于优化的HIP的HIP和HIP类似物；(4)同时给予选自由胰淀素/普兰林肽(SYMLINTM)、exendin-4(EXENATIDETM；BYETTATM)、促胃液素、上皮生长因子和上皮生长因子类似物GIP、GLP-1、GLP-1受体激动剂、GLP-1类似物、INGAP、利拉鲁肽(NN2211)、和阻滞GLP-1的降解的二肽基肽酶抑制剂组成的组的试剂；以及(5)减少或逐渐减少另一种糖尿病治疗的给予。
在另一个实施方案中，提供在需要这样的治疗的受试者中治疗与受损的胰腺功能相关联的病症的方法。所述方法除给予优化的前胰岛肽化合物(包括优化的HIP)之外还可以包括以下步骤：给予一种或更多种抑制、阻滞或破坏靶向于胰岛的自身免疫细胞的试剂。这样的治疗在上文称为“免疫治疗”。在本实施方案的各个方面，所述抑制，阻滞或破坏靶向于胰岛的自身免疫细胞的试剂选自由以下单独给出或互相组合而组成的组：包括hOKT3γ1(Ala-Ala)的抗CD-3抗体(teplizumab)；靶向于免疫应答且特异地阻滞在1型糖尿病中造成B细胞死亡的T淋巴细胞的ChAglyCD3；细胞毒性的T淋巴细胞抗原4，CLTA-4 Ig(阿巴西普(Abatacept))；单独的或与他克莫司(FK506)或者IL-2(雷帕鸣)组合的西罗莫司(雷帕霉素)；单独的或与普留净(阿地白介素)组合的雷帕鸣；热激蛋白60(Diapep277)；抗谷氨酸脱羧酶65(GAD65)疫苗；糖尿病抑制性树突状细胞疫苗，GSK189075，包括用做保持β细胞功能的阿托伐他汀的二氮嗪和他汀类药物，单独的或与达利珠单抗(Daclizumab)组合的霉酚酸酯；抗CD20试剂，利妥昔单抗；Campath-1H(抗CD52抗体)，利索茶碱(lysofylline)；多克隆抗T淋巴细胞球蛋白(ATG/Thymoglobulin)，粒细胞集落刺激因子，Neulasta(聚乙二醇化非格司亭)，维生素D，25-羟基和1，25-羟基维生素D补充物二者；IBC-VSO疫苗，所述疫苗为胰岛素的旨在防止胰腺β细胞受损的合成的代谢非活性形式；干扰素α；使用CD4+CD25+抗原特异调节性T细胞或为抑制对郎格罕氏岛内的β细胞的免疫攻击而设计的任一种或多种试剂的疫苗，Prochymal(人类成年干细胞)，抗炎的Ankinra和抗炎试剂，去氧精胍啉(Deoxyspergualin)，阻滞促炎症细胞因子产生和抑制T细胞与B细胞的抗炎剂。这些或类似的试剂可以用于直接利用调节性T细胞或通过免疫治疗的使用的组合疗法，以阻止产生胰岛素的细胞的毁灭。
在另一个实施方案中，提供在需要这样的治疗的受试者中治疗与受损的胰腺功能相关联的病症的方法，其中所述与受损的胰腺功能相关联的病症的至少一个症状由于优化的前胰岛肽化合物(包括优化的HIP)的给予而被医治或减轻。在本实施方案的一个方面，所述症状选自低水平的胰岛素或胰岛素活性、胰岛素抵抗、高血糖、血红素A1C水平大于6.0％、小便频繁、烦渴、善饥、不正常的体重减轻或增加、超重、加重的疲劳、易怒、视力模糊、生殖器官瘙痒、奇怪的疼和痛、口腔干燥、皮肤干燥或瘙痒、阳萎、***酵母菌感染、割伤和擦伤愈合不良、过度的或不正常的感染、糖血控制损失或恶化、血糖波动、血液胰高血糖素波动、和血液甘油三酸酯波动，与高血糖一起最终导致微血管的和大血管的并发症，所述并发症包括导致失明的视力症状，加速的肾损伤，所述加速肾损伤可能导致需要透析的肾衰竭和肾移植，以及导致足溃疡和截肢的神经病。此外最近的研究已证明在具有改善的糖血控制的1型糖尿病患者中微血管的和大血管/心血管两者风险的降低。
在另一个实施方案中，提供在需要这样的治疗的受试者中治疗与受损的胰腺功能相关联的病症的方法。所述与受损的胰腺功能相关联的病症为1型糖尿病、新发1型糖尿病、2型糖尿病、成人隐匿性自身免疫性糖尿病、前驱糖尿病、空腹血糖受损、糖耐量低减、胰岛素抵抗综合症、代谢综合症/代谢障碍综合症、超重、肥胖症、高脂血症、高甘油三酯血症、饮食失调症、无***周期和多囊卵巢综合症任一。
本公开的实施方案还提供选择性地结合于优化的前胰岛肽化合物(包括优化的HIP)的抗体。在一个实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。在另一个实施方案中，所述抗体为多克隆抗体。这样的抗体可以用于本文提供的诊断方法，所述方法包括在哺乳动物的血清或组织中检测优化的HIP水平。在一个实施方案中，所述诊断方法用于监控使用优化的HIP的治疗，以确保接收该治疗的患者体内达到了治疗有效水平。
本公开的实施方案还提供用于治疗具有1型糖尿病或2型糖尿病或其他具有异常的胰岛素水平、葡萄糖代谢扰动(perturbation)或胰岛素抵抗的病况的患者的试剂盒，以及关于试剂盒使用的说明，所述试剂盒包括在同一包装内或分别包装的治疗有效剂量的优化的前胰岛肽化合物(包括优化的HIP)以及可选的至少一个试剂，所述试剂用于刺激GLP-1受体或增强GLP-1水平，促进β细胞再生，促进提高饱腹感，促进减少食物摄入以及促进减少体重，。进一步的实施方案提供用于测量样品中优化的前胰岛肽化合物(包括优化的HIP)水平的试剂盒，所述试剂盒包括优化的前胰岛肽的抗体(包括优化的HIP的特异抗体)以及可选地包括优化的前胰岛肽化合物(包括优化的HIP)以及可选地包括标记手段。
附图说明
本专利的文件含有至少一个以彩色制作的照片或附图。根据请求以及缴纳必需的费用，专利和商标局将提供本专利的带有彩色附图或照片的副本。
为了更全面地理解本发明的本质和优点，应该参考以下与附图相联系的详细描述，其中：
图1是描绘在与具HIP1、HIP2和HIP3的人胰腺导管组织一起培养的孵育(incubation)之后的胰岛素水平的图。
图2是描绘在用HIP1、HIP2和HIP3处理的小鼠的胰岛素需求的图。
图3是描绘在用HIP1、HIP2和HIP3处理的小鼠中的葡萄糖从基线起的平均减少的图。
图4A是描绘在用HIP1、HIP2和HIP3处理的小鼠中的胰岛数目的图。图4B提供用安慰剂和用HIP处理的小鼠的胰岛素免疫染色的代表性的图像，并且胰岛素着色的胰岛以黄色勾勒出轮廓，以区别这些结构和自发荧光血细胞。在所有图像中图解比例尺为50μm。
图5是在用HIP处理过的小鼠胰腺组织上的针对胰岛素的免疫荧光染色。
图6是描绘大鼠中肌肉内递送的HIP的半衰期的图。
图7是描绘皮下递送至大鼠的HIP的半衰期的图。
图8是描绘血浆中的HIP2和HIP2B的体外稳定性随时间推移的图。
图9A是展示在非还原和还原条件下响应于与各种HIP和优化的HIP的共同孵育的来自PANC-1细胞的人类胰岛素表达的蛋白质印迹分析(Western Blot analysis)。图9B是在非还原和还原条件下响应于与各种HIP和优化的HIP的共同孵育的丽春红染色(PonceauStain)。
图10A展示用HIP2和优化的HIP肽处理四天的PANC-1细胞，以200倍放大的拍摄于第7天的图片。图10B展示在7天内PANC-1细胞形态变化的进程(对照、HIP2和HIP2B)，使用以200倍放大拍摄于第1、2、3、5和7天的图片。图10C展示用对照和优化的HIP(HIP2二聚物和HIP2 PEG)处理的PANC-1细胞的形态变化的进程。
图11为针对CK19和DAPI的染色，以显示在HIP2B的给予之后在人类胰腺细胞中的细胞核和胰岛素。
图12是描绘在用安慰剂和利索茶碱(LSF)、HIP2和LSF、以及HIP2B和LSF处理之后的三个NOD小鼠葡萄糖水平的图。
图13是PANC-1细胞在用150μM HIP和优化的HIP肽处理48小时后的Cy3双抗体免疫组织化学染色，证实在用HIP和优化的HIP刺激时HIP受体从PANC-1细胞的细胞膜至细胞质的迁移。
图14展示了在SFM和TSFM中用HIP和优化的HIP2B肽通过曝光调整的PANC-1细胞。
图15展示利用免疫荧光分析对优化的HIP2肽在PANC-1细胞上的影响的重复评估，分析表明HIP2B与HIP受体(EXTL)相互作用，导致在用HIP刺激时HIP受体从细胞质膜进入细胞质到达细胞核。
图16展示优化的HIP2B增强了HIP受体(EXTL3)在PANC-1细胞中从细胞质膜向细胞核的迁移时间的蛋白质印迹。
图17是描绘在STZ-糖尿病小鼠模型中，给予HIP2、HIP2B和安慰剂之后的平均每日葡萄糖水平的图。
图18是描绘在用HIP2B处理的组(绿色)和对照组(紫色)以及安慰剂组的小鼠间每日葡萄糖水平的图。
图19是描绘在干预的开始和结束时在用HIP2B(黄色)、用HIP2(绿色)和用对照(蓝色)处理组的小鼠的间葡萄糖水平的图。
图20展示优化的HIP2B将空腹葡萄糖水平恢复至非糖尿病范围及恢复至低于在STZ处理之前的基线葡萄糖水平的影响。
图21展示在本研究结束时在处理组之间的葡萄糖耐量试验的结果，其中在所述优化的HIP2B处理组中看到较低的葡萄糖水平。
图22展示当在小鼠的糖尿病模型中以不同的剂量递送时，在STZ引起的糖尿病小鼠中优化的HIP2B的剂量响应分析研究，比较优化的HIP2B在葡萄糖控制上的效果，以确定产生最大效力的最低潜在剂量。
图23描绘了HIP2B的不同的浓度对糖尿病减轻的影响。
图24描绘了在向斯普拉格-道利大鼠以4mg/kg经皮下和静脉内给予后，HIP2B、HIP2和INGAP的药物动力学分析。
图25描绘对经皮下递送的优化的HIP2B的药物动力学分析。
发明的详细描述
在描述本发明的组合物和方法之前，应当理解本发明并非限于所描述的特定的过程、组合物或方法学，因为这些可以变化。还应当理解本说明书中所用的术语仅为了描述具体的形式或实施方案的目的，而非意图限定本发明的范围，本发明的范围将仅仅由所附的权利要求来限定。除非有不同的定义，本文所用的所有的技术和科学术语都具有与本领域的一般技术人员所普遍理解的含义相同的含义。虽然任何与本文所描述的方法和材料相似或等效的方法和材料都可以用于本发明的实施方案的实践或测试，现在描述优选的方法，装置和材料。本文提到的所有出版物通过引用被整体并入本文。本文中不应被解释为由于在先发明，而使本发明无权先于这些公开。
胰岛素从1922年起就已是用于治疗1型糖尿病和其他与胰岛素缺乏或效力减弱或产生量减低相关的病况的主要(如果不是唯一可用的)治疗。然而，施用胰岛素的糖尿病患者不具有正常的葡萄糖代谢，因为胰岛素问题仅是缺失和异常的胰腺功能的一部分。
迄今为止，还没有已被成功用于应对1型糖尿病或2型糖尿病的基本疾病机理的单独或组合的疗法。刺激胰腺内产生胰岛素的细胞的再生的疗法的成功开发，将表明对于糖尿病患者的重大治疗突破。一些文献误导性地使用术语“胰岛细胞”(islet cell)以指代仅β细胞或全部胰岛。然而，区分β细胞和胰岛是重要的，因为一些治疗选择寻求β细胞数目的增加，但是除了胰岛移植外，还没有治疗可用于内源地替代整个胰岛。
虽然经过几十年的研究，并且1974年出现胰岛移植，以及由针对胰岛移植的埃德蒙顿方案(Edmonton Protocol)而更新地声称成功，这些方法在美国已不是非常成功的。例如，在移植四年后，接受胰岛移植的患者中的少于10％保持胰岛素的自力更生。此外严重的副作用的比率为18％。可以十分肯定，在1型糖尿病发作(onset)时，患者已经失去了他们的胰岛的大部分，并且他们的胰岛数目继续逐渐减少。然而，最近的研究已发现，在诊断2型糖尿病时，患者表现出损失了胰岛质量和数目的至少50％。对于1型糖尿病患者，胰岛的数目和质量继续减少，这并非由于自身免疫性攻击，而是因为β细胞有效地“燃烧殆尽”。虽然这种减少在1型患者身上发生得更快，在2型患者中也以每年10-20％减少。
在正常功能的胰腺中，少量的胰岛逐日自然死亡，并且根据需要被替换，以保持葡萄糖水平在控制中。被称为胰岛新生的这个再生过程以平均每月近似于2％的速率替换胰岛。在非糖尿病患者中，现存胰岛中β细胞的质量可以取决于个人的胰岛素需求而增大或减少。这个过程称为“β细胞增殖”，不发生在1型糖尿病患者中，并在2型患者中受到限制。
对胰岛新生的研究并非近来开始的。1920年，有报道称阻塞性的胰腺结石使胰腺的的大部分萎缩，但是使胰岛增大。然后有人猜测，扎上(绑上)胰腺导管可能导致识别出可能能够用于治疗糖尿病的物质。外科医生扎上糖尿病儿童的胰腺导管，希望产生将形成新胰岛的物质。虽然这些手法(precedure)的积极效果短暂，它们证实了在人体内进行胰岛修复的潜在可能。
意图为胰脏炎构建仓鼠模型的胰腺导管绑扎法研究导致形成许多新的胰岛。这个研究导致被称为胰岛新生关联肽(Islet Neogenesis Associated Pipetide，或INGAP)的仓鼠肽的分离，。在INGAP的临床开发中，进一步证实了新的人类胰岛能够从类似干细胞的胰岛祖细胞中分化出来，所述胰岛祖细胞甚至在1型糖尿病发作之后几十年仍遍布成人胰腺。
除了使用导管绑扎法以生产新胰岛的想法外，还进行了关于在怀孕期间潜在的胰岛再生的研究。已有报道说，胰岛在胚胎形成后期被形成，并且声称胰岛群体(population)在出生后通过从周围的导管组织的***过程继续生长。
在1型或晚期2型糖尿病患者中控制他们的疾病的主要方式是通过给予胰岛素，或通过皮下注射或通过使用皮下输注泵。除了明显的生活方式的缺点之外，胰岛素疗法也与身体的正常的控制机制不相匹配，并且因此并不完全掌控(manage)葡萄糖波动。如邻近的图表所示，甚至控制地最好的1型糖尿病患者也与正常的葡萄糖代谢没有任何相似之处。这是因为胰岛素分泌仅是缺失的胰腺功能的一部分。
研究人员已经评估了是否可以通过药物治疗刺激胰岛素的内源产生。例如，在过去的几十年间，已经研究了几种疗法，其中参与葡萄糖代谢的肽或这样的肽的类似物被给予糖尿病患者。这些疗法包括给予具有与类胰高血糖素肽-1(GLP-1)的氨基酸序列相似的氨基酸序列的肽，并且这样的肽包括：GLP-1受体类似物、Exendin-4、来源于希拉毒蜥的Exenatide/BYETTATM、JanuviaTM、抑胃肽/葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)、与GLP-1同源的化合物，例如利拉鲁肽(NN2211)、抑制GLP-1分解的二肽基肽酶-4抑制剂、促胃液素、上皮生长因子和上皮生长因子类似物，以及来源于仓鼠的胰岛新生关联肽(INGAP)。
这些治疗都不能被证明在逆转糖尿病的基本机制上为有效。新胰岛的生成不仅形成产生胰岛素的β细胞，还形成参与葡萄糖代谢的其他细胞。因此，如果生成足够的新胰岛，患者最终能够复原糖血控制。因此，胰岛新生不仅呈现了治疗糖尿病的可能性，而且实际上呈现了逆转糖尿病的可能性。
为使任何胰岛细胞再生试剂有效，胰腺在其生成新胰岛细胞的能力方面必须为“弹性的”。贯穿人的一生的响应于胰岛死亡或凋亡的新胰岛的生成与胰腺的弹性相关的证据已取代了长期坚持的观念，即产生胰岛素的胰岛结构的数目在出生时为固定的并且在人的一生中被保持，但是β细胞在现存胰岛中增殖的弹性和能力已经被充分地确定。目前被接受的是，胰岛新生从预先存在的胰腺细胞通过在胰腺的内分泌和外分泌部分都被发现的祖细胞的分化发生。数据显示，甚至在1型糖尿病发作后，胰岛可以被再生。
例如，1型糖尿病患者在怀孕期间能够具有C-肽的正常水平。一些团队已发现，所有怀孕的1型患者的高达三分之一之中，在怀孕的第一个三个月期间，其C-肽水平具有反常的升高并升高至正常的范围。C-肽的这样的升高伴随胰岛素需求的显著减少，即一些患者能够在怀孕的第一个三个月期间暂时停用胰岛素。患者中怀孕期间C-肽的这样的升高发生于开始怀孕后10个星期之内，尽管在怀孕之前没有可测量的C-肽，意味这对起作用的胰岛结构的修复。假设，发生在怀孕期间的胰岛新生的原因是内源类固醇产生的相伴随的提高和防止对胎儿的免疫攻击的免疫体系的下调，所述下调还可能在对胰岛的淋巴细胞攻击的抑制上起作用。随同免疫抑制一起，还推测在怀孕期间具有母亲体内胰岛生长促进因子的上调，以补偿怀孕中母亲体内葡萄糖调定点(setpoint)的降低。动物模型也已证实在怀孕期间胰岛新生发生于β细胞扩增的发育之前，并且已证实人胰腺祖细胞分化成为胰岛。相似地，曾经为了肾移植而进行长期免疫抑制的患者已被观察到有生产胰岛素的胰岛的再生。
在过去的十年中，已经进行临床试验来评估许多可以阻止胰腺的β细胞的毁灭的免疫调节物的影响。抗CD-3抗体，例如靶向于免疫应答并且特异地阻滞在1型糖尿病中引起β细胞死亡的T淋巴细胞的hOKT3γ1(Ala-Ala)和ChAglyCD3，已为了这个目的而被使用，如涉及以下物质的给予的治疗：西罗莫司(雷帕霉素)、他克莫司(FK506)、热激蛋白60(DIAPEP277TM)、抗谷氨酸脱羧酶65(GAD65)疫苗、单独或与达利珠单抗结合使用的霉酚酸酯、抗CD20试剂、多克隆抗T淋巴细胞球蛋白(ATG)、利索茶碱、利妥昔单抗、Campath-1H(抗CD52抗体)、维生素D、IBC-VSO疫苗，所述IBC-VSO疫苗为胰岛素的合成的代谢非活性形式，被设计以防止胰腺β细胞毁灭，以及使用CD4+CD25+抗原特异调节性T细胞的干扰素α接种疫苗。这些治疗方法意图直接使用或通过使用免疫治疗来利用调节性T细胞，以阻止产生胰岛素的细胞的毁灭。这些试验的目的是为了确定这样的试剂通过防止对胰腺的胰岛的β细胞的进一步免疫攻击来保持胰岛功能的能力。
此外最近的研究已发现维生素D可以在防止1型糖尿病中发挥重要的免疫调节作用。直到54.7％的美国人口，无论在何纬度，具有低25-羟基维生素D水平。维生素D缺乏已被证实不仅与1型糖尿病的提高的风险相关联并见于1型糖尿病的发作，而且还普遍见于1型和2型糖尿病两种患者中。推荐保持在40ng/mL以上的水平，以维持正常的免疫功能。对于高达10,000IU/天的剂量，未见不利影响。
提供以下定义以辅助读者。除非有不同的定义，本文所用的所有专业术语，符号和其他科学或医学术语或用辞都意图具有化学和医学领域的技术人员所普遍理解的含义。在一些情况下，具有普遍理解的含义的术语为了清楚和/或容易地参考的目的在本文中被定义，并且本文中对这样的定义的包含应该不必需被解释为表明与本领域中通常理解的术语的定义有本质上的不同。
还必须注意，如在本文和所附的权利要求中所用的，单数形式“一(a)”，“一(an)”和“所述(the)”包括复数的含义，除非内容中明确地说明不是这样。所以，例如，“纤维原细胞”的含义为一个或更多个纤维原细胞和本领域的技术人员所知的其等效的含义，等等。
如本文所用，术语“约”意思是正在被使用的数的数值的正或负10％。因此，约50％意思是在45％-55％范围内。如本文所用，“前胰岛肽”是指刺激胰岛细胞新生的蛋白质或衍生自这样的蛋白质的肽，包括但不限于人类REG3A(SEQ ID NO：1)、人类REG3G(SEQ IDNO：28)、人类REG1A、人类REG1B、人类REG4、仓鼠INGAP(SEQ ID NO：27)、仓鼠REG2、仓鼠REG3G、大鼠REG1、大鼠PAP/REG3B、大鼠PAP3、大鼠REG3G、小鼠REG1、小鼠REG2、小鼠REG3A、小鼠REG3B、小鼠REG3G、小鼠REG3S、小鼠REG4、牛PTP、黑猩猩、牛、狗、羊和这样的蛋白质的类似蛋白和同源蛋白，以及衍生自这样的蛋白质或其同源蛋白的肽段。这样的前胰岛肽的蛋白质序列为公众可用的。前胰岛肽还包括含有HIP2的活性的十四个氨基酸序列(或每个同源蛋白的相应序列)(见下表1)，并且是少于150个氨基酸、少于125个氨基酸、少于个100氨基酸、少于75个氨基酸、少于50个氨基酸或少于25个氨基酸的REG3A、INGAP或同源蛋白质的片段的肽。这样的肽(提供活性的十四个氨基酸序列)的例子包括但不限于以下：
Figure GPA00001123003700101
Figure GPA00001123003700111
这样的肽段包括但不限于HIP1、HIP2、HIP3、INGAP肽(SEQ ID NO：26)和其同源物，如以下识别的。在人体内已发现与大鼠基因相似的人类基因，被称为Reg基因，并且根据该基因在人类中发现HIP，以及人类和其他哺乳动物的物种的前胰岛肽的种类之间的高度的相似性。以下物种相似性图表显示与HIP相关的序列在进化过程中被精密地保持。有可能的是，这些序列的每个都将对人类有一些效力，但是没有任何一个与人类的HIP活性序列精确地匹配。
物种同源性
Figure GPA00001123003700121
上面的表格将含有所述十四个氨基酸的HIP2序列的人类肽的十六氨基酸延长物(stretch)与其他物种的进行比较。
Figure GPA00001123003700131
如本文所用，“优化的前胰岛肽”是指前胰岛肽的变体，包括但不限于人类REG3A、人类REG3G、人类REG1A、人类REG1B、人类REG4、仓鼠INGAP、仓鼠REG2、仓鼠REG3G、大鼠REG1、大鼠PAP/REG3B、大鼠PAP3、大鼠REG3G、小鼠REG1、小鼠REG2、小鼠REG3A、小鼠REG3B、小鼠REG3G、小鼠REG3S、小鼠REG4、牛PTP、黑猩猩、牛、狗、绵羊和这样的蛋白质的类似物和同源物，以及衍生自这样的蛋白质或其同源物，HIP1、HIP2和/或HIP3的肽片段，或这样的肽(SEQ ID NOs：31-90)的同源物，其中所述肽已被修饰以提高这样的肽的稳定性，溶解度或生物利用度，如在各个实施方案中所描述的。为了本公开的目的，稳定性是指所述肽对被血清中的蛋白酶降解的抵抗性，所述蛋白酶靶向且降解非优化的前胰岛肽、REG3A、REG3G、INGAP、REG3G肽、INGAP肽、HIP1、HIP2和/或HIP3或这样的肽的同源物。同样，为了本公开的目的，生物利用度是指针对体内治疗应用可利用的肽的量，所述体内治疗应用是由靶细胞、通路和/或基于所述肽避免被蛋白酶降解的能力的***机制，以及其他降解非优化的前胰岛肽，人类REG3A，人类REG3G，人类REG1A，人类REG1B，人类REG4，仓鼠INGAP，仓鼠REG2，仓鼠REG3G，大鼠REG1，大鼠PAP/REG3B，大鼠PAP3，大鼠REG3G，小鼠REG1，小鼠REG2，小鼠REG3A，小鼠REG3B，小鼠REG3G，小鼠REG3S，小鼠REG4，牛PTP，黑猩猩，牛，狗，绵羊和这样的蛋白质的类似物和同源物，HIP1，HIP2和/或HIP3或这样的肽的同源物的***通路的应用。优选地，优化的前胰岛肽是指通过添加C末端的酰胺基团和N末端的乙酰基基团、PEG化和其组合被封闭的REG3G肽、INGAP肽、HIP3、HIP1和/或HIP2或同源物。
如本文所用，“优化的HIP”是指HIP、HIP1和/或HIP2的变体，其中所述肽已被修饰以增加HIP、HIP1或HIP2的稳定性、溶解度或生物利用度，如本文的实施方案所描述的。为了本公开的目的，稳定性是指所述肽对被血清中的靶向于且降解非优化的HIP3、HIP1和/或HIP2的蛋白酶的降解的抗性。同样，为了本公开的目的，生物利用度是指针对体内治疗应用可利用的肽的量，所述体内治疗应用是由靶细胞、通路和/或基于所述肽避免被蛋白酶降解的能力的***机制，以及其他降解非优化的HIP3、HIP1和/或HIP2的***通路的应用。优选地，优化的HIP是指通过添加C末端的酰胺基团和N末端的乙酰基基团、PEG化和其组合被封闭的HIP3、HIP1和/或HIP2。
如本文所用，“治疗”病况或患者是指采取步骤以获得有益的或期望的结果，包括临床结果。为了本公开的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于糖尿病的一种或更多种症状的缓解或改进、疾病的程度的削弱、疾病的进程的延迟或减慢、病情的改进、缓和或稳定化，以及以下描述的其他有益的结果。糖尿病的症状包括低的或不足的胰岛素水平或胰岛素活性、小便频繁、烦渴、善饥、不正常的体重减轻、加重的疲劳、易怒、视力模糊、生殖器官瘙痒、奇怪的疼和痛、口腔干燥、皮肤干燥或瘙痒、阳萎、***酵母菌感染、割伤和擦伤愈合不良、过度的或不正常的感染、高血糖、糖血控制损失、餐后血糖波动、血液胰高血糖素波动、血液甘油三酸酯波动。糖尿病可以通过本领域的一般技术人员所周知的方法被诊断。例如，普遍地，糖尿病具有大于126mg/dL葡萄糖的血浆血糖结果。前驱糖尿病，也可以使用本文所公开的组合物和方法治疗，普遍地在具有在100和125mg/dL葡萄糖之间的血糖水平的患者中被诊断。其他症状也可以用于诊断糖尿病、相关的疾病和病况，以及受减弱的胰腺功能影响的疾病和病况。
如本文所用，一个症状或更多个症状的“减少”(以及与本短语在语法上等效的表述)意思是降低所述一个症状或更多个症状的严重度或频率的，或所述一个症状或更多个症状的消除。
术语“抑制”包括给予本公开的化合物，以防止所述症状的发作，缓解所述症状，或消除所述疾病、病况或失调。
如本文所用，“与受损的胰腺功能相关联的病症”是这样的病症，其中所述病症与受试者中针对所述受试者产生和/或分泌激素和/或细胞因子的胰腺的削弱的能力相关联。优选地，该激素或细胞因子为胰岛素。与受损的胰腺功能相关联的病症包括1型糖尿病、新发1型糖尿病、2型糖尿病、成人隐匿性自身免疫性糖尿病、前驱糖尿病、空腹血糖受损、糖耐量低减、胰岛素抵抗综合症、代谢综合症、超重、肥胖症、高脂血症、高甘油三酯血症、饮食失调症和多囊卵巢综合症。
如本文所用，向受试者“给予”药物或治疗或者药物或治疗的“给予”(以及与本短语在语法上等效的表述)包括直接给予(包括直接向作为靶的组织中或上的自给予，或向受试者给予治疗，由此所述治疗积极地影响靶组织)，以及间接给予(包括开出药物的处方的行为)二者。例如，如本文所用，指导患者进行自给予药物和/或提供患者药物处方的医师是正在将药物给予患者。
如本文所用，“受试者”或“患者”为哺乳动物，典型地为人类，但是可选地为有兽医学上重要性的哺乳类动物，包括但不限于马、牛、绵羊、狗和猫。
如本文所用，疾病的“体现”是指患有所述疾病的受试者的症状、征兆、解剖学状态(例如胰岛细胞的缺失)、生理学状态(例如葡萄糖水平)、或报告(例如甘油三酸酯水平)特征。
如本文所用，药物或试剂的“治疗有效量”为，当药物或试剂被给予具有疾病或病况的受试者时，将具有所意图的治疗效果(例如受试者中的疾病或病况的一种或更多种体现的缓解、改善、缓和/或消除)的药物或试剂的量。完全的治疗效果不一定通过一个剂量的给予发生，而是可能仅在一系列剂量的给予之后才发生。所以，治疗有效量可以在一次或更多次给予中被给予。
如本文所用，药物的“预防有效量”为，当被给予受试者时，将具有所意图的预防效果，例如，防止或延迟疾病或症状的发作(或重复发作)，或减少疾病或症状发作(或重复发作)的可能性的药物的量。完全的预防效果不一定通过一个剂量的给予发生，而是可能仅在一系列剂量的给予之后才发生。所以，预防有效量可以在一次或更多次给予中被给予。
“药学上可接受的”的意思是载体、稀释剂或赋形剂必须与所述制剂的其他成分配伍并且不对它们的接收者有害。
如本文所用，“TID”、“QD”和“QHS”分别具有它们的平常含义“每天3次”、“每天1次”和“睡前1次”。
试剂给予的“与......组合”包括平行给予(在一段时间内将两种试剂共同给予患者，例如，在一个月内交替的日给予单克隆抗体和肽激素，例如肠促胰岛素激素或类似物)、共同给予(其中所述试剂在大致相同的时间被给予，例如，彼此相隔约几分钟至几小时)、和共同制剂(其中所述试剂被组合或复合成为适合于通过口服，皮下或非肠道给予的单个剂型)。
“DPP-4抑制剂”为二肽基肽酶-4抑制剂。
“仓鼠INGAP”为非人类胰岛新生关联肽，具有序列Ile-Gly-Leu-His-Asp-Pro-Ser-His-Gly-Thr-Leu-Pro-Asn-Gly-Ser(SEQ ID NO：26)。这个肽为具有序列Ile-Gly-Leu-His-Asp-Pro-Ser-His-Gly-Thr-Leu-Pro-Asn-Gly-Ser(SEQ ID NO：27)的仓鼠INGAP蛋白质的片段。
“GIP”为抑胃肽，还被称为葡萄糖依赖性促胰岛素多肽。
“GLP-1”为高血糖素样肽-1。
“HIP3”(Ile-Gly-Leu-His-Asp-Pro-Thr-Gln-Gly-Thr-Glu-Pro-Asn-Gly-Glu)(SEQ IDNO：2)为提纯形式、合成形式或重组形式的人类前胰岛肽。HIP3具有约1564.6的分子量。
“HIP1”(Trp-Ile-Gly-Leu-His-Asp-Pro-Thr-Gln-Gly-Thr-Glu-Pro-Asn-Gly)(SEQ ID NO：3)为提纯形式、合成形式或重组形式的人类前胰岛肽。
“HIP2”(Ile-Gly-Leu-His-Asp-Pro-Thr-Gln-Gly-Thr-Glu-Pro-Asn-Gly)(SEQ ID NO：4)为提纯形式、合成形式或重组形式的人类前胰岛肽。HIP2具有约1435.5的分子量。
HIP3Blocked或HIP3B(Ac-Ile-Gly-Leu-His-Asp-Pro-Thr-Gln-Gly-Thr-Glu-Pro-Asn-Gly-Glu-NH2)(SEQ IDNO：5)为提纯形式、合成形式或重组形式的由N末端的乙酰基基团和C末端的酰胺基团封闭的人类前胰岛肽。HIPB具有约1605.7的分子量。
HIP1Blocked(Ac-Trp-Ile-Gly-Leu-His-Asp-Pro-Thr-Gln-Gly-Thr-Glu-Pro-Asn-Gly-NH2)(SEQ ID NO：6)为提纯形式、合成形式或重组形式的由N末端的乙酰基基团和C末端的酰胺基团封闭的人类前胰岛肽。
HIP2Blocked或HIP2B(Ac-Ile-Gly-Leu-His-Asp-Pro-Thr-Gln-Gly-Thr-Glu-Pro-Asn-Gly-NH2)(SEQ ID NO：7)为提纯形式、合成形式或重组形式的由N末端的乙酰基基团和C末端的酰胺基团封闭的人类前胰岛肽。HIP2B具有约1476.6的分子量。
INGAP PeptideBlocked或INGAPB为提纯形式、合成形式或重组形式的由N末端的乙酰基基团和C末端的酰胺基团封闭的INGAP肽。
HIP3Cys(Ile-Gly-Leu-His-Asp-Pro-Thr-Gln-Gly-Thr-Glu-Pro-Asn-Gly-Glu-Cys)(SEQID NO：8)为提纯形式、合成形式或重组形式的具有附加的C末端半胱氨酸残基的人类前胰岛肽。
HIP1Cys(Trp-Ile-Gly-Leu-His-Asp-Pro-Thr-Gln-Gly-Thr-Glu-Pro-Asn-Gly-Cys)(SEQID NO：9)为提纯形式、合成形式或重组形式的具有附加的C末端半胱氨酸残基的人类前胰岛肽。
HIP2Cys(Ile-Gly-Leu-His-Asp-Pro-Thr-Gln-Gly-Thr-Glu-Pro-Asn-Gly-Cys)(SEQ IDNO：10)为提纯形式、合成形式或重组形式的具有附加的C末端半胱氨酸残基的人类前胰岛肽。
INGAP PeptideCys或INGAPCys为提纯形式、合成形式或重组形式的具有附加的C末端半胱氨酸残基的INGAP肽。
HIP3CysDimer(Ile-Gly-Leu-His-Asp-Pro-Thr-Gln-Gly-Thr-Glu-Pro-Asn-Gly-Cys)2(SEQID NO：11)为提纯形式、合成形式或重组形式的人类前胰岛肽二聚物，其中每个单体已被修饰以含有C末端半胱氨酸残基。所述二聚物通过在各个单体的半胱氨酸残基之间创建(create)二硫键而形成。
HIP1CysDimer(Trp-Ile-Gly-Leu-His-Asp-Pro-Thr-Gln-Gly-Thr-Glu-Pro-Asn-Gly-Glu-Cys)2(SEQ ID NO：12)为提纯形式、合成形式或重组形式的人类前胰岛肽二聚物，其中每个单体已被修饰以含有C末端半胱氨酸残基。所述二聚物通过在各个单体的半胱氨酸残基之间创建二硫键而形成。
HIP2CysDimer(Ile-Gly-Leu-His-Asp-Pro-Thr-Gln-Gly-Thr-Glu-Pro-Asn-Gly-Cys)2(SEQID NO：13)为提纯形式、合成形式或重组形式的人类前胰岛肽二聚物，其中每个单体被修饰以含有C末端半胱氨酸残基。所述二聚物通过在各个单体的半胱氨酸残基之间创建二硫键而形成。HIP2具有约1435.5的分子量。
INGAPCysDimer为提纯形式、合成形式或重组形式的INGAP肽二聚物，其中每个单体已被修饰以含有N末端半胱氨酸残基。
HIP3CysBlocked(Ac-Ile-Gly-Leu-His-Asp-Pro-Thr-Gln-Gly-Thr-Glu-Pro-Asn-Gly-Glu-Cys-NH2)(SEQ ID NO：14)为提纯形式、合成形式或重组形式的已被修饰以含有C末端半胱氨酸残基并且被N末端的乙酰基基团和C末端的酰胺基团封闭的人类前胰岛肽。
HIP1CysBlocked(Ac-Trp-Ile-Gly-Leu-His-Asp-Pro-Thr-Gln-Gly-Thr-Glu-Pro-Asn-Gly-Cys-NH2)(SEQ ID NO：15)为提纯形式、合成形式或重组形式的已被修饰以含有C末端半胱氨酸残基并且被C末端的乙酰基基团和C末端的酰胺基团封闭的人类前胰岛肽。
HIP2CysBlocked(Ac-Ile-Gly-Leu-His-Asp-Pro-Thr-Gln-Gly-Thr-Glu-Pro-Asn-Gly-Cys-NH2)(SEQ ID NO：16)为提纯形式、合成形式或重组形式的已被修饰以含有C末端半胱氨酸残基并且被N末端的乙酰基基团和C末端的酰胺基团封闭的人类前胰岛肽。
INGAPCysBlocked为提纯形式、合成形式或重组形式的已被修饰以含有C末端半胱氨酸残基并且被N末端的乙酰基基团和C末端的酰胺基团封闭的INGAP肽。
HIP3CysBlockedDimer(Ac-Ile-Gly-Leu-His-Asp-Pro-Thr-Gln-Gly-Thr-Glu-Pro-Asn-Gly-Glu-Cys-NH2)2(SEQ ID NO：17)为提纯形式、合成形式或重组形式的人类前胰岛肽二聚物，其中每个单体已被修饰以含有C末端半胱氨酸残基并且被N末端的乙酰基基团和C末端的酰胺基团封闭。所述二聚物通过在各个单体的半胱氨酸残基之间创建二硫键而形成。
HIP1CysBlockedDimer(Ac-Trp-Ile-Gly-Leu-His-Asp-Pro-Thr-Gln-Gly-Thr-Glu-Pro-Asn-Gly-Cys-NH2)2(SEQ ID NO：18)为提纯形式、合成形式或重组形式的人类前胰岛肽二聚物，其中每个单体已被修饰以含有C末端半胱氨酸残基并且被C末端乙酰基基团和C末端的酰胺基团封闭。所述二聚物通过在各个单体的半胱氨酸残基之间创建二硫键而形成。
HIP2CysBlockedDimer或HIP2B Cys二聚物(Ac-Ile-Gly-Leu-His-Asp-Pro-Thr-Gln-Gly-Thr-Glu-Pro-Asn-Gly-Cys-NH2)2(SEQ ID NO：19)为提纯形式、合成形式或重组形式的人类前胰岛肽二聚物，其中每个单体已被修饰以含有C末端半胱氨酸残基并且被N末端的乙酰基基团和C末端的酰胺基团封闭。所述二聚物通过在各个单体的半胱氨酸残基之间创建二硫键而形成。HIP2B Cys二聚物具有约3157.5的分子量。
INGAPCysBlocked二聚物为提纯形式、合成形式或重组形式的INGAP肽二聚物，其中每个单体已被修饰以含有C末端半胱氨酸残基并且被N末端的乙酰基基团和C末端的酰胺基团封闭。所述二聚物通过在各个单体的半胱氨酸残基之间创建二硫键而形成。
HIP3CysPEG(Ile-Gly-Leu-His-Asp-Pro-Thr-Gln-Gly-Thr-Glu-Pro-Asn-Gly-Glu-Cys(PEG))(SEQ ID NO：20)为提纯形式、合成形式或重组形式的已被修饰以含有C末端半胱氨酸残基的人类前胰岛肽，所述C末端半胱氨酸残基已被共价结合于由二聚马来酰亚胺活化的40Kd PEG结构。
HIP1CysPEG
(Trp-Ile-Gly-Leu-His-Asp-Pro-Thr-Gln-Gly-Thr-Glu-Pro-Asn-Gly-Cys(PEG))(SEQ ID NO：21)为提纯形式、合成形式或重组形式的人类前胰岛肽，其已被修饰以含有C末端半胱氨酸残基，所述C末端半胱氨酸残基已被共价结合于由二聚马来酰亚胺活化的40Kd PEG结构。
HIP2CysPEG(Ile-Gly-Leu-His-Asp-Pro-Thr-Gln-Gly-Thr-Glu-Pro-Asn-Gly-Cys(PEG))(SEQ ID NO：22)为提纯形式、合成形式或重组形式的人类前胰岛肽，其已被修饰以含有C末端半胱氨酸残基，所述C末端半胱氨酸残基已被共价结合于由二聚马来酰亚胺活化的40Kd PEG结构。
INGAPCysPEG为提纯形式、合成形式或重组形式的INGAP肽，其已被修饰以含有C末端半胱氨酸残基，所述C末端半胱氨酸残基已被共价结合于由二聚马来酰亚胺活化的40KdPEG结构。
HIP3CysBlockedPEG(Ac-Ile-Gly-Leu-His-Asp-Pro-Thr-Gln-Gly-Thr-Glu-Pro-Asn-Gly-Glu-Cys(PEG)-NH2)(SEQ ID NO：23)为提纯形式、合成形式或重组形式的由N末端的乙酰基基团和C末端的酰胺基团封闭的人类前胰岛肽，其已被修饰以含有C末端半胱氨酸残基，所述C末端半胱氨酸残基已被共价结合于由二聚马来酰亚胺活化的40Kd PEG结构。
HIP1CysBlockedPEG(Ac-Trp-Ile-Gly-Leu-His-Asp-Pro-Thr-Gln-Gly-Thr-Glu-Pro-Asn-Gly-Cys(PEG)-NH2)(SEQ ID NO：24)为提纯形式、合成形式或重组形式的由N末端的乙酰基基团和C末端的酰胺基团封闭的人类前胰岛肽，其已被修饰以含有C末端半胱氨酸残基，所述C末端半胱氨酸残基已被共价结合于由二聚马来酰亚胺活化的40Kd PEG结构。
HIP2CysBlockedPEG或HIP2B Cys-PEG(Ac-Ile-Gly-Leu-His-Asp-Pro-Thr-Gln-Gly-Thr-Glu-Pro-Asn-Gly-Cys(PEG)-NH2)(SEQ ID NO：25)为提纯形式、合成形式或重组形式的由N末端的乙酰基基团和C末端的酰胺基团封闭的人类前胰岛肽，其已被修饰以含有C末端半胱氨酸残基，所述C末端半胱氨酸残基已被共价结合于由二聚马来酰亚胺活化的40Kd PEG结构。HIP2B Cys(PEG)具有约44,782的分子量。
INGAPCysBlocked PEG是提纯形式、合成形式或重组形式的由C末端的乙酰基基团和N末端的酰胺基团封闭的INGAP肽，其已被修饰以含有C末端半胱氨酸残基，所述C末端半胱氨酸残基已被共价结合于由二聚马来酰亚胺活化的40Kd PEG结构。
REG3G为衍生自人类再生胰岛的蛋白质3γ前体，其具有序列MLPPMALPSVSWMLLSCLILLCQVQGEETQKELPSPRISCPKGSKAYGSPCYALFLSPKSWMDADLACQKRPSGKLVSVLSGAEGSFVSSLVRSISNSYSYIWIGLHDPTQGSEPDGDGWEWSSTDVMNYFAWEKNPSTILNPGHCGSLSRSTGFLKWKDYNCDAKLPYVCKFKD(SEQ ID NO：28)。REG3G肽为衍生自人类再生胰岛的蛋白质3γ前体肽，所述蛋白质3γ前体肽衍生自具有序列IGLHDPTQGSEPDG(SEQ ID NO：29)的REG3G。其他REG3G肽为WIGLHDPTQGSEPDG(SEQ ID NO：58)和IGLHDPTQGSEPDGD(SEQ ID NO：59)。
本公开的实施方案为优化前胰岛肽(包括HIP)的稳定性和溶解性用以作为治疗剂的改进的使用提供详细的策略。HIP为衍生自人类蛋白质再生胰岛的3α蛋白质(REG3A)(NM_138937.1)的肽片段，也被称为与胰脏炎相关联的蛋白质前体(NP-002571)，位于第2条染色体，位置(location)2p12，定位(position)79240075(SEQ ID NO：1)。HIP3、HIP1和HIP2诱导或刺激从处于胰腺中的祖细胞的胰岛新生。根据本公开的方法使用的这些新生剂结果得到前胰岛肽(包括HIP)的优化的形式，所述优化的形式当用作治疗剂以治疗疾病时表现出提高了的体内稳定性，溶解性和效力。这些疾病包括但不限于糖尿病(1型糖尿病)、2型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病和需要胰岛素的成人始发糖尿病，幼年时期和***的糖尿病)和成人隐匿性自身免疫糖尿病(LADA)。
本公开的实施方案还提供药物组合物和治疗，用于使用这样的组合物治疗胰腺官能障碍，包括1型和2型糖尿病。在一个实施方案中，这些组合物包含优化的前胰岛肽(包括优化的HIP)。在另一个实施方案中，这些组合物包括优化的前胰岛肽(包括优化的HIP)和其他影响葡萄糖代谢的试剂。包括在这些其他试剂中的是在胰腺胰岛新生中所涉及到的试剂和抑制、阻滞或破坏靶向于胰岛细胞的自身免疫细胞的试剂。在一个实施方案中，本文所公开的治疗通过向需要这样的治疗的哺乳动物给予治疗有效剂量的优化的前胰岛肽(包括优化的HIP)被实践。在另一个实施方案中，本文所公开的治疗通过与影响葡萄糖代谢的另一种试剂(例如激素或化合物)组合，向需要这样的治疗的哺乳动物给予治疗有效剂量的优化的前胰岛肽(包括优化的HIP)而被实践，所述影响葡萄糖代谢的另一种试剂包括但不限于在β细胞再生，饱足感和胃排空中所涉及到的激素或化合物，例如GLP-1、GIP、GLP-1受体类似物、GLP-1类似物和防止GLP-1毁灭(destruction)的二肽基肽酶-4抑制剂，以及抑制、阻滞或破坏靶向于胰腺细胞的自身免疫细胞的试剂。在上述的后一个实施方案中，所述优化的HIP和其他试剂可以被分别给予或可以首先被掺合以提供联合组合物并且同时被给予。
NOD小鼠中的基因表达的微阵列分析已显示Reg基因特别在胰岛新生中的上调。此外，已知在胚胎发育晚期，Reg基因出现上调以占据(populate)发育中的人的胰腺，以在产后保持其本身的的葡萄糖代谢。已显示胚胎组织和非内分泌胰腺上皮细胞(NEPECs)的共同移植导致了来自NEPEC群体的对新胰岛结构的刺激。Reg在所共同移植的胚胎材料中的上调可能是针对这种效果的刺激。
体内研究已显示当被引入糖尿病小鼠时，HIP1、HIP2和HIP3刺激胰腺中的祖细胞分化为新胰岛结构。
虽然对于胰岛结构的新生有效，仍然需要优化前胰岛肽(包括HIP变异体)，以改进它们作为治疗剂给予的溶解性、稳定性和生物利用度。对前胰岛肽(包括HIP变异体)的将减少它们蛋白酶降解的机会的修饰将提高它们的效力，从而减少为得到积极的治疗效果所需要的用量。这些修饰的结果被称为“优化的前胰岛肽”或“优化的HIP”。
在一个实施方案中，优化的前胰岛肽(包括优化的HIP)以提纯形式、合成形式或重组形式被本公开提供，并且根据本文所公开的方法被给予以诱导胰腺胰岛新生。
进一步地，优化的前胰岛肽(包括优化的HIP)可以被长时间稳定地储存。当在20C储存在生理盐水中时，优化的HIP可以在几个月内稳定。
在具体的实施方案中，优化的前胰岛肽(包括优化的HIP)在功能上极度活跃，即，能够表现出与REG3A、其他HIP肽和非人HIP同源物(例如仓鼠INGAP)相关联的一种或更多种的功能活性的更大活性。
由于核苷酸编码序列的简并，编码与优化的前胰岛肽(包括优化的HIP)相同或基本上相似的氨基酸序列的多种DNA序列可以用于本公开的实践，以制备用于生产重组的优化的前胰岛肽(包括优化的HIP变异体)的表达载体。所述DNA序列包括但不限于包括通过不同的密码子的取代而被改变的优化的前胰岛肽(包括优化的HIP)的所有或部分的核酸序列，所述不同的密码子编码所述序列内的相同或功能上等效的氨基酸残基，从而产生沉默变化(silent change)。所述优化的前胰岛肽(包括优化的HIP)和其衍生物包括但不限于含有优化的前胰岛肽(包括优化的HIP变异体)的所有或一部分氨基酸序列(包括改变的序列)，作为主要氨基酸序列的那些，在所述改变的序列中，功能上等效的氨基酸残基取代了原序列内的残基，导致沉默变化。例如，序列内的一种或更多个氨基酸残基可以被作为功能上的等效物起作用的有相似极性的另一个氨基酸所取代，导致沉默改变(silent alteration)。所述序列内的氨基酸的取代物可以选自所述氨基酸所属类别的其他成员。例如，非极性(疏水性的)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。优化的前胰岛肽(包括优化的HIP衍生物)还包括但不限于含有前胰岛肽(包括HIP)的所有或一部分氨基酸序列(包括改变的序列)，作为主要氨基酸序列的那些，在所述改变的序列中，氨基酸残基被具有相似化学性质的残基取代。在具体的实施方案中，优化的HIP的1、2、3、4或5个氨基酸被取代，结果得到优化的HIP的类似物和/或衍生物。
在具体的实施方案中，嵌合蛋白或融合蛋白可以用于本文所公开的方法。如本文所用，“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包括有效链接(operatively linked)至非前胰岛肽或HIP多肽或其类似物或衍生物的优化的前胰岛肽(包括优化的HIP)或其类似物或衍生物。在所述融合蛋白中，优化的前胰岛肽或HIP和所述非前胰岛或HIP多肽被“有效链接”，即它们符合彼此读框地融合。所述非前胰岛或HIP多肽可以被融合至优化的前胰岛肽或HIP的N末端或C末端。例如，所述融合蛋白可以为在其N末端含有异源信号序列的优化的HIP。在某些宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中，优化的HIP或其类似物或衍生物的表达和/或分泌可以通过使用异源信号序列被提高。在再另一个实施例中，所述融合蛋白为优化的HIP-免疫球蛋白融合蛋白，其中所述优化的HIP序列被融合至从免疫球蛋白家族的成员所衍生的序列。所述优化的HIP-免疫球蛋白融合蛋白可以被并入药物组合物并且根据本公开被给予受试者以抑制免疫应答。
用于本文所公开的方法中的优化的前胰岛肽(包括优化的HIP)或其类似物或衍生物，或与优化的前胰岛肽(包括优化的HIP)嵌合或融合的蛋白可以被化学修饰用于改善生物利用度和/或提高效力、溶解性和稳定性的目的。例如，所述蛋白质可以被共价或非共价联接于白蛋白，转铁蛋白或附加的聚乙二醇(PEG)部分。
用于本文所公开的方法的优化的前胰岛肽(包括优化的HIP)或其类似物或衍生物，或与优化的前胰岛肽或HIP嵌合或融合的蛋白可以通过根据本文的教导和本领域已知的标准的重组DNA技术生产。例如，编码不同的多肽序列的DNA片段可以根据常规的技术被符合彼此读框地共同连接在一起，例如，通过采用平端(blunt-ended)或粘端(stagger-ended)连接，限制酶消化以提供适合的末端，适合的粘性末端的补齐，碱性磷酸酶处理以避免不期望的结合，以及酶连接。此外，融合基因可以通过常规的技术合成，包括DNA合成仪。或者，可以使用在两个连续基因片段之间生成互补的悬垂的锚定引物进行基因片段的PCR扩增，所述两个连续基因片段可以接下来被退火和再扩增以生成嵌合的基因序列。此外，许多表达载体为市售的，这些载体已经编码了融合的部分(例如GST多肽)。编码优化的HIP的核酸可以被克隆到这样的表达载体由此所述融合部分被符合读框地连接于优化的HIP。所述融合蛋白可以是被融合于His标签或抗原决定簇标签(例如V5)的优化的HIP，以协助重组的优化的HIP的提纯和检测，或者以掩蔽(mask)在受试者中的免疫应答。优化的HIP及其类似物和衍生物的短氨基酸序列也使这些有价值的肽的合成生产可以容易地实践，而且多种用于肽合成的自动化仪器为市售的，而且针对不需要自动化的肽合成的合成方法为长久以来已知的并且可以根据本文的教导被使用以制备优化的HIP或其类似物或衍生物。
在一些实施方案中，优化的前胰岛肽(包括优化的HIP)或其类似物或衍生物，或与优化的前胰岛肽或HIP嵌合或融合的蛋白可以使用本领域已知的任何方法被修饰，由此其具有延长的体内的半衰期。例如，人免疫球蛋白的Fc片段或诸如高分子量聚乙二醇(PEG)的惰性聚合物分子可以，使用或不使用多功能接头(linker)，通过PEG对所述蛋白质的N末端或C末端的位点特异性共轭(conjugate)，或经由赖氨酸残基上存在的ε-氨基基团，被附加于(attached to)优化的HIP或其类似物或衍生物。将使用导致生物活性的最小损失的线性或支化聚合物的衍生化。共轭程度可以通过SDS-PAGE和质谱进行密切监控以确保PEG分子对优化的HIP或其类似物或衍生物的合适共轭。未反应的PEG可以通过尺寸排阻层析或通过离子交换色谱从优化的HIP-PEG共轭物分离。由PEG衍生的共轭物可以使用本领域的技术人员所知的方法测试体内效力。
本公开的实施方案提供优化的前胰岛肽制剂(包括优化的HIP制剂)和基于优化的前胰岛肽或HIP的治疗，和用于在糖尿病和各种其他涉及受损的胰腺功能的指示的治疗中递送优化的前胰岛肽或HIP变异体的方法。
在一个实施方案中，前胰岛肽通过添加C末端的酰胺基团和N末端的乙酰基基团被优化，从而有效地阻断那些在血清中识别并且降解肽的自由端的蛋白酶的蛋白水解活性，而结果得到所述优化的前胰岛肽化合物。
在一个实施方案中，HIP3、HIP1和/或HIP2通过添加C末端的酰胺基团和N末端的乙酰基基团被优化，从而有效地阻断那些在血清中识别并且降解肽的自由端的蛋白酶的蛋白水解活性，而结果分别得到所述优化的HIP化合物HIP3Blocked(SEQ ID NO：5)、HIP1Blocked(SEQ ID NO：6)和HIP2Blocked(SEQ ID NO：7)。这些添加的封闭基团通过固相肽合成(SPPS)制备。固相合成的基本前提是，当肽链的一端锚定于不溶性支撑体上时，氨基酸可以被组装于有任何期望的序列的肽中。如以上提到的，在实际SPPS中，所述肽的羧基末端连接于所述聚合物。在氨基酸的期望的序列已经共同连接在所述支撑体上之后，可以应用试剂以将所述肽链从所述支撑体裂解并且将粗肽释放进溶液中。所有所述合成中涉及到的反应，如果可能的话，都进行到完成，由此能够获得均一的产物。
当肽的C末端为酰胺时，衍生物为肽酰胺。肽酰胺为极重要的衍生物，因为许多在天然存在的肽激素以酰胺的形式存在。为了合成肽酰胺，已经开发出固相树脂，所述固相树脂在裂解时直接得到肽酰胺。当N末端为乙酰基基团时，所述肽从C末端向N末端组装。然后N末端在碱存在下使用乙酸酐被乙酰化。
在另一个实施方案中，前胰岛肽通过添加C末端半胱氨酸残基被修饰，结果得到Cys前胰岛肽化合物。这些优化的前胰岛肽化合物能够在溶液中形成二聚物，其中在各个单体的半胱氨酸之间形成二硫键，结果得到优化的前胰岛肽化合物前胰岛肽CysDimer。
在另一个实施方案中HIP3、HIP1和/或HIP2通过添加C末端半胱氨酸残基被修饰，结果分别得到所述优化的HIP化合物HIP3Cys(SEQ ID NO：8)、HIP1Cys(SEQ ID NO：9)和HIP2Cys(SEQ ID NO：10)。这些优化的HIP化合物能够在溶液中形成二聚物，其中在各个单体的半胱氨酸之间形成二硫键，结果分别得到所述优化的HIP化合物HIP3CysDimer(SEQ ID NO：11)、HIP1CysDimer(SEQ ID NO：12)和HIP2CysDimer(SEQID NO：13)。所述半胱氨酸残基的添加是通过用2mL乙酸湿化4克粗肽，并且用～500mL去离子水稀释，然后通过逐滴添加20％NH4OH溶液调整pH至～8.2并且允许在室温下搅拌过夜。过夜后反应未完成，因此添加铁***溶液直至保持持久的黄绿色。在这个阶段，通过Ellman测试和HPLC分析确定反应完成。然后使用一匙AG-1 X2(氯形式)树脂处理所述氧化溶液30分钟，并且在P4漏斗上过滤，并且在HPLC提纯之前最终pH被调整至～5。
在另一个实施方案中所述Cys前胰岛肽通过添加C末端的酰胺基团和N末端的乙酰基基团被封闭，从而保护所述化合物不被在血清中识别自由端的蛋白酶降解，并且结果得到优化的HIP化合物前胰岛肽CysBlocked。此外这些化合物能够在溶液中形成二聚物，其中在各个单体的半胱氨酸之间形成二硫键，结果得到优化的前胰岛化合物前胰岛肽CysBlockedDimer。这些封闭基团如以上所讨论的被添加。
在另一个实施方案中，HIP3Cys(SEQ ID NO：8)、HIP1Cys(SEQ ID NO：9)和/或HIP2Cys(SEQ ID NO：10)通过添加C末端的酰胺基团和N末端的乙酰基基团被封闭，从而保护所述化合物不被在血清中识别自由端的蛋白酶降解，并且结果分别得到所述优化的HIP化合物HIP3CysBlocked(SEQ ID NO：14)、HIP1CysBlocked(SEQ ID NO：15)和HIP2CysBlocked(SEQ ID NO：16)。此外这些化合物能够在溶液中形成二聚物，其中在各个单体的半胱氨酸之间形成二硫键，结果得到分别优化的HIP化合物HIP3CysBlockedDimer(SEQ ID NO：17)、HIP1CysBlockedDimer(SEQ ID NO：18)和HIP2CysBlockedDimer(SEQ ID NO：19)。这些封闭基团如以上所讨论的被添加。
在另一个实施方案中，所述Cys前胰岛肽通过在C末端半胱氨酸残基上共价结合由二聚马来酰亚胺活化的40Kd PEG结构被优化，结果得到优化的HIP化合物前胰岛肽CysPEG。所述PEG结构通过将CS504肽的单体已提纯形式(1.1当量)溶解于乙酸缓冲液(pH＝6.5)可以被共价结合于所述C末端半胱氨酸残基。PEG马来酰亚胺的溶液(1当量)可以在去离子水中制备并且在搅拌下被添加进所述肽溶液。所得溶液的pH可以使用稀NH4OH溶液被再次调整至～6.5，在室温下搅拌30分钟，并且使用几滴乙酸酸化，并且最终通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)被提纯。
在另一个实施方案中，HIP3Cys(SEQ ID NO：8)、HIP1Cys(SEQ ID NO：9)和/或HIP2Cys(SEQ ID NO：10)通过在C末端半胱氨酸残基上共价结合由二聚马来酰亚胺活化的40Kd PEG结构被优化，结果分别得到优化的HIP化合物HIP3CysPEG(SEQ ID NO：20)、HIP1CysPEG(SEQ ID NO：21)和HIP2CysPEG(SEQ ID NO：22)。所述PEG结构通过将CS504肽的单体已提纯形式(1.1当量)溶解于乙酸缓冲液(pH＝6.5)被共价结合于所述C末端半胱氨酸残基。PEG马来酰亚胺(1当量)的溶液在去离子水中制备并且在搅拌下被添加进所述肽溶液。所得溶液的pH使用稀NH4OH溶液被再次调整至～6.5，在室温下搅拌30分钟，并且使用几滴乙酸酸化，并且最终通过RP-HPLC被提纯。
在另一个实施方案中前胰岛肽CysPEG通过添加C末端的酰胺基团和N末端的乙酰基基团被优化，从而保护所述化合物不被在血清中识别自由端的蛋白酶降解，并且结果得到所述优化的HIP化合物前胰岛肽CysPEGBlocked。所述封闭基团如以上所讨论的被添加。
在另一个实施方案中HIP3CysPEG(SEQ ID NO：20)、HIP1CysPEG(SEQ ID NO：21)和HIP2CysPEG(SEQ ID NO：22)通过添加C末端的酰胺基团和N末端的乙酰基基团被优化，从而保护所述化合物不被在血清中识别自由端的蛋白酶降解，并且结果分别得到所述优化的HIP化合物HIP3CysPEGBlocked(SEQ ID NO：23)、HIP1CysPEGBlocked(SEQID NO：24)和HIP2CysPEGBlocked(SEQ ID NO：25)。所述封闭基团如以上所讨论的被添加。
本公开的优化的前胰岛肽或HIP或类似物或衍生物治疗或组合治疗可以用于，使用优化的HIP化合物和治疗方法，通过从祖细胞向新胰岛结构的分化，治疗任何患有与胰岛素的生产或分泌的削弱有关的疾病、症状或病况的哺乳动物(包括人类和动物)，所述胰岛素的生产或分泌的削弱是由于β细胞功能的损失或削弱或比所能够提供给受试者的更大的胰岛素产量的需求。这样的疾病和病况包括1型糖尿病、2型糖尿病、前驱糖尿病、空腹血糖受损、空腹高胰岛素血症，包括但不限于1a型糖尿病患者，或可以显现抗体(抗GAD65抗体，抗胰岛抗体，或抗胰岛素抗体)的成人隐匿性自身免疫性糖尿病患者，或那些具有胰岛素缺乏而不具有针对β细胞的自身免疫的1型糖尿病患者(1b型糖尿病)。此外，本公开的实施方案可以被实践为针对被新诊断出患有1型糖尿病的患者，1型糖尿病患者的兄弟姐妹和一级亲属，以及具有阳性抗体和显示1型糖尿病的征兆的其他自身免疫病况的人具有治疗上的益处。在一个实施方案中，本文所公开的方法被实践以在需要这样的治疗的患者身上逆转1型糖尿病。
所述组合治疗和相关的方法和组合物还可以用于作为用于儿童和成人的1型糖尿病的胰岛素治疗的辅助治疗，以改进糖尿病患者的葡萄糖波动，以及用于未有效控制的糖尿病的患者、患有无感知低血糖的患者和与在1型糖尿病中低血糖症复发的患者。
所述优化的前胰岛肽或HIP或类似物或衍生物治疗以及相关的方法和组合物可以用于治疗具有新诊断出的2型糖尿病的患者、具有高血糖的儿童和成人中2型糖尿病的患者，同时使用胰岛素、口服糖尿病药物或其他皮下糖尿病治疗的2型糖尿病的患者，以及未有效控制的2型糖尿病的患者。在一些患者中，包括儿童和成人，本文所公开的方法和组合物可以逆转1型和2型糖尿病。本文所公开的方法和组合物也可以用于治疗具有非典型形式的糖尿病的儿童和成人和具有餐后高血糖病况的患者。
所述优化的前胰岛肽或HIP或类似物或衍生物治疗以及相关的方法和组合物也可以用于治疗需要减少重量、减少甘油三酸酯、LDL胆固醇的儿童以及成人患者，包括但不限于在患有糖尿病以及不患有1型或2型糖尿病的患者中，实现减少重量或治疗肥胖症和超重。在一个实施方案中，本文所公开的方法和组合物被用于治疗具有病态肥胖症的患者。在其他实施方案中，本文所公开的方法和组合物被用于治疗具有病态肥胖症的患者或具有食欲缺乏，食欲过盛或其他饮食失调症的患者。
所述由单一试剂优化的治疗以及相关的方法和组合物也可以用于治疗具有代谢障碍综合征或代谢综合症的儿童和成人，以及表现出变化的葡萄糖代谢并发的神经性疼痛综合症的病况的患者，以及那些患有伴随或不伴随糖尿病的高甘油三酯血症和餐后高甘油三酯血症的患者。在一个实施方案中，这些方法被实践以在需要这样的治疗的患者身上治疗多囊卵巢综合症。
其他可以从所述优化的前胰岛肽或HIP或类似物或衍生物治疗以及相关的方法受益的患者一般包括被诊断为具有诸如空腹高血糖症、前驱糖尿病、空腹血糖受损、糖耐量低减和高血糖病的病况的儿童和成人患者。
所述优化的前胰岛肽或HIP或类似物或衍生物治疗以及相关的方法和组合物也可以用于治疗具有神经性疼痛综合症和神经病的患者，无论所述患者是否被诊断为有糖尿病。
所述优化的前胰岛肽或HIP或类似物或衍生物治疗以及相关的方法和组合物也可以用于治疗具有复发性胰脏炎或胰腺癌的患者，并且可以用于所有以实现衍生自胰腺中祖细胞的新胰岛结构为目的的药征。
在一个实施方案中，刺激从胰腺祖细胞的胰岛分化得到产生胰岛素的胰岛结构的试剂选自优化的前胰岛肽或HIP或其类似物或衍生物。在另一个实施方案中，优化的前胰岛肽(包括HIP)和另一种试剂组合以刺激胰岛细胞新生。所述另外的试剂可以为，例如，胰淀素和/或类似物，包括但不限于普兰林肽(SYMLINTM)、GLP-1受体类似物、exendin-4(EXENATIDETM)、利拉鲁肽(NN2211)、GLP-1、GLP-1类似物GIP、GLP-1、仓鼠INGAP、其他拟肠促胰岛素(incretin-mimetic)的激素、和/或以类似形式作用的化合物和试剂，和延长前述的任何化合物和试剂的半衰期或提高其水平或活性的试剂，例如，二肽基肽酶-4抑制剂，所述二肽基肽酶-4抑制剂延迟GLP-1的降解。有许多通过对GLP-1受体的直接兴奋活性或通过抑制GLP-1的降解的GLP-1模拟物。这些试剂可用于本公开的某些实施方案中。GLP-1模拟物可以用于与HIP和/或作为靶向免疫治疗结合用于治疗1型糖尿病，而且它们可以用于改善糖血控制、增加饱腹感、延迟肠(gut)葡萄糖吸收，并且引起导致1型糖尿病的基本机理的逆转。这些试剂和方法可以防止糖尿病中糖耐量低减的恶化；以防止前驱糖尿病、空腹血糖受损向糖耐量低减和糖尿病的发展；以逆转新诊断出的2型糖尿病；以治疗2型糖尿病，并且以治疗或防止超重、肥胖症、多囊卵巢综合症和神经性疼痛综合症。
方法，试剂和药物制剂可用于本公开的实践以实现从成人胰腺中的祖细胞的胰岛分化并且包括在以下参考文献中描述的针对其他目的的那些，以下参考文献中的每一个以引用的方式并入本文：Rosenberg等人，1992，Adv.Exp.Med.Biol.321：95-104；Mar.1996，Diabetologia 39(3)：256-62；1996年7月，Pancreas 13(1)：38-46；和2004年11月，Ann.Surg.240(5)：875-84；Vinik等人，1997年六月，Horm.Metab.Res.29(6)：278-93。所述对胰岛再生或胰腺祖细胞分化的成功的刺激可以通过受试者体内胰岛素的增加了的产量和/或分泌来表现。
在一个实施方案中，胰淀素或胰淀素的类似物例如SYMLINTM或普兰林肽为在优化的HIP被给予之前被采用的或与优化的HIP伴随被给予。胰淀素可以在胰岛再生之前被给予，并且在胰岛再生时期给予期间继续给予，这是根据以下参考文献的教导：Young等人，1997，Curr.Opin.Endocrin.Diabetes 4：282-290，该参考文献以引用的方式并入本文。在一个实施方案中，胰淀素和/或类似物，包括但不限于普兰林肽，在优化的HIP起始之前通过皮下给予以优化糖血控制，并且然后可以单独或连同其他胰岛刺激肽，例如优化的HIP或优化的HIP类似物或衍生物一起使用。在一个实施方案中，胰淀素或普兰林肽以0.3-0.8微克每千克患者重量定量给药。在一个实施方案中，本剂量在餐前(例如，QHS和3AM)皮下给予。在一个实施方案中，所述治疗有效剂量以皮下的方式递送或通过注入装置/泵和/或经皮的、鼻内的、口服的、显微操作针递送***、口服胶囊方法被递送。在另一个实施方案中，所述治疗有效剂量利用持续释放制剂被给予，所述制剂要求通过频率不高于每星期一次、每2星期一次、或每月一次的注射或其他递送方法给予。如上文所述的，在一些实施方案中，胰淀素或普兰林肽与另一种胰岛刺激剂共同给予。
在一个实施方案中，GLP-1受体类似物，包括exendin-4或exendin-4的类似物以伴餐的5-10mcg的剂量与优化的HIP在所述方法中被采用。exendin-4可以为了本公开的目的根据以下参考文献的教导被配制和给予，以下参考文献中的每一个以引用的方式并入本文：Alcantara等人，1998，Cell Biochem.Funct.16(1)：51-6；Dupre等人，2004，J.Clin.Endocrin.Metab.89(7)：3469-73；Edwards等人，1999，Diabetes 48：86-93；和Xu等人，1999，Diabetes 48：2270-76。在一个实施方案中，exendin-4在餐前以在5-10微克范围内定量给药。在一个实施方案中，exendin-4单独或与优化的HIP和/或其他胰岛刺激肽结合通过皮下给予。在一个实施方案中，所述治疗有效剂量通过皮下给予。在另一个实施方案中，exendin-4的递送为通过经皮的、鼻内的、通过口服胶囊方法、口腔的、或显微操作针递送***。在另一个实施方案中，治疗有效剂量被包含在持续释放制剂中，所述持续释放制剂要求以不高于每星期一次，每2星期一次，或每月一次的频率给予。在一个实施方案中，exendin-4在患有1型或2型糖尿病患者、或肥胖症、超重、胰岛素抵抗综合症、空腹血糖受损、前驱糖尿病、多囊卵巢综合症、代谢综合症或饮食失调症的患者中，与优化的HIP或另一种胰岛细胞新生或祖细胞转变试剂(transformation agent)共同给予。
GIP和GLP-1属于生长激素的肠促胰岛素族(见参考文献Creutzfeldt，1979，Diabetologia 16：75-85；Creutzfeldt和Ebert，1985，Diabetologia 28：565-573；Holst等人，2001，Scand.J.Clin.Lab.Invest.Suppl.234：75-85；和Vilsboll等人，2003年6月，J.Clin.Endocrin.Metab.88(6)：2706-13，它们中的每一个以引用的方式并入本文)，并且在一个实施方案中，在所述方法中采用肠促胰岛素激素或类似物伴随或不伴随优化的HIP的共同使用，以刺激从成人胰腺中祖细胞向胰岛的分化。
在各种实施方案中，GIP或GIP类似物与优化的前胰岛肽(包括HIP)一起采用。GIP可以为了本公开的目的根据以下参考文献的教导被配制和给予，以下参考文献中的每一个以引用的方式并入本文：Andersen等人，1978，J.Clin.Invest.62：152-161；Creutzfeldt等人，Feb.1980，Diabetes 29(2)：140-5；Dupré等人，1973，J.Clin.Endocrin.Metab.37：826-828；Ebert等人，1980，Clinical Gastroenterology 9(3)：679-98；Elahi等人，1979，Am.J.Physiol.237：E185-E191，和1994，Regulatory Peptide 51(1)：63-74；Krarup等人，1983年六月，J.Clin.Endocrin.Metab.56(6)：1306-12；Krarup等人，1987，Metabolism 36(7)：677-82；Krarup等人，1988，Acta Med.Scand.223(5)：437-41；Lynn等人，2003，FASEB 17：19-93；Meir等人，2002，Regulatory Peptides 107：1-3；和Nauk等人，1993，J.Clin.Endocrin.Metab.76(4)：912-7。
在一个实施方案中，GIP与优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物组合被静脉内或皮下给予并且以2-10纳克每千克患者重量定量给药，以提供30分钟的静脉内或皮下的连续注入的递送时间，所述时间开始于餐前3-5分钟、在睡觉时间前、以及开始于3AM。在一个实施方案中，GIP在餐前、QHS、和3AM被皮下给予。在一个实施方案中，GIP口服给予或使用注入装置或经皮、口服的，鼻内的或显微操作针递送***被给予。在另一个实施方案中，采用要求以不高于每星期一次、每2星期一次、或每月一次的频率的注射给予的持续释放制剂。针对根据本文所公开的方法给予GIP的合适的组合物为了其他目在以下参考文献中被描述，Jones等人，1989年11月6日，Diabetes Res.Clin.Pract.7(4)：263-9。
在各种实施方案中，GLP-1或类似物，或GLP-1受体激动剂或二肽基肽酶-4抑制剂与优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物在所述方法中被组合采用，以刺激从祖细胞的胰岛分化。GLP-1、GLP-1受体激动剂、GLP-1类似物和DPP-4抑制剂可以为了本公开的目的根据以下参考文献的教导被配制和给予，以下参考文献中的每一个以引用的方式并入本文：Elahi等人，1994，Regulatory Peptides 51(1)：63-74；Gutniak等人，1994，Diabetes Care 17：1039-44；Kreymann等人，1987，Lancet 2：1300-1304；Larsen等人，1996，Diabetes 45(Suppl.2)：233A(Abstract)；Larsen等人，2001，Diabetes Care 24(8)：1416-21；List等人，2004，Am.J.Physiol.Endocrin.Metab.286(6)：E875-81；Lugari等人，2000，Horm.Metab.Res.32：424-428；Marquez等人，Mar.1998，Cell.Biochem.Funct.16(1)：51-6；Meier等人，March 2004，Critical Care Medicine 32(3)：848-851；Meneilly等人，2003，Diabetes Care26：2835-41；Nauk等人，1996，Diabetologia 39(12)：1546-53；Thorens等人，Dec.1995，Diabetes Metab.21(5)：311-8；Vilsboll等人，2003，J.Clin.Endocrin.Metab.88(6)：2706-13；Wang等人，1997，J.Clin.Invest.99：2883-2889；和Zander等人，2002，Lancet 359：824-30。
在各种实施方案中，GLP-1、GLP-1受体激动剂或GLP-1类似物被皮下给予，或DPP-4抑制剂与优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物组合被口服给予并且在400-800mg每日且8-20mg每千克患者重量的范围内定量给药。在一个实施方案中，GLP-1在餐前和QHS被口服或皮下给予。在一个实施方案中，GLP-1使用连续皮下注入装置以1-30ng/千克体重/分钟的速率被给予或使用经皮的、口服的、或显微操作针递送体系以提供30分钟的静脉内或皮下的连续注射的递送时间，所述时间开始于餐前3-5分钟、在睡觉时间前、以及开始于3AM。在另一个实施方案中，采用需要以不高于每星期一次、每2星期一次、或每月一次的频率的注射给予的持续释放试剂。
在一个实施方案中，利拉鲁肽(NN2211)以10-40微克每千克体重的剂量与优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物组合被皮下给予。在另一个实施方案中，利拉鲁肽在餐前、QHS、和3AM被皮下给予。在另一个实施方案中，利拉鲁肽用注入装置或经皮的、口腔的、或显微操作针递送体系被给予以提供30分钟的静脉内或皮下的连续注射的递送时间，所述时间开始于餐前3-5分钟、在睡觉时间前、以及开始于3AM。在另一个实施方案中，采用需要以不高于每星期一次、每2星期一次、或每月一次的频率的注射给予的持续释放制剂。
在所述组合治疗的一个实施方案中，利拉鲁肽或NN2211以约20微克每kg患者重量每日的剂量与优化的前胰岛肽(包括HIP)组合被给予。这一剂量将为患者提供将餐前的药丸(bolus)胰岛素减少10-20％的能力，伴随减少的波动和降低的餐后葡萄糖、胰高血糖素和甘油三酸酯。根据本文所公开的方法的利拉鲁肽的给予可以用于改善糖血控制，如测量的，例如但不限于，在1型糖尿病中通过血红素A1C；以防止糖尿病中糖耐量低减的发展；以防止空腹血糖受损向糖耐量减低和糖尿病的发展；以逆转新诊断出的2型糖尿病；以及以治疗2型糖尿病。
在所述组合治疗的实施方案中，在优化的前胰岛肽或HIP治疗期间，利拉鲁肽或NN2211在午前、在食物摄入大约4小时前和在睡觉时间，连续三个星期，以大约20微克每kg患者重量的剂量向成人患者给予。对于以低于约1.0ng/mL的C-肽水平起始治疗的患者，C-肽水平被监控，并且当C-肽水平升高至高于0.5ng/mL时，抗体hOKT3g1(Ala-Ala)被连续12天给予。
在所述组合治疗中，exendin-4或合成exendin-4或另一种GLP-1类似物、GLP-1受体激动剂、或二肽基肽酶-4抑制剂在餐前单独或与优化的前胰岛肽或HIP或另一种胰岛分化剂一起被给予，以在优化的HIP治疗的起始之前或在优化的HIP治疗期间改善糖血控制。这样的试剂，当在餐前递送时，可以导致对胰岛素的需要减少至少20％，并且当优化的HIP被给予时，将进行对胰岛素和糖尿病药物的适当的逐渐减少。当优化的HIP和/或其他试剂被在1型和2型糖尿病患者二者中递送时，由于新胰岛细胞从祖细胞分化，将发生谨慎的对胰岛素和其他糖尿病药物的逐渐减少以抵御低血糖症。最终，由于胰腺重新具有新的起作用的胰岛，胰岛素和糖尿病药物，包括优化的HIP，将被逐渐减少。对于以低于约1.0ng/mL的C-肽水平起始治疗的患者，C-肽水平被监控，并且当C-肽水平升高至高于0.5ng/mL时，将发生对外源胰岛素剂量的谨慎的监控和逐渐减少。
在1型糖尿病患者中，在优化的前胰岛肽(包括HIP)和/或其他肽化合物(SYMLINTM、仓鼠INGAP、GLP-1、GLP-1受体激动剂、GLP-1类似物)的起始之前，使用DPP-4抑制剂(在免疫治疗将被给予之前，期间，或之后)以保护新形成的胰岛。例如，抗体hOKT3g1(Ala-Ala)被连续12天给予，其效力在第一次治疗后表现出，直至24个月，但是相似的人源化的单克隆抗体ChAglyCD3可以被连续6天给予，然后每年重复。Diamyd’s GAD65化合物以相隔一个月的两次皮下注射被递送。DIAPEP277TM，一种热激蛋白60，在研究开始、1个月后和6个月后利用1mg的皮下注射，伴随植物油中的40mg甘露醇进行，在新诊断出的糖尿病患者中已被证明成功。基于所选的所述免疫调节物，将确定治疗的周期性。在另一个实施方案中，DIAPEP277TM，一种热激蛋白60疫苗，以及IBC-VSO疫苗(胰岛素的合成的代谢非活性形式，被设计以防止胰腺β细胞毁灭)，干扰素α，或使用CD4+CD25+抗原特异调节性T细胞或相似试剂的接种疫苗被用于所述组合治疗中。在另一个实施方案中，免疫调节试剂，包括但不限于抗CD3免疫治疗试剂和多克隆抗T-淋巴细胞球蛋白，与优化的HIP组合使用。这样的试剂还包括：西罗莫司(雷帕霉素)、他克莫司(FK506)、热激蛋白60(DIAPEP277TM)、抗谷氨酸脱羧酶65(GAD65)疫苗、单独或与达利珠单抗组合的霉酚酸酯、抗CD20试剂利妥昔单抗、Campath-1H(抗CD52抗体)和/或维生素D。
一些自身免疫细胞靶向于胰腺β细胞并且因此在一些可根据本文所公开的方法治疗的疾病和病况中起到起因的作用。见参考文献：Bach等人，2001，Ann.Rev.Immun.19：131-161；Lernmark等人，Endocrin.Metab.Clin.N.Am.20(3)：589-617；和Mathis等人，Dec.2001，Nature 414(6865)：792-798，它们中的每一个以引用的方式并入本文。
以前的涉及在1型糖尿病患者中引入免疫试剂的治疗方法仅保护那些还没有被免疫攻击破坏的胰岛细胞，并且不满足使胰腺重新具有拥有功能完全的β细胞的新胰岛结构的需要。这些方法组合了以减少β细胞毁灭为目的的全身性和特异性免疫调节和从成人胰腺中的祖细胞分化新胰岛细胞的方法学。
本公开所述的方法可以采用特异地抑制靶向于生产胰岛素、胰淀素、或胰高血糖素的胰腺β细胞的自身免疫细胞的活性或阻滞或破坏所述自身免疫细胞的试剂。这样的试剂包括阻止胰岛细胞毁灭的免疫调节肽。例如，一种这样的试剂为可以延迟胰岛细胞损失的进程或减慢或停止1型糖尿病发作的单克隆抗体。抗CD3抗体包括可用于本文所公开的方法的一组常规的试剂。例如，为了本公开的目的的合适的抗CD3抗体包括TolerRx正在开发的TRX4(Ala-Ala和ChAglyCD3)抗体和在以下参考文献中描述的人源化的抗CD3抗体：Herold等人，2002年5月30日，NEJM 346(22)：1692-1698，以引用的方式并入本文。在一个实施方案中，所述人源化的抗CD3抗体每年14天以下述剂量被静脉内递送：第1天1-1.42μg/kg，第2天5.67μg/kg，第3天11.3μg/kg，第4天22.6μg/kg，以及第5-14天45.4μg/kg。这些治疗每年可以在优化的HIP使用3-6月之后被重复，而由于发生了新胰岛细胞的形成，胰岛素正在逐渐减少使用。在所述优化的HIP治疗阶段期间，维生素D和普兰林肽/SYMLINTM的使用可以继续。在优化的前胰岛肽(包括HIP)和胰岛素治疗停止使用后，免疫调节可以针对抗CD3抗体每年被重复，虽然最近的研究已发现它们的效力继续长达24个月。
在另一个实施方案中，所述免疫调节化合物为可以阻止或减慢胰岛细胞毁灭的热激蛋白。这样的蛋白质包括DIAPEP277TM，DevelogenAG正在开发的热激蛋白。在一个实施方案中，DIAPEP277TM以在植物油中的40mg甘露醇中的1mg在基线被皮下递送，以第一个月1次然后以3个月两次为间隔进行。在组合治疗的一个实施方案中，优化的前胰岛肽(包括HIP)或优化的HIP类似物或衍生物与DIAPEP277TM如下被共同给予。所述DIAPEP277TM首先在基于优化的前胰岛肽(包括HIP)或类似物或衍生物的治疗开始大约30天之前，以大约1mg的剂量被皮下给予。然后DIAPEP277TM的第二次给予在所述基于优化的HIP或类似物或衍生物的治疗的开始的时间(第一次给予90天之后)进行。
在另一个实施方案中，所述免疫调节化合物为多克隆抗T淋巴细胞球蛋白(ATG)。给出ATG剂量的四个用量。ATG的第一个用量为9mg每kg体重，然后3个连续的3mg/kg剂量将在4小时内被静脉给予。在第一次ATG给予的一小时之前，将进行皮肤耐受性测试(0.2mL最终溶液)。在组合治疗的一个实施方案中，ATG在使用优化的HIP或优化的HIP类似物或衍生物之前被递送。ATG的最后的用量被递送于所述基于优化的HIP或类似物或衍生物的治疗开始最少14天之前。ATG的第二次给予可以基于对抗GAD65抗体和其他在使用ATG的初始治疗之后第24个月表明自身免疫性攻击的免疫标记的每季度测量被要求。如果指向胰腺的自身免疫抗体有显著升高，较早的治疗可以被要求。
所述优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物可以经由皮下注射，口服(经由靶向于肝的囊泡)，或其他脂质体试剂，或通过以治疗有效剂量的24小时连续皮下注入被递送，如上文所描述的。在一个实施方案中，每日剂量为约5至20mg每kg患者体重每24小时。在一个实施方案中，所述每日剂量为～600至800mg。所述基于优化的前胰岛肽或类似物或衍生物的治疗被持续给予3至6个月的时间并且通过C-肽的产生密切地监控。所述免疫治疗将基于所选的免疫试剂被周期性地递送。例如，DIAPEP277TM以3个月为间隔被给予一共6个月，并且将在基于优化的HIP或类似物或衍生物的治疗之前初始地被递送3个月。
在本文所公开的方法中有用的免疫调节试剂可以按照本领域已知的或按照本文所描述的被配制、给予、和定量给药。下面描述针对本文所公开的方法的实践的药物制剂和附加的定量给药和给予规程。
优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物的组合物，例如，和其药学上可接受的盐和酯，当与各种其他化合物组合时，为协同性地或附加性地对在治疗糖尿病或相似的失调中将祖细胞分化为新胰岛细胞有效。这些化合物包括优化的前胰岛肽(包括HIP)和其类似物或衍生物、胰淀素和/或类似物，包括但不限于醋酸普兰林肽/普兰林肽、GLP-1、GLP-1受体激动剂、例如exendin-4、利拉鲁肽(NN2211)、GLP-1类似物、二肽基肽酶-4抑制剂、GIP、仓鼠INGAP、和其他拟肠促胰岛素的激素，和/或以类似形式作用的化合物和试剂，和延长前述任何化合物和试剂的半衰期或提高前述任何化合物和试剂的水平或活性的试剂，例如，延迟GLP-1的降解的二肽基肽酶抑制剂，和抑制、阻滞或破坏靶向于β细胞的自身免疫细胞的试剂，包括但不限于：抗CD-3抗体，包括hOKT31(Ala-Ala)和ChAglyCD3、ATG、西罗莫司(雷帕霉素)、他克莫司(FK506)、热激蛋白60(DIAPEP277TM)、抗谷氨酸脱羧酶65(GAD65)疫苗、单独或与达利珠单抗结合的霉酚酸酯、抗CD20试剂利妥昔单抗、Campath-1H(抗CD52抗体)、利索茶碱和维生素D，作为胰岛素的合成的代谢非活性形式的IBC-VSO疫苗，所述IBC-VSO疫苗被设计以防止胰腺β细胞毁灭，和干扰素α接种疫苗，所述干扰素α接种疫苗使用被设计以防止胰腺β细胞毁灭的CD4+CD25+抗原特异调节性T细胞或相似的试剂的。在这个最后的实施方案中，CD4+CD25+抗原特异性调节T细胞或相似试剂的干扰素α接种疫苗在组合治疗中被使用，以直接或通过使用抗CD3免疫治疗利用调节T细胞。
诸如西罗莫司(雷帕霉素)、他克莫司(FK506)、TRX4抗体、人源化的抗CD3抗体、DYAMIDTM抗GAD65抗体和DIAPEP277TM的化合物，当被添加进优化的HIP或将祖细胞分化为新胰岛细胞的试剂的使用时，也协同性地或附加性地对在治疗糖尿病或相似的失调中有效。
药物治疗方案的改进可以通过两个具有治疗效果的试剂的组合给予获得，如果所述两个或更多个试剂的相互作用可使它们的组合效果减少共治疗中使用的一个或两个试剂的不良事件(adverse event，AE)的发生率。这种不利影响的发生率的减少可以是，例如，共治疗中使用的一个或两个试剂的较低剂量的给予的结果。例如，如果药物A当以标记的剂量单独使用时的效果为25％并且具有45％的不利事件发生率；而药物B当以标记的剂量单独使用时的效果为25％并且具有35％的不利事件发生率，但是当所述两个药物以低于每个的标记的剂量组合时，如果总体效果为35％并且不利事件发生率为20％，则具有药物治疗方案的改进。本公开提供的组合治疗包括表现出这样的改进的那些方案。
药物组合物、定量给药和给予
在优选的实施方案中，优化的前胰岛肽(包括HIP)以约0.5至约5mg/kg/天的浓度被递送，更优选地以对人分次皮下注射。所以60kg的个人将潜在地接收分成二至三次的60mg/天，即每餐后递送的20mg。在其他优选的实施方案中，优化的前胰岛肽(包括HIP)也可以通过口服胶囊方法以在约0.5至约5mg/kg/天的范围内的剂量被递送，优选地每餐后分次口服递送。
基于通过腹腔(IP)向STZ所致的糖尿病小鼠递送的以从每日两次1000微克至每日0.1微克的剂量范围的HIP2和优化的HIP2B的剂量范围研究(实施例13)，HIP2B能够以HIP2用量的大致为10％和与用于人试验中的来源于仓鼠的INGAP的剂量10mg/kg(600mg/天)相比等效的大致为1mg/kg的用量使用(图23)。
例如，在一些方面，各个实施方案涉及包含如上文所定义的化合物和药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物，或有效量的包含如上文所定义的化合物的药物组合物。
本文所公开的化合物可以以常规的方式通过它们为活性的任何途径被给予。给予可以为全身的、局部的、或口服的。例如，给予可以为但不限于肠胃外的、皮下的、静脉内的、肌内的、腹膜内的、经皮的、口服的、口腔的、或眼睛途径的、或***内的、通过吸入、通过积存注射、或通过植入物。所以，针对本公开的化合物的给予的模式(单独或与其他药物组合)可以为但不限于舌下的、可注射的(包括短效的、积存、植入物和通过皮下或肌内注射的小球形式)、或通过使用***霜剂、栓剂、***栓剂、***环、直肠栓剂、子宫内装置、和经皮的形式例如贴片和霜剂。
给予的具体模式将取决于医嘱。对具体的给予路径和剂量方案的选择由医师根据医师所知的方法进行调整或滴定(titrated)，以获得最佳的临床响应。要被给予的化合物的量为治疗上有效的量。要被给予的用量将取决于正在被治疗的受试者的特征，例如，具体的被治疗的动物、年龄、重量、健康状况，同时进行的治疗的种类(如果有的话)以及治疗的频率，并且可以由本领域的技术人员(例如，由医师)容易地确定。
含有本公开的化合物和合适的载体的药物制剂可以为固体剂型，包括但不限于片剂、胶囊、扁囊剂、小球、丸剂、粉剂和颗粒；局部剂型，包括但不限于溶液、粉剂、流体乳状液、流体悬浊液、半固体、软膏剂、糊剂、霜剂、凝胶和胶状剂(jellies)，及泡沫；以及肠胃外剂型，包括但不限于溶液、悬浊液、乳状液和干粉；包含有效量的本公开的聚合物或共聚物。本领域中还已知的是，活性成分可以与药学上可接受的稀释剂、填料、崩解剂、粘结剂、润滑剂、表面活性剂、疏水性的载体、水溶性载体、乳化剂、缓冲剂、湿润剂、增湿剂、增溶剂、防腐剂等等一起被包含在这样的制剂中。给予的手段和方法为本领域已知的并且技术人员可以参考各种药学参考资料以获得指导。例如，可以参考ModernPharmaceutics，Banker&Rhodes，Marcel Dekker，Inc.(1979)；和Goodman&Gilman′s ThePharmaceutical Basis of Therapeutics，6th Edition，MacMillan Publishing Co.，New York(1980)。
本公开的化合物可以被配制用于通过注射的肠胃外给予，例如，通过团注或连续输注。所述化合物可以通过在约15分钟至约24小时的时间内通过皮下连续输注被给予。用于注射的制剂可以以单位剂型存在，例如在安瓿或多剂量容器中，与额外的防腐剂一起。所述组合物可以采用在油性或水性媒介中的悬浊液、溶液或乳状液形式，并且可以含有配方试剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
对于口服给予，所述化合物可以通过将这些化合物与本领域中众所周知的药学上可接受的载体组合被容易地配制。这样的载体使本文所公开的化合物能够被配制为片剂、丸剂、糖衣剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浊液等等，用于由要被治疗的患者口服摄取。用于口服用途的药用制备剂可以通过添加固体赋形剂，可选地研磨所得的混合物，以及(如果期望)在添加合适的助剂之后处理颗粒的混合物获得，以获得片剂或糖衣芯。合适的赋形剂包括但不限于诸如食糖类的填料，所述糖类包括但不限于乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；纤维素制备剂，例如但不限于玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)。如果期望，可以添加崩解剂，所述崩解剂例如但不限于交聚维酮、琼脂、或藻酸或其盐，例如藻酸钠。
可以提供具有合适的包衣的糖衣芯。为了这个目的，可以使用浓的糖溶液，所述溶液可以可选地含有***树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、亮漆溶液，和合适的有机溶剂或溶剂混合物。染料或颜料可以添加进所述片剂或糖衣包衣以识别或区分活性化合物剂量的不同的组合。
可以口服使用的药用制备剂包括但不限于用明胶制得的推合式胶囊，以及用明胶和诸如甘油或山梨醇的增塑剂制得的软的密封的胶囊。所述推合式胶囊可以含有与填料(例如乳糖)、粘结剂(例如淀粉)和/或润滑剂(例如滑石或硬脂酸镁)，以及可选的稳定剂掺合的所述活性成分。在软胶囊中，所述活性化合物可以被溶解或悬浮于合适的液体中，例如脂肪油、液态石蜡或液态聚乙二醇。此外，可以添加稳定剂。所有用于口服给予的制剂应该以适合于这样的给予的用量。
对于口腔给予，所述组合物可以采用，例如，以常规的方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于通过吸入给予，针对根据本公开的用途的化合物常规地以气溶胶喷雾存在的形式，从加压的包装或喷雾器，使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体，而被递送。对于加压的气溶胶的情况，所述剂量单位可以通过提供阀门以递送计量的量来确定。用于吸入器或吹药器中的例如，明胶的舱和药筒可以被配制以含有所述化合物的粉末混合物和合适的粉末基质(例如乳糖或淀粉)。
本公开的化合物也可以被配制为直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠剂，例如，含有常规的栓剂基质例如可可脂或其他甘油酯。
除此前描述的制剂之外，本公开的化合物也可以被配制为积存制备剂。这样的长效制剂可以通过植入(例如皮下地或肌内地)或通过肌内注射给予。
积存注射可以在约1至约6个月或更长的间隔内被给予。所以，例如，所述化合物可以与合适的聚合的或疏水性的材料(例如作为在可接受的油中的乳状液)或离子交换树脂一起进行配制，或作为难溶性衍生物，例如作为难微溶性盐。
在经皮给予中，本公开的化合物，例如，可以应用于膏剂，或可以通过经皮的治疗体系应用，所述体系因此被提供给有机体。
所述化合物的药物组合物还可以包括合适的固相或凝胶相载体或赋形剂。这样的载体或赋形剂的例子包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种食糖类、淀粉、纤维素衍生物、明胶和诸如聚乙二醇的聚合物。
本公开的化合物也可以与其他活性成分组合被给予，所述活性成分例如辅助剂、蛋白酶抑制剂、或其他可配伍的药物或化合物，其中这样的组合被视为对实现本文所描述的方法所期望的效果是合乎期望的或有利的。
制备优化的HIP和其类似物或衍生物的方法
本领域已知的任何技术都可以用于合成和提纯优化的HIP或其类似物或衍生物，包括但不限于从头(de novo)化学合成以及通过沉淀提纯、吸附(例如、柱色谱法、膜吸附剂、径向流层析柱、成批吸附、高效液相色谱法(HPLC)、离子交换色谱法、无机吸附剂、疏水吸附剂、固定化金属亲和层析法、亲合色谱法)、或凝胶过滤、电泳、液相分配、清洁剂分配、有机溶剂萃取和超滤。在提纯过程中，优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物的生物活性可以通过一种或更多种体外或体内分析被监控。优化的前胰岛肽或其类似物或衍生物的纯度可以通过本领域已知的任何方法被分析，例如但不限于凝胶电泳。见Scopes，supra。在一些实施方案中，在本文所公开的组合物中使用的优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物可以在总蛋白质mg的80至100％的范围内，或总蛋白质mg的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％。在一个实施方案中，在组合物中使用的优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物，为总蛋白质的至少99％。在另一个实施方案中，优化的前胰岛肽(包括优化的HIP)或其类似物或衍生物被提纯至表观均一，如(例如)通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳所分析的。在一个实施方案中，优化的前胰岛肽(包括HIP)被合成并且使用HPLC检验直至纯度大于95％。
本领域已知的方法可以用于以重组方式生产优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物。编码优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物的核酸序列可以被***到表达载体内以在宿主细胞中进行增殖和表达。
如本文所用的表达构建体是指编码优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物的核酸序列可操作地与一个或更多个调节区关联，所述一个或更多个调节区使优化的HIP或其类似物或衍生物在合适的宿主细胞的表达成为可能。“可操作地关联”是指其中所述调节区和要被表达的优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物以允许转录和最终的翻译的方式被联接(join)和确定位置的关联。
对于优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物的转录所必需的所述调节区可以由所述表达载体提供。如果要表达缺少同源起始密码子的优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物基因序列，也可以提供翻译起始密码子(ATG)。在相容的宿主-构建体***中，细胞转录因子，例如RNA聚合酶，将结合于所述表达构建体上的所述调节区，以在宿主有机体内使所述优化的前胰岛肽(包括HIP)序列的转录发生。基因表达所需的调节区的精确性质可以在宿主细胞之间有所不同。通常，需要能够结合RNA聚合酶并促进可操作地关联的核酸序列的转录的启动子。这样的调节区可以包括那些参与转录和翻译的起始的5’非编码序列，例如TATA框、加帽序列、CAAT序列等等。编码序列的非编码区3’可以含有转录终止调节序列，例如终止子和多聚腺苷酸化位点。
为了将具调节功能的DNA序列(例如启动子)连接于优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物基因序列，或将优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物基因序列***载体的克隆位点，提供合适的匹配的限制性位点的接头(linker)或衔接子(adapter)可以通过本领域中众所周知的技术被连接于cDNA的末端。在使用限制的酶切割之后可以进行修饰以通过反向消化(digesting back)或在连接前填充单链DNA末端创建平端。或者，期望的限制性酶切位点可以通过使用含有期望的限制性酶切位点的引物的PCR扩增所述DNA被引入DNA片段。
包括与调节区可操作地关联的优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物序列的表达构建体可以被直接引入合适的宿主细胞，用于表达和生产前胰岛肽(包括优化的HIP)或其类似物或衍生物而不需要进一步克隆。所述表达构建体也可以含有帮助前胰岛肽(包括优化的HIP)或其类似物或衍生物序列向宿主细胞的基因组整合(例如，通过同源重组)的DNA序列。在这样的情况下，不一定需要采用包括适合于合适的宿主细胞的复制起点的表达载体以在所述宿主细胞中增殖和表达优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物。
可以使用多种表达载体，包括但不限于质粒、粘粒、噬菌体、噬菌粒或经修饰的病毒。这样的宿主-表达***相当于(represent)媒介，通过所述媒介，编码优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物的基因的序列可以被生产并且然后被提纯，而且还相当于当使用适合的核苷酸编码序列转化或转染时，可以原位表达优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物的细胞。这些包括但不限于，微生物，例如使用含有编码优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物的序列的重组的噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，E.coli和B.subtilis)；使用含有编码前胰岛肽(包括优化的HIP)或其类似物或衍生物的序列的重组的表达载体转化的酵母(例如，Saccharomyces，Pichia)；使用含有编码优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物的序列重组的病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞***；使用含有编码优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物的序列的重组的病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的或使用含有编码优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物的序列重组的质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的的植物细胞***；或容纳含有衍生自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或衍生自哺乳动物病毒启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的重组的表达构建体的哺乳动物细胞***(例如，COS、CHO、BHK、293、NS0、和3T3细胞)。优选地，细菌细胞(例如Escherichia coli)和真核细胞用于重组的优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物的表达。例如，哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，可以和具有来自巨细胞病毒的主要即刻早期基因的启动子元件的载体一起使用，以有效表达优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物序列。
在细菌***中，许多表达载体可以被优势地选择，取决于正在被表达的优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物的预期的使用。例如，当大量的优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物要被生产时，为了优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物的药物组合物的生成，合乎期望的是引导容易被提纯的融合蛋白产物的高水平的表达的载体。载体包括但不限于E.coli表达载体pCR2.1 TOPO(Invitrogen公司)；pIN载体，等等。载体的系列，如pFLAG(Sigma公司)，pMAL(NEB公司)和pET(Novagen公司)也可以用于表达如FLAG肽，malE-，或CBD-蛋白的融合蛋白的异体蛋白。这些重组的蛋白质可以被导入细胞周质间隙用于正确的折叠和成熟。被融合的部分可以用于被表达的蛋白质的亲和提纯。针对特异性蛋白酶(如肠激酶)的切割位点的存在允许人们切割下所述优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物。pGEX载体也可以用于表达如谷胱甘肽5-转移酶(GST)的融合蛋白的异体蛋白。通常，这样的融合蛋白为可溶性的并且可以容易地从裂解的细胞中被提纯，所述提纯是通过吸附和结合于谷胱甘肽琼脂糖珠基质然后在自由谷胱甘肽存在下洗脱。pGEX载体被设计以包括凝血酶或凝血因子Xa蛋白酶切割位点，由此被克隆的靶基因产物可以从GST部分被释放。
在昆虫***中，可以使用许多表达外源基因的载体，例如，可以使用苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)作为表达外源基因的载体。所述病毒在诸如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的细胞内生长。编码优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物的序列可以被单独克隆进所述病毒的非必需区(例如，多角体蛋白基因)并且被置于AcNPV启动子(例如，多角体蛋白启动子)的控制下。
在哺乳动物宿主细胞中，可以利用许多基于病毒的表达***。在腺病毒被用于作为表达载体的情况下，优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物的感兴趣的编码序列可以被连接于腺病毒转录/翻译控制复合物，例如，晚期启动子和三联前导序列。然后这种嵌合的基因可以通过体外重组或体内重组***腺病毒基因组。向病毒基因组的非必需区(例如，E1或E3区)***将得到在被感染的宿主中可存活并且能够表达优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物的重组的病毒。特异性起始信号也可以被要求用于编码被***的优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物的序列的有效率的翻译。这些信号包括ATG起始密码子和邻近的序列。此外，所述起始密码子必须与期望的编码序列的读码框相同，以确保对完整***的翻译。这些外源的翻译控制信号和起始密码子可以有多种来源，自然的和合成的两者。表达的效率可以通过包括合适的转录增强子元件、转录终止子等等得到增强。
此外，可以选择以合乎期望的特有的方式调节被***的序列的表达，或修饰和加工基因产物的宿主细胞菌株。对蛋白质产物的这样的修饰(例如，糖基化)和加工(例如，切割)可以对所述蛋白质的功能为重要的。不同的宿主细胞具有对蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰形式为特征的和特异性的机制。可以选择适合的细胞系或宿主系同以确保对被表达的异体蛋白的正确的修饰和处理。为了这个目的，可以使用拥有针对初级转录和基因产物的翻译后的修饰(例如基因产物的糖基化和磷酸化)的合适的加工的细胞机制的真核宿主细胞。这样的哺乳动物宿主细胞包括但不限于PC12、CHO、VERY、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0(不内源性生产任何免疫球蛋白链的小鼠骨髓瘤细胞系)、CRL7O3O、和HsS78Bst细胞。如果发现翻译后的修饰对于优化的HIP或其类似物或衍生物的期望的活性为不重要的，可以使用在细菌或酵母***中的表达。
为了合适地加工的优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物的长期的、高产率的生产，细胞中的稳定表达是优选的。稳定地表达优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物的细胞系可以通过使用含有可选择的标记的载体而被改造。以举例而非限制的形式，在所述表达构建体的引入之后，被改造的细胞可以被允许在富集的培养基中生长1-2天，并且然后转移到选择性的培养基。所述表达构建体中的可选择的标记将抗性赋予所述选择，并且取决于所采用的载体结构和宿主细胞，可以允许细胞稳定地将所述表达构建体整合于它们的染色体中并且在培养期间生长并且扩大成为细胞系。这样的细胞可以在长时间内培养，此时优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物被连续地表达。
可以使用很多选择体系，包括但不限于，抗生素抗性(标记诸如赋予对遗传霉素或G-418的抗性的Neo；对博莱霉素(Zeocin)具有抗性的Zeo；和对杀稻瘟菌素具有抗性的Bsd)；抗代谢物抗性(标记诸如赋予对甲氨蝶呤的抗性的Dhfr的)；gpt，赋予对霉酚酸的抗性；以及hygro，赋予对潮霉素的抗性。此外，变异的细胞系，包括但不限于胸苷激酶型，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶型或腺嘌呤磷酸核糖转移酶型细胞，可以与承载与胸苷激酶、次黄嘌呤、鸟嘌呤或腺嘌呤磷酸核糖转移酶相应的基因的载体组合使用。本领域普遍已知的重组DNA技术的方法可以例行地应用以选择期望的重组的克隆，150∶1。
所述重组细胞可以在标准的温度，孵育时间，光密度和培养基组成条件下被培养。然而，用于重组细胞的生长条件可以与用于优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物的表达的那些条件不同。改进的培养条件和培养基也可以用于增强优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物的生产。本领域已知的任何技术都可以应用于建立用于生产优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物的最佳条件。
从通过重组的技术或自然来源提纯以生产优化的前胰岛肽(包括HIP)或其片段的替代方法为肽合成。例如，整体的优化的HIP或其类似物或衍生物，或对应于优化的HIP或其类似物或衍生物的部分的蛋白质，可以通过使用肽合成器而被合成。可以使用常规的肽合成或本领域中众所周知的其他合成方案。
具有优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物或其部分的氨基酸序列的蛋白质可以通过固相肽合成被合成。在合成期间，具有被保护侧链的N-α-被保护氨基酸被分步地添加至正在生长的多肽链上，所述多肽链通过其C末端连接并且连接至不可溶的聚合的支撑体，即聚苯乙烯珠。蛋白质通过将N-α-脱保护氨基酸的氨基基团连接至N-α-被保护氨基酸的α-羧基基团上而被合成，所述N-α-被保护氨基酸通过与诸如二环己基碳二亚胺的试剂反应而被活化。自由氨基基团向所述活化羧基的附加(attachment)导致肽键的形成。最普遍使用的N-α-保护基团包括Boc(为对酸不稳定)和Fmoc(为对碱不稳定)。适合的化学物质、树脂、保护基团、被保护的氨基酸和试剂的细节为本领域中众所周知的并且因此不在本文中详细讨论。
所得的优化的前胰岛肽(包括HIP)或其类似物或衍生物的提纯使用常规的程序实现，例如使用凝胶渗透、分配和/或离子交换色谱的制备HPLC。适合的基质和缓冲剂的选择为本领域中众所周知的并且因此不在本文中详细描述。
通过对本发明的试剂和方法的前述的详细描述，提供以下实施例以描述本发明的各个方面。
实施例1
体外HIP活性。体外研究在宾夕法尼亚大学人类胰岛实验室进行。人类胰岛和导管部分被培养多于10天并且然后在盲性研究中被处理。放射免疫分析法被用于测量所述人类胰腺培养中的胰岛素水平，所述人类胰腺培养被用作为阴性对照的炒肽(scrambledpeptide)、HIP3、HIP1、HIP2和作为阳性对照的来源于仓鼠的INGAP处理。肽由BachemBioScience(95％纯度，研究级)合成。
复制培养在第10天和第12天被处理并且在HIP肽、对照和INGAP处理一周后，被裂解(lysed)以检测胰岛素含量。在10天的培养中，胰岛素生产量下降，并且然后，在用HIP肽处理之后，胰岛素重新被生产。
如图1所示的导管部分图描绘了y轴上的胰岛素水平，所述水平在用人类胰腺导管组织培养中孵育之后，通过放射免疫分析测量。所述胰岛部分图指示在人类胰岛组织中孵育之后的胰岛素水平。在基线的胰岛部分中的基线胰岛素水平显著高于在基线的导管部分中的基线胰岛素水平。
导管和胰岛组织使用Ricordi法进行分离。无论导管细胞还是胰岛的培养在本质上都不是完全均一的。本研究还暗示祖细胞，作为HIP的靶，在胰岛和导管培养中均被发现。重复本研究，得到相似的在以下图表中显示的结论，通过放射免疫分析，在用HIP2培养的人类导管组织之中具有增加了多达四倍的胰岛素水平。
重复的研究确认了胰岛素在占绝大多数的人类导管细胞培养和胰岛培养中均有增加，其中基线导管培养中的基线胰岛素水平始终比胰岛培养中的基线胰岛素水平低约1/3，在用HIP肽孵育之后与阴性对照相比具有在胰岛素含量上相似的上升。
实施例2
体内研究。HIP3、HIP1和HIP2已是小鼠中体内研究的对象。研究已显示这些HIP变异体在被引入糖尿病小鼠时刺激胰腺中祖细胞向新胰岛结构的分化。在小鼠中已发展出糖尿病的模型(Rosenberg等人，2004)。选择受试者数目以得到足够数目的用于本研究的糖尿病动物并且动物被随机地分配至研究组。所有动物每天两次(午前和午后)通过腹腔注射被定量给药，连续进行28天。在定量给药阶段期间，剂量给予的时间保持一致(±2小时)。在确认小鼠已经患糖尿病(血糖大于16.7mmol/L(300mg/dL))至少1星期后，小鼠被定量给药。
使用在pH4.5的柠檬酸缓冲液中的40mg/kg的链脲霉素通过腹腔注射小鼠，连续进行5天，试图使它们患糖尿病。小鼠必须曾经具有大于16.7mmol/L(300mg/dL)的血糖至少1星期，以被认为患有糖尿病。如果任何动物的血糖水平升高至400mg/dL以上，所述动物使用胰岛素处理。每3天，在每天的相同时间，在尾巴上刻一个缺口并且和收集一滴血液。使用葡萄糖计确定葡萄糖测量。组别分配和剂量水平如下在表1中：
表2.
  组别   处理   剂量水平   剂量体积   动物数目
  1   载体   0   100μL   6
  2   HIP3   250μg   100μL   6
  3   HIP1   250μg   100μL   6
  4   HIP2   250μg   100μL   6
研究终点包括以下：葡萄糖变化；胰岛素需求变化；以及死后胰腺的组织学。
胰岛素需求变化。在用HIP处理过的小鼠中可见胰岛素需求和胰岛素需求的下降速率都有显著的减少，如图2所示。用HIP2处理过的小鼠在第21天完全不需要胰岛素。
葡萄糖水平的变化。与对照比较，在所有用HIP处理过的组中，葡萄糖从基线起有平均减少，并且这种减少在所有用HIP处理过的组中都显著，如图3所示。在HIP1和对照之间平均葡萄糖降低14.7％，在HIP2和对照之间平均葡萄糖降低29.4％，并且在HIP1和对照组之间平均葡萄糖降低57.3％。所述数据显示了，与对照糖尿病小鼠相比，在所有用HIP处理过的小鼠组胰岛素需求有对显著的更快速率的减少。在小鼠胰腺中观察到HIP处理之后，有显著更多数目的胰岛，所述小鼠胰腺在每只被研究的小鼠中都被切开和复查。使用表3中的以下数据，所述胰腺被组织学家盲性评估。
表3.
  总胰岛(％增加)   总胰岛质量(μm2)(％增加)
  安慰剂   280   854364
  HIP2   454(62％)   2161782(153％)
  HIP3   410(46％)   1703513(99％)
HIP和安慰剂之间胰岛数目的差异为统计上显著的(p＝0.022)。在用HIP处理过的小鼠和用安慰剂处理过的组之间，在胰岛面积甚至有更大的增加。用HIP2处理过的组的胰岛面积为360,297μm2，用安慰剂处理过的组的胰岛面积为142,394μm2，用HIP3处理过的组的胰岛面积为283,918μm2(p＝0.05)，如图4A所示。图4B显示HIP2B提高了糖尿病小鼠中的胰岛数目。(a)在用安慰剂处理过的和用HIP处理过的小鼠中的胰岛素免疫染色的代表性图像。(b)胰岛素着色的胰岛被用黄色勾勒出轮廓以将这些结构区分于自发荧光血细胞。
还在小鼠胰腺上进行对胰岛素的免疫荧光染色，用HIP处理过的小鼠表现出更高的胰岛素染色程度，如图5所示。本小鼠胰腺组织被采集并且固定于4％全氟烷氧基树脂(PFA)中，被封闭和切片。10倍物镜，1.6optivar。
实施例3
以下实施例描述了合成和提纯HIP和优化的HIP的示例性方法。
HIP肽的合成通过由Merrifield提出的普通的固相程序(Merrifield，R.B.1963，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154)，使用标准的Fmoc保护化学(Fields，G.B.和Noble，R.L.1990，Int.J.Peptide Protein Res.35，161-214)。
树脂结合保护的肽通过在清除剂存在下使用三氟乙酸(TFA)处理被裂解和脱保护，以得到粗产物。提纯的肽产物通过反相高效液相色谱(HPLC)获得。
肽的聚乙二醇(PEG)的衍生化可以由引入分子量范围在300至43,000间的离散PEG单元组成。
实施例A：Ac-IGLHDPTQGTEPNG-NH2(HIP2B)(SEQ ID NO：7)。从Rink酰胺树脂，4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧基树脂起始，Fmoc保护的氨基酸依次地引入并且使用HOBt和DCC(N-羟基苯并***和二环己基碳二亚胺)偶联(coupled)。起始树脂和每个氨基酸的被Fmoc保护的基团的Fmoc脱保护通过二甲基甲酰胺中20％的哌啶实现。在所述N末端氨基酸Ile的Fmoc保护基团被移除之后，树脂结合保护的肽使用二氯甲烷中20％的乙酸酐被乙酰化。侧链基团的脱保护和所述肽从树脂的裂解通过伴随以2.5％水和2.5％三异丙基硅烷的95％的三氟乙酸的溶液实现。在1小时的处理之后，使用***使所述肽从裂解溶液中沉淀，过滤并干燥。
提纯。所述粗产物通过反相高效液相色谱(HPLC)在C-18支撑体(support)上被提纯，使用水中0.1％TFA和乙腈中0.1％TFA分别作为缓冲剂A和B。使用增加梯度的缓冲剂B洗脱所述产物。残留TFA与乙酸盐的交换通过再次将产物级分(fraction)施加于C-18HPLC柱上，用0.1M NH4OAc水溶液洗涤以及在水和乙腈(作为流动相)中1％乙酸的梯度下洗脱所述产物而实现。收集纯产物级分并冷冻干燥。肽的特性(identity)和均一性通过氨基酸组成分析、分析性HPLC和质谱分析确认。
实施例B：IGLHDPTQGTEPNG(HIP2)(SEQ ID NO：4)。从Fmoc-Gly-Wang树脂起始，肽序列如实施例A中被组装。氨基末端未被乙酰化，以提供具有未被封闭的自由氨基和羧基末端的肽。被提纯产物如实施例A中被分离。
实施例C：(Ac-IGLHDPTQGTEPNGC-NH2)2(HIP2B CysDimer)(SEQ ID NO：19)。肽的自由硫醇形式的合成如实施例A中描述的。粗产物通过在2mL乙酸中溶解大约2g肽并且用～500mL蒸馏水稀释被氧化以形成二聚物，pH通过逐滴添加20％NH4OH溶液被调整至～8.2。所述溶液被允许在室温下搅拌过夜。所述反应在过夜后未达到完成。为完成所述反应，添加1％铁***溶液直至保持持续的黄绿色。通过Ellman测试和HPLC分析判断所述反应的完成。然后被氧化的肽的溶液使用3-5g AG-1X2离子交换(氯化物形式)树脂搅拌30分钟，过滤，并且在HPLC提纯之前用乙酸调整pH至～5。
实施例D：(IGLHDPTQGTEPNGC)2(HIP2 Cys二聚物)(SEQ ID NO：13)。从Fmoc-Cys(Trt)-Wang树脂起始，肽序列如实施例2中被制备。如实施例C中描述的实现所述粗产物的醚沉淀，到二聚物的氧化和HPLC提纯。
实施例E：Ac-IGLHDPTQGTEPNGC-NH2(HIP2B Cys)(SEQ ID NO：16)。如实施例A中实现单体主要序列的合成和提纯。
以下实施例描述了制备封闭的HIPs的示例性方法。HIP封闭的肽通过固相肽合成(SPPS)制备。固相合成的基本前提是，当肽链的一端固定于不可溶支撑体时，氨基酸可以被组装成任何期望序列的肽。如以上提到的，在实际的SPPS中，所述肽的羧基末端连接于所述聚合物。在氨基酸的期望的序列已经共同连接于所述支撑体上之后，可以应用试剂以从所述支撑体裂解所述肽链并且将粗肽释放进溶液中。所述合成中涉及到的所有反应，如果可能的话，都进行到完成，由此能够获得均一的产物。
当肽的C末端为酰胺时，衍生物为肽酰胺。肽酰胺为极重要的衍生物，因为许多在天然存在的肽激素以酰胺的形式呈现。为了合成肽酰胺，已经开发出固相树脂，所述固相树脂在裂解时直接得到肽酰胺。当N末端为乙酰基基团时，所述肽从C末端向N末端组装。然后N末端在碱存在下使用乙酸酐被乙酰化。
Fmoc-氨基酸衍生物用于构建所述序列。在氨基酸期望的序列共同连接于所述支撑体上之后，所述肽被乙酰化、过滤和干燥。然后所述乙酰化的肽-树脂被使用含有清除剂的三氟乙酸(TFA)裂解，以从所述支撑体以及所有保护基团释放所述肽。然后使用高效液相色谱(HPLC)提纯粗材料。
实施例F：Ac-IGLHDPTQGTEPNGC(PEG)-NH2(HIP2B Cys-PEG)(SEQ ID NO：25)。来自实施例5的肽的单体已提纯形式(1.1当量)被溶解于乙酸缓冲液(0.1M，pH＝6.5)。马来酰亚胺衍生的聚乙二醇(PEG马来酰亚胺)的溶液(1当量)在蒸馏水中制备并且被在搅拌下添加进所述肽溶液。所得溶液的pH用稀NH4OH溶液被调整至～6.5，在室温下搅拌30分钟，用几滴乙酸酸化并且通过HPLC提纯。
实施例G：IGLHDPTQGTEPNGC(PEG)(HIP2 Cys-PEG)(SEQ ID NO：22)。从Fmoc-Cys(Trt)-Wang树脂起始，如实施例B中所描述的合成和提纯主要序列。如实施例F中使用PEG马来酰亚胺衍生化后接着HPLC提纯。
实施例H：(PEG)-IGLHDPTQGTEPNG(PEG-HIP2)(SEQ ID NO：91)。树脂结合的主要肽的序列如实施例2中被制备。在N末端Ile的Fmoc脱保护之后，被保护的肽树脂使用HOBT和DCC作为偶联剂通过PEG-羧酸衍生化。如实施例A中所描述的从树脂裂解并提纯(PEG)-肽。
实施例4
以下实施例阐明了被裂解为HIP2的HIP1的肌内给予和皮下给予的药物动力学。
评估了使用20只大鼠，每种给予途径5只大鼠的HIP递送的药物动力学。类似于来源于仓鼠的INGAP的发现，肌内(IM)的途径提供了所述材料的更好的血液浓度，但是通过ELISA测量确定的半衰期少于30分钟，如图6所示。
皮下(SQ)的给予途径显示出略微更长的半衰期，如图7所示，但是ELISA所检测到的水平为小于IM途径的水平。在血液中IM途径提供比SQ略微更长的半衰期。
实施例5
以下实施例显示HIP2B肽在冻融研究中的稳定性。
实验程序。本研究以二组起始，每组八个样品。一个组被保持在4-8℃而另一组保持在25℃，作为为期2个月的稳定性研究的一部分。每个样品含有在5微升蒸馏水中的4.57毫克HIP2B。每7天从每个温度组取出一个样品并且置于零下20℃的冷冻器中用于储存，直至可以进行液相色谱/质谱(LC/MS)分析。在所述稳定性研究中，在1、2和3个星期后，一系列样品通过与HIP2B的对照样品对照进行评估，所述对照样品在本研究的起始已被制备并且在-20℃储存。在上文描述的每个温度的3个星期的稳定性测试后，所有样品，如LC/MS所确定，都未发生变化，并且因此被认为在1、2和3个星期稳定。本稳定性冻融研究表明，当所述HIP序列储存在二甲亚砜(DMSO)中时，在所述HIP序列中的Pro-Asn连接处发生碳位移，当在-20℃储存在生理盐水中时，所述序列在几个月内保持稳定。
实施例6
优化的HIP展示出随时间(T)推移，对于体外对血清蛋白酶的增加的肽稳定性。
所述肽在37℃在人血浆中孵育。样品孵育进行多于1小时的时间。使用1、5、10、30和60分钟的各个时间点跟踪反应。在每个时间点的血浆蛋白酶的失活通过在100℃加热所述样品1分钟实现。在操作完成之后，所述由血浆处理的样品通过与质谱相连的反相色谱，即HPLC/LC-MS，与对照样品对照进行评估。
用HIP和优化的HIP肽处理的血浆在第1、5、10、30和60分钟进行评估。在每个时间点，0.70mL血浆被移液器移入10mL试管。向每个试管添加0.30mL HIP或优化的HIP肽的储备溶液(1.66mg/mL)，所述储备溶液在由磷酸盐缓冲的盐溶液中制备。所述血浆/肽样品在每个时间点在37℃被孵育，随后在100℃加热以使血浆蛋白酶的蛋白水解的活性失活。在失活之后，所述样品用1mL水稀释，离心并且移除上清液以进行分析。
样品在C-18反相柱(50mm×2.0mm)上分析，使用水中0.07％TFA作为缓冲液A和乙腈中0.07％TFA作为缓冲液B。使用在10min中从98％A/2％B渐进至30％A/70％B的线性梯度以0.4mL/min的流速进行。使用波长220nm的紫外线和质谱监控洗脱液。由血浆处理的肽(37℃)的色谱图和肽基准样品及血浆对照之间的对比被用于确定肽对血浆处理的相对稳定性。
对照
T＝0：血浆(0.7mL)与肽储备溶液(0.3mL)，在100℃加热1min。添加1mL水，离心。
血浆背景对照：0.7mL血浆与PBS(0.3mL)，在100℃加热1min，添加1mL水，离心。
热处理的肽基准：肽储备溶液(0.3mL)与0.7mL PBS，在100℃加热1min，添加1mL水。
未加热的肽基准：肽储备溶液(0.3mL)添加0.7mL PBS与1mL水。
结果。
HIP2(IGLHDPTQGTEPNG)(SEQ ID NO：4)在HIP2孵育仅1min.后通过新组分(≈5％)的出现得到蛋白水解的证据。所述新组分随时间推移持续增加。在30min.，所述新组分表现≈50％，并且在60min.，浓度为≈70％。主要的代谢产物被识别是GLHDPTQGTEPNG(SEQ ID NO：92)，表明主要损失N末端的异亮氨酸。此外，有证据表明出现由IGL的损失造成的少量的HDPTQGTEPNG(SEQ ID NO：93)。
HIP2B(Ac-IGLHDPTQGTEPNG-NH2)(SEQ ID NO：7)HIP2的N-乙酰化C-酰胺形式在37℃孵育1hr后看上去对血浆蛋白酶完全稳定。
HIP3(IGLHDPTQGTEPNGE)(SEQ ID NO：3)HIP3的蛋白水解的速度小于HIP2的蛋白水解的速度。在60min.后，HIP3的起始浓度为≈50％。被识别出的主要代谢产物为HDPTQGTEPNG(SEQ ID NO：93)，表明IG的损失。
HIP3B(Ac-IGLHDPTQGTEPNGE-NH2)(SEQ ID NO：5)HIP3的被封闭形式在高达1hr的血浆孵育内为完全稳定。
HIP2B Cys-Dimer(Ac-IGLHDPTQGTEPNGC-NH2)2(SEQ ID NO：19)本化合物在至少1小时内看上去为对血浆蛋白酶稳定。然而，对孵育的样品的100℃热处理以及所述T＝0对照都表明起始材料向结构为......的胱氨酸加合物的转化。
Ac-IGHDPTQGTEPNGC(C)-NH2。(SEQ ID NO：94)转化看上去是由于当所述样品在100℃加热时被来自血浆的半胱氨酸替代。
HIP2B Cys-PEG(Ac-IGLHDPTQGTEPNGC(PEG)-NH2)(SEQ ID NO：22)。本高分子量结构在高达1小时内为对血浆蛋白酶稳定。
结果。HIP2和HIP2B肽在血浆中的蛋白水解如图8所示。HIP2的结果显示在血浆中孵育仅1分钟后出现新组分(～5％)。此新组分随时间推移持续增加和表现，并且主要代谢产物被识别为初级损失了N末端异亮氨酸并且次级地损失了前三个氨基酸的HIP2序列。HIP2B表现出在37℃孵育1小时后对血浆蛋白酶完全稳定。称为HIP2B和HIP3B的HIP2和HIP3的被封闭形式在高达1小时内明显地比未被封闭的结构对血浆蛋白酶更稳定。HIP2B的二聚物和PEG衍生物也非常稳定。
实施例7
利用从被称为PANC-1的人胰腺上皮样细胞生长确立无限增殖人类细胞系的技术，评估HIP和优化的HIP对胰岛素生产的影响的体外影响。所述细胞系展示出根据适合的信号分化为其他胰腺细胞种类的能力。因此，PANC-1细胞被用作胰腺的天然存在的祖细胞的代用物。
Panc-1细胞在T75烧瓶中的含有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养。所述细胞于37℃，5％CO2孵育24小时，然后用最终浓度为167nM的HIPs处理。本处理每天进行一次共进行四天。在第五天所述细胞被破碎以获得细胞裂解液。在这些细胞提取物中，确定总蛋白质水平，并且使用50微克的总蛋白质进行蛋白质印迹分析。含有50微克蛋白质的样品在含有或不含5％的还原剂β-巯基乙醇的上样缓冲液中被稀释，并且被上样至凝胶的每个胶孔中。在电泳并且将蛋白质转移到硝化纤维素膜后，以鸡多克隆抗胰岛素抗体(ab14042，1/2000稀释)作为一抗，兔多克隆-HRP结合抗鸡(对NIT凝胶1/1000稀释，对PANC-1凝胶1/2000稀释)作为二抗，检测了胰岛素的存在。
图9为展示从PANC-1细胞的人类胰岛素表达响应于使用HIP和优化的HIP的孵育的蛋白质印迹分析。下标为A的条(panel)展示了当所述样品在非还原条件被上样时Panc-1细胞中针对胰岛素的带。结果表明，HIP2、HIP2B和二聚HIP2与PEG化的HIP2或对照相比刺激了更高的胰岛素产量。在还原条件，连接胰岛素中两个多肽链的二硫键被还原，并且因此所述链被分离，并且，在这种情况下，所述胰岛素抗体不与胰岛素反应。与非还原条件相反，胰岛素分子为完整的并且被所述抗体所识别。
图9B显示了与图9A中的膜相同的膜中所包含的总蛋白质。通过丽春红染色的总蛋白质水平的确定展示了不同泳道含有相似量的蛋白质。确定NIT-1和PANC-1细胞中的总蛋白质水平，并且使用50微克总蛋白质进行蛋白质印迹分析。含有50微克蛋白质的样品在含有或不含5％的还原剂β-巯基乙醇的上样缓冲液中被稀释，并且被上样至凝胶的每个胶孔中。
所述丽春红染色展示出，响应于不同的HIPs和优化的HIPs的胰岛素表达的不同与所述胶孔中被上样的蛋白质的量无关。而且，针对胰岛素(例如，还原条件中的膜)的信号的缺失不是蛋白质缺失的原因。
实施例8
HIP和优化的HIP肽对于PANC-1细胞系的细胞形态的影响。所述细胞使用HIP和优化的HIP肽处理四天。在图10A(以200倍放大取得于第7天)，可以看到对照条件与使用HIPs和优化的HIPs处理的细胞之间形态上的差异，后者具在组织学上更加分化的细胞(特别是由HIP2B处理的细胞中)。图10B显示了细胞形态在7天内的变化进程，对照在顶部，HIP2在中部以及HIP2B在底部。各图以200倍放大，取得于第1、2、3、5和7天。由对照处理的细胞看上去没有经历任何变化，而由HIP2和HIP2B处理的细胞显著地偏离它们初始的外观。图10C展示了当HIP2 Dimer和HIP2 PEG在PANC-1细胞培养中被处理时在形态变化的进程。总体来说，由对照处理的细胞没有经历任何显著的视觉变化，由HIP2和HIP2B处理的细胞显著地偏离它们初始的外观。
实施例9
人胰腺组织培养中的HIP2B活性。宾夕法尼亚大学人类胰岛实验室展示了在人胰腺导管细胞培养中HIP和优化的HIP肽的影响。人类胰腺细胞的导管级分在胶原基质中培养10天，然后每隔一天使用HIP2B处理。细胞使用针对CK19的双抗体染色(针对导管组织的标记物)和DAPI染色做标记，以显示细胞核和胰岛素。如图11所示，细胞经历形态上的变化，所述变化诱导胰岛素在在非诱导时为胰岛素阴性的细胞中的表达。
实施例10
HIP和优化的HIP肽在非肥胖糖尿病模型中的影响的试点数据。
与由STZ处理的小鼠(见上文)的增加了的胰岛质量、面积和数目的数据相一致，试点的NOD小鼠模型展示出针对优化的HIP在胰岛新生方面提供更好的效力的潜力的初步的证据，如由在HIP处理39天后的小鼠的C-肽水平所测量的。
所述非肥胖糖尿病(NOD)模型被用作针对1型自身免疫糖尿病的模型。糖尿病的这种形式为最具挑战性，在于对胰腺和其胰岛素产量的潜在破坏是由自身免疫性攻击导致的。因此，为了显示在这种形式的糖尿病中确切的胰岛新生，必须与HIP组合使用免疫耐受剂。所述NOD小鼠模型为极度困难的模型。因为许多小鼠可能仅暂时地成为患糖尿病的小鼠并得到缓解，而其他发展为严重的糖尿病。在这种转基因小鼠模型中的定时干涉难以确定。
在使用免疫耐受剂，利索茶碱(lysophylline，LSF，正在开发中)的初步研究中，三只NOD小鼠患上糖尿病并且随机地施以安慰剂与LSF，HIP2与LSF，以及HIP2B与LSF。如图12所示，在适合的时间接收到LSF的组中，与单独由LSF处理的在研究中始终具有逐步升高的葡萄糖的NOD小鼠相比，两个由HIP处理的组在所述研究期间以稳定改善的葡萄糖水平作为响应。虽然并非统计上显著的研究，这些数据提供了针对免疫耐受剂和HIP组合以治疗1型糖尿病的探索的非常可信的证据。
实施例11
HIP2B和HIP2对HIP受体的影响。以下成套的研究展示了，在针对与HIP的细胞质膜受体之间的相互作用中以及在从受体到细胞核的运输(trafficking)中，HIP2B与HIP2同样有效。针对人类前胰岛肽的受体在稳定的人类胰腺细胞系中使用双抗体方法被标记。第一抗体为兔多克隆，并且第二抗体为使用Cy3荧光染料标记的羊-抗兔。
这些细胞通常生长在无血清培养基(SFM)中，并且当使用胰蛋白酶处理时，被去稳定并使其有能力经历发育的变化。细胞在含有及不含HIP的无血清培养基中以及在含有胰蛋白酶的无血清培养基(TSFM)中培养。这是为了显示简单的去稳定，不激活发育的变化。
当在稳定条件下使用HIP处理时，不导致变化。当在发育的优质条件下由HIP处理时，被标记的受体通过被细胞质膜包覆并移动至核膜响应HIP的存在，所述核膜是接收针对分化的信号的地点。
当在稳定条件下使用HIP处理时，不导致变化。当在发育的优质条件下由HIP处理时，被标记的受体通过被细胞质膜包裹并移动至核膜响应HIP的存在，所述核膜是接收针对分化的信号的地点。
图13展示了由胰蛋白酶处理的并在无血清培养基中孵育的PANC-1细胞分化成胰岛细胞团。HIP受体在人类胰腺细胞分化期间被上调并且看上去与HIP2和HIP2B相互作用。HIP2和优化的HIP2B刺激了从细胞质膜上的HIP受体向刺激胰腺祖细胞分化成产生胰岛素的新胰岛的细胞的细胞核的移动。
图14展示了由Cy3标记的在(A)单独的TSFM和(B)具150μM(优化的HIP2B)的TSFM中48小时的兔-抗人HIP受体的抗体。HIP刺激所述与受体膜结合的蛋白质被细胞质膜包覆并被运送至核膜。
图15展示了优化的HIP2B对HIP受体(EXTL3)的影响的重复的免疫荧光分析。上条显示了EXTL3的Cy3免疫荧光染色(红色)。在图的下条中EXTL3的Cy3免疫染色已经被细胞核的DAPI(蓝色)染色所覆盖。细胞在标准的生长培养基中生长作为对照，并且与HIP存在或不存在下在无血清培养基中生长的细胞相比较。黄色箭头展示了在标准的生长培养基中生长的EXTL3的表面表达的例子。细胞的边界清晰，表明EXTL3在质膜上的表面表达。黄色箭头勾勒出细胞的边界，而细胞核显示为蓝色。中间的图像为在SFM中生长的细胞。EXTL3定位于细胞质中，如细胞质的Cy3染色所表明的。绿色箭头表示在细胞核的位置缺乏染色。在生长于SFM中的细胞的下方图中绿色箭头展示出细胞核的鲜明的蓝色DAPI染色，表明EXTL3在细胞核中的缺失。在生长于SFM和HIP中的细胞的上方图中，由蓝色箭头指示的EXTL3免疫染色在核中的存在表明EXTL3向核迁移。在生长于SFM和HIP中的细胞的下方图中，蓝色箭头表明细胞核的位置。在下方图中有EXTL3-Cy3染色和细胞核DAPI染色的重叠，证实了EXTL3在细胞核的定位(蓝色箭头)。在所有图像中比例尺为20μm。
图16展示了优化的HIP2B增进HIP受体(EXTL3)在PANC-1细胞中从细胞质膜向细胞核的迁移。细胞质内和细胞核级分中的HIP(EXTL3)水平的蛋白质印迹分析在所示的时间点分离。蛋白质印迹分析展示了在无HIP的SFM中培养6小时后观察到HIP受体(EXTL3)的更高的细胞核水平。向培养基质中添加HIP2和HIP2B增进EXTL3细胞核的迁移，这由这种蛋白质在30分钟的更高的核水平展示。这些比较表明，在HIP存在下，EXTL3从细胞质腔(compartment)向细胞核的增进的迁移时间，并且所述EXTL3核迁移可以通过HIP的存在进行调整。蛋白质印迹为使用这些细胞和时间点得到的重复的结果。
实施例12
在随机的HIP2、HIP2B相对安慰剂的安慰剂对照研究中，八十(80)只小鼠用STZ处理以诱导糖尿病。小鼠被监控，直至它们达到与糖尿病的发作相一致的高血糖的水平。用于干涉小鼠的基线葡萄糖水平平均化为300+/-6mg/dL，并且在HIP干涉组和安慰剂组之间的葡萄糖水平中没有统计上显著的不同(p＝0.301)。
36天后，所有HIP处理的小鼠不需要胰岛素，并且与安慰剂组相比，葡萄糖有显著的下降趋势。随机挑选的小鼠在对它们的胰腺的免疫组织化学进行研究的过程期间被宰杀。进行对于血清的C-肽分析。在干涉的39天之后，在接下来的60天内，每天将测试剩余的小鼠的葡萄糖水平和总体健康状况。
初步的评估展示了，HIP处理导致与安慰剂相比有38.7％的减少(p＜0.05)。此外，HIP2形成HIP2B的稳定化未使体内活性下降。
如图17所示，HIP处理导致116mg/dL的葡萄糖水平较安慰剂低(↓38.7％，p＜0.05)。所有HIP处理的小鼠都脱离胰岛素。HIP处理过的小鼠的56％(9/16)具有小于230mg/dL的葡萄糖水平。安慰剂处理的小鼠的9％(1/11)具有小于230mg/dL的葡萄糖水平。HIP2B在37摄氏度下在体外在血清中显著地更稳定。HIP2B还在盐溶液中具有更长的半衰期。对HIP2的形成HIP2B的修饰未削弱体内活性。
为评估HIP2B的治疗潜力，利用了由STZ诱导的糖尿病小鼠模型。六十只C57BL/6J小鼠使用在柠檬酸缓冲液(pH 4.5)中50mg/kg的STZ腹膜内注射，注射连续5天，以使它们患糖尿病。当血糖水平在连续两天内都为≥200mg/dL时，小鼠被随机选择用于本研究。每日使用一滴血液监控血糖，所述血液通过在尾巴顶端割出刻痕收集。使用葡萄糖计确定葡萄糖的测量。如果任一动物中的血糖水平升高至≥324mg/dL，所述动物使用胰岛素处理(1单位每天，甘精胰岛素，肌内)直至血糖降至324mg/dL以下。做胰岛素定量给药的记录，由此能够进行对胰岛素需求的比较。额外的3只动物不用STZ处理，并用于确立非糖尿病基线值。
将动物分配为三组，如表4所示。使用载体对照、HIP2(300μg)或HIP2B(300μg)对糖尿病动物进行连续39天的每天两次(午前和午后)腹腔注射。来自处理组(arms)(组1-3)的每个的小鼠在第39天被宰杀。在宰杀的前一天的晚上，所有小鼠被禁食，得到在宰杀之前测量的的午前葡萄糖水平，所述午前葡萄糖水平被认为是空腹葡萄糖水平。保持剩余的动物组从第40-60天无医学干涉。它们每天接受午前葡萄糖测量和胰岛素给予(在合适的情况下)。研究终点包括以下：1)血糖变化和2)胰岛素需求变化。
表4：使用STZ所致的糖尿病小鼠的随机分组
  组   处理   用量   剂量水平   剂量体积   动物数目
  1   载体   每天注射2IP，共39天   0   100μL   20
  2   HIP2   每天注射2IP，共39天   300μg   100μL   20
  3   HIP2B   每天注射2IP，共39天   300μg   100μL   20
在本研究的过程期间，HIP2和HIP2B组的血糖水平较之对照组都具有显著的降低。然而，两个HIP组的血糖水平之间没有不同。图17展示了到第36天为止，对HIP2形成HIP2B的修饰未削弱体内活性。HIP处理导致116mg/dL的葡萄糖水平较安慰剂低(↓38.7％，p＜0.05)。所有使用HIP处理的小鼠都脱离胰岛素。用HIP处理过的小鼠的百分之五十六(56)(9/16)具有小于230mg/dL的葡萄糖水平。安慰剂处理的小鼠的百分之九(9)(1/11)具有小于230mg/dL的葡萄糖水平。
图17为描绘在给予HIP2、HIP2B和安慰剂之后STZ-糖尿病小鼠模型中的平均每日葡萄糖水平的图。平均基线葡萄糖水平为300mg/dL±2mg/dL，在安慰剂和HIP处理的组之间没有显著的不同(p＝0.301)。
图18为描绘由HIP2B处理的组(绿色)和对照(紫色)和安慰剂组的小鼠中每日葡萄糖水平的图。每个组的线的斜率(图18)代表葡萄糖水平的变化的速率，我们称为“再生速度”。在本研究从第1天至第39天的过程中，HIP2B处理导致葡萄糖水平下降的速率(再生速度)为-0.602，与其相比，用安慰剂处理的组的葡萄糖水平升高的速率为+0.381。
图19展示在本研究的第1天和第38天的葡萄糖的不同，比较HIP2B、HIP2和安慰剂。图19展示了在干涉的开始和结束时在优化的HIP2B接收者(黄色)、由HIP2(绿色)和由对照(蓝色)处理的组的小鼠之间改善了的葡萄糖控制。对照组具有相对于基线有28.9mg/dL至334.6mg/dL的平均增加。HIP2B和HIP2组相对于基线有显著减少，HIP2B组具有235.3mg/dL的平均非空腹葡萄糖(相对于对照p＝0.024)并且HIP2组具有231.6mg/dL的平均非空腹葡萄糖(相对于对照p＝0.029)。
图20展示了在本研究结束时在处理组之间的空腹葡萄糖水平。所述优化的HIP2B处理的组在研究结束时具有106.7mg/dL±0.58mg/dL(p＝0.046)的空腹葡萄糖，而由安慰剂处理的对照具有258.00±84.5mg/dL的平均空腹葡萄糖。用未被封闭的HIP2处理过的小鼠具有115.3mg/dL±16.5mg/dL(p＝0.050)的平均空腹葡萄糖，与用安慰剂处理过的组比较。
图21展示了在所述处理过程之后且在宰杀之前在动物上进行的葡萄糖耐量测试结果。在37摄氏度优化的HIP2B在体外在血清中显著地更稳定。优化的HIP2B在盐溶液中还具有更长的半衰期。对HIP2的形成HIP2B的修饰未削弱体内活性。
实施例13
为评估HIP2B的治疗潜力以及为显著改善糖血控制所必需的HIP2B最低有效剂量，进行利用由STZ诱导的糖尿病小鼠模型的剂量响应研究。
图22展示了，当在小鼠的糖尿病模型中以变化的药剂量递送，以确定产生最大效力的最低潜在用量时，为评估和比较优化的HIP2B在葡萄糖控制上的效果，而进行的HIP2B的剂量响应分析的结果。本研究为在由STZ处理的小鼠模型中为了确定五种浓度的HIP2B对糖血控制和糖尿病衰减的影响的随机的试验。处理组在100uL生理盐水中优化的HIP2B的最大1000微克BID至0.1微克BID的范围内变化。所述六个研究组为以下所列。
Figure GPA00001123003700501
在每天～09:00至11:00检查小鼠的葡萄糖水平，无论喂养模式如何。由于在每天葡萄糖测量时间的潜在的葡萄糖变化，每天在每个处理组计算五天移动的平均葡萄糖值。HIP2B浓度的影响通过以下进行评估：1)平均葡萄糖水平，以及2)如通过将干预组中的血糖漂移与对照组相比所确定的，HIP2B变化的浓度减轻葡萄糖毒性的发展的程度。
图22描绘了在由STZ处理的小鼠中进行的剂量响应研究并且确认了在由10、100和1000微克BID处理的糖尿病小鼠中效力是等效的。对小于1mg/kg的定量给药，在小鼠中有削弱的效力的信号，所述信号对应于0.1和0.01mg/kg的剂量水平。
优化的HIP2B对于治疗糖尿病在许多方面与传统治疗(例如胰岛素)截然不同。HIP2B初始了导致胰岛新生的信号级联(signal cascade)。与胰岛素(其中响应的效力主要通过其即刻的葡萄糖减少能力被测量)相反，任何胰岛新生剂的药效学响应在几天和几星期期间被测量。所以，胰岛新生剂(例如HIP2B和INGAP)的效力不仅可以通过在重复的每天定量给药之后的糖血控制的长期修复被评估，还可以通过高血糖的减轻和/或正常血糖实现的速率被评估。所有HIP处理组都接近正常血糖。
剂量衰减响应被计算为平均葡萄糖的变化，其中最大可获得响应等于糖尿病被减轻的最大程度。在本评估中，我们报道了响应于每单位剂量的的变化，如通过在本研究全过程中每个处理组的最大血糖漂移与对照组的血糖漂移的不同所计算的。对照组不具有疾病的减轻并且得到100％的疾病诱导。HIP2B剂量减轻这种效果的程度被描述为在每个处理组中相对于安慰剂组的疾病的％减轻。
图23描绘了HIP2B的变化的浓度对糖尿病的减轻的影响。三个最高治疗水平中的每个将糖尿病的严重性减轻至相同的程度。HIP的两个最低治疗剂量(0.1和1微克每天递送的BID)没有展示出像所述三个较高用量一样最佳的响应。
在剂量水平0.1和1微克BID，HIP2B的响应展示出高于安慰剂的疾病衰减。当HIP2B浓度提高至10微克BID，得到最大的效力和糖尿病减轻。在剂量水平1000、100和10微克BID，糖尿病被减轻至在安慰剂组中所看到的最大疾病状态的60％至70％之间。从这些结果，我们得到结论，即HIP2B的将提供最佳效力的最低剂量水平为在小鼠中1-10微克BID或在人中等效于0.5-1.0mg/kg(30-60mg BID)的人类剂量的范围内。本剂量为用于2B期INGAP试验的剂量(600mg/天)的约1/10。
实施例14
进行药物动力学研究以确认使用所述优化的HIP2B结构实现的生物利用度的改进。绝对生物利用度和药效学研究在Sprague Dawley大鼠中，在HIP2、优化的HIP2B和INGAP的静脉内和皮下的剂量给予之后进行(图24)。目的为确定在两个不同途径的给予之后，HIP2、优化的HIP2B和INGAP在雄性大鼠中的吸收、绝对生物利用度和血浆水平。
六个组，每组五只雄性Sprague Dawley大鼠，以静脉内和皮下途径被给予HIP2、HIP2B或INGAP，如以下的表格中。
  组   给予途径   测试项   正常浓度(mg/mL)   剂量体积(mL/kg)   正常剂量水平(mg/kg)
  1   皮下   HIP2   2   2   4
  2   静脉内   HIP2   2   2   4
  3   皮下   HIP2B   2   2   4
  4   静脉内   HIP2B   2   2   4
  5   皮下   INGAP   2   2   4
  6   静脉内   INGAP   2   2   4
在第5、10、15、30分钟和45分钟从每组的五只动物中从颈内静脉导管收集十个连序的血液血浆样品(每个0.03mL)，然后在剂量后1、2、3、8和24小时收集样品。血浆被收集到含有EDTA的管中。收集后，样品在冷包装中保持冷却，之后被离心，并且转移至预先标记的微量离心管以在-70℃或以下储存。
每个200μL的大鼠血浆样品被添加进含有1mL乙腈(0.07％三氟乙酸，TFA)的微量离心管，并且使用旋涡混合器搅拌1分钟。然后离心以移除沉淀的血浆蛋白质。上清溶液被移除并使用Speed Vac进行蒸发至干燥。向含有所述被干燥的沉淀物的微离心管添加200μL的20∶80乙腈∶水(含有0.07％TFA)。所述样品被离心以移除任何不可溶材料，并且将上清液溶液转移至分析瓶用于LC/MS MS分析。质谱被校准以检测针对HIP2B(M＝286.0)、HIP2(M＝287.1)和INGAP(M＝212.2、356.1、373.9)的各自基准样品的每个，观察到的最丰富的一种或多种子离子。优化的HIP2B、HIP2和INGAP血浆样品在C-18反相柱(50mmx2.0mm，Varian Pursuit XRS3)上分析，使用水中0.07％TFA作为缓冲液A以及乙腈中0.07％TFA作为缓冲液B。使用从98％A/2％B在9min中渐进至100％B的线性梯度以0.4mL/min的流速进行。
以下血浆对照如上文所描述的进行处理并且用于建立标准的浓度曲线：
1.空白血浆作为背景对照
2.含有6.7×104、6.7×103、6.7×102、67和6.7ng/mL的HIP2B、HIP2和INGAP的五个标准的血浆样品
还通过LC/MS MS分析优化的HIP2B、HIP2和INGAP的保留的药剂量样品，以确定在注射时每个的浓度。分析确认了所述浓度(在实验误差内)为2mg/mL。所有动物在剂量后的所有时间以及每种途径的给予之后表现正常。HIP2和INGAP：在HIP2的静脉内或皮下给予后，仅在给药之后的五分钟观察到非常低水平的HIP2，所有接下来的样品都低于定量限度。在INGAP的静脉内或皮下给予之后，所有被测量的血浆样品都低于定量下限。作为结果，不能够计算在静脉内和皮下的剂量给予之后HIP2和INGAP的血浆药物动力学参数。
在HIP2B静脉内给予之后，HIP2B血浆浓度以单相形式减少，具有0.19小时(11分钟)的平均末期血浆半衰期。平均Cmax为8237ng/mL，发生于5分钟的第一取样时间点。平均C0估计为18805ng/mL。平均AUC0-∞为2231ng*hr/mL。表观平均血浆清除率为1.9L/hr/kg，具有0.48L/kg的表观平均分布容积。
在优化的HIP2B的皮下给予之后，被吸收的HIP2B以单相形式减少，具有0.34小时(20分钟)的平均末期血浆半衰期。平均AUC0-∞为1932ng*hr/mL。表观平均Cl/F为2.1L/hr/kg，具有1L/kg的表观平均V2/F。HIP2B的绝对皮下生物利用度为87％。图25展示了优化的HIP2B的皮下给予的药物动力学，优化的HIP2B血浆水平在直至2小时内为可检测的，具有～20分钟的t1/2，e。
INGAP血浆浓度在任何时间点都为不可检测的，表明INGAP被迅速地清除和/或代谢。优化的HIP2B血浆水平在皮下剂量给予之后相对于HIP2或INGAP显著地更高。基于所观察到的有多重峰的LC/MS色谱血浆谱图，优化的HIP2B与HIP2和INGAP相比十分不可能在体内迅速地代谢。HIP2B的生物利用度为87％。
图24展示了作为药物动力学分析的一部分的对来源于大鼠血浆的优化的HIP2B、HIP2和INGAP样品的LC/MS MS分析，在药物动力学分析中，通过皮下或经由静脉内注射以4mg/kg剂量给予HIP2B、HIP2和INGAP。
在皮下给予之后，HIP2B水平在直至1.5小时内为可检测的。T1/2大致为0.5小时。在第5分钟检测到非常低水平的HIP2，在第5分钟后没有后续的检测。基于所观察的有多重峰的LC/MS色谱谱图，优化的HIP2B与HIP2相比在体内的代谢更慢。
INGAP的浓度在任何时间点都为不可检测的，表明INGAP被迅速地清除和/或代谢。以下表格汇总了本数据。
比较药物动力学分析
  肽   途径   剂量(mg/kg)   C0(ng/mL)   Cmax(ng/mL)   Tmax(h)   C1h(ng/mL)   AUC(0-∞)(ng*h/mL)   T1/2(h)   F
  HIP2B   SQ   4   na   2739   0.167   611.5   1932   0.34   0.87
  IV   4   18805   8237   0.083   114   1614.3   0.19   na
  HIP2   SQ   4   na   32   0.083   0   2.7   0.02   0.01
  IV   4   18805   29   0.083   0   441.9   0.02   na
  INGAP   SQ   4   na   0   na   0   0   ＜0.025   0
  IV   4   18805   0   na   0   439.5*   ＜0.025   na
n＝5；na＝不可用
*外推得出的
我们得到结论，即优化的HIP2B的血浆水平在皮下给予之后相对于HIP2或INGAP显著地更高。HIP2B血浆水平在静脉内给予之后相对于HIP或INGAP显著地更高。在静脉内注射之后，优化的HIP2B显示出与时间相关的耗尽，在第45min具不可检测的浓度。T1/2大致为9分钟。仅在第5分钟的时间点观察到HIP2，并且INGAP在任何时间点都为不可检测的，表明二者都迅速地被清除和/或代谢。
虽然本发明已经参照某些优选的实施方案被相当详细地描述，但是其他形式也是可能的。因此所附的权利要求的精神和范围不应限于本说明书和本说明书中包含的优选的形式。
序列表
<110>CureDM，Inc.
     Levetan，Claresa S.
<120>使用前胰岛肽及其类似物的组合物和方法
<130>132163.00502
<150>US 60/969,019
<151>2007-08-30
<150>US 60/979,526
<151>2007-10-12
<150>US 60/991,964
<151>2007-12-03
<150>US 61/031,479
<151>2008-02-26
<160>94
<170>PatentIn版本3.5
<210>1
<211>528
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<400>1
atgctgcctc ccatggccct gcccagtgta tcttggatgc tgctttcctg cctcatgctg     60
ctgtctcagg ttcaaggtga agaaccccag agggaactgc cctctgcacg gatccgctgt    120
cccaaaggct ccaaggccta tggctcccac tgctatgcct tgtttttgtc accaaaatcc    180
tggacagatg cagatctggc ctgccagaag cggccctctg gaaacctggt gtctgtgctc    240
agtggggctg agggatcctt cgtgtcctcc ctggtgaaga gcattggtaa cagctactca    300
tacgtctgga ttgggctcca tgaccccaca cagggcaccg agcccaatgg agaaggttgg    360
gagtggagta gcagtgatgt gatgaattac tttgcatggg agagaaatcc ctccaccatc    420
tcaagccccg gccactgtgc gagcctgtcg agaagcacag catttctgag gtggaaagat    480
tataactgta atgtgaggtt accctatgtc tgcaagttca ctgactag                 528
<210>2
<211>15
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>2
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1                5                  10                  15
<210>3
<211>15
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>3
Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly
1                5                  10                  15
<210>4
<211>14
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>4
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly
1                5                   10
<210>5
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<212>PRT
<213>人类
<220>
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<400>5
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<210>6
<211>15
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>SITE
<222>(1)...(1)
<223>酰化
<220>
<221>AMIDATION
<222>(15)...(15)
<400>6
Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly
1                5                  10                  15
<210>7
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<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>SITE
<222>(1)...(1)
<223>酰化
<220>
<221>AMIDATION
<222>(14)...(14)
<400>7
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly
1                5                   10
<210>8
<211>16
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>8
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly Glu Cys
1                5                   10                 15
<210>9
<211>16
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>9
Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly Cys
1                5                   10                 15
<210>10
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<212>PRT
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<400>10
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly Cys
1                5                   10                 15
<210>11
<211>15
<212>PRT
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<220>
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<400>11
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly Cys
1                5                   10                 15
<210>12
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<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>DISULFID
<222>(17)...(17)
<400>12
Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly Glu
1                5                   10                  15
Cys
<210>13
<211>15
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>DISULFID
<222>(15)...(15)
<400>13
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly Cys
1                5                   10                  15
<210>14
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<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>SITE
<222>(1)...(1)
<223>酰化
<220>
<221>AMIDATION
<222>(16)...(16)
<400>14
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly Glu Cys
1                5                   10                 15
<210>15
<211>16
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>SITE
<222>(1)...(1)
<223>酰化
<220>
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<222>(16)...(16)
<400>15
Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly Cys
1                5                   10                  15
<210>16
<211>15
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>SITE
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<223>酰化
<220>
<221>AMIDATION
<222>(15)...(15)
<400>16
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly Cys
1                5                   10                 15
<210>17
<211>16
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>SITE
<222>(1)...(1)
<223>酰化
<220>
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<222>(16)...(16)
<220>
<221>AMIDATION
<222>(16)...(16)
<400>17
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly Glu Cys
1                5                   10                 15
<210>18
<211>16
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>SITE
<222>(1)...(1)
<223>人类
<220>
<221>DISULFID
<222>(16)...(16)
<220>
<221>AMIDATION
<222>(16)...(16)
<400>18
Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly Cys
1                5                   10                 15
<210>19
<211>15
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>SITE
<222>(1)...(1)
<223>酰化
<220>
<221>DISULFID
<222>(15)...(15)
<220>
<221>AMIDATION
<222>(15)...(15)
<400>19
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly Cys
1                5                   10                 15
<210>20
<211>16
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>SITE
<222>(16)...(16)
<223>聚乙二醇化
<400>20
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly Glu Cys
1                5                   10                 15
<210>21
<211>16
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>SITE
<222>(16)...(16)
<223>聚乙二醇化
<400>21
Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly Cys
1                5                  10                  15
<210>22
<211>15
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>SITE
<222>(15)...(15)
<223>聚乙二醇化
<400>22
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly Cys
1                5                   10                 15
<210>23
<211>16
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>SITE
<222>(1)...(1)
<223>酰化
<220>
<221>SITE
<222>(16)...(16)
<223>聚乙二醇化
<220>
<221>AMIDATION
<222>(16)...(16)
<400>23
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly Glu Cys
1                5                   10                 15
<210>24
<211>16
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>SITE
<222>(1)...(1)
<223>酰化
<220>
<221>SITE
<222>(16)...(16)
<223>聚乙二醇化
<220>
<221>AMIDATION
<222>(16)...(16)
<400>24
Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly Cys
1                5                   10                 15
<210>25
<211>15
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>SITE
<222>(1)...(1)
<223>酰化
<220>
<221>SITE
<222>(15)...(15)
<223>聚乙二醇化
<220>
<221>AMIDATION
<222>(15)...(15)
<400>25
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly Cys
1                5                   10                 15
<210>26
<211>15
<212>PRT
<213>金仓鼠(Mesocricetus auratus)
<400>26
Ile Gly Leu His Asp Pro Ser His Gly Thr Leu Pro Asn Gly Ser
1                5                   10                  15
<210>27
<211>15
<212>PRT
<213>金仓鼠(Mesocricetus auratus)
<400>27
Ile Gly Leu His Asp Pro Ser His Gly Thr Leu Pro Asn Gly Ser
1                5                  10                   15
<210>28
<211>175
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>28
Met Leu Pro Pro Met Ala Leu Pro Ser Val Ser Trp Met Leu Leu Ser
1                5                  10                   15
Cys Leu Ile Leu Leu Cys Gln Val Gln Gly Glu Glu Thr Gln Lys Glu
            20                   25                 30
Leu Pro Ser Pro Arg Ile Ser Cys Pro Lys Gly Ser Lys Ala Tyr Gly
        35                  40                  45
Ser Pro Cys Tyr Ala Leu Phe Leu Ser Pro Lys Ser Trp Met Asp Ala
    50                   55                  60
Asp Leu Ala Cys Gln Lys Arg Pro Ser Gly Lys Leu Val Ser Val Leu
65                  70                  75                  80
Ser Gly Ala Glu Gly Ser Phe Val Ser Ser Leu Val Arg Ser Ile Ser
                85                  90                  95
Asn Ser Tyr Ser Tyr Ile Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly
            100                 105                 110
Ser Glu Pro Asp Gly Asp Gly Trp Glu Trp Ser Ser Thr Asp Val Met
        115                 120                 125
Asn Tyr Phe Ala Trp Glu Lys Asn Pro Ser Thr Ile Leu Asn Pro Gly
    130                 135                 140
His Cys Gly Ser Leu Ser Arg Ser Thr Gly Phe Leu Lys Trp Lys Asp
145                 150                 155                 160
Tyr Asn Cys Asp Ala Lys Leu Pro Tyr Val Cys Lys Phe Lys Asp
                165                 170                 175
<210>29
<211>14
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>29
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Ser Glu Pro Asp Gly
1                5                  10
<210>30
<211>16
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>30
Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly Glu
1                5                  10                  15
<210>31
<211>16
<212>PRT
<213>黑猩猩(Pan troglodytes)
<400>31
Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Ser Glu Pro Asp Gly Gly
1                5                   10                  15
<210>32
<211>16
<212>PRT
<213>金仓鼠(Mesocricetus auratus)
<400>32
Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Ser His Gly Thr Leu Pro Asn Gly Ser
1                5                   10                  15
<210>33
<211>16
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>33
Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Met Gly Gln Gln Pro Asn Gly Gly
1                5                   10                 15
<210>34
<211>16
<212>PRT
<213>大鼠(Rattus norvegicus)
<400>34
Trp Ile Trp Leu His Asp Pro Thr Met Gly Gln Gln Pro Asn Gly Gly
1                5                   10                 15
<210>35
<211>16
<212>PRT
<213>牛(Bos taurus)
<400>35
Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Glu Gly Ser Glu Pro Asp Ala Gly
1                5                  10                  15
<210>36
<211>16
<212>PRT
<213>狗(Canis familiaris)
<400>36
Trp Met Gly Leu His Asp Pro Thr Glu Gly Tyr Glu Pro Asn Ala Asp
1                 5                  10                 15
<210>37
<211>16
<212>PRT
<213>绵羊(Ovis aries)
<400>37
Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Glu Gly Ser Glu Pro Asn Ala Gly
1                5                   10                 15
<210>38
<211>15
<212>PRT
<213>黑猩猩(Pan troglodytes)
<400>38
Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Ser Glu Pro Asp Gly
1                5                  10                   15
<210>39
<211>15
<212>PRT
<213>金仓鼠(Mesocricetus auratus)
<400>39
Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Ser His Gly Thr Leu Pro Asn Gly
1                5                  10                   15
<210>40
<211>15
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>40
Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Met Gly Gln Gln Pro Asn Gly
1                5                   10                 15
<210>41
<211>15
<212>PRT
<213>大鼠(Rattus norvegicus)
<400>41
Trp Ile Trp Leu His Asp Pro Thr Met Gly Gln Gln Pro Asn Gly
1                5                   10                  15
<210>42
<211>15
<212>PRT
<213>牛(Bos taurus)
<400>42
Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Glu Gly Ser Glu Pro Asp Ala
1                5                  10                   15
<210>43
<211>15
<212>PRT
<213>狗(Canis familiaris)
<400>43
Trp Met Gly Leu His Asp Pro Thr Glu Gly Tyr Glu Pro Asn Ala
1                5                   10                 15
<210>44
<211>15
<212>PRT
<213>绵羊(Ovis aries)
<400>44
Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Glu Gly Ser Glu Pro Asn Ala
1                5                   10                  15
<210>45
<211>14
<212>PRT
<213>黑猩猩(Pan troglodytes)
<400>45
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Ser Glu Pro Asp Gly
1                5                  10
<210>46
<211>14
<212>PRT
<213>金仓鼠(Mesocricetus auratus)
<400>46
Ile Gly Leu His Asp Pro Ser His Gly Thr Leu Pro Asn Gly
1                5                  10
<210>47
<211>14
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>47
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Met Gly Gln Gln Pro Asn Gly
1                5                  10
<210>48
<211>14
<212>PRT
<213>大鼠(Rattus norvegicus)
<400>48
Ile Trp Leu His Asp Pro Thr Met Gly Gln Gln Pro Asn Gly
1                5                  10
<210>49
<211>14
<212>PRT
<213>牛(Bos taurus)
<400>49
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Glu Gly Ser Glu Pro Asp Ala
1                  5                       10
<210>50
<211>14
<212>PRT
<213>狗(Canis familiaris)
<400>50
Met Gly Leu His Asp Pro Thr Glu Gly Tyr Glu Pro Asn Ala
1                5                   10
<210>51
<211>14
<212>PRT
<213>绵羊(Ovis aries)
<400>51
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Glu Gly Ser Glu Pro Asn Ala
1                5                  10
<210>52
<211>15
<212>PRT
<213>黑猩猩(Pan troglodytes)
<400>52
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Ser Glu Pro Asp Gly Gly
1                5                   10                  15
<210>53
<211>15
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>53
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Met Gly Gln Gln Pro Asn Gly Gly
1                5                   10                 15
<210>54
<211>15
<212>PRT
<213>大鼠(Rattus norvegicus)
<400>54
Ile Trp Leu His Asp Pro Thr Met Gly Gln Gln Pro Asn Gly Gly
1                5                   10                 15
<210>55
<211>14
<212>PRT
<213>牛(Bos taurus)
<400>55
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Glu Ser Glu Pro Asp Ala Gly
1                5                  10
<210>56
<211>15
<212>PRT
<213>狗(Canis familiaris)
<400>56
Met Gly Leu His Asp Pro Thr Glu Gly Tyr Glu Pro Asn Ala Asp
1                5                   10                 15
<210>57
<211>15
<212>PRT
<213>绵羊(Ovis aries)
<400>57
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Glu Gly Ser Glu Pro Asn Ala Gly
1                5                  10                  15
<210>58
<211>15
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>58
Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Ser Glu Pro Asp Gly
1                5                   10                 15
<210>59
<211>15
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>59
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Ser Glu Pro Asp Gly Asp
1                5                  10                  15
<210>60
<211>14
<212>PRT
<213>黑猩猩(Pan troglodytes)
<400>60
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Ser Glu Pro Asp Gly
1                5                  10
<210>61
<211>14
<212>PRT
<213>金仓鼠(Mesocricetus auratus)
<400>61
Ile Gly Leu His Asp Pro Ser His Gly Thr Leu Pro Asn Gly
1                5                  10
<210>62
<211>14
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>62
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Met Gly Gln Gln Pro Asn Gly
1                5                   10
<210>63
<211>14
<212>PRT
<213>大鼠(Rattus norvegicus)
<400>63
Ile Trp Leu His Asp Pro Thr Met Gly Gln Gln Pro Asn Gly
1                5                   10
<210>64
<211>14
<212>PRT
<213>牛(Bos taurus)
<400>64
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Glu Gly Ser Glu Pro Asp Ala
1                5                  10
<210>65
<211>14
<212>PRT
<213>狗(Canis familiaris)
<400>65
Met Gly Leu His Asp Pro Thr Glu Gly Tyr Glu Pro Asn Ala
1                5                   10
<210>66
<211>14
<212>PRT
<213>绵羊(Ovis aries)
<400>66
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Glu Gly Ser Glu Pro Asn Ala
1                5                  10
<210>67
<211>14
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>67
Ile Gly Leu His Asp Pro Lys Lys Asn Arg Arg Trp His Trp
1                5                   10
<210>68
<211>14
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>68
Ile Gly Leu His Asp Pro Lys Lys Asn Arg Arg Trp His Trp
1                5                   10
<210>69
<211>14
<212>PRT
<213>大鼠(Rattus norvegicus)
<400>69
Ile Gly Leu His Asp Pro Lys Asn Asn Arg Arg Trp His Trp
1               5                   10
<210>70
<211>14
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>70
Thr Gly Leu His Asp Pro Lys Arg Asn Arg Arg Trp His Trp
1                5                  10
<210>71
<211>14
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>71
Thr Gly Leu His Asp Pro Lys Ser Asn Arg Arg Trp His Trp
1               5                   10
<210>72
<211>14
<212>PRT
<213>金仓鼠(Mesocricetus auratus)
<400>72
Ile Gly Leu His Asp Pro Lys Asn Asn Arg Arg Trp His Trp
1                5                  10
<210>73
<211>14
<212>PRT
<213>大鼠(Rattus norvegicus)
<400>73
Ile Trp Leu His Asp Pro Thr Met Gly Gln Gln Pro Asn Gly
1                5                  10
<210>74
<211>14
<212>PRT
<213>大鼠(Rattus norvegicus)
<400>74
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Leu Gly Gly Glu Pro Asn Gly
1                5                   10
<210>75
<211>14
<212>PRT
<213>大鼠(Rattus norvegicus)
<400>75
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Leu Gly Gln Glu Pro Asn Arg
1                5                  10
<210>76
<211>14
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>76
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Met Gly Gln Gln Pro Asn Gly
1                5                  10
<210>77
<211>14
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>77
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Leu Gly Ala Glu Pro Asn Gly
1                5                  10
<210>78
<211>14
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>78
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Leu Gly Tyr Glu Pro Asn Arg
1                5                   10
<210>79
<211>14
<212>PRT
<213>大鼠(Rattus norvegicus)
<400>79
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Leu Gly Gln Glu Pro Asn Arg
1                5                  10
<210>80
<211>14
<212>PRT
<213>金仓鼠(Mesocricetus auratus)
<400>80
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Leu Gly Gln Glu Pro Asn Gly
1                5                   10
<210>81
<211>14
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>81
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Ser Glu Pro Asp Gly
1                5                  10
<210>82
<211>14
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>82
Ile Gly Leu His Asp Leu Ser Leu Gly Ser Leu Pro Asn Glu
1                5                  10
<210>83
<211>14
<212>PRT
<213>牛(Bos taurus)
<400>83
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Glu Gly Ser Glu Ala Asn Ala
1                5                  10
<210>84
<211>14
<212>PRT
<213>金仓鼠(Mesocricetus auratus)
<400>84
Ile Gly Leu His Asp Pro Ser His Gly Thr Leu Pro Asn Gly
1                5                  10
<210>85
<211>14
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>85
Ile Gly Leu His Asp Pro Gln Lys Arg Gln Gln Trp Gln Trp
1                5                   10
<210>86
<211>14
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>86
Ile Gly Leu His Asp Pro Gln Lys Lys Gln Leu Trp Gln Trp
1                5                  10
<210>87
<211>14
<212>PRT
<213>黑猩猩(Pan troglodytes)
<400>87
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Ser Glu Pro Asp Gly
1                5                  10
<210>88
<211>14
<212>PRT
<213>牛(Bos taurus)
<400>88
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Glu Gly Ser Glu Pro Asp Ala
1                5                  10
<210>89
<211>14
<212>PRT
<213>狗(Canis familiaris)
<400>89
Met Gly Leu His Asp Pro Thr Glu Gly Tyr Glu Pro Asn Ala
1                5                  10
<210>90
<211>14
<212>PRT
<213>绵羊(Ovis aries)
<400>90
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Glu Gly Ser Glu Pro Asn Ala
1                5                  10
<210>91
<211>14
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>SITE
<222>(1)...(1)
<223>聚乙二醇化
<400>91
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly
1                5                  10
<210>92
<211>13
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>92
Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly
1                5                  10
<210>93
<211>11
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>93
His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly
1                5                  10
<210>94
<211>15
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<221>SITE
<222>(1)...(1)
<223>酰化
<220>
<221>AMIDATION
<222>(15)...(15)
<220>
<221>SITE
<222>(15)...(15)
<223>半胱氨酸加合物
<400>94
Ile Gly His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly Cys Cys
1                5                  10                  15

Claims (21)

1.一种前胰岛肽，所述前胰岛肽选自由经过修饰的HIP1肽、HIP2肽、HIP3肽、人类REG3A肽、人类REG3G肽、人类REG1A肽、人类REG1B肽、人类REG4肽、仓鼠INGAP肽、仓鼠REG2肽、仓鼠REG3G肽、大鼠REG1肽、大鼠PAP/REG3B肽、大鼠PAP3肽、大鼠REG3G肽、小鼠REG1肽、小鼠REG2肽、小鼠REG3A肽、小鼠REG3B肽、小鼠REG3G肽、小鼠REG3S肽、小鼠REG4肽、牛PTP肽或挪威大鼠REG3肽组成的组，其中所述修饰包括C末端酰胺基团和N末端乙酰基基团。
2.如权利要求1所述的肽，其中所述修饰还包括C末端半胱氨酸残基。
3.如权利要求1所述的肽，其中所述肽选自由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成的组。
4.一种药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的如权利要求1、2或3中任一项所述的前胰岛肽。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其中所述治疗有效量是从0.5到5mg/kg/天。
6.如权利要求4所述的药物组合物，其中所述治疗有效量是从60到180mg/天。
7.如权利要求4所述的药物组合物，还包括药学上可接受的赋形剂。
8.如权利要求1、2或3中的任一项所述的肽在制备用于刺激胰岛新生或者刺激胰岛细胞再生的药物中的应用。
9.如权利要求1、2或3中的任一项所述的肽在制备用于在受试者中治疗与受损的胰腺功能相关联的病症的药物中的应用。
10.如权利要求8所述的应用，其中所述肽以治疗有效量被给予。
11.如权利要求9所述的应用，其中所述肽以治疗有效量被给予。
12.如权利要求9所述的应用，其中所述与受损的胰腺功能相关联的病症选自1型糖尿病、2型糖尿病、成人隐匿性自身免疫性糖尿病、前驱糖尿病、空腹血糖受损、糖耐量低减、胰岛素抵抗综合症、代谢综合症/代谢紊乱综合症、超重、肥胖、高脂血症、饮食失调症、无***周期和多囊卵巢综合症。
13.如权利要求12所述的应用，其中所述1型糖尿病是新发1型糖尿病。
14.如权利要求12所述的应用，其中所述高脂血症是高甘油三脂血症。
15.如权利要求8所述的应用，其中胰岛细胞再生试剂与所述肽一起使用。
16.如权利要求15所述的应用，其中所述胰岛细胞再生试剂选自人类前胰岛肽、胰淀素、普兰林肽、exendin-4、GIP、GLP-1、GLP-1受体激动剂、仓鼠INGAP肽、利拉鲁肽和二肽基肽酶抑制剂。
17.如权利要求9所述的应用，其中抑制、阻滞或破坏靶向于胰腺内分泌细胞的自身免疫细胞的试剂与所述肽一起使用。
18.如权利要求17所述的应用，其中所述抑制、阻滞或破坏靶向于胰岛细胞的自身免疫细胞的试剂选自下述试剂中的一种或更多种：抗CD-3抗体；细胞毒性的T淋巴细胞抗原4，CLTA-4Ig；单独的或与他克莫司或者IL-2组合的西罗莫司；单独的或与普留净组合的雷帕明；热激蛋白60；利索茶碱，IBC-VSO，疫苗，干扰素α；包括用做保持β细胞功能的试剂的阿托伐他汀的二氮嗪和他汀类药物，单独的或与达利珠单抗组合的霉酚酸酯；抗CD20试剂；Campath-1H；多克隆抗T淋巴细胞球蛋白，粒细胞集落刺激因子，Neulasta，维生素D，25-羟基维生素D补充物和1,25-羟基维生素D补充物二者；Prochymal，和抗炎试剂。
19.如权利要求18所述的应用，其中所述抑制、阻滞或破坏靶向于胰岛细胞的自身免疫细胞的试剂选自下述试剂中的一种或更多种：hOKT3γ1（Ala-Ala）；和靶向于免疫应答且特异地阻滞1型糖尿病中造成β细胞死亡的T淋巴细胞的ChAglyCD3。
20.如权利要求18所述的应用，其中所述抑制、阻滞或破坏靶向于胰岛细胞的自身免疫细胞的试剂选自下述试剂中的一种或更多种：糖尿病抑制性树突细胞疫苗，GSK189075；抗谷氨酸脱羧酶65疫苗；IBC-VSO疫苗，所述疫苗是旨在防止胰腺β细胞受损的胰岛素的合成的代谢非活性的形式；和使用CD4+CD25+抗原特异调节性T细胞或者旨在抑制对郎格罕氏岛内的β细胞的免疫攻击而设计的任一种或多种试剂的疫苗。
21.如权利要求18所述的应用，其中所述抑制、阻滞或破坏靶向于胰岛细胞的自身免疫细胞的试剂选自下述试剂中的一种或更多种：利妥昔单抗；抗炎的Anakinra；和去氧精胍啉，阻滞促炎症细胞因子产生并抑制T细胞与B细胞的抗炎试剂。
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