CN101892175A

CN101892175A - 牛源荚膜a型多杀性巴氏杆菌及其分离鉴定和应用

Info

Publication number: CN101892175A
Application number: CN 201010115552
Authority: CN
Inventors: 于力; 马文戈; 姜志刚
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2010-02-26
Filing date: 2010-02-26
Publication date: 2010-11-24
Anticipated expiration: 2030-02-26
Also published as: CN101892175B

Abstract

本发明公开了一株牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌及其应用。本发明从6省(市)发生牛出血性败血症的病料中分离到牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌，其微生物保藏号是：CGMCC No.3619。将本发明牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌经BHI培养后采用油佐剂制备成灭活免疫原，在小鼠模型上证明对A型Pm强毒攻击具有完全的保护作用，但与B型Pm无交叉保护。试验结果表明，本发明牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌可制备成疫苗应用于预防荚膜A型多杀性巴氏杆菌所引起的牛出血性败血症。本发明菌株接种雏鸡不致病，表明该菌株为非鸡源的荚膜A型多杀性巴氏杆菌。

Description

牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌及其分离鉴定和应用

技术领域

本发明涉及一株巴氏杆菌，尤其涉及一株牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌，本发明还涉及该牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌在防治牛出血性败血症中的应用，属于巴氏杆菌病原和疫苗领域。

背景技术

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella mutocida，Pm)是具有异质性特征的病原菌亚种群，常引起牛、猪、鸡、兔等家养动物和野生动物以败血症和呼吸***疾患为主的疾病。根据菌体表面的荚膜多糖的抗原特异性将该菌分为A、B、D、E和F五个荚膜型(Capsulartype)。

牛出血性败血症(牛出败)是由多杀性巴氏杆菌引起的，主要以肺部病损为特征的牛传染病，一般为散发性，在剧烈应激和新荚膜型出现的情况下，多呈地方性流行。国外牛出败主要流行荚膜A、B或E型，我国以往主要是荚膜B型，因此疫苗株也一直使用B型菌。

自2006年以来，在我国6省(市)的牛群(包括肉牛和奶牛)已确定发生了A型牛出血性败血症疫情。由于牛群没有免疫力，该病在我国呈地方性流行，严重应激条件下发病率高达100％，病牛致死率高达40％～60％，给养牛业造成重大经济损失。可以预计，该病将是我国未来5至10年内对养牛业危害最为严重的传染病之一。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌；

本发明的目的之二是将上述牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌应用于防治牛出血性败血症；

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一株牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌，其微生物保藏号是：CGMCC No.3619；分类命名：多杀巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)；保藏时间是：2010年1月29日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明从黑龙江、天津、吉林、内蒙古、山东和宁夏发生急性牛出血性败血症的病料中分离到多杀性巴氏杆菌(Pm)。参考已发表文献改良PCR方法，对Pm种保守基因kmt、荚膜生物合成基因和16S rRNA基因进行PCR扩增以及序列测定和分析。

本发明对A型荚膜生物合成基因和16S rRNA基因的引物进行重新设计。所重新设计的A型荚膜合成基因的特异性引物为：capA1：5′TGC CAA AAT CGC AGT CAG TAT TTT TTA TCC3′(SEQ ID NO：1)；capA2：5′TGC CAT CAT TGT CAG TGA TTT ATT TTG TAA G 3′(SEQID NO：2)；所重新设计的16S rRNA基因的特异引物序列为：16sU：5′TCA GAT TGA ACG CTG GCG GCA GGC TTA AC 3′(SEQ ID NO：3)；16sL：5′CAC CCC AGT CAT GAA TCA TAC CGT GGT AA 3′(SEQ IDNO：4)。

在进行多重PCR扩增时，本发明通过大量的试验发现，将牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌的菌液按照如下处理所得到的产物作为PCR模板，具有最优的扩增效果：将病原菌用BHI培养24h的培养物250ul，12000×g离心2分钟，轻轻吸弃上清，用50uL无菌双蒸水震荡悬浮，煮沸2min，作为PCR模板。

多重PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示，从所分离的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌中扩增出与阳性对照相同大小的两条特异片段，分别为460bp的多杀性巴氏杆菌特异性kmt1基因和1044bp的荚膜A型生物合成基因hyaD-hyaC，而阴性对照中未扩增出任何条带。

对Pm物种特异性基因kmt1的PCR产物进行序列分析，其与GenBank中AF016259、AY225341、AY225342、AY225343、AY225344、DQ233648、DQ233649、EU873317中的各荚膜型kmt1基因同源性均在98％以上；用Clustal W方法分析，同源性均在96.6％以上，进一步验证了这些分离株均为多杀性巴氏杆菌。荚膜A型生物合成基因片段全长1045bp，其与AF067175中荚膜A型特异性的hyaD-hyaC基因等长，仅在562位发生C→T同义突变，同源性为99.9％；而与GenBank中属于其它荚膜型的AF169324 bcbD基因、AF302465 dcbF基因、AF302466 ecbJ基因、AF302467 fcbD基因的同源性很低，介于20.76％-35.78％之间。PCR扩增和序列分析均表明，本发明从上述六省(市)分离的Pm均为荚膜A型菌。

16S rRNA基因***进化分析显示，本发明分离株(代表株为Pm-TJ)与英国荚膜A型分离株PM338同源性最高，达99.93％，而与其它牛源荚膜A型Pm的同源性稍有下降，但明显高于与其它动物来源荚膜A型Pm的同源性；而且，各种不同动物来源的荚膜B、D、E、F型Pm与A型Pm的同源性均明显低于A型Pm之间的同源性。

此外，本发明通过大量的试验发现，当采用BHI培养基培养本发明所分离到的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌，可维持菌株毒力不衰减。

将本发明牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌经BHI培养后采用油佐剂制备为灭活免疫原，在小鼠模型上证明对A型Pm强毒攻击具有完全的保护作用，但与B型Pm无交叉保护。试验结果表明，本发明牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌可制备成疫苗应用于预防荚膜A型多杀性巴氏杆菌所引起的牛出血性败血症。

将本发明牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌接种雏鸡不致病，试验结果显示本发明菌株为非鸡源的荚膜A型多杀性巴氏杆菌。

附图说明

图1我国不同区域牛源荚膜A型Pm分离株kmt1基因和hyaD-hyaC基因多重PCR检测。A：黑龙江；B：天津；C：吉林；D：宁夏；E：内蒙古；F：山东；G：阳性对照；H：阴性对照；L：250bpDNA ladder。

图2Pm的16S rRNA基因***进化树。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1本发明牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌的分离和鉴定

1.1病原的分离和鉴定：病原材料分别来自黑龙江、吉林、宁夏、山东、内蒙古、天津和贵州发病牛的肺脏、肝脏、心脏、肾脏、呼吸道和肠道组织。

将病料研磨后，用无菌PBS配成1∶10悬液，4℃过夜，取上清腹腔接种小白鼠3只。用悬液12,000×g离心10分钟的上清，腹腔接种小白鼠3只。悬液离心后，上清经0.2um滤膜过滤的无菌滤液，腹腔接种小白鼠3只。PBS对照2只。每只小白鼠接种量为0.2ml，逐日观察发病情况。无菌采集24～48h死亡小鼠的肺脏、肝脏、心脏和血液，触片染色镜检，并将病料接种于BHI培养基增菌。24h的BHI培养物接种鲜血琼脂、BHI琼脂、麦康凯琼脂平板，37℃24h培养后观察菌落形态。随机挑选单菌落接种BHI，纯培养24h，涂片染色镜检。将BHI 24h培养物，转移接种于生化反应管，根据杭州天和微生物试剂有限公司《细菌微量生化反应管使用说明书》，观察反应结果(马文戈等，中国预防兽医学报，2008)。

各地病料中均可检出革兰氏阴性短小杆菌，美蓝和瑞氏染色两极浓染。用病料1∶10悬液腹腔接种的3只小鼠，于接种后24～48h内死亡；用病料悬液离心后的上清、0.2um超滤液以及PBS分别接种的小鼠，120h内健活。小鼠肺、肝、心脏组织在BHI中的增菌物，在鲜血琼脂平板上24h，生长出圆形***、光滑湿润、边缘整齐、微蓝色闪光的菌落，无溶血现象；在麦康凯平板上不生长；在BHI琼脂平板上生长茂盛，形成圆形扁平、光滑湿润、边缘整齐的菌落。涂片染色镜检呈现革兰氏阴性短杆菌，美蓝和瑞氏染色可见到两极浓染的菌体。黑龙江和天津病料分离菌的培养特性相同。分离菌发酵葡萄糖、果糖、甘露醇和山梨醇；麦芽糖、乳糖、鼠李糖和卫矛醇试验阴性；过氧化氢酶阳性；鸟氨酸脱羧酶阳性；靛基质试验阳性；还原硝酸盐；产生硫化氢。

1.2病原对小鼠的致病力：初步研究表明，挑取BHI琼脂平板上的单菌落，接种BHI于37℃培养18-24h培养物，每只接种1亿菌的3只小鼠，于6～9h死亡；每只接种0.1亿菌的3只小鼠，于11～36h死亡；每只接种0.01亿菌的3只小鼠，于32～71h死亡。对照鼠120h健活。通过优化培养条件，该细菌对小鼠致病力大幅度增强，分别接种100、10个菌的两组小鼠均在24～48小时内全部死亡，接种1个菌的小鼠在48～72小时内有1/3发生死亡。按照上述病原分离方法从发病死亡小鼠肺脏、肝脏分离病原，在BHI中纯培养后再次接种小鼠，显示同样的致病力。

1.3、PCR鉴定方法

(1)PCR引物设计：参考Pm种特异性基因引物Kmt1，A、B、D、E、F荚膜血清型特异性基因引物capA、capB、capD、capE、capF(Townsend等，Journal of Clinical Microbiology，2001)，以及16S rRNA基因(Davies R L，Microbiology，2004)，对A型荚膜生物合成基因和16S rRNA基因的引物进行重新设计。重新设计的A型荚膜合成基因引物：capA1：5′TGC CAA AAT CGC AGT CAGTAT TTT TTA TCC3′；capA2：5′TGC CAT CAT TGT CAG TGA TTTATT TTG TAA G 3′；重新设计的16S rRNA基因引物序列16sU：5′TCA GAT TGA ACG CTG GCG GCA GGC TTA AC 3′；16sL：5′CAC CCCAGT CAT GAA TCA TAC CGT GGT AA 3′。

(2)样品处理及PCR方法：将病原菌BHI培养物、作为阴性对照的牛口腔分泌物各250ul，12000×g离心2分钟，弃上清，用50ul无菌双蒸水震荡悬浮，作为PCR模板。50ul PCR反应体系组成：双蒸水36ul，5倍Prime Star缓冲液10ul，10mmol/ldNTP 1.5ul，10umol/l上下游引物各1.0ul，Prime Star TaqDNA聚合酶1.0ul，模板0.5ul。PCR扩增反应条件为：95℃5分钟预变性；94℃30秒，55℃30秒，72℃45秒共30个循环；72℃10分钟延伸。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4PCR分型与鉴定：以BHI培养的菌液为模板，采用1.3所述的多重PCR方法进行扩增；用上述多重PCR方法从上述六省市的病料中均扩增出小于500bp以及1000bp左右的两条特异条带；kmt1，kmt1+capA，kmt1+capB，kmt1+capD，kmt1+capE，kmt1+capF引物组合，只有kmt1+capA同时扩增出小于500bp以及1000bp左右的两条特异条带，其他组合只扩增出小于500bp的一条特异条带(图1)。用PCR方法从上述六省市的病料中扩增1468bp的16S rRNA基因片段。序列比对显示所有分离株的16S rRNA基因同源性为100％。

1.5kmt1基因序列测定及同源性分析：用双脱氧末端终止法对克隆的kmt1基因片段进行双向测序。小于500bp的片段全长为 460bp，Blast搜索结果显示，其与GenBank中AF016259、AY225341、AY225342、AY225343、AY225344、DQ233648、DQ233649、EU873317中的各血清型kmt1基因同源性均在98％以上；用Clustal W方法分析，同源性均在96.6％以上。

1.6荚膜合成基因序列测定及同源性分析

荚膜A型生物合成基因片段全长1045bp，与AF067175中荚膜A型特异性的hyaD-hyaC基因等长，仅在562位发生C→T同义突变，同源性为99.9％；而与GenBank中属于其他血清型的AF169324 bcbD基因、AF302465 dcbF基因、AF302466 ecbJ基因、AF302467 fcbD基因同源性很低，介于20.76％-35.78％之间。

1.716S rRNA基因序列测定及***进化分析

从上述六省市的病料中扩增1468bp的16S rRNA基因片段序列比对显示，所有分离株的16S rRNA基因同源性为100％。选择GenBank中不同动物来源各种血清型Pm的16S rRNA基因序列，与我们分离的荚膜A型Pm的16S rRNA基因一同建立***进化树，结果见图2。

试验例1本发明牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌的免疫原性试验

1.1免疫原制备：将实施例1所分离的Pm-TJ第12代培养菌液涂布于BHI琼脂平板，37℃培养24h左右，直至菌苔铺满整个平板，收集菌苔制成10¹⁰CFU/mL菌液并加入0.2％甲醛于37℃灭活24h，以15％体积的法国佐剂(MONTANIDE ISA 15A VG)充分混合，制备免疫原。

1.2免疫方案及攻毒保护结果：取15只SPF级小鼠，分为A、B、C三组，每组5只。A组接种1.1所制备的免疫原，剂量为2.5×10⁸CFU/只；B组接种B型牛出败灭活苗，剂量为2.5×10⁸CFU/只；C组5只小鼠做空白对照。21日后用Pm-TJ第12代菌液攻毒，观察3日，统计保护率。分别用灭活的Pm-TJ和B型牛出败灭活苗分别免疫小鼠，21天后攻A型Pm，计其保护率，结果(表1)显示灭活A型Pm组攻毒保护率为100％，B型牛出败灭活苗组和空白对照组全部死亡。

表1小鼠免疫保护试验结果

	A组	B组	C组
				小鼠数量	5	5	5
免疫原	A型pm灭活疫苗	B型pm灭活疫苗	空白对照
				免疫剂量(CFU)	2.5×10⁸	2.5×10⁸	-
攻毒剂量(CFU)	50	50	50
				死亡率	0/5	5/5	5/5
保护率	100％	0％	0％

1.3本发明牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌对雏鸡的致病性：

由于引起禽霍乱的病原菌也是A型Pm，所以本发明进行了雏鸡致病性试验，将9只3日龄SPF雏鸡分为A、B、C三组，每组3只，分别腹腔注射接种1、10、100个Pm-TJ的第12代活菌，逐日观察发病状况。

表2 Pm-TJ的雏鸡致病性试验结果

	A组	B组	C组
				攻毒剂量(CFU)	1	10	100
死亡率	0/3	0/3	0/3

试验结果显示(表2)，A、B、C三组雏鸡分别接种1、10、100个Pm-TJ活菌，3日后所有雏鸡均健康存活，表明我国新出现的牛源A型Pm与禽源Pm无关。

序列表

<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120>牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌及其分离鉴定和应用

<130>KLPI000015

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>artifical sequence

<400>1

tgccaaaatc gcagtcagta ttttttatcc 30

<210>2

<211>31

<212>DNA

<213>artifical sequence

<400>2

tgccatcatt gtcagtgatt tattttgtaa g 31

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>artifical sequence

<400>3

tcagattgaa cgctggcggc aggcttaac 29

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>artifical sequence

<400>4

caccccagtc atgaatcata ccgtggtaa 29

Claims

1.一株牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌，其微生物保藏号是：CGMCC No.3619。

2.权利要求1所述的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌在制备防治由牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌所导致牛出血性败血症的药物中的用途。

3.一种防治牛出血性败血症的疫苗组合物，由有效量的权利要求1所述的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌和佐剂组成。

4.按照权利要求3所述的疫苗，其特征在于：所述的佐剂是油佐剂。

5.一种用于鉴定权利要求1所述牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌的A型荚膜合成基因的引物，其特征在于：其碱基序列为SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示。

6.一种用于鉴定权利要求1所述牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌的16S rRNA基因的引物序列，其特征在于：其碱基序列为SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4所示。

7.一种培养权利要求1所述牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌的方法，包括：采用BHI培养基进行培养。