CN112226379B - 猪红斑丹毒丝菌1a型菌株、猪丹毒灭活疫苗及其应用 - Google Patents

猪红斑丹毒丝菌1a型菌株、猪丹毒灭活疫苗及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪红斑丹毒丝菌1a型菌株、猪丹毒灭活疫苗及其应用，属于兽用生物制品技术领域。本发明涉及新分离出的当前流行菌株红斑丹毒丝菌HG‑1菌株，该菌株的保藏编号为CCTCC NO:M 2019684。该菌株分离自急性败血症死亡的育肥猪的心血中，毒力强，其针对8～9周龄仔猪的半数致死剂量为3.8×103CFU。试验证明，该菌株制成的灭活疫苗能有效预防1a型和2型猪红斑丹毒丝菌引起的猪丹毒，同时该疫苗的安全性良好，疫苗免疫后仔猪没有出现接种部位红肿、发热、死亡等症状。此疫苗具有制备工艺简单，对猪的安全性良好，能同时保护免疫猪抵抗1a型和2型猪红斑丹毒丝菌的感染等优点。

Description

猪红斑丹毒丝菌1a型菌株、猪丹毒灭活疫苗及其应用
技术领域
本发明涉及一种猪红斑丹毒丝菌1a型菌株，以及由该菌株制备的猪丹毒灭活疫苗及其应用，属于兽用生物制品技术领域。
背景技术
猪源红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)，俗称猪丹毒杆菌，是丹毒丝菌科丹毒丝菌属的一种兼性厌氧的革兰氏阳性的纤细小杆菌，有荚膜、无鞭毛、不产生芽胞。该菌在自然界分布广泛，可引起猪及其他动物的丹毒病。红斑丹毒丝菌被分为1a型、1b型、2～24型和N型共26个血清型。不同血清型菌株的毒力存在明显的差别，其中1a型和1b型的菌株毒力较强，从急性败血死亡的猪体内分离出的猪红斑丹毒丝菌大多为1a型。目前已经发现的猪红斑丹毒丝菌的毒力因子及其潜在的毒力因子有：神经氨酸酶、透明质酸酶、荚膜和其他表面蛋白(如SpaA、RspA、RspB)等。
在猪群中，红斑丹毒丝菌引起的猪丹毒，是一种急性、热性传染病，临床表现为急性败血型、亚急性疹块型和慢性心内膜炎型，该病在世界范围内广泛存在和流行。猪红斑丹毒丝菌感染人的临床表现与猪高度相似，主要表现形式为局部皮肤损伤(类丹毒)、全身性皮肤损伤及与心内膜炎相关的败血症。猪丹毒在世界范围内发生，给欧洲、亚洲等多个国家造成了严重的经济损失，并已证实在我国呈散发性流行，该病的流行有明显的季节性，夏季多发，且可影响各种日龄的猪，急性猪丹毒的病死率可达80％～90％，给我国养猪业造成了严重的经济损失。
20世纪80年代以前，猪丹毒曾是危害我国养猪业的三大传染病(猪瘟、猪丹毒、猪肺疫)之一。20世纪90年代后期至21世纪很少有关于猪丹毒病例的报道，曾一度被认为在我国已经消失。但2010年以来，猪丹毒又在我国多个省份发生。目前，我国使用的仍是20世纪60年代研制的猪丹毒灭活疫苗(C43-5株)、猪丹毒活疫苗(GC42株或G4T10株)等。因此，研发一种针对当前流行菌株，且免疫效力更强的新型猪丹毒疫苗是预防和控制猪丹毒的必然要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪红斑丹毒丝菌1a型菌株。
同时，本发明还提供一种由上述猪红斑丹毒丝菌1a型菌株制备的猪丹毒灭活疫苗。
最后，本发明还提供一种猪红斑丹毒丝菌1a型菌株在制备猪丹毒灭活疫苗中的应用。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
猪红斑丹毒丝菌1a型菌株，其名称为红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)HG-1，保藏编号：CCTCC NO:M 2019684，保藏日期：2019年09月02日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)。
本发明中猪红斑丹毒丝菌1a型菌株HG-1(CCTCC NO:M 2019684)分离自急性败血症死亡的育肥猪的心血中，毒力强，其针对8～9周龄仔猪的半数致死剂量为3.8×103CFU。将该菌株在含10％新生牛血清的TSA培养基上，37℃培养24～48小时，可长成光滑、边缘整齐、有微蓝色泽、无色透明、针尖大露珠样小菌落；革兰氏阳性，直的或稍微弯曲的细长小杆菌，两端钝圆，无芽孢，无运动性；经血清型鉴定为1a型，可制成灭活疫苗用于预防当前流行的1a型及2型菌株感染。
猪丹毒灭活疫苗，其抗原为灭活的猪红斑丹毒丝菌1a型菌株HG-1(CCTCC NO:M2019684)。
进一步的，所述猪丹毒灭活疫苗中还含有佐剂，如GEL水溶性聚合物佐剂(如市售的MontanideTM GEL 01PR水溶性聚合物佐剂、MontanideTM GEL 02PR水溶性聚合物佐剂，佐剂的含量为10％～20％，体积百分数)、氢氧化铝胶佐剂(佐剂的含量为20％，体积百分数)等。
进一步的，所述猪丹毒灭活疫苗中还含有防腐剂，如0.005％的硫柳汞(体积百分数)、0.3％的苯酚(体积百分数)等。
进一步的，所述灭活可采用常规的灭活剂，如甲醛、β-丙内酯(BPL)等。
进一步的，在1mL猪丹毒灭活疫苗中，猪红斑丹毒丝菌1a型菌株HG-1(CCTCC NO:M2019684)的灭活菌体含量不少于3.0×109CFU/mL。
猪丹毒灭活疫苗的用法及用量：颈部肌肉注射，(按瓶签注明头份)不论猪只大小，每次均注射1头份(2mL)。仔猪在3～4周龄首免，3周后再次免疫；母猪在产前8～9周首免，3周后二免，以后每胎产前5～6周免疫一次。
本发明中猪红斑丹毒丝菌1a型菌株HG-1(CCTCC NO:M 2019684)接种于适宜培养基中纯化培养后，再接种于液体培养基(如TSB)中增殖培养，培养液经(甲醛)灭活后，离心收集菌体加入佐剂(如MontanideTM GEL 02PR水溶性聚合物佐剂)乳化制成灭活疫苗，该灭活疫苗能有效预防1a型和2型猪红斑丹毒丝菌引起的猪丹毒。同时，该灭活疫苗的安全性良好，疫苗免疫后仔猪没有出现接种部位红肿、发热、死亡等症状。
猪红斑丹毒丝菌1a型菌株在制备猪丹毒灭活疫苗中的应用。具体的，猪丹毒灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1)将猪红斑丹毒丝菌1a型菌株HG-1(CCTCC NO:M 2019684)的菌液进行灭活；
2)将灭活后的菌液浓缩去除上清，洗涤后稀释，得到抗原液；
3)将抗原液与佐剂、防腐剂混合均匀，即得。
步骤1)中，所述菌液中猪红斑丹毒丝菌1a型菌株HG-1(CCTCC NO:M 2019684)的活菌含量不少于1.0×109CFU/mL。
步骤2)中，所述灭活采用甲醛灭活剂，甲醛灭活剂按照菌液总量的0.25％～0.3％(体积分数)加入浓度为37％～40％的甲醛溶液；37～39℃灭活24～48小时。
步骤2)中，所述洗涤、稀释均可采用无菌PBS溶液(0.0l mol/L、pH值7.2)；洗涤后用无菌PBS溶液稀释至菌体抗原(即灭活的猪红斑丹毒丝菌1a型菌株HG-1，CCTCC NO:M2019684)浓度至少为3.53×109CFU/mL。
步骤3)中，所述抗原液与GEL佐剂按照80％～90％:10％～20％的体积比混合，或者将抗原液与氢氧化铝胶佐剂按照80％:20％的体积比混合；室温下500～800r/min搅拌20～30min，至其混合均匀。
步骤3)中，所述防腐剂是按照0.005％(体积百分数)的量加入硫柳汞，或者按照0.3％(体积百分数)的量加入苯酚。
步骤3)中，所述猪丹毒灭活疫苗中含灭活的猪红斑丹毒丝菌1a型菌株HG-1(CCTCCNO:M 2019684)的菌体含量不少于3.0×109CFU/mL。
本发明中猪丹毒灭活疫苗的制备工艺简单，对猪的安全性良好，能同时保护免疫猪抵抗1a型和2型猪丹毒丝菌感染。
本发明的有益效果：
在我国猪群中，猪丹毒是一种典型的“老病新发”型细菌传染病，因此研发一种新的安全、高效的猪丹毒疫苗势在必行。目前国内猪红斑丹毒丝菌主要流行的血清型为1a型，另有少量2型。本发明中猪红斑丹毒丝菌1a型菌株HG-1(CCTCC NO:M 2019684)于2018年6月分离自广东患病猪群，经血清型鉴定为1a型。通过对猪红斑丹毒丝菌1a型菌株HG-1(CCTCCNO:M 2019684)制成的灭活疫苗进行大量的动物免疫保护试验，证明该灭活疫苗的免疫效果良好，可以有效预防当前流行的1a型及2型菌株感染。
本发明以优势流行菌株猪红斑丹毒丝菌1a型菌株HG-1(CCTCC NO:M 2019684)作为疫苗制备菌株，接种于TSB液体培养基(含10％新生牛血清)中培养，收获培养物，经甲醛灭活后，加入佐剂混合制成猪丹毒灭活疫苗，该疫苗可用于预防1a型和2型猪红斑丹毒丝菌引起的猪丹毒，并且具有安全性好、免疫效力高、免疫期长等优点。
保藏证明和存活证明说明
保藏菌株：红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)HG-1，保藏编号：CCTCC NO:M 2019684，保藏日期：2019年09月02日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)。
附图说明
图1为菌株HG-1菌落形态；
图2为菌株HG-1菌体革兰氏染色100×显微镜下形态；
图3为菌株HG-1的PCR鉴定结果；
图4为菌株HG-1的分子生物学方法鉴定血清型的结果；
图5为菌株HG-1的血清因子方法鉴定血清型的结果。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
猪丹毒灭活疫苗，其抗原为灭活的猪红斑丹毒丝菌1a型菌株HG-1(CCTCC NO:M2019684)；所述猪丹毒灭活疫苗中，猪红斑丹毒丝菌1a型菌株HG-1(CCTCC NO:M2019684)的灭活菌体含量不少于3.0×109CFU/mL。
实施例2
猪红斑丹毒丝菌1a型菌株在制备猪丹毒灭活疫苗中的应用，包括以下步骤：
1.生产用种子制备
1)一级种子繁殖与鉴定
将猪红斑丹毒丝菌1a型菌株HG-1(CCTCC NO:M 2019684)生产菌种接种于含10％新生牛血清的TSA培养基上，37℃恒温培养36小时后挑选5个以上典型菌落，分别接种含10％新生牛血清的TSA培养基上，37℃培养24小时，进行纯粹检验合格后，作为一级种子。在2～8℃保存，保存时间应不超过7日，继代不得超过5代。
2)二级种子繁殖
将HG-1株一级种子接种于含10％新生牛血清的TSB液体培养基中，放置于摇床上37℃、180r/min振荡培养14小时，经检验合格后，作为二级种子。在2～8℃保存，使用期应不超过7日。
2.菌液培养
按玻璃瓶容积装入适量含10％新生牛血清的TSB液体培养基中，然后按1:100的比例将二级种子转接到新的TSB培养基中，经37℃、180r/min振荡培养16小时后收获菌液。
3.活菌计数
按现行《中国兽药典》附录方法使用适宜于本菌生长的含10％新生牛血清的TSA培养基进行活菌计数。使用细菌瓶培养，猪红斑丹毒丝菌1a型菌株HG-1的活菌含量不少于1.0×109CFU/mL。
4.菌液灭活
将猪红斑丹毒丝菌1a型菌株HG-1的培养液进行灭活，按菌液总量的0.3％(体积比)加入甲醛溶液(浓度为37％～40％)，在37℃灭活48小时。
5.灭活检验
取灭活后的菌液0.2mL接种于适宜该菌生长的TSA培养基中(含10％新生牛血清)，同时取灭活菌液0.2mL按1:100的比例接种于适宜该菌生长的TSB液体培养基(含10％新生牛血清)，37℃连续培养7日，均无菌生长即为合格。
6.配苗
1)准备佐剂
按照赛彼科特殊化学品(上海)有限公司，MontanideTM GEL 02PR产品说明书，将GEL佐剂经121℃高压灭菌30min，并冷却至室温备用。
2)抗原的准备
用中空纤维超滤器将灭活检验合格的菌液浓缩去除上清(或用低温高速离心机将灭活检验合格的菌液离心去除上清)，并用无菌PBS(0.0l mol/L、pH值7.2)进行洗涤，根据灭活前活菌计数结果，使用无菌PBS(0.0l mol/L、pH值7.2)将HG-1株菌体抗原稀释并调节浓度至3.53×109CFU/mL。
3)配苗
将抗原液与GEL 02 PR佐剂按85:15的体积比混合，室温下以500～800r/min的转速下搅拌20～30min进行充分乳化，在终止搅拌前按0.005％(体积百分数)的量加入硫柳汞，充分混匀。最终使疫苗中含灭活HG-1株菌体含量不少于3.0×109CFU/mL。
4)半成品检验
按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果显示无菌生长。
5)分装
定量分装，加盖密封，2～8℃保存。
试验例1
猪红斑丹毒丝菌的鉴定：
1.材料与方法
1.1病料来源
2018年6月采集自广东省某规模化养猪场的一头疑似猪丹毒临床症状的猪的病料。病猪表现为精神沉郁、高热稽留、食欲减退、步态僵硬或倒地不起、甚至有可视粘膜发绀及呼吸困难等症状，从发病到死亡时间较短，介于2～5天之间。在采集心血、肺脏的同时，采集肝脏、肾脏、***、脾脏、脑、关节液等组织进行分离鉴定。
1.2培养基的制备
TSA(胰蛋白胨大豆琼脂，Tryptic Soy Agar)培养基的配制方法：称取20g TSA，量取500mL蒸馏水，倒入锥形瓶中，充分摇匀溶解，121℃高压蒸汽灭菌30min，放入超净工作台中冷却至60℃左右，向培养基中加入10％(50mL)过滤除菌的新生牛血清，倒入平板中制成TSA培养基，冷却后备用。
TSB(胰蛋白胨大豆肉汤，Tryptic Soy Broth)培养基的配制方法：称取3g TSB，100mL蒸馏水，倒入锥形瓶中，充分摇匀溶解，121℃高压蒸汽灭菌30min，放入超净工作台中冷却至60℃左右，向培养基中加入10％(10mL)过滤除菌的新生牛血清，冷却后备用。
PBS缓冲液的配制方法：称取1.45g磷酸氢二钠(分析纯)、0.15g磷酸二氢钠(分析纯)、4.1g氯化钠(分析纯)，倒入500mL的锥形瓶中，加蒸馏水溶解并摇匀，并定容至500mL；121℃、30min高压灭菌，冷却后备用。
1.3方法
1.3.1细菌的分离培养
将采集的心血、肺脏等组织划线接种于含10％新生牛血清的TSA培养基中，37℃培养36小时后挑取疑似菌落进行传代纯化培养，再培养24小时后观察猪红斑丹毒丝菌的菌落形态。同时，挑取3～5个单菌落进行革兰氏染色镜检，观察菌体形态特征。如果从同一病例不同病料组织中均分离到猪红斑丹毒丝菌，则只选择其中一个病料组织的分离菌株进行保存，其优先次序为心血、肺脏、肝脏、脾脏、***、关节液、肾脏、脑。
1.3.2镜检
从纯化后的菌落中挑取一个单菌落固定在抹片上，革兰氏染色后用显微镜观察细菌形态。
1.3.3 PCR鉴定
1.3.3.1引物设计
根据参考文献报道的细菌通用引物16S rRNA基因序列合成引物，PCR引物序列如下：
上游引物JD01：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(如SEQ ID NO.1所示)；
下游引物JD02：5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’(如SEQ ID NO.2所示)。
对猪红斑丹毒丝菌进行PCR扩增。预计引物扩增片段大小约为1500bp。
1.3.3.2PCR反应体系及反应条件
PCR反应体系(25μL)：12.5μL 2×Taq MasterMix(Dye)(2×Taq MasterMix含有Taq DNA Polymerase，3mM MgCl2和400μM each dNTP)、10.5μL ddH2O、上、下游引物各1μL、DNA模板。
PCR反应条件：首先95℃(预变性)4min；其次94℃(变性)30s、56℃(退火)30s、72℃(延伸)2min，共循环30次；然后72℃(再延伸)10min；最后4℃暂时保存。
将PCR产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳，每孔加样5μL，Maker加10μL，30min后用凝胶成像***观察结果，并将PCR产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定，并对测序结果应用在线生物学软件Standard Nucleotide BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行NCBI数据库搜索比对分析。
1.3.4分离菌的血清型鉴定方法
1.3.4.1分子生物学方法鉴定血清型
根据红斑丹毒丝菌GCT(glycerol-3-phosphate cytidylyltransferase)基因的序列设计一对红斑丹毒丝菌1a型的特异性引物，用于猪源红斑丹毒丝菌1a型的血清型鉴定，引物序列如下：
上游引物P3：5’-CTCCTAACGCTTTAGCACGC-3’(如SEQ ID NO.3所示)；
下游引物P4：5’-TGATCCTTTGCCACTAATGC-3’(如SEQ ID NO.4所示)。
对猪红斑丹毒丝菌进行PCR扩增。预计引物扩增片段大小为356bp。
1.3.4.2 PCR反应体系及反应条件
PCR扩增反应体系(25μL)：12.5μL Mix、10.5μL ddH2O、上、下游引物各1μL、DNA模板。猪源红斑丹毒丝菌1a型参考菌株CVCC43008株为阳性对照。
PCR反应条件：95℃预变性2min，进入循环：94℃30s，60℃30s，68℃1min，共35个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物4℃保存。
扩增产物分别进行电泳，每孔加样5μL，Maker加10μL，1％琼脂糖凝胶电泳，30min后用凝胶成像***观察结果。
1.3.4.3血清因子方法鉴定血清型
将猪红斑丹毒丝菌HG-1株接种于含10％新生牛血清的TSA固体培养基上，37℃培养36小时后挑取单菌落进行传代纯化培养24小时，用无菌的PBS洗脱菌苔，并7000r/min离心5min，弃上清，无菌PBS浓缩并混合均匀后于121℃高压蒸汽处理2小时，然后7000r/min离心10min，上清即为用于琼脂扩散试验的分型抗原，又称热稳定性抗原。
用标准分型血清按Kieletein-Rapp-Gabriedson(KRG)琼脂扩散血清分型方法对分离的猪红斑丹毒丝菌菌株进行鉴定，方法如下：将1g Noble琼脂、8.5g氯化钠溶于100mLPBS中，在微波炉中加热使其完全溶解，冷却至约56℃后加入0.1g防腐剂(硫柳汞)，配制成约3～4mm厚凝胶平板，4℃保存备用。用打孔器在平板上按需要打孔(孔径3mm、孔间距4mm)，用酒精灯加热封底；中央孔加入某一型标准阳性血清，周围各孔加待测抗原，每孔约15μL左右。同时设阴性血清作为对照。放入湿盒中，放置于37℃，24小时后观察结果，连续观察三日。若抗原与抗体孔之间出现清晰的白色沉淀线则判为阳性，反之则判为阴性。
1.3.5毒力试验
将猪红斑丹毒丝菌1a型HG-1株接种于含10％新生牛血清的TSA培养基上，37℃复苏培养36小时后挑取单菌落进行传代纯化培养24小时，挑取纯化好的单菌落于含10％新生牛血清的TSB液体培养基中，置于恒温摇床中37℃振荡培养14小时作为种子液，将种子液按照1:100的比例转接到新的含10％新生牛血清的TSB液体培养基中，37℃振荡培养12小时即为子液。将制备的菌液进行10倍比稀释到第4、5、6、7梯度(分别为105、104、103、102)。将25头8～9周龄健康仔猪随机均分为5组(5头/组)，取上述4个梯度稀释菌液分别对前4组健康仔猪进行耳缘静脉接种(1mL/头)。同时对原菌液进行稀释计数，确定接种的实际菌量。第五组作为空白对照接种无菌PBS(0.0l mol/L、pH值7.2)。连续观察、记录发病及死亡情况15日，死亡者立即剖检，取其身体各部位组织器官进行细菌分离鉴定，并根据Reed-Muench法计算猪红斑丹毒丝菌1a型HG-1株针对仔猪的半数致死剂量(50％lethal dose，LD50)。
1.3.6猪红斑丹毒丝菌原始种子批的建立
将分离出的猪红斑丹毒丝菌1a型HG-1株，作为开发猪丹毒灭活疫苗的疫苗菌株。将这株细菌保存25～30瓶作为原始种子批。
2.实验结果
2.1菌株的培养特性
猪红斑丹毒丝菌分离株在含10％新生牛血清的TSA培养基上，37℃培养36小时，可长成光滑、边缘整齐、有微蓝色泽、无色透明、针尖大露珠样小菌落，如图1所示。该菌在普通培养基上也可生长，但在含有血清的培养基上长势更好。
2.2菌株的形态
革兰氏染色后在显微镜下观察，细菌为革兰氏阳性、直的或稍微弯曲的细长小杆菌，两端钝圆，无芽孢，无运动性，如图2所示。可与β-半乳糖苷、乙酰胺、葡萄糖、乳糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、硫化氢、尿素等反应呈阳性，与蔗糖、核糖、木糖、胆汁溶菌对照、胆汁七叶苷、鸟氨酸、***醇、硝酸盐(还原)等反应呈阴性。
2.3猪红斑丹毒丝菌的PCR鉴定结果
将扩增产物分别进行电泳，在凝胶成像***中观察，结果扩增出1500bp大小的片段，如图3所示，图中的Marker为DL 2000，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道1～6均为HG-1株16S rRNA基因的扩增结果；泳道7为阴性对照。然后送去测序，测序结果如SEQ ID NO.5所示。将序列测定结果通过在线生物学分析软件BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对分析，结果表明该菌株与其他猪红斑丹毒丝菌的亲缘关系均在99％以上。
2.4猪红斑丹毒丝菌的分子生物学方法鉴定血清型结果
将扩增产物分别进行电泳，然后在凝胶成像***中观察，结果扩增出356bp大小的片段，如图4所示，图中的Marker为DL 2000，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，100bp；泳道1为菌株HG-1、泳道2为阳性对照1a型参考菌株CVCC43008、泳道3为阴性对照。结果证明，菌株HG-1的血清型为1a型。
2.5猪红斑丹毒丝菌的血清因子方法鉴定血清型结果
用标准分型血清按Kieletein-Rapp-Gabriedson(KRG)琼脂扩散血清分型方法对分离的猪红斑丹毒丝菌菌株进行鉴定，其中中间孔加入标准阳性血清，周围孔分别加入鉴定菌株的热稳定抗原，出现沉淀线判为阳性，如图5所示，图中的中间孔为标准1a型血清，1加样为HG-1的热稳定性抗原，2加样为1a型参考菌株CVCC43008的抗原作为阳性对照，3为阴性对照。通过此方法鉴定出分离株为猪红斑丹毒丝菌1a型菌株。
2.6菌株毒力
对猪红斑丹毒丝菌HG-1株进行猪半数致死剂量(LD50)的测定，试验结果表明猪红斑丹毒丝菌HG-1株表现出很强的毒力，其LD50等于3.8×103CFU(见表1)。根据毒力试验结果，确定将猪红斑丹毒丝菌1a型HG-1株作为猪丹毒灭活疫苗的疫苗菌株。
表1猪源红斑丹毒丝菌HG-1株仔猪毒力试验结果
Figure BDA0002339085610000101
观察发现：动物在接种HG-1株36小时后开始发病，表现为精神沉郁、食欲减退或完全废绝、关节肿胀、跛行或卧地不起、可视黏膜发绀等临床症状，攻毒后4日内全部死亡。对照组的猪在观察期内各种指标均正常，无明显临床症状。
对发病死亡的猪进行解剖，并采集病料，进行分离鉴定。剖检结果显示，呈全身败血症变化；脾显著充血肿大；肺充血、水肿；全身***肿大，呈***；心脏外膜上可见小的出血点；肾脏肿大呈暗红色，有弥漫性出血点。在观察期结束后将对照组的5头猪也进行解剖，并采集病料，剖检未发现明显病理变化。从发病死亡猪的病料中均能分离出猪红斑丹毒丝菌，经过鉴定确实为HG-1株，对照组的病料中均未分离到猪红斑丹毒丝菌。
2.7猪红斑丹毒丝菌原始种子的保存
将HG-1株保存25～30瓶作为原始种子批。以脱脂牛奶为保护剂，冷冻真空干燥后的猪红斑丹毒丝菌呈固体但蓬松的蜂窝状结构，加水立即溶解。将原始种子批，贴上含有菌种名称、保存时间、保存人等信息的标签，置-80℃冰箱保存。三日后对保存菌种进行复苏检验，其无杂菌且活性良好，表明原始种子批达到要求。
将猪红斑丹毒丝菌1a型HG-1株送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏信息如下：保藏菌株：红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)HG-1，保藏编号：CCTCCNO:M 2019684，保藏日期：2019年09月02日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)。
试验例2
实施例2中猪丹毒灭活疫苗成品的检验：
1)性状
本品为灰白色混悬液，久置底部有少量沉淀，振荡后呈均匀混悬液。
2)装量检查
按现行《中国兽药典》附录进行检验，符合规定。
3)无菌检验
按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。
4)安全检验
仔猪接种的安全性试验：采用按照实施例2的方法试制的3批猪丹毒灭活疫苗(批号：201901、201902、201903)分别对3～4周龄健康仔猪进行2倍剂量接种(4mL/头)，同时设立对照组接种无菌PBS(0.0lmol/L、pH值7.2)(4mL/头)，免疫部位为颈部肌肉，免疫后密切观察其临床症状及病理变化。
结果表明，3批疫苗接种仔猪均无因接种疫苗引起的精神状态和食欲异常、呕吐、腹泻甚至死亡等局部或全身不良反应。接种前与接种后一周内的体温测定结果表明，免疫组仔猪出现了短暂的体温升高，但在接种后24小时体温平均升高不超过1℃，且在48小时内恢复正常。观察期结束后，解剖观察各组试验仔猪免疫部位，3批疫苗组仔猪的免疫部位均无明显的疫苗残留、局部炎症和组织病变等现象，也无肉芽肿的形成，与对照组相比无明显差异。上述试验结果表明，实施例2中猪丹毒灭活疫苗对使用最小日龄靶动物(3～4周龄仔猪)进行接种是安全的。
5)效力检验
仔猪免疫攻毒法：用4～5周龄健康仔猪30头，随机均分为6组(5头/组)，具体分组情况见表2。第1组和第4组为疫苗免疫组，每头仔猪各颈部肌肉注射疫苗2mL，3周后，再按相同方法接种疫苗2mL。第2组和第5组仔猪不接种疫苗，接种2mL无菌PBS作为空白对照组。第3组和第6组仔猪不接种作为健康对照组，隔离饲养，不攻毒。在第2次接种后14日，将第1组和第2组通过耳缘静脉注射含约40LD50剂量红斑丹毒丝菌1a型亲本菌株HG-1菌液1mL(含活菌数为1.6×105CFU)，将第4组和第5组通过耳缘静脉注射含约4LD50剂量红斑丹毒丝菌2型参考菌株CVCC43006菌液1mL(含活菌数约为6.8×106CFU)，逐日观察所有仔猪的发病情况至14日。
免疫试验结果(见表2)表明，由猪红斑丹毒丝菌1a型菌株HG-1制备的猪丹毒灭活疫苗对1a型亲本菌株HG-1和2型参考菌株CVCC43006的抵抗力均较好，对1a型亲本菌株HG-1的保护率为100％，攻毒后仔猪没有出现明显的临床症状；对2型参考菌株CVCC43006也有较好的保护力(80％)，攻毒后只有1头仔猪出现精神沉郁，食欲不振等轻微症状。
表2猪红斑丹毒丝菌HG-1株仔猪免疫保护试验结果
Figure BDA0002339085610000121
注：“——”表示不适用。
由上表可以看出，由猪红斑丹毒丝菌1a型菌株HG-1制备的猪丹毒灭活疫苗对1a型和2型猪红斑丹毒丝菌均有良好的免疫保护效果。
6)甲醛、硫柳汞残留量测定
按现行《中国兽药典》附录进行测定，符合规定。
试验证明，本发明中猪丹毒灭活疫苗可以有效地抵抗猪红斑丹毒丝菌1a型和2型原始菌株及当代流行菌株的感染。
以上对本发明的具体实施例进行了描述，但本发明的实施方式不受上述特定实施例的限制。本领域技术人员在权利要求的范围内做所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 河南科技大学
<120> 猪红斑丹毒丝菌1a型菌株、猪丹毒灭活疫苗及其应用
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<160> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 上游引物JD01
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 下游引物JD02
<400> 2
acggttacct tgttacgact t 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 上游引物P3
<400> 3
ctcctaacgc tttagcacgc 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 下游引物P4
<400> 4
tgatcctttg ccactaatgc 20
<211> 1408
<212> DNA
<213> 猪红斑丹毒丝菌1a型菌株HG-1
<221> 菌株HG-1的16S rRNA
<400> 5
gcagtcgaac gaagtgaaga ggagcttgct ccttggaact tagtggcgaa cgggtgagta 60
atacataagc aacctgcctc gatgcctggg ataacagagg gaaacttctg ctaataccgg 120
atacgttaat ctaagacatc ttagattaat taaagatggg atacatcaca acgagatggg 180
cttatggcgc attagttagt tggtaaggta acggcttacc aagacgatga tgcgtagccg 240
acctgagagg gtgaccggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc 300
agcagtaggg aattttcggc aatgggggaa accctgaccg agcaacgccg cgtgagtgaa 360
gacggccttc gggttgtaaa gctctgttgt aagggaagaa cgataggaag agggaatgct 420
tcttatatga cggtacctta ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta 480
atacgtaggt ggcaagcgtt atccggaatt attgggcgta aagggagcgc aggcggttta 540
tcaagtttat ggttaaagtt cggggcttaa ccccgtgatg ccatagaaac tggtagacta 600
gagtgcagga gaggttagtg gaattccatg tgtagcggta aaatgcgtag atatatggag 660
gaacaccagt ggcgaaggcg gctaactggc ctgtaactga cgctgaggct cgaaagcgtg 720
gggagcaaat aggattagat accctagtag tccacgccgt aaacgatgga tactaagtgt 780
tggagaaatt cagtgctgta gttaacgcaa taagtatccc gcctggggag tatgcgcgca 840
agcgtaaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagtat gtggtttaat 900
tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatacc gcgcaaaagc acagagatgt 960
gtaatagtta tggcggatac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt 1020
tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgtctttagt taccagcatt aagttgggga 1080
ctctaaagag actgccggtg ataaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg 1140
ccccttatga tctgggctac acacgtacta caatggcgta tacagagggc agcgaagcag 1200
cgatgcggag cgaatctcag aaagtacgtc tcagttcgga ttggagtctg caactcgact 1260
ccatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagaatgc cgcggtgaat acgttctcgg 1320
gccttgtaca caccgcccgt caaaccatga gagttggtaa tacccgaagc cggtggccta 1380
acctagttac taggagggag ccgtcgaa 1408

Claims (10)

1.猪红斑丹毒丝菌1a型菌株，其特征在于：所述猪红斑丹毒丝菌1a型菌株为红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)HG-1，保藏编号：CCTCC NO:M 2019684。
2.猪丹毒灭活疫苗，其特征在于：所述猪丹毒灭活疫苗的抗原为灭活的猪红斑丹毒丝菌1a型菌株，所述猪红斑丹毒丝菌1a型菌株为红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)HG-1，保藏编号：CCTCC NO:M 2019684。
3.根据权利要求2所述的猪丹毒灭活疫苗，其特征在于：所述猪丹毒灭活疫苗中还含有佐剂和防腐剂。
4.根据权利要求3所述的猪丹毒灭活疫苗，其特征在于：所述佐剂为GEL水溶性聚合物佐剂、氢氧化铝胶佐剂中的一种。
5.根据权利要求3所述的猪丹毒灭活疫苗，其特征在于：所述防腐剂为硫柳汞、苯酚中的一种。
6.根据权利要求2～5中任一项所述的猪丹毒灭活疫苗，其特征在于：所述猪丹毒灭活疫苗中，猪红斑丹毒丝菌1a型菌株的灭活菌体含量不少于3.0×109CFU/mL。
7.如权利要求1所述的猪红斑丹毒丝菌1a型菌株在制备猪丹毒灭活疫苗中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述猪丹毒灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1)将猪红斑丹毒丝菌1a型菌株的菌液进行灭活；
2)将灭活后的菌液浓缩去除上清，洗涤后稀释，得到抗原液；
3)将抗原液与佐剂、防腐剂混合均匀，即得。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：步骤1)中，所述菌液中猪红斑丹毒丝菌1a型菌株的活菌含量不少于1.0×109CFU/mL。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：步骤2)中，所述灭活采用甲醛灭活剂。
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