CN111621450B - 一种鸭源鸡杆菌及其应用 - Google Patents

一种鸭源鸡杆菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111621450B
CN111621450B CN202010664292.4A CN202010664292A CN111621450B CN 111621450 B CN111621450 B CN 111621450B CN 202010664292 A CN202010664292 A CN 202010664292A CN 111621450 B CN111621450 B CN 111621450B
Authority
CN
China
Prior art keywords
duck
chicken
origin
strain
vaccine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010664292.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111621450A (zh
Inventor
张玉杰
刘�东
刘红祥
郭玉广
高天佐
杜元钊
赵鹏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Original Assignee
Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd filed Critical Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority to CN202010664292.4A priority Critical patent/CN111621450B/zh
Publication of CN111621450A publication Critical patent/CN111621450A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111621450B publication Critical patent/CN111621450B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明提供一种鸭源鸡杆菌和用该菌制备的灭活疫苗，保藏编号为CCTCC NO:M 2020272的鸭源鸡杆菌YT‑1株所制备的疫苗能够用于预防鸭源鸡杆菌引起的种鸡产蛋下降、受精率下降和输卵管炎疾病，从而填补我国没有鸭源鸡杆菌疫苗的空白。本发明通过对临床上蛋种鸡和肉种鸡经人工授精后出现产蛋下降的病例进行了病原的分离鉴定与纯化，得到了一株鸭源鸡杆菌，经过细菌的分离培养、特异性PCR鉴定和16s rRNA序列分析及动物回归试验，确定所筛选的细菌为鸭源鸡杆菌，并用该菌株制备的灭活疫苗免疫鸡群，结果表明，该苗能够有效预防临床上由鸭源鸡杆菌引起的产蛋下降和输卵管炎等疾病。

Description

一种鸭源鸡杆菌及其应用
技术领域
本发明属于禽类疫苗制备技术领域，具体涉及一种鸭源鸡杆菌和用该菌制备的灭活疫苗。
背景技术
Kjos-Hansen等在1950年首次报道了鸡杆菌，Christensen等于2003年将巴氏杆菌科中的鸭巴氏杆菌、输卵管炎巴氏杆菌和溶血性巴氏杆菌单独成立为鸡杆菌属，Bisgaard等于2009年进一步将鸭源鸡杆菌明确为鸡杆菌属的一个代表种。鸡、火鸡、鸭、鹅、鹦鹉、鹧鸪和珍珠鸡等各种禽类中都可以分离出鸡杆菌，从具有不同临床症状的禽类中也可以分离到不同的鸡杆菌属细菌。
研究表明，鸡杆菌可以从健康的禽类中分离到，有人认为这些细菌可能是上呼吸道和下生殖道正常微生物群的一部分；与此相反，kohlert和mirle等从患生殖***疾病的蛋鸡中亦可分离到鸡杆菌，并认为该病原菌是开产蛋鸡输卵管炎、输卵管囊肿和败血症的潜在致病菌，进而导致产蛋量和蛋的品质下降；另一项研究则表明某些禽杆菌引起鸡心内膜炎、鼻窦炎或者上呼吸道感染。此外，该病原菌还能造成患有免疫抑制疾病的鸡群较高的死亡率。国内关于该菌的研究主要局限于菌株分离培养特性，但对于该菌在临床上的危害以及实验室相关动物回归试验数据尚无人论证，王川庆等于2008年首次报道了鸭源鸡杆菌在我国的存在，郑鹿平等于2010年从64只患输卵管炎鸡的不同脏器中分离鉴定到45株鸭源鸡杆菌，方翟等于2014年从患腺胃肿大的 10日龄雏鸡腺胃内分离到1株鸭源鸡杆菌。
研究表明鸭源鸡杆菌能够引起鸡输卵管囊肿和产蛋量下降，但对受精率无影响。自2000年以来，我国一些规模化种鸡场每批鸡群在开产后人工授精均会出现产蛋量和孵化率双双下降的情况，并且有愈演愈烈的趋势，给养鸡企业造成了巨大的经济损失，因鸭源鸡杆菌血清型众多，初步猜测该病可能与新血清型的鸭源鸡杆菌有关。为有效防控该病，筛选新的血清型鸭源鸡杆菌就迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸭源鸡杆菌和用该菌制备的灭活疫苗，该鸭源鸡杆菌所制备的疫苗能够用于预防鸭源鸡杆菌引起的种鸡产蛋下降、受精率下降和输卵管炎疾病，从而填补我国没有鸭源鸡杆菌疫苗的空白。
本发明首先提供一种鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis)YT-1株，已经于2020年7月3日保藏于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO: M 2020272；
本发明所提供的鸭源鸡杆菌为YT-1株用于制备疫苗；
所述的疫苗，为灭活疫苗。
本发明另一个方面还提供一种鸭源鸡杆菌灭活疫苗，包含有灭活的鸭源鸡杆菌菌株抗原和疫苗佐剂，其中抗原为鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis)YT-1株；
其中灭活疫苗中的抗原含量约为12.5亿/mL；
其中鸭源鸡杆菌是使用甲醛溶液进行灭活。
所述的疫苗佐剂为水相佐剂。
本发明的灭活疫苗，其制备方法如下：
1)菌液培养：采用发酵罐对鸭源鸡杆菌YT-1株进行培养，获得细菌液；
2)菌液灭活：将收获的菌液加入10％甲醛溶液，使其终浓度为0.3％，4℃条件灭活96小时；
3)抗原液制备：根据菌体计数结果，将灭活的YT-1株用无菌PBS缓冲液调整到12.5亿/mL；
4)制苗：取抗原液95份导入乳化罐内，开动电机慢速转动搅拌，同时加入MONTANIDE·GEL·02佐剂5份，加入后搅拌充分混匀。
本发明通过对临床上蛋种鸡和肉种鸡经人工授精后出现产蛋下降的病例进行了病原的分离鉴定与纯化，得到了一株鸭源鸡杆菌，经过细菌的分离培养、特异性PCR鉴定和16s rRNA序列分析及动物回归试验，确定所筛选的细菌为鸭源鸡杆菌，并用该菌株制备的灭活疫苗免疫鸡群，结果表明，该苗能够有效预防临床上由鸭源鸡杆菌引起的产蛋下降和输卵管炎等疾病。
附图说明
图1：发病鸡群临床症状图；
图2菌落在TSA、血平板及革兰氏染色后光学显微镜下图；
图3：PCR扩增结果电泳图；
图4：基于鸭源鸡杆菌16s rRNA基因序列的遗传进化分析图，其中图中黑色圆圈代表试验分离的鸭源鸡杆菌YT-1株；
图5：基于鸭源鸡杆菌OmpA基因氨基酸序列的遗传进化分析图，其中图中黑色圆圈代表试验分离的鸭源鸡杆菌YT-1株；
图6：鸭源鸡杆菌YT-1株与参考毒株OmpA基因氨基酸比对图；
图7：动物回归试验图；
图8：攻鸭源鸡杆菌后病鸡生殖***病变及蛋壳质量变化图，其中A图中右侧虚线框内为试验2组和4组所产鸡蛋，左侧为试验5组所产鸡蛋。
具体实施方式
本发明从山东、辽宁和河南采集发病种鸡疑似样品，通过病毒和细菌的分离鉴定以及动物回归试验，确定了引起开产种鸡人工授精后产蛋量下降和孵化率下降的病原为鸭源鸡杆菌，进而为该病的深入研究奠定了基础，这对该病的防控具有重要意义。
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1：细菌株的分离
1、基本情况：2019年10月至今，山东、辽宁、河南、广西地区的蛋种鸡和肉种鸡场出现了一种以开产鸡群人工授精后产蛋下降、蛋壳质量变差为特征的新发传染病。鸡群感染后一般无明显临床症状，开产鸡群尤其是上高峰的鸡群感染后会出现持续性减料现象，10g～20g不等，同时伴随着产蛋率下降，蛋壳质量变差，白壳蛋和软皮蛋增多(图1-C)，此过程一般持续2周左右，到达最低点稳定几天后，开始恢复，采食量回升，产蛋率上升，但升不到发病前的水平，此过程亦持续2周左右，整个病程为5周～7周。期间部分病鸡表现为精神萎靡，闭目缩颈(图1-E)，拉水样料便或乳黄色粘稠稀便 (图1-D)，部分鸡产蛋停止，一般无明显死亡现象，部分鸡群因管理不当造成死淘略高于正常。死亡鸡只和发病鸡只剖检主要表现为肝脏呈红黄相间的条纹状坏死、卵泡破裂、卵子充血、输卵管囊肿、输卵管内有黄白色干酪样分泌物(图1-A，B)，其它脏器无明显变化。
2、病毒分离：无菌采集病鸡输卵管、卵泡和肝脏等组织，弃掉卵泡内卵黄，将卵泡膜、输卵管和肝脏剪碎后，加入适量生理盐水，匀浆器匀浆后加双抗各1000U，反复冻融3次，4℃、8 000r/min离心15min，吸取上清液，0.22μm滤器过滤除菌。将上述滤液经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚20 枚，12日龄SPF鸭胚20枚，0.2mL/枚。接种后置于37℃生化培养箱恒温孵化。弃掉24h内死亡的鸡胚和鸭胚，连续观察5d，收获接种24h后的鸡胚尿囊液和鸭胚尿囊液，－80℃冻存备用。按照上述方法盲传3代。
3、支原体的分离培养检测：无菌取病鸡输卵管、卵泡，将卵泡内卵黄弃掉，用无菌生理盐水冲洗数遍后用高压灭菌后的研钵研磨输卵管和卵泡膜，加入适量的无菌生理盐水充分涡旋，4℃静置1h，取上清用0.45μm无菌滤器过滤除菌后经卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚，37℃培养7d。弃掉24h内死亡的鸡胚，收获接种24h后的鸡胚卵黄膜。并连续盲传3代。
结果表明66份样品接种SPF鸡胚和SPF鸭胚，经盲传3代，均无死亡现象，胚体无异常，尿囊液无血凝活性，无疑似病毒；经卵黄囊接种后，均未分离检测到支原体。
4、细菌的分离、纯化及初步鉴定：打开病鸡腹腔，剖开输卵管，用高压灭菌的棉棒蘸取输卵管壁表面和病变的卵泡表面后浸入盛有适量生理盐水的2ml离心管中，无菌摘取公鸡睾丸置于超净工作台酒精灯周围，用烧红的刀片将睾丸纵向切开，用无菌棉棒蘸取睾丸内容物后浸入盛有适量生理盐水的2ml 离心管中，将以上样品充分涡旋后，吸取0.2ml液体于3％马血清的TSA平板上，并用涂板器涂抹均匀，37℃培养过夜；挑取疑似菌落于绵羊血琼脂平板， 37℃培养过夜，进行革兰氏染色、镜检，并将可疑菌落再次接种绵羊血琼脂平板进一步纯化。将纯化后的菌落分别接种麦康凯培养基、伊红美蓝培养基，观察其生长情况。
5、筛选结果：从66份样品中分离到66株形态特征一致的菌株，分离菌大多定植于开产母鸡输卵管和卵巢、性成熟公鸡***、睾丸和泄殖腔，其它脏器如肝脏、气管和肺脏等极少，如表1所示。分离菌在TSA培养基上呈针尖样，添加3％马血清后生长旺盛，呈圆形、灰白、半透明、边缘整齐，直径 1～2mm的小菌落，如图2-A，在绵羊血琼脂平板上呈β溶血，如图2-B。光学显微镜下观察呈细小杆状，革兰氏染色阴性，如图2-C。在麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板上不生长。
表1：66份样品中不同脏器分离的菌株
Figure BDA0002579774980000051
注：调查的33家母鸡和公鸡均为笼养，人工授精，“—”表示无
将从烟台地区分离的1株疑似鸭源鸡杆菌命名为YT-1株，已于2020年7 月3日保藏于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020272。
实施例2：YT-1株的鉴定
一、特异性PCR鉴定
利用鸡杆菌保守基因rpoB、16s rRNA和23s rRNA为鉴定引物(如表2)，对YT-1株进行特异性PCR鉴定；再用鸡杆菌16s rRNA基因(1461bp)和OmpA 基因(1076bp)全长引物对YT-1株进行PCR扩增，将扩增获得的目的片段送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
表2：引物序列表
Figure BDA0002579774980000061
结果显示YT-1株经PCR扩增，均能得到3条目的带：560bp、790bp和 1030bp或1080bp，初步确定YT-1株为鸡杆菌。阳性菌株经PCR扩增16s rRNA 基因(图3-B)和OmpA基因(图3-C)全长，将获得的目的片段测序。
二、细菌分类16s rRNA基因分析
将PCR扩增得到的16s rRNA基因全长序列(SEQ ID NO:1)与NCBI中公布的鸭源鸡杆菌的16s rRNA基因序列用MegAlign软件进行比对分析；以 Neighbor-joining的方法，bootstrap进行1000个重复，用MEGA 6.0进行遗传进化分析。
结果显示YT-1株鸭源鸡杆菌与NCBI中已发表的鸭源鸡杆菌株的16s rRNA 基因核苷酸同源性在99.0％-99.9％之间(表3)，与中国河南、丹麦以及美国地区的参考菌株同源性最接近，均处于进化树中的鸭源鸡杆菌分支(图4)，说明新分离的细菌YT-1株为鸭源鸡杆菌。
表3：鸭源鸡杆菌YT-1株与参考菌株16s rRNA基因核苷酸的同源性比较
Figure BDA0002579774980000062
Figure BDA0002579774980000071
三、主要保护性抗原基因外膜蛋白A(OmpA)基因分析
将PCR扩增得到的OmpA基因全长序列翻译为氨基酸序列后(SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3)与NCBI中公布的鸭源鸡杆菌的OmpA基因氨基酸序列用MegAlign软件进行比对分析；以Neighbor-joining的方法，bootstrap进行1000个重复，用MEGA 6.0进行遗传进化分析。
结果显示YT-1株鸭源鸡杆菌的OmpA基因与NCBI中已发表的鸭源鸡杆菌株OmpA基因核苷酸同源性在84.9％～86.2％之间，氨基酸同源性在46.0％～46.2％之间(表4、图6)，说明不同菌株OmpA基因在核苷酸和氨基酸水平的同源性较低，表现出明显的菌株差异性，OmpA基因氨基酸遗传进化分析显示，YT-1 株处于单独的进化分支(图5)。
表4鸭源鸡杆菌YT-1株与参考菌株OmpA基因之间的同源性比较
Figure BDA0002579774980000072
实施例3动物回归试验—攻毒动物模型的建立
将24只15周龄健康海兰褐蛋鸡平均分为3组，8只/组，饲养在装有通风管道并能提供过滤空气的封闭房间，光照、通风、饮水和饲料等严格执行海兰蛋鸡饲养管理方案。攻菌前1周，采集每只鸡的泄殖腔拭子和咽拭子样本进行细菌分离，所有试验鸡只鸡杆菌检测均为阴性。
鸡群在135日龄，开始按照下表5试验设计进行试验，1组进行一次攻菌， 2组进行两次攻菌，3组为对照。每天观察鸡只是否有临床异常，每日下午17:00 点收集各组鸡蛋并记录数量。分别于攻菌后第3、5和7天采集每组鸡只的泄殖腔拭子和生殖道拭子(无菌棉棒进入深度至少6cm)进行细菌分离，实验过程共持续31天，试验结束后将所有鸡只处死尸检、取样并进行细菌分离。
表5试验设计表
实验分组 数量 处理 攻菌及剂量 攻菌方式
1 8 1次攻菌 G.anatis 8.66×10<sup>7</sup>cfu/200ul 模拟人工授精
2 8 2次攻菌 G.anatis 8.66×10<sup>7</sup>cfu/200ul 模拟人工授精
3 8 — — —
注：人工授精是每5天给母鸡进行一次输精，保证较高的受精率，母鸡一生要进行N次人工授精，直至淘汰。
试验1组鸡群自攻菌后第3天开始吃料速度减慢，采食量下降，最高 5g/天(表6)，并于攻菌后第23天开始，日产蛋率从87.5％～100％之间降到75％左右，并维持在这一水平(图7)，病程3w～4w，所产鸡蛋蛋壳质量正常。试验2组鸡群一次攻菌后情况与试验1组鸡群情况一致，并于二次攻菌后第2天减料达到最高10g/天，从二次攻菌后第5天开始，出现剧烈的降蛋现象，日产蛋率从87.5％～100％之间降到0～25％之间，有的鸡只甚至绝产，随着时间的推移，日产蛋率开始逐渐恢复，但不能恢复到发病前的水平，最后日产蛋率在50％左右徘徊(图7)，病程4w～5w，产蛋中后期个别鸡只所产鸡蛋蛋壳质量差，皮薄、易碎，与现场实际发病情况完全一致。整个试验过程中，对照组鸡只一切正常。
动物回归试验表明，鸭源鸡杆菌可以引起人工授精的母鸡产蛋下降，这与临床的发病情况完全一致，该动物模型成立，为后续鸭源鸡杆菌疫苗的评估奠定了基础。
表6：攻菌后各组鸡群的临床表现
Figure BDA0002579774980000081
Figure BDA0002579774980000091
实施例4疫苗的制备及细菌中和试验
1疫苗的制备
1.1菌液的培养及灭活
(1)菌液培养采用发酵罐对鸭源鸡杆菌YT-1株和F149株(鸭源鸡杆菌 F149株(保藏编号NCTC11413)购自北京百欧博伟生物技术有限公司，菌种来自美国菌种保藏中心，保藏编号
Figure BDA0002579774980000092
43329TM)分别进行培养，按照发酵罐容积的60％～80％加入TSB培养基，同时加入消泡剂，通入高压蒸汽进行灭菌，待温度降至37℃时，加入马血清、鸭源鸡杆菌菌种，各组分终浓度分别为2.5％、2.5％，进行发酵培养。培养温度为37℃、搅拌转速100r/min、pH值为7.2～7.5，菌液培养5～6小时后，取样进行纯粹检验。离心收获菌泥。用比浊法测定菌泥菌体数。置2～8℃保存、备用。
(2)菌液灭活根据菌泥菌体计数结果，将菌泥用适量灭菌的PBS缓冲液复溶至菌体数为50.0亿/mL，加入10％甲醛溶液，使其终浓度为0.3％，2～ 8℃灭活96小时。取样进行灭活检验。将灭活菌液用适量灭菌的PBS缓冲液稀释，取样进行菌体计数，置2～8℃保存、备用。
1.2半成品检验
(1)纯粹检验取灭活前菌液，按现行《中国兽药典》附录中的方法进行检验，应纯粹。
(2)灭活检验取灭活前菌液，按现行《中国兽药典》附录中的方法进行检验，应无菌生长。
(3)菌体计数取稀释好的灭活菌液，按比浊法进行细菌计数，鸭源鸡杆菌YT-1株和F149株菌数均不低于12.5亿/mL。
1.3灭活疫苗的制备：经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备。
(1)抗原液制备根据菌体计数结果，将检验合格的YT-1株和F149株用无菌PBS缓冲液调整到12.5亿/mL；
(2)制苗取抗原液95份导入乳化罐内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入MONTANIDE·GEL·02佐剂5份，加入后搅拌充分混匀即可。
(3)分装定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。
1.4疫苗成品检验
1.4.1性状
外观：半透明白色悬浊液，底部有少许沉淀。
1.4.2无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行，结果符合规定。
1.4.3安全检验：不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。用28 日龄SPF鸡10只和健康家兔10只，每只颈部皮下注射疫苗1.0ml，同时分别设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验鸡、兔采食、饮水及临床情况。应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
结果表明，试验组和对照组鸡、兔发育正常，精神状态良好，剖检试验组发现注射部位疫苗吸收良好，无红肿、组织坏死等炎症反应。说明试制疫苗安全无害，对动物生长无影响。
1.4.4效力检验
准备25只健康家兔，10只颈部皮下注射鸭源鸡杆菌YT-1株疫苗，另外 10只颈部皮下注射鸭源鸡杆菌F149株疫苗，0.5ml/只，另取5只同日龄健康家兔不免疫作对照，免后28日，采血分离血清，分别测定抗体。免疫组抗体的乳胶凝集试验应为“++++”(表示100％凝集)，对照组应均为阴性。同时，准备25只开产SPF母鸡，10只免疫鸭源鸡杆菌YT-1株疫苗，另外10只免疫鸭源鸡杆菌F149株疫苗，0.5ml/只，另取5只不免疫作对照，免后28日，用鸭源鸡杆菌YT-1株、F149株菌液0.2ml(活菌量为1.0×108CFU)模拟人工授精通过生殖道攻菌，每5天1次，连续攻菌3次，从最后一次攻菌开始，连续观察30天；对照鸡发病，免疫鸡不发病。
2、细菌交叉中和试验
将鸭源鸡杆菌YT-1株和F149株按上述方法制成灭活疫苗，分别免疫健康家兔，免疫剂量0.5ml/只，每隔2周免疫一次，共免疫3次，三免后2周进行采血分离血清，用鸭源鸡杆菌YT-1株、F149株乳胶凝集诊断抗原进行抗原-抗体交叉中和试验。结果发现，YT-1株诊断抗原与YT-1株阳性血清产生明显的乳胶凝集颗粒，F149株诊断抗原与F149株阳性血清产生明显的乳胶凝集颗粒，但YT-1株诊断抗原与F149株阳性血清、F149株诊断抗原与YT-1 株阳性血清的凝集度明显低，说明不同菌株对自身的中和能力较强，但对彼此的中和能力较差(表7)。
表7：鸭源鸡杆菌YT-1株、F149株的血清交叉中和试验结果表
Figure BDA0002579774980000111
注：*表示病毒；**表示血清，R值大于0.8为同一血清型，R值在0.25～0.8 之间为同一血清型不同亚型，R值小于0.25为不同血清型。
3、攻毒保护试验
将50只10周龄健康海兰褐蛋鸡平均分为两组，10只/组，饲养在装有通风管道并能提供过滤空气的封闭房间，光照、通风、饮水和饲料等严格执行海兰蛋鸡饲养管理方案。免疫前3天，采集每只鸡的泄殖腔拭子和咽拭子样本进行细菌分离，所有试验鸡只鸡杆菌检测均为阴性。按照表8试验设计使用鸭源鸡杆菌YT-1株和F149株制备的灭活疫苗进行免疫。
鸡群在135日龄，开始按照下表8试验设计进行试验，1组和2组为免疫 YT-1组，3组和4组为免疫F149组，5组为正常对照。每天观察鸡只是否有临床异常，每日下午17:00点收集各组鸡蛋并记录数量。分别于攻菌后第3、 5、7、11和28天采集每组鸡只的泄殖腔拭子和生殖道拭子(无菌棉棒进入深度至少6cm)进行细菌分离，实验过程共持续30天，试验结束后将所有鸡只处死尸检、取样并进行细菌分离。
表8试验设计
Figure BDA0002579774980000121
攻毒保护试验结果表明，1组和4组鸡群在整个实验过程中一切正常，无异常临床症状、产蛋率及蛋的品质正常，与5组正常对照鸡群一致，攻菌后从第3天至第28天泄殖腔拭子和生殖道拭子均不排菌；2组和3组鸡群于二次攻菌后第5天开始发病，首先吃料速度减慢，料量下降，随后产蛋率迅速下降，降幅达70％以上，有的母鸡甚至出现绝产现象，期间个别母鸡精神沉郁，拉稀，所产鸡蛋质量差，皮薄、质脆、易碎，与自然发病情况完全一致，攻菌后从第3天至第28天泄殖腔拭子和生殖道拭子均能分离到鸭源鸡杆菌，基因测序结果为鸭源鸡杆菌YT-1株和F149株。以上试验表明，鸭源鸡杆菌YT-1 株、F149株灭活疫苗免疫鸡群后只能对菌株自身起到很好的免疫保护作用，而对彼此无交叉保护能力。
实施例5鸭源鸡杆菌YT-1株灭活疫苗的临床应用
分别以YT-1株、F149株为疫苗种子，按照实施例3的方法制备鸭源鸡杆菌YT-1株和F149株灭活疫苗。
将40只22周龄健康海兰褐蛋鸡平均分为5组，8只/组，饲养在装有通风管道并能提供过滤空气的封闭房间，光照、通风、饮水和饲料等严格执行海兰蛋鸡饲养管理方案。攻菌前1周，采集每只鸡的泄殖腔拭子和咽拭子样本进行细菌分离，所有试验鸡只鸡杆菌检测均为阴性。
鸡群在135日龄，开始按照下表9试验设计进行试验，1组和2组免疫YT-1 株灭活疫苗，3组和4组免疫F149株灭活疫苗，按照要求进行两次攻菌，5 组为对照。每天观察鸡只是否有临床异常，每日下午17:00点收集各组鸡蛋并记录数量。分别于攻菌后第3、5和7天采集每组鸡只的泄殖腔拭子和生殖道拭子(无菌棉棒进入深度至少6cm)进行细菌分离，实验过程共持续31天，试验结束后将所有鸡只处死尸检、取样并进行细菌分离。
表9：试验设计
Figure BDA0002579774980000131
结果表明试验2组和4组二次攻菌后第2天减料达到最高10g/天，持续时间为4周～5周,然后开始缓慢恢复，同时于二次攻菌后第5天开始出现打蔫现象，个别鸡只拉黄色泡沫样稀粪，鸡只生殖道有炎性分泌物流出，与现场实际发病情况、动物回归试验情况完全一致；整个试验过程中，试验1组和3 组无任何异常；对照组鸡只一切正常。
试验2组和4组自二次攻菌后第5天开始，出现剧烈的降蛋现象，日产蛋率从87.5％～100％之间降到0～25％之间，有的鸡只甚至绝产，随着时间的推移，日产蛋率开始逐渐恢复，但不能恢复到发病前的水平，最后日产蛋率在 50％左右徘徊，产蛋中后期个别鸡只所产鸡蛋蛋壳质量差，皮薄、易碎，如图 8-A，绝大多数鸡蛋的蛋清和蛋黄正常，仅少数鸡蛋的蛋清稀薄；试验1组、试验3组和对照组均正常。
试验2组和试验4组自攻菌后第3、5、7天的生殖道拭子中均能分离获得大量菌落形态单一的鸭源鸡杆菌，试验1组和3组鸭源鸡杆菌为阴性。试验结束后，剖检所有试验鸡只，发现试验2组和4组鸡只均出现不同程度的生殖***病变，卵泡充血、变形、液化，破裂后卵黄跌入腹腔形成腹膜炎，输卵管囊肿、积液、内有白色干酪物，如图8-B和图8-C，与现场剖检变化一致，其它脏器无异常，试验1组、试验3组和对照组均无异常。
免疫疫苗后攻毒保护试验结果表明，制备的鸭源鸡杆菌YT-1株灭活疫苗能够对流行的鸭源鸡杆菌菌YT-1株流行群起到很好的保护作用；制备的鸭源鸡杆菌F149株灭活疫苗能够对流行的鸭源鸡杆菌菌F149株流行群起到很好的保护作用，但不能对YT-1株流行群起到保护作用。
综上所述，两种毒株的疫苗不能相互保护，鉴于目前我国人工授精的开产种鸡主要感染以鸭源鸡杆菌YT-1株为代表的流行群，因此，用鸭源鸡杆菌 YT-1株制备的灭活疫苗，种鸡免疫后攻毒，不降蛋、不排毒、无异常临床症状，可用于预防临床上该菌引起的产蛋下降等问题。
综上，本发明的鸭源鸡杆菌YT-1株灭活疫苗是国内首个针对鸭源鸡杆菌引起的“产蛋下降”疫苗，对我国养鸡业的健康发展具有重大意义。
序列表
<110> 青岛易邦生物工程有限公司
<120> 一种鸭源鸡杆菌及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1461
<212> DNA
<213> 鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis)
<400> 1
attgaacgct ggcggcaggc ttaacacatg caagtcgaac ggtaacgggt tgaaagcttg 60
ctttcaatgc tgacgagtgg cggacgggtg agtaaggctt ggggatctgg cttttggagg 120
gggataacca ttggaaacga tggctaatac cgcatagtat cgagagatga aaggggtggg 180
aaaccacttg ccaagggatg aaccctagtg agattaggta gttggtgggg taaaggccta 240
ccaagccgac gatctctagc tggtctgaga ggatggccag ccacactggg actgagacac 300
ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc gcaatggggg gaaccctgac 360
gcagccatgc cgcgtggatg aagaaggcct tcgggttgta aagttctttc ggtggtcagg 420
aaggttagga tgttaatagc atactgattt gacgttagcc acagaagaag caccggctaa 480
ctccgtgcca gcagccgcgg taatacggag ggtgggagcg ttaatcggaa taactgggcg 540
taaagggcac gcaggcggga cgttaagtga gatgtgaaag ccccgggctt aacctgggaa 600
cagcatttca tactggcgta ctagagtact ttagggaggg gtagaattcc acgtgtagcg 660
gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaatacc gaaggcgaag gcagcccctt gggaagatac 720
tgacgctcat gtgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 780
tgtaaacgct gtcgatttgg gggttgtacg aaaggtatgg ctctcgaagc aaacgtgata 840
aatcgaccgc ctggggagta cggccgcaag gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc 900
gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gatgcaacgc gaagaacctt acctactctt 960
gacatcctaa ggagaagcta gagatagctt tgtgctttcg agaacttaga gacaggtgct 1020
gcatggctgt cgtcagctcg tgttgtgaaa tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 1080
ccttattctt tgttaccagc gggtaaagcc ggggactcaa aggagactgc cagtgacaag 1140
ctggaggaag gtggggatga cgtcaagtca tcatggccct tacgagtagg gctacacacg 1200
tgctacaatg gtgcatacag agggaggcga agtagcgata cggagcgaaa ctcagaaagt 1260
gcatcgtagt ccggattgga gtctgcaact cgactccatg aagtcggaat cgctagtaat 1320
cgcgaatcag aatgtcgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 1380
catgggagtg ggttgtacca gaagtagata gcttaacctt attggagggc gtttaccacg 1440
gtatgattca tgactggggt g 1461
<210> 2
<211> 1080
<212> DNA
<213> 鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis)
<400> 2
atgaaaaaga ctgcaatcgc attagcaatt tcaggattag cattcgtatc agtaccacaa 60
gcagctcctc aagcgaacac tttctacggt ggtgcggaag ctggttgggg ttgtatttgt 120
aatgatgtaa atcaatttga tgctgaaaaa aatgatggta ttggttatgg tggtcatcgc 180
aactcagtaa cttacggtgt attcggtggc ttgtaaatga ctgataactt cgctgttgaa 240
aaaaccagta acttctttgg ctagttaaaa gtggacgatg gtgatactga acgtgctggt 300
cacactgctc acggcttaaa tcttagctaa aaagcaagct ccagatgatt ttatgttgac 360
ggtttagacg tttacggtcg ttcaggtgca gcattaatcc gttctgatta cacaacgcat 420
gtagacggta tcagtaccta ttctgatcat aaattaaaag tatctcctgt attcgcaggc 480
ggtgttgaat ttgcaattct tcctgagttg gcagcacgtt tagaatacca atggattgct 540
aaagtaggta ccaaaggcgc ggtgttgaat ttgcaattct tcctgagttg gcagcacgtt 600
tagaatacca atggattgct aaagtaggta ccaaaggcgc tttcggtcaa tcagcagctc 660
ctgcgcccgt tgttgaattt gttaacaaaa aattaaataa gcaatctgat gtattgtacg 720
cattcggtaa agcaaactta aaacctgaag cagcacaatc attagataat ttacaacaag 780
aaatctctaa agttggttca ttatcttctg ttgaagttgc aggttacaca gaccgtgttg 840
gttctgacaa atataaggca aaacttacac aagaacgtgc taacacagat gctaactact 900
tagtttctga atcattatct ccagatgtga ttatagcagt tggttacggt gaagctaacc 960
cagtaactgg taacacttgt gatgcagtta aaggtcgtaa agcgtgaatc gcttgttaag 1020
caccagaccg tcgtgttgaa gtttctggaa gtggtcaaca ccaacgaaca atcgaccaat 1080
<210> 3
<211> 360
<212> PRT
<213> 鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis)
<400> 3
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Leu Ala Ile Ser Gly Leu Ala Phe Val
1 5 10 15
Ser Val Ala Gln Ala Ala Pro Gln Ala Asn Thr Phe Tyr Ala Gly Ala
20 25 30
Lys Ala Gly Trp Ala Ser Phe His Asn Asp Val Asn Gln Phe Asp Ala
35 40 45
Glu Lys Asn Asp Gly Ile Gly Tyr Gly Val His Arg Asn Ser Val Thr
50 55 60
Tyr Gly Val Phe Gly Gly Tyr Gln Ile Thr Asp Asn Phe Ala Val Glu
65 70 75 80
Ala Gly Tyr Asp Phe Tyr Gly Gln Leu Lys Met His Asp Gly Asp Thr
85 90 95
Glu Arg Ala Arg His Thr Ala His Gly Leu Asn Leu Ser Leu Lys Ala
100 105 110
Ser Tyr Pro Val Ala Tyr Val Asp Gly Leu Asp Val Tyr Gly Arg Leu
115 120 125
Gly Ala Ala Leu Ile Arg Ser Asp Tyr Thr Thr His Val Asp Gly Glu
130 135 140
Lys Val Ala Ser Asp His Lys Leu Lys Val Ser Pro Val Phe Ala Ala
145 150 155 160
Gly Val Glu Tyr Ala Ile Leu Pro Glu Leu Ala Ala Arg Leu Glu Tyr
165 170 175
Gln Trp Ile Ala Lys Val Gly Lys Val Asp Gln Ile Ser Asn Glu Asn
180 185 190
Ser Ala Phe Ala Gly Ser Ser Tyr Ser Pro Ser Ile Gly Ser Val Ser
195 200 205
Leu Gly Leu Ser Tyr Arg Phe Gly Gln Ser Ala Ala Pro Ala Pro Val
210 215 220
Val Glu Val Val Asn Lys Lys Phe Ala Leu Ser Ser Asp Val Leu Phe
225 230 235 240
Ala Phe Gly Lys Ala Asn Leu Lys Pro Glu Ala Ala Gln Ser Leu Asp
245 250 255
Asn Leu Gln Gln Glu Ile Ser Lys Val Gly Ser Leu Ser Ser Val Glu
260 265 270
Val Ala Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Ser Asp Lys Tyr Asn Gln Lys
275 280 285
Leu Ser Gln Glu Arg Ala Asn Thr Val Ala Asn Tyr Leu Val Ser Lys
290 295 300
Ser Ile Ser Pro Asp Val Ile Lys Ala Val Gly Tyr Gly Glu Ala Asn
305 310 315 320
Pro Val Thr Gly Asn Thr Cys Asp Ala Val Lys Gly Arg Lys Ala Leu
325 330 335
Ile Ala Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu Val Ser Val Ser Gly
340 345 350
Gln His Gln Gln Thr Ile Glu Gln
355 360

Claims (6)

1.一种鸭源鸡杆菌，其特征在于，所述的鸭源鸡杆菌（Gallibacteriumanatis）的保藏编号为CCTCC NO ： M 2020272。
2.权利要求1所述的鸭源鸡杆菌在制备疫苗中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为灭活疫苗。
4.一种鸭源鸡杆菌灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗包含有抗原和疫苗佐剂，其中抗原包含有灭活的权利要求1所述的鸭源鸡杆菌。
5.如权利要求4所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的鸭源鸡杆菌是使用甲醛溶液进行灭活。
6.如权利要求4所述的灭活疫苗，其特征在于，所述疫苗佐剂为水相佐剂。
CN202010664292.4A 2020-07-10 2020-07-10 一种鸭源鸡杆菌及其应用 Active CN111621450B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010664292.4A CN111621450B (zh) 2020-07-10 2020-07-10 一种鸭源鸡杆菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010664292.4A CN111621450B (zh) 2020-07-10 2020-07-10 一种鸭源鸡杆菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111621450A CN111621450A (zh) 2020-09-04
CN111621450B true CN111621450B (zh) 2022-07-05

Family

ID=72258617

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010664292.4A Active CN111621450B (zh) 2020-07-10 2020-07-10 一种鸭源鸡杆菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111621450B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101892175A (zh) * 2010-02-26 2010-11-24 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 牛源荚膜a型多杀性巴氏杆菌及其分离鉴定和应用
CN102781954A (zh) * 2009-10-09 2012-11-14 哥本哈根大学 来自鸡卡氏杆菌的细胞溶解性rtx-毒素

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10152307A1 (de) * 2001-10-26 2003-05-08 Boehringer Ingelheim Vetmed Neue bakterielle Geflügelkrankheit

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102781954A (zh) * 2009-10-09 2012-11-14 哥本哈根大学 来自鸡卡氏杆菌的细胞溶解性rtx-毒素
CN101892175A (zh) * 2010-02-26 2010-11-24 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 牛源荚膜a型多杀性巴氏杆菌及其分离鉴定和应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王艳.鸭源鸡杆菌外膜蛋白A 的原核表达及免疫保护性分析.《中国兽医科学》.2017,第47卷(第10期),第1269-1274页. *
鸡卡氏杆菌GZ2017株的分离与16S rRNA序列分析;张升波;《动物医学进展》;20181231;第39卷(第9期);第18-24页 *
鸡杆菌河南分离株的分子进化分析;张金来等;《西北农林科技大学学报(自然科学版)》;20110630;第39卷(第6期);第8-14页 *
鸭源鸡杆菌外膜蛋白A 的原核表达及免疫保护性分析;王艳;《中国兽医科学》;20171231;第47卷(第10期);第1271-1272页 *
鸭源鸡杆菌整合子及其耐药性的相关性分析;彭志锋等;《畜牧兽医学报》;20161231;第47卷(第8期);第1676-1681页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111621450A (zh) 2020-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110251671B (zh) 鹅星状病毒卵黄抗原抗体复合物制备方法
CN105816868B (zh) 一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗
CN102220287B (zh) 鸡传染性支气管炎冷适应致弱疫苗株及其应用
CN111905100B (zh) 一种鹅星状病毒二价灭活疫苗和卵黄抗体及其制备方法
CN109082415B (zh) 一种鹅星状病毒病毒株及其应用
CN111000993B (zh) 一种鸭病毒性肝炎、鸭呼肠孤病毒病二联灭活疫苗及其制备方法
CN109265540B (zh) 一种鹅星状病毒卵黄抗体的制备及其应用
CN106282130A (zh) 一种i群4型禽腺病毒、灭活疫苗及其制备方法
CN105582533B (zh) 一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗
CN111154730B (zh) 一种鹅星状病毒变异毒株
CN110628726B (zh) 一种番鸭新型腺病毒株、二价灭活疫苗及其制备方法
CN109097340B (zh) 一种禽腺病毒、一种四联疫苗及其制备方法
RU2436296C2 (ru) Улучшенные способы получения птичьих яиц и птицы, свободных от специфических микроорганизмов
CN109055320B (zh) 一株传染性支气管炎病毒分离株及在疫苗制备中的应用
CN111621450B (zh) 一种鸭源鸡杆菌及其应用
CN111574625A (zh) 抗鸡滑液囊支原体疾病的特异性卵黄抗体制备方法和应用
CN106190991A (zh) 一种禽脑脊髓炎病毒、灭活疫苗及其制备方法
CN106065030A (zh) 鸡包涵体肝炎的卵黄抗体及其制备方法
CN112999343B (zh) 一种鹅星状病毒的灭活疫苗及其制备方法
CN107365382B (zh) 一种鸭2型腺病毒病的卵黄抗体及制备方法
CN116286670A (zh) 一种新型鸭呼肠孤病毒及其在灭活疫苗和卵黄抗体制备中的应用
CN112646750B (zh) 一种血清18型鸭疫里默氏杆菌及应用
CN111110839B (zh) 一种预防雏鹅痛风的鹅星状病毒二价灭活疫苗
CN109260467B (zh) 一种预防雏鹅痛风症状的疫苗
CN107982532B (zh) 一种鸭甲肝病毒抗原抗体复合物疫苗及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant