CN106755462A - 一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测引物组合物、检测盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测引物组合物、检测盒及其应用，属于细菌检测技术领域。一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测引物组合物，由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3和反向外引物B3组成，其中，各引物的序列分别为：FIP：GCCACAAGCCAAATAAAAGACTACCAAATGGCATTATTTTATGGCTCG，BIP：AGCACAGTTTTGTTGGGCAGAAAATAACGTCCAATCAGTTGC，F3：CGCGAAATTGAGTTTTATGC，B3：CAAGGAAATATAAACCGGCAA。本发明检测方法快速、灵敏高、准确性好。
Description
技术领域
本发明涉及细菌检测技术领域，具体涉及一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测引物组合物、检测盒及其应用。
背景技术
牛多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）为巴氏杆菌科巴氏杆菌属成员，革兰氏阴性菌，显微镜下观察为短小的杆状或者球状，两端钝圆、没有鞭毛、不形成芽孢。生化特性为需氧或兼性厌氧、对营养的要求较高；可分解甘露糖、葡萄糖、蔗糖和果糖、产酸不产气。有荚膜的菌株抗性较强，多见于临床病料新分离菌株。该菌易感染月龄较小的犊牛，引起地方性的新生犊牛肺炎、运输热或者断奶牛肺炎；实际生产中这些疾病的产生通常伴随着各种应激因素，如不利的气候影响、不良的营养状况、长途运输等。尤其是该菌在呈急性感染时会表现为出血性败血症，导致病畜迅速死亡。目前根据细菌的荚膜血清反应将该菌可以分为A、B、D、E和F5种荚膜血清型，其中临床上对牛有致病性的为A、B和E型。至2006年报道分离A型菌株以来，我国其它地区如天津、宁夏、内蒙古、新疆、湖北、吉林和山东等地也相继报道分离了A型菌株，表明我国从北部到中部都存在该病的流行。由于该病对养牛业的危害极大，因此对该病的诊断就显得尤为重要。
传统的牛多杀性巴氏杆菌检测方法主要是通过实验室手段进行细菌的分离和相关的生化鉴定、血清学鉴定；近些年也出现了常规PCR鉴定、套式PCR鉴定和荧光定量PCR鉴定。这些方法往往存在需要精密仪器和特殊实验条件的限制，制约了现地应用。因此，建立一种实际应用性强的检测技术在基层推广应用，具有很强的临床意义。
环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是一种新颖的恒温核酸扩增方法，它是一种灵敏的链置换技术，可以在恒温条件下和短时间内将目标DNA从几个拷贝扩增到109~1010拷贝。LAMP技术的基本原理是针对靶序列的6个区域，设计4条特异性引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶-Bst DNA polymerase 在等温条件下进行反应。同一链上的一组引物顺序地退火到靶序列，在链置换DNA聚合酶的作用下，后阶段退火的引物置换前面引物所形成的链。置换发生在两条链上，对引物设计的要求是能形成环状结构。反应在恒温条件下进行，链的变性是由链置换产生的。LAMP反应形成一系列不同长度茎环结构的DNA再通过特定的方法判断扩增与否。该方法具有方便快速、操作简单、敏感性高、适用性强、结果准确等特点，而且对实验所用的仪器要求非常低，一台普通的水浴锅就可以完成全部实验反应。
为了实现牛多杀性巴氏杆菌的快捷、准确和简易检测诊断，很有必要提供一种利用LAMP技术检测牛多杀性巴氏杆菌的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测方法，使其能够快速、准确地对疑似样品进行检测，以克服现有方法在临床实用性上的不足。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测引物组合物，由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3和反向外引物B3组成，其中，各引物的序列分别为：
FIP：GCCACAAGCCAAATAAAAGACTACCAAATGGCATTATTTTATGGCTCG，
BIP：AGCACAGTTTTGTTGGGCAGAAAATAACGTCCAATCAGTTGC，
F3：CGCGAAATTGAGTTTTATGC，
B3：CAAGGAAATATAAACCGGCAA。
本发明提供了上述牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测引物组合物在检测牛多杀性巴氏杆菌中的应用。
一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测试剂盒，包含检测溶液，每24μL检测溶液中包括：
10×Thermo Pol反应缓冲液 2.5μL
正向内引物FIP 1.0μmol/L
反向内引物BIP 1.0μmol/L
正向外引物F3 0.4μmol/L
反向外引物B3 0.4μmol/L
MgSO4 1.0mmol/L
dNTP 1.6nmol/L
Bst DNA聚合酶 320000U/L
显色试剂 3mmol/L
DEPC水 补足至24μL，
其中，各引物的序列分别为：
FIP：GCCACAAGCCAAATAAAAGACTACCAAATGGCATTATTTTATGGCTCG，
BIP：AGCACAGTTTTGTTGGGCAGAAAATAACGTCCAATCAGTTGC，
F3：CGCGAAATTGAGTTTTATGC，
B3：CAAGGAAATATAAACCGGCAA。
优选地，所述显色试剂为羟基萘酚蓝，在恒温扩增反应前加入。
本发明提供了上述牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测试剂盒在检测牛多杀性巴氏杆菌中的应用。
本发明提供了利用上述牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测试剂盒检测牛多杀性巴氏杆菌的方法，包括以下步骤：
步骤S1：当原始病料样品为液体样本时，取所述液体样本1mL在12000rpm/min条件下离心2min后起弃掉上清，再用PBS缓冲液1 mL重悬沉淀，12000rpm/min条件下离心2min后再次弃掉上清；然后利用100μL PBS缓冲液将沉淀吹悬后，取1μL作为样品模板DNA；当原始病料样品为固体样本时，取所述固体样品的病变与正常交界处的组织0.5g，加入10倍的PBS缓冲液无菌研磨，冻融2次后无菌纱布过滤，然后将获得的滤液采用前述液体样本的方法进行处理，得到样品模板DNA；
步骤S2：取1μL的样品模板DNA加入24μL环介导等温扩增检测试剂盒中的检测溶液，62℃恒温反应1小时；
步骤S3：观察反应结束后溶液的颜色变化，阳性结果显示为天蓝色，阴性结果显示为紫色。
优选地，所述样品模板DNA，是疑似感染牛多杀性巴氏杆菌的患病动物组织样品的基因组。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
采用LAMP技术设计的4条引物分别针对6个不同的区域，任何一个不匹配反应就无法进行。本发明所设计的4条引物：正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3，分别针对靶序列上的6个独立区域。其中正向内引物是FIP，包括F1c区段（同靶序列的F1c区段完全相同）、F2区段（同靶序列的F2c区段完全相同）和TTTT连接子；正向外引物是F3，该基因与靶序列的F3c区段完全互补；反向内引物BIP，包括B1c区段（同靶序列的B1c区段完全相同）、B2区段（同靶序列的B2c区段完全相同）和TTTT连接子；反向外引物B3，同靶序列上的B3c区段完全互补。本发明所设计的4条引物分别针对靶序列上6个不同的区域，从而保证反应的强特异性性。
本发明牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测方法，包括提取样品模板DNA，利用所述环介导等温扩增引物组合物进行环介导等温扩增；羟基萘酚蓝 (hydroxylnaphthol blue，HNB) 属于金属离子指示剂的一种。 HNB是Mg2+的滴定剂，其颜色随溶液pH变化而改变，因此可以通过监测 环介导等温扩增反应体系中Mg2+浓度的变化及溶液pH而起到颜色指示剂的作用。反应前将HNB加入到反应液中，反应体系呈紫色，反应过程中Mg2+与环介导等温扩增反应的副产物P2O7 4-结合产生大量沉淀，溶液中Mg2+浓度降低，pH发生变化，从而使HNB的颜色由紫色变为天蓝色。因此，反应结束后通过反应体系的颜色变化，来判断牛多杀性巴氏杆菌的有无：天蓝色表示检测为阳性，存在牛多杀性巴氏杆菌；紫色表示检测结果为阴性，不存在牛多杀性巴氏杆菌。
1）强特异性：本发明利用牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测试剂盒对提取的牛多杀性巴氏杆菌、牛源金黄色葡萄球菌、牛源无乳链球菌和牛源大肠杆菌基因组，同时进行环介导等温扩增实验，并设置阴性对照。扩增结果表明以其它细菌（牛源金黄色葡萄球菌、牛源无乳链球菌和牛源大肠杆菌基因组）作为模板时没有阳性扩增。本发明环介导等温扩增检测引物组合物对牛多杀性巴氏杆菌具有特异性。
2）高敏感性：利用牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测试剂盒和常规PCR对倍比稀释的样品进行检测，结果表明：本发明牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测试剂盒可检测到10 CFU/mL，而常规PCR扩增的方法只能检测到1000 CFU/mL。由此可见，本发明提供的牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测试剂盒具有更高的敏感性。
3）快速性：相对常规PCR反应长达数小时的反应时间和检测时间，本发明仅需1小时即可完成整个反应和结果判定。
4）可操作性：相对常规PCR，本发明牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测试剂盒不需要昂贵的PCR仪，只需要一个简单的恒温水浴锅即可完成反应；且结果的检测可以直接肉眼判定，无需使用凝胶电泳等特殊仪器。因此本发明试剂盒具有较强的现地可操作性。
本发明的检测方法快速、灵敏高、准确性好、操作简便，其灵敏度比常规PCR高100倍，通过肉眼可直接观察到检测结果，可作为牛多杀性巴氏杆菌的特异性检测，为疑似感染牛多杀性巴氏杆菌的患病动物组织样品的快速诊断提供了一种新的方法，具有非常高的实用价值。
附图说明
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明。
图1为环介导等温扩增反应的特异性检测结果（凝胶检测图），其中，1：阴性对照；2：牛多杀性巴氏杆菌；3：牛源金黄色葡萄球菌；4：牛源无乳链球菌；5：牛源大肠杆菌；
图2为环介导等温扩增反应的敏感性检测结果（加入HNB后直接肉眼观察），其中，1：阴性对照，扩增产物显示为紫色；2：1 CFU/mL，扩增产物显示为紫色；3：10 CFU/mL，扩增产物显示为天蓝色；4：102 CFU/mL，扩增产物显示为天蓝色；5：103 CFU/mL，扩增产物显示为天蓝色；6：104 CFU/mL，扩增产物显示为天蓝色；
图3为常规PCR方法的敏感性检测结果（凝胶检测图），其中，1：阴性对照；2：1 CFU/mL；3：10 CFU/mL；4：102 CFU/mL；5：103 CFU/mL；6：104 CFU/mL。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步清楚阐述本发明的内容，但本发明的保护内容不仅仅局限于下面的实施例。
1、材料准备
牛多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida CVCC1667）、牛源金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus CVCC3050）、牛源无乳链球菌（streptococcus agalactiaeCVCC1886）、牛源大肠杆菌（Escherichia coli CVCC1299）购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。Bst DNA聚合酶及10×Thermo Pol反应缓冲液 （购自New England Biolabs公司），dNTP（购自Clontech公司）、Mg2+（购自Vazyme公司）。
2、引物设计与合成
参考目前已发表的牛多杀性巴氏杆菌的基因序列，针对牛多杀性巴氏杆菌的基因KMT1的保守区域，其中，KMT1基因序列如序列表中序列1所示，利用PrimerExplorer V4在线软件http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html设计用于检测牛多杀性巴氏杆菌的LAMP引物，其中，LAMP引物包括：正向内引物FIP和反向内引物BIP，正向外引物F3和反向外引物B3，引物序列分别如下所示：
FIP： GCCACAAGCCAAATAAAAGACTACCAAATGGCATTATTTTATGGCTCG；
BIP：AGCACAGTTTTGTTGGGCAGAAAATAACGTCCAATCAGTTGC；
F3：CGCGAAATTGAGTTTTATGC；
B3：CAAGGAAATATAAACCGGCAA。
设计完成的引物由苏州泓迅生物合成。
正向内引物FIP的序列如序列表中序列2所示；反向内引物BIP的序列如序列表中序列3所示；正向外引物F3的序列如序列表中序列4所示；反向外引物B3的序列如序列表中序列5所示。
3、样品基因组的提取
当原始病料样品为液体样本时，取所述液体样本1mL在12000rpm/min条件下离心2min后起弃掉上清，再用PBS缓冲液1 mL重悬沉淀，12000 rpm/min条件下离心2min后再次弃掉上清；然后利用100μL PBS缓冲液将沉淀吹悬后，取1μL作为样品模板DNA；
当原始病料样品为固体样本时，取所述固体样品的病变与正常交界处的组织0.5g，加入10倍的PBS缓冲液无菌研磨，冻融2次后无菌纱布过滤，然后将获得的滤液采用前述液体样本的方法进行处理，得到样品模板DNA。
4、牛多杀性巴氏杆菌LAMP反应体系的建立
LAMP反应体系，以25μL计，包括如下组分：
10×Thermo Pol反应缓冲液 2.5μL
正向内引物FIP 1.0μmol/L
反向内引物BIP 1.0μmol/L
正向外引物F3 0.4μmol/L
反向外引物B3 0.4μmol/L
MgSO4 1.0mmol/L
dNTP 1.6nmol/L
Bst DNA聚合酶 320000U/L
羟基萘酚蓝 3mmol/L
样品模板DNA 1μL
DEPC水 补足至25μL。
将上述组分混匀后放置于PCR仪内或者水浴锅中恒温62℃作用1小时；反应结束后可以进行凝胶检测或者可视化检测，对结果进行判定。
5、牛多杀性巴氏杆菌LAMP检测试剂盒条件的优化
5.1 引物浓度优化
在25 μL的LAMP反应体系中以一对引物为变量，其他反应底物成分相同，依次对FIP与BIP（0.4μmol/L、0.6μmol/L、0.8μmol/L、1.0μmol/L、1.2μmol/L、1.4μmol/L、1.6μmol/L、1.8μmol/L、2.0μmol/L）、F3与B3（0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.4μmol/L、0.5μmol/L、0.6μmol/L）这两对引物进行浓度梯度优化，每个浓度重复3次，反应结束之后，进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。
5.2 扩增时间优化
配置LAMP反应体系，每个时间条件下样品设置3个重复，分别在恒温水浴锅中反应30min、45 min、60 min、75 min后取出，进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。
5.3 扩增温度的优化
配置LAMP反应体系，每个温度条件下样品设置3个重复，分别在不同温度60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃反应1小时后取出，进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。
5.4 Mg²+浓度优化
对Mg2+的浓度设置梯度为0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L、1.2 mmol/L、1.4mmol/L，每个浓度梯度下设置3个重复。待所有浓度梯度反应结束后，进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。
5.5 Bst DNA聚合酶浓度优化
对Bst DNA聚合酶的浓度进行优化，其梯度设置为160000 U/L、320000 U/L、480000 U/L 、640 000U/L、800000 U/L，每个浓度梯度设置3个重复。待所有浓度梯度反应结束后，进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。
5.6 LAMP反应的特异性试验
以临床上常见的牛细菌性疾病：牛源金黄色葡萄球菌、牛源无乳链球菌和牛源大肠杆菌的基因组作为检测对象，提取上述三种细菌的基因组，并以此为模板进行环介导等温扩增，来验证其反应的特异性，结果参见图1所示。
结果显示，当发生LAMP扩增反应时，产生大量的焦磷酸镁白色沉淀导致反应液的浊度上升，通过HNB的显色反应结果所示，牛多杀性巴氏杆菌的反应管呈天蓝色，其为阳性结果；而其它牛源金黄色葡萄球菌、牛源无乳链球菌、牛源大肠杆菌和阴性对照菌反应管均呈紫色，为阴性结果，证明所设计的LAMP特异性引物具有种的特异性。 这说明该引物组合物可被用于生产实践中病料样品中牛多杀性巴氏杆菌的快速可靠的检测盒鉴定。
5.7 LAMP反应的敏感性试验
取已知CFU值的牛多杀性巴氏杆菌液，然后用PBS缓冲液进行稀释，使其分别相当于含有1 CFU/mL、10CFU/mL、100 CFU/mL、1000 CFU/mL、10000 CFU/mL，然后提取上述五组牛多杀性巴氏杆菌的基因组，并分成两部分，一部分用LAMP试剂盒检测；另一部分用常规PCR方法检测，将两者检测结果进行比较，以验证其反应的敏感性，结果参见图2~3所示。
参阅图2，LAMP试剂盒检测结果表明：阴性对照组的扩增产物显示为紫色；1 CFU/mL的扩增产物显示为紫色；10 CFU/mL的扩增产物显示为天蓝色；102 CFU/mL的扩增产物显示为天蓝色；103 CFU/mL的扩增产物显示为天蓝色；104 CFU/mL的扩增产物显示为天蓝色。
参阅图3，常规PCR方法检测结果表明：阴性对照组无特异性扩增产物；1 CFU/mL无特异性扩增产物；10 CFU/mL无特异性扩增产物；102 CFU/mL无特异性扩增产物；103 CFU/mL在600bp左右出现特异性扩增产物；104 CFU/mL在600bp左右出现特异性扩增产物。
将上述两种方法的检测结果进行比较：LAMP试剂盒的检测阈值为10CFU/mL，而常规PCR的检测阈值则是103 CFU/mL；表明LAMP检测方法检测敏感性为常规PCR的100倍，能够更加有效地检测病料，提高临床诊断的准确性。
5.8 LAMP实际应用的符合性
临床采集63头患呼吸道病牛的鼻腔拭子。提取样品的基因组，分别利用建立的的LAMP检测方法与常规PCR方法进行检测。通过对上述方法实际应用中检测结果比较，验证LAMP实际应用的符合性。
6、牛多杀性巴氏杆菌LAMP方法的优化结果
6.1 优化体系和条件
通过上述条件的优化，牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增试剂盒的最后优化的LAMP体系，以25μL计，为：
10×Thermo Pol反应缓冲液 2.5μL
正向内引物FIP 1.0μmol/L
反向内引物BIP 1.0μmol/L
正向外引物F3 0.4μmol/L
反向外引物B3 0.4μmol/L
MgSO4 1.0mmol/L
dNTP 1.6nmol/L
Bst DNA聚合酶 320000U/L
羟基萘酚蓝 3mmol/L
样品模板DNA 1μL
DEPC水 补足至25μL。
反应条件为62℃反应1小时。
6.2 牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增试剂盒的符合性
利用牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增试剂盒与常规PCR方法对获得的63份样品进行检测，结果发现牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增试剂盒的检出率（23/63）显著高于常规PCR方法（13/63），且常规PCR方法检出的阳性样品都可以被牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增试剂盒检出。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
SEQUENCE LISTING
<110> 南阳师范学院
<120> 一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测引物组合物、检测盒及其应用
<130> 2017
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 431
<212> DNA
<213> 牛多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）
<400> 1
acccagtggg gcggtgcgaa tgaaccgatt gccgcgaaat tgagttttat gccacttgaa 60
atgggaaatg gcattatttt atggctcgtt gtgagtgggc ttgtcggtag tcttttattt 120
ggcttgtggc aaagaaaagc acagttttgt tgggcagagt ttggtgtgtt gagccaatct 180
gcttccttga caacggcgca actgattgga cgttatttat tactcagctt attgttattt 240
gccggtttat atttccttgt cagtctgatt tatcaatatt tccatgttga gttacgtttc 300
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tacctatttt ggtctttttc ttcgtgttca acggtttgat cgtgtcagtc caaatgaaac 420
aaaaagtggc g 431
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gccacaagcc aaataaaaga ctaccaaatg gcattatttt atggctcg 48
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agcacagttt tgttgggcag aaaataacgt ccaatcagtt gc 42
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgcgaaattg agttttatgc 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
caaggaaata taaaccggca a 21
Claims (7)
1.一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测引物组合物，其特征在于：由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3和反向外引物B3组成，其中，各引物的序列分别为：
FIP：GCCACAAGCCAAATAAAAGACTACCAAATGGCATTATTTTATGGCTCG，
BIP：AGCACAGTTTTGTTGGGCAGAAAATAACGTCCAATCAGTTGC，
F3：CGCGAAATTGAGTTTTATGC，
B3：CAAGGAAATATAAACCGGCAA。
2.如权利要求1所述的牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测引物组合物在检测牛多杀性巴氏杆菌中的应用。
3.一种牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于：包含检测溶液，每24μL检测溶液中包括：
10×Thermo Pol反应缓冲液 2.5μL
正向内引物FIP 1.0μmol/L
反向内引物BIP 1.0μmol/L
正向外引物F3 0.4μmol/L
反向外引物B3 0.4μmol/L
MgSO4 1.0mmol/L
dNTP 1.6nmol/L
Bst DNA聚合酶 320000U/L
显色试剂 3mmol/L
DEPC水 补足至24μL，
其中，各引物的序列分别为：
FIP：GCCACAAGCCAAATAAAAGACTACCAAATGGCATTATTTTATGGCTCG，
BIP：AGCACAGTTTTGTTGGGCAGAAAATAACGTCCAATCAGTTGC，
F3：CGCGAAATTGAGTTTTATGC，
B3：CAAGGAAATATAAACCGGCAA。
4.如权利要求3所述的牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述显色试剂为羟基萘酚蓝，在恒温扩增反应前加入。
5.如权利要求3或4所述的牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测试剂盒在检测牛多杀性巴氏杆菌中的应用。
6.利用如权利要求3或4所述的牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测试剂盒检测牛多杀性巴氏杆菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤S1：当原始病料样品为液体样本时，取所述液体样本1mL在12000rpm/min条件下离心2min后起弃掉上清，再用PBS缓冲液1 mL重悬沉淀，12000rpm/min条件下离心2min后再次弃掉上清；然后利用100μL PBS缓冲液将沉淀吹悬后，取1μL作为样品模板DNA；当原始病料样品为固体样本时，取所述固体样品的病变与正常交界处的组织0.5g，加入10倍的PBS缓冲液无菌研磨，冻融2次后无菌纱布过滤，然后将获得的滤液采用前述液体样本的方法进行处理，得到样品模板DNA；
步骤S2：取1μL的样品模板DNA加入24μL所述环介导等温扩增检测试剂盒中的检测溶液，62℃恒温反应1小时；
步骤S3：观察反应结束后溶液的颜色变化，阳性结果显示为天蓝色，阴性结果显示为紫色。
7.如权利要求6所述的利用牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增检测试剂盒检测牛多杀性巴氏杆菌的方法，其特征在于：所述样品模板DNA，是疑似感染牛多杀性巴氏杆菌的患病动物组织样品的基因组。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108660192A (zh) * | 2018-05-31 | 2018-10-16 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 一种快速检测溶血性曼氏杆菌的lamp引物组及其应用 |
| CN109628622A (zh) * | 2019-02-02 | 2019-04-16 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 一种检测多杀性巴氏杆菌的实时定量lamp引物组及试剂盒 |
| CN110218819A (zh) * | 2019-06-14 | 2019-09-10 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 一种检测猪呼吸道疫病病原的高通量微流控芯片及检测方法 |
| CN110885892A (zh) * | 2019-11-01 | 2020-03-17 | 拱北海关技术中心 | 一种多杀性巴氏杆菌的检测方法及其引物和探针 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101892175A (zh) * | 2010-02-26 | 2010-11-24 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 牛源荚膜a型多杀性巴氏杆菌及其分离鉴定和应用 |
| CN104073567A (zh) * | 2014-07-18 | 2014-10-01 | 昆明滇龙生物医药科技有限公司 | 牛重大病原菌―多杀性巴氏杆菌基因诊断试剂盒及检测方法 |
-
2017
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101892175A (zh) * | 2010-02-26 | 2010-11-24 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 牛源荚膜a型多杀性巴氏杆菌及其分离鉴定和应用 |
| CN104073567A (zh) * | 2014-07-18 | 2014-10-01 | 昆明滇龙生物医药科技有限公司 | 牛重大病原菌―多杀性巴氏杆菌基因诊断试剂盒及检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| DONGBO SUN等: "Development of a novel LAMP diagnostic method for visible detection of swine Pasteurella multocida", 《VET RES COMMUN》 * |
| 于新友等: "牛多杀性巴氏杆菌和牛支原体双重PCR检测方法的建立及应用", 《中国奶牛》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108660192A (zh) * | 2018-05-31 | 2018-10-16 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 一种快速检测溶血性曼氏杆菌的lamp引物组及其应用 |
| CN109628622A (zh) * | 2019-02-02 | 2019-04-16 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 一种检测多杀性巴氏杆菌的实时定量lamp引物组及试剂盒 |
| CN110218819A (zh) * | 2019-06-14 | 2019-09-10 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 一种检测猪呼吸道疫病病原的高通量微流控芯片及检测方法 |
| CN110885892A (zh) * | 2019-11-01 | 2020-03-17 | 拱北海关技术中心 | 一种多杀性巴氏杆菌的检测方法及其引物和探针 |
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