CN101842482B - 原核生物苯丙氨酸氨裂合酶的组合物及使用所述组合物的方法 - Google Patents

原核生物苯丙氨酸氨裂合酶的组合物及使用所述组合物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及原核生物产生的苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)，其中这种原核生物PAL变体与野生型PAL相比具有更高的苯丙氨酸转化活性和/或降低的免疫原性。本发明因此提供了细菌PAL及其生物活性片段、突变体、变体和类似物的组合物，以及为了治疗和工业目的生产、纯化和使用这些组合物的方法。

Description

原核生物苯丙氨酸氨裂合酶的组合物及使用所述组合物的方法
相关申请的交叉引用
本申请是2007年5月25日提交的美国申请11/807,227的部分继续申请，该美国申请在此全文引入作为参考。
技术领域
本发明提供原核生物苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)及其组合物，以及优化这些组合物以增强PAL催化活性和稳定性，同时降低PAL的免疫原性和/或蛋白水解敏感性。本发明还提供这些优化的PAL组合物在治疗和工业方面的应用。
背景技术
PAL是一种广泛分布在植物中的非哺乳动物酶(Koukol等人，J.Biol.Chem.236：2692-2698(1961)；Hanson等人，The Enzymes 7：75-166(1972)；Poppe等人，Curr.Org.Chem.7：1297-1315(2003))、某些真菌(Rao等人，Can.J.Biochem.4512：1863-1872(1967)；Abell等人，Methods Enzymol.142：242-253(1987))和细菌(Bezanson等人，Can.J.Microbiol.16：147-151.(1970)；Xiang等人，J.Biol.Chem.277：32505-32509(2002)；Hill等人，Chem.Commun.1358-1359(2003))中的非哺乳动物酶，并且可以在大肠杆菌中重组产生。
PAL的代表性列表包括：Q9ATN7藿香(Agastache rugosa)；O93967捕蝇鹅膏(Amanita muscaria)；P35510，P45724，P45725，Q9SS45，Q8RWP4拟南芥(Arabidopsis thaliana)(鼠耳水芹)；Q6ST23白绿竹(Bambusaoldhamii)；Q42609兰花(Bromheadia finlaysoniana)；P45726茶(Camelliasinensis)；Q9MAX1长春花(Catharanthus roseus)(Madagascar periwinkle)；Q9SMK9鹰嘴豆(Cicer arietinum)；Q9XFX5，Q9XFX6克莱门特柑x芦柑(Citrus Clementina x Citrus reticulate)；Q42667柠檬(Citrus limon)；Q8H6V9，Q8H6W0中果咖啡(Coffea canephora)(罗巴斯塔咖啡)；Q852S1胡萝卜(Daucus carota)；O23924毛地黄(Digitalis lanata)；O23865胡萝卜(Daucus carota)；P27991大豆(Glycine max)；O04058向日葵(Helianthusannuus)；P14166，(Q42858)甘薯(Ipomoea batatas)；Q8GZR8，Q8W2E4莴苣(Lactuca sativa)；O49835，O49836紫草(Lithospermum erythrorhizon)；P35511，P26600番茄(Lycopersicon esculentum)；P35512苹果(Malusdomestica)(欧洲苹果(Malus sylvestris))；Q94C45，Q94F89木薯(Manihotesculenta)(树薯)；P27990紫花苜蓿(Medicago sativa)；P25872，P35513，P45733烟草(Nicotiana tabacum)；Q6T1C9栓皮栎(Quercus suber)；P14717，P53443，Q7M1Q5，Q84VE0，Q84VE0水稻(Oryza sativa)；P45727鳄梨(Persea americana)；Q9AXI5牵牛花(Pharbitis nil)(紫罗兰)(日本牵牛花(Japanese morning glory))；P52777火炬松(Pinus taeda)；Q01861，Q04593豌豆(Pisum sativum)；P24481，P45728，P45729欧芹(Petroselinum crispum)(Petroselinum hortense)；Q84LI2蝴蝶兰x朵丽蝶兰(Phalaenopsis xDoritaenopsis)杂交栽培种；P07218，P19142，P19143菜豆(Phaseolusvulgaris)；Q7XJC3，Q7XJC4海岸松(Pinus pinaster)；Q6UD65脂杨trichocarpa亚种x美洲黑杨(Populus balsamifera subsp.trichocarpa xPopulus deltoids)；P45731，Q43052，O24266大齿杨(Populuskitakamiensis)；Q8H6V5，Q8H6V6颤杨(Populus tremuloides)；P45730毛果杨(Populus trichocarpa)；O64963樱桃(Prunus avium)；Q94EN0地黄(Rehmannia glutinosa)；P11544圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)(酵母)(瘦弱红酵母(Rhodotorula gracilis))；P10248深红酵母(Rhodotorularubra)(酵母)(胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa))；Q9M568，Q9M567覆盆子(Rubus idaeus)；P31425，P31426马铃薯(Solanum tuberosum)；Q6SPE8长梗繁缕(Stellaria longipes)；P45732矮柱花草(Stylosanthes humilis)；P45734地三叶草(Trifolium subterraneum)；Q43210，Q43664小麦(Triticumaestivum)；Q96V77黑粉菌(Ustilago maydis)；P45735葡萄(Vitis vinifera)；和Q8VXG7玉米(Zea mays)。
大量研究集中于使用酶苯丙氨酸氨裂合酶(PAL，EC 4.3.1.5)用于苯丙酮尿症(PKU)的酶替代治疗(Hoskins等人，Lancet 1(8165)：392-394(1980)；Gilbert等人，Biochem.J.199(3)：715-723(1981)；Hoskins，J.A.等人，Res.Commun.Chem.Pathol.Pharmacol.35(2)：275-282(1982)；Sarkissian等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(5)：2339-2344(1999)；Liu等人，Artif.CellBlood Substit.Immobil.Biotechnol.30(4)：243-257(2002)；Wieder，K.J.，JBiol.Chem.254(24)：12579-12587(1979)；Gamez等人，Mol.Ther.11(6)：986-989(2005)；Ambrus等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.224(3)：598-602(1983)；Ambrus等人，Science 201(4358)：837-839(1978)；Kalghatgi，Res.Commun.Chem.Pathol.Pharmacol.27(3)：551-561(1980)；Ambrus，Res.Commun.Chem.Pathol.Pharmacol.37(1)：105-111(1982)；Gilbert等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.131(2)：557-563(1985)；Pedersen，Res.Commun.Chem.Pathol.Pharmacol.20(3)：559-569(1978)；Marconi等人，Biochimie 62(8-9)：575-580(1980)；Larue等人，Dev.Pharmacol.Ther.9(2)：73-81(1986)；Ambrus，CM.等人，Ann.Intern.Med.106(4)：531-537(1987)；Bourget等人，Appl.Biochem.Biotechnol.10：57-59(1984)；Bourget等人，FEBS Lett.180(1)：5-8(1985)；Bourget等人，Biochim.Biophys.Acta 883(3)：432-438(1986)；Chang等人，Artif.Cells BloodSubstit.Immobil.Biotechnol.23(1)：1-21(1995)；Chang等人，MolBiotechnol.17(3)：249-260(2001)；美国专利5,753,487)。
PKU是一种由于负责苯丙氨酸代谢的酶——肝苯丙氨酸羟化酶(PAH)的活性受损而引起的先天性氨基酸代谢障碍。具有导致PKU和高苯丙氨酸血症(HPA)的PAH突变的患者表现出苯丙氨酸水平升高、神经生理功能受损和认知发展下降。对于严重PKU患者，存在不可逆的智力低下的可能性，除非利用饮食限制将苯丙氨酸水平保持在低水平。PAL将苯丙氨酸转化为氨和反式肉桂酸，反式肉桂酸是一种无害的代谢物，进一步代谢并且在尿中作为马尿酸盐***出去(Hoskins等人，(1980)同上；Hoskins等人，Biomed Mass Spectrom 11(6)：296-300(1984))。
目前的对PKU的处理包括在一生中坚持低苯丙氨酸饮食(Levy，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(5)：1811-1813(1999))。这种饮食治疗难以坚持(Matalon等人，Genet.Med.6(1)：27-32(2004)；Woolf等人，Arch.Dis.Child.33(167)：31-45(1958)；Kim，Mol Ther.10(2)：220-224(2004))，并且不总是能够消除可能由升高的苯丙氨酸水平引起的受损的神经学效应(Sarkissian等人，Mol.Genet.Metab.69：188-194(2000))。怀孕期间低于理想水平的饮食控制可能导致先天缺陷(Levy，(1999)同上)。另外，PKU/HPA患者在限制饮食的情况下非常难以享有正常的生活，并且饮食治疗可能与几种营养物质的缺乏相关，其中一些对于脑发育是有害的(Levy，(1999)同上)。大多数低苯丙氨酸饮食产品具有不能十分令人满意的感官特性，使得对这种治疗的顺应性受到影响(Levy，(1999)同上)。因此，治疗性处理的发展应代替或补充目前的饮食治疗，并防止PKU患者所遭受的神经学损伤，特别是对于那些患有该疾病的最严重形式的患者而言。
1999年，Scriver及其同事报道了他们最初对来自圆红冬孢酵母的酶PAL(Sarkissian等人，(1999)同上)在PKU酶替代应用中的用途的研究。小鼠PKU和HPA模型研究证明了PAL给药(通过腹膜内注射或口服，使用与抑肽酶蛋白酶抑制剂联合的PAL或在大肠杆菌细胞中重组表达并存在的PAL)与较低的血液血浆苯丙氨酸水平有关。另外，描述对PKU患者应用PAL的初步研究已经表明，使用在肠溶衣包衣明胶胶囊中给药的PAL(Hoskins等人，(1980)同上)，或使用体外酶来源(Ambrus等人，Ann.Intern.Med.106(4)：531-537(1987))，导致苯丙氨酸水平降低。这些研究提示，如果PAL受到针对蛋白水解降解的保护，则在口服后可能使血浆Phe水平的明显降低。
基于PAL限制向癌细胞供应苯丙氨酸营养物质从而抑制肿瘤生长的能力，已经提出了PAL对于癌症治疗的应用(Fritz等人，J Biol Chem.251(15)：726(1976)；Roberts等人，Cancer Treat Rep.60(3)：261-263(1976)；Shen等人，Cancer Res.37(4)：1051-1056(1977)；Shen等人，Cancer TreatRep.63(6)：1063-1068(1979)；Wieder等人，J Biol Chem.254(24)：12579-12587(1979))。但是在第13次注射后，静脉内注射的聚乙二醇化的PAL从循环血液中被快速清除。另外，PAL-介导的苯丙氨酸减少阻止了鼠白血病和转移性黑素瘤的增殖(Abell等人，Cancer Res.33：2529-2532(1973)；Roberts等人，(1976)同上；Shen等人，(1977)同上)。
来自海洋细菌海洋链霉菌属(Streptomyces maritimus)的细菌PAL可以用作抑菌剂肠道菌素的重要来源。海洋链霉菌PAL，EncP，催化肠道菌素合成的第一步，即苯丙氨酸向反式肉桂酸的转化(Xiang等人，J.Biol.Chem.277：32505-32509(2002))。
PAL可以用于工业合成L-苯丙氨酸甲酯(用于阿斯巴甜(Aspartame)的生产)(D′Cunha等人，Enzyme and Microbial Technology 19(6)：421-427(1996)；Hamilton等人，Trends in Biotechnol.3(3)：64-68(1985))和其它用作药物前体的取代的L-苯丙氨酸衍生物的工业合成(美国专利申请20020102712)。
PAL也可以具有农业应用，其中PAL参与产生类苯基丙烷(phenylpropanoids)的初始酶促过程，类苯基丙烷在植物、真菌和细胞中产生木素类、香豆素类和黄烷类。因此，PAL活性的调节可以影响许多农业现象，例如果实的褐变，另外，活性位点PAL抑制剂的基于结构的药物设计可以产生有效的除草剂(Poppe等人，(2003)同上)。
尽管PAL可能具有许多工业和治疗用途，但是PAL的应用可能受到比活性降低和蛋白水解不稳定性的限制。类似于其它治疗性蛋白质，PAL作为酶治疗剂的应用具有几个缺点，例如免疫原性和蛋白水解敏感性。此外，为了在以高苯丙氨酸血症为特征的疾病中实现血浆苯丙氨酸水平的控制并将其维持在略窄的正常范围内，在底物亲和力与酶活性之间需要精细的平衡。迄今为止，由于缺乏对这种蛋白质的结构和生化知识，还没有进行旨在改善这些参数的共同的努力。
因此，仍然需要具有良好动力学特性的PAL分子，这些特性包括强催化活性和更长的生物半衰期、更高的生化稳定性和/或减弱的免疫原性。
发明内容
已经有数种细菌PAL已被鉴定为HAL/PAL家族的一部分，包括但不限于来自海洋链霉菌的PAL(也称为EncP，SEQ ID NO：5，图4)、来自点形念珠藻(Nostoc punctiforme)的PAL/HAL(登录号ZP_00105927，来自点形念珠藻ATCC 29133，2004年10月1日提交，NCBI MicrobialGenomes Annotation Project)(SEQ ID NO：2，图4)、来自多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)(Gene ID 3679622，Ava_3988苯丙氨酸/组氨酸氨裂合酶，多变鱼腥藻ATCC 29413，2006年3月31日(SEQ ID NO：4，图4)、光合作用原核生物巢状组囊藻(Anacystis nidulans)(Lofflehardt，Z.Naturforsch 31(11-12)：693-9(1976))、肠细菌科革兰氏阴性细菌、发光杆菌(Photorabdus luminescens)TT01(Williams等人，Microbiology151：2543-2550(2005))和轮生链霉菌(Streptomyces verticillatus)(Bezanson等人，Can.J.Microbiol.16(3)：147-51(1970))的PAL/HAL。此外，已经评价了海洋链霉菌中的PAL活性(Xiang，L.等人，J.Biol.Chem.277：32505-32509(2002))。已经对蓝藻如鱼腥藻和念珠藻进行了关于生物活性天然产物产生的研究，所述天然产物通过混合的多聚乙酰肽生物合成途径产生(Moore，B.S.，Natural Products Reports 22(5)：580-593(2005)；Becker等人，Gene 325：35-42(2004)；Hoffman等人，Gene 311：171-180(2003))。本发明是基于原核生物或细菌PAL可以有效治疗PKU和其它疾病的这一发现。本发明涉及细菌PAL及其生物活性片段、突变体、变体和类似物的组合物，其具有增强的性质，例如更强的催化活性、更高的生化稳定性，以及对于治疗应用而言，具有减弱的免疫原性和更长的生物半衰期。本发明还提供了细菌PAL及其生物活性片段、突变体、变体和类似物的生产和纯化方法，以及为了治疗和工业目的使用这些组合物的方法。
此处使用的“细菌PAL”和“原核生物PAL”可以互换使用，是指(1)来自原核生物的野生型PAL，包括但不限于来自海洋链霉菌(也称为EncP，SEQ ID NO：5，图4)、点形念珠藻(SEQ ID NO：2，图4)、多变鱼腥藻(SEQID NO：4，图4)、巢状组囊藻(Lofflehardt，(1976)同上)、发光杆菌(Photorabdus luminescens)TT01(Williams等人，(2005)同上)和轮丝链霉菌(Bezanson等人，(1970)同上)的PAL；(2)这些野生型酶的片段、突变体、变体和类似物，它们保留对苯丙氨酸类似的(即，至少50％)催化活性，并且在一些实施方案中，显示提高的催化活性和/或延长的半衰期和/或降低的免疫原性，和(3)这些野生型酶、其片段、突变体、变体和类似物的化学修饰形式，它们已经连接到提供其它有益效果如延长的半衰期的其它化学部分上。例如，当提到为了治疗或工业目的制备或使用原核生物PAL、其片段、突变体、变体、类似物或化学修饰形式和这些酶的组合物的方法时，是指制备、使用或配制所有这些野生型、其片段、突变体、变体、类似物或化学修饰形式的方法。
第一方面，本发明提供细菌PAL及其生物活性片段、突变体、变体或类似物。一个实施方案是来自点形念珠藻的细菌PAL(SEQ ID NO：2)或其生物活性片段、突变体、变体或类似物。另一个实施方案是来自多变鱼腥藻的细菌PAL(SEQ ID NO：4)或其生物活性片段、突变体、变体或类似物。在一些实施方案中，所述变体在对应于圆红冬孢酵母PAL的Ser 210、Ala-Ser-Gly三联体(211-213)、Asp214、Leu 215、Asn270、Val269、Leu266、Leu134、His137、Lys468、Glu496、Gln500的位置处保留野生型活性位点残基或这些野生型活性位点的保守置换，其中第211-213位的Ala-Ser-Gly三联体被认为是苯丙氨酸的结合位点。
希望的变体可以包括蛋白质，其中一个或多个半胱氨酸残基已被另一种氨基酸(例如，丝氨酸)残基替换，从而减少可能与酶活性降低、免疫原性提高和/或其它不利的体内效应有关的蛋白质聚集。
希望的变体可以包括融合蛋白，其中所述酶与本领域已知能够延长半衰期的另一种异源多肽融合，该异源多肽例如是免疫球蛋白的天然或修饰的恒定区或其保留补救表位(salvage epitope)的片段。
本发明进一步涉及这些多肽的化学修饰形式，它们已与提供其它有利效应的化学部分连接。例如，本领域中已知水溶性聚合物与多肽的非特异性或位点特异性(例如，N-末端)连接能够延长半衰期，化学部分的连接也可以降低免疫原性和提高蛋白酶抗性。
这种细菌PAL按照本发明的方法分离和纯化，并且由此以能够在治疗上使用该酶的量存在。在一些实施方案中，使用编码完整或野生型细菌PAL的cDNA。但是在其它实施方案中，可以使用编码其生物活性片段或突变体的cDNA。此外，本发明提供了通过基于结构的分子工程方法获得的优化的细菌PAL和/或PAL的化学修饰(例如，聚乙二醇化)形式的组合物。具体实施方案涉及适于治疗应用的、具有提高的比活性、增强的稳定性、降低的免疫原性和/或蛋白水解敏感性的优化的PAL组合物。一个实施方案是具有提高的比活性的点形念珠藻PAL的聚乙二醇化形式。另一个实施方案是具有提高的比活性的多变鱼腥藻PAL的聚乙二醇化形式。
在各种实施方案中，PAL变体的聚乙二醇化根据PAL∶PEG或PEG∶PAL的比例来描述。除非另外指出，此处使用的“PAL∶PEG”比例是指聚乙二醇化反应中PAL变体上的赖氨酸残基与PEG分子的比例。类似地，除非另外指出，此处使用的“PEG∶PAL”比例是指聚乙二醇化反应中PEG分子与PAL变体上的赖氨酸残基的比例。
在一个实施方案中，本发明涉及免疫原性降低的聚乙二醇化的PAL变体。另一个实施方案是免疫原性降低的点形念珠藻PAL(NpPAL)变体的聚乙二醇化形式。另一个实施方案是免疫原性降低的多变鱼腥藻PAL(AvPAL)变体的聚乙二醇化形式。特定的实施方案涉及这样的NpPAL或AvPAL变体，其中聚乙二醇化是通过NpPAL或AvPAL变体与水溶性聚合物例如聚乙二醇(PEG)反应实现的。在一些实施方案中，聚乙二醇化是通过NpPAL或AvPAL变体与PEG以至少1∶1、至少1∶1.5、至少1∶2、至少1∶3或至少1∶4的PAL∶PEG比例反应一次而实现的。在一个实施方案中，PAL变体是AvPAL变体，并且聚乙二醇化是采用1∶3的PAL∶PEG比例实现的。
本发明还涉及为了降低免疫原性而将聚乙二醇化的PAL变体再聚乙二醇化。在一些实施方案中，聚乙二醇化是通过NpPAL或AvPAL变体与PEG反应两次或更多次而实现的，每次聚乙二醇化的PAL∶PEG比例为至少1∶1、至少1∶1.5、至少1∶2、至少1∶3或至少1∶4。在一些实施方案中，聚乙二醇化是通过NpPAL或AvPAL变体与PEG反应两次、三次、四次、五次或或更多次而实现的，每次聚乙二醇化的PAL∶PEG比例为至少1∶1、至少1∶1.5、至少1∶2、至少1∶3或至少1∶4。在一个实施方案中，PAL变体是AvPAL变体，并且在第一次和第二次聚乙二醇化反应时均采用1∶3的PAL∶PEG比例实现聚乙二醇化。
在一些实施方案中，本发明的野生型PAL的生物活性位点可以按照需要修饰，以优化PAL动力学特性。在一个实施方案中，修饰的PAL具有降低血浆苯丙氨酸水平并且使其保持在大约120μM至大约240μM的最佳范围内的足够的活性。在其它实施方案中，生物活性的修饰PAL具有至少大约0.1s-1或大于大约0.5s-1的kcat。在一些实施方案中，生物活性的修饰PAL具有至少大约0.2s-1或大于大约1.0s-1的kcat。在其它实施方案中，生物活性的修饰PAL具有大约10μM至大约1000μM的Km。在其它实施方案中，生物活性的修饰PAL具有大约100μM至大约1000μM的Km。在其它实施方案中，生物活性的修饰PAL显示比野生型高大约2倍至大约1000倍的酶活性。在其它实施方案中，生物活性的修饰PAL显示比野生型高大约10％至100％的酶活性。这些生物活性的修饰PAL蛋白可以使用本领域公知的方法形成，例如通过定点诱变。在进一步的实施方案中，本发明涉及代谢苯丙氨酸(即，将苯丙氨酸转化为另一种物质)的细菌PAL在制备治疗哺乳动物、特别是人类PAH活性缺乏的药物中的应用，以及用于治疗PAH活性缺乏的含有细菌PAL的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物含有单独的或与药学上合适的载体组合的来源于细菌的高度纯化的PAL或其生物活性片段、突变体或类似物。在一些实施方案中，制剂含有纯度大于95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的细菌PAL。在其它实施方案中，本发明的细菌PAL的相对比活性高于野生型PAL的比活性的大约110％。
第二方面，本发明提供为了治疗和工业目的使用PAL组合物的新方法。在一个实施方案中，本发明涉及通过给需要这种治疗的个体施用治疗有效量的包含细菌PAL的药物组合物，治疗全部或部分由PAH活性缺乏引起的疾病的方法。PAH活性的缺乏可以显示为，例如，与正常PAH活性水平相比，50％或更低、25％或更低、或10％或更低、或1％或更低的活性水平，并且可以表现为升高的苯丙氨酸水平，例如，在高苯丙氨酸血症、轻度苯丙酮尿症或经典严重苯丙酮尿症中。在一些实施方案中，所述疾病是苯丙酮尿症(PKU)。
在特定的实施方案中，所述个体是被诊断为具有突变的苯丙氨酸羟化酶(PAH)的个体。突变PAH可以在PAH的催化域含有突变。这些突变的例子包括但不限于突变F39L、L48S、I65T、R68S、A104D、S110C、D129G、E178G、V190A、P211T、R241C、R261Q、A300S、L308F、A313T、K320N、A373T、V388M、E390G、A395P、P407S和Y414C。
也涉及一种治疗具有高于正常的血浆苯丙氨酸浓度(例如，大于180μM或360μM)的个体的方法，包括以有效导致个体血浆苯丙氨酸浓度降低的量给该个体施用细菌PAL组合物。所述个体在施用细菌PAL之前可能具有大于180μM的血浆苯丙氨酸浓度。更特别地，所述个体具有120μM至200μM的血浆苯丙氨酸浓度。在其它实施方案中，所述个体具有200μM至600μM的血浆苯丙氨酸浓度。在另外其它一些实施方案中，所述个体具有600μM至1200μM的血浆苯丙氨酸浓度。可治疗的另一类个体是具有大于1200μM的无限制的血浆苯丙氨酸浓度的个体。
在特定的实施方案中，所述个体为婴儿，更特别地为血浆苯丙氨酸浓度大于1200μM的婴儿。本发明涉及治疗患苯丙酮尿症的婴儿的方法，包括以有效导致婴儿血浆苯丙氨酸浓度降低的量给婴儿施用细菌PAL组合物，其中婴儿为0-3岁，并且婴儿的血浆苯丙氨酸浓度为大约360μM至大约4800μM。在施用细菌PAL之前，婴儿的苯丙氨酸浓度为大约1200μM，并且细菌PAL的施用使血浆苯丙氨酸浓度降至大约1000μM。在其它实施方案中，在施用细菌PAL之前，婴儿的苯丙氨酸浓度为大约800μM，并且PAL的施用使血浆苯丙氨酸浓度降至大约600μM。在进一步的实施方案中，在施用PAL之前，婴儿的苯丙氨酸浓度为大约400μM，并且PAL的施用使血浆苯丙氨酸浓度降至大约300μM。在某些实施方案中，此处涉及的治疗方法应当使婴儿的血浆苯丙氨酸浓度降至大约120μM至大约360μM的范围，或大约120μM至大约240μM的范围。
本发明还涉及一种治疗患有高苯丙氨酸血症(HPA)的怀孕女性的方法，包括给个体单独施用细菌PAL或与蛋白质限制性饮食联合施用，其中与不进行联合施用时的浓度相比，细菌PAL的单独施用或与蛋白质限制性饮食的联合施用可有效降低个体血浆中的苯丙氨酸浓度。在某些实施方案中，个体具有大于180μM但是小于600μM的无限制的血浆苯丙氨酸浓度。在其它实施方案中，个体具有大于500μM但是小于1200μM的无限制的血浆苯丙氨酸浓度。在另外其它一些实施方案中，个体具有大于1200μM的无限制的血浆苯丙氨酸浓度。血浆苯丙氨酸浓度大于1200μM的怀孕者是这类治疗的特别有吸引力的候选者，打算怀孕的育龄女性也是其候选者。在个体的血浆苯丙氨酸浓度大于1200μM的那些实施方案中，所述方法进一步包括给个体施用蛋白质限制性饮食。
本发明描述了治疗个体的经典严重苯丙酮尿症(PKU)的方法，包括给个体施用细菌PAL或其生物活性片段、突变体、变体或类似物，其中与不施用细菌PAL时的浓度相比，细菌PAL的施用可有效降低个体血浆中的苯丙氨酸浓度。为按照本发明方法进行治疗而选择的个体具有升高的血浆Phe浓度，在没有治疗剂的情况下该浓度可能大于1800μM。其它实施方案涉及在没有治疗方案的情况下血浆苯丙氨酸浓度大于1000μM的个体。在一些实施方案中，本发明的联合施用方法使个体的血浆苯丙氨酸浓度降至低于600μM。在一个实施方案中，降至低于500μM。在另一个实施方案中，联合给药使个体的血浆苯丙氨酸浓度降至大约120μM至大约360μM的范围。在另一个实施方案中，个体的血浆苯丙氨酸浓度降至大约120μM至大约240μM的范围。
某些实施方案包括优化剂量以满足所治疗的生物体(例如哺乳动物或人类)的需要，以有效地改善疾病症状。PAL可以每日单剂量、每日多剂量、每周单剂量或每周多剂量给药。在一些实施方案中，PAL治疗不是连续的，而是每日施用PAL，直到个体的血浆苯丙氨酸浓度降至低于360μM。在一些实施方案中，每日监测个体的血浆苯丙氨酸浓度，并且当观察到血浆苯丙氨酸浓度升高10％时施用PAL。在其它实施方案中，剂量每周给予一次。本发明涉及至少0.001mg/kg、0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.05mg/kg的剂量，并且每周可达0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg或更高的剂量。在一些实施方案中，剂量是1mg/kg/周、0.1mg/kg/周或0.01mg/kg/周。
本发明涉及递送同等剂量的多种肠胃外或非肠胃外给药途径，包括口服、经皮、经粘膜、肺内(包括喷雾)、肌肉内、皮下或静脉内给药。还特别涉及通过快速浓注或直接输注到关节或CSF内给药，例如鞘内、脑内、心室内、经腰椎穿刺术或经小脑延髓池给药。在一些实施方案中，剂量经皮下或口服递送。
本发明还涉及其它提高人类个体中的PAL活性的手段，包括基因治疗。PAL基因的转移能够通过本领域已知的多种手段进行，包括病毒载体、同源重组或直接DNA注射。该方面的范围中包括特征为编码细菌PAL或其生物活性突变体或类似物的全部或一部分的核酸序列的实施方案，它们可以在体内施用至PAH缺乏的细胞内。
在另一个实施方案中，细菌PAL也可以与蛋白质限制性饮食联合施用。在本发明的方法中施用的蛋白质限制性饮食是可将个体的总苯丙氨酸摄入量限制为小于每天600mg的苯丙氨酸限制性饮食。在其它实施方案中，蛋白质限制性饮食是其中总苯丙氨酸被限制为小于每天300mg的苯丙氨酸限制性饮食。在另外其它一些实施方案中，蛋白质限制性饮食是补充有诸如酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸等氨基酸的饮食。还涉及包含细菌PAL和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合物。该组合物可以进一步包含药物蛋白质补充物。在其它实施方案中，PAL组合物是婴儿配方的一部分。在另外其它一些实施方案中，蛋白质补充物不含苯丙氨酸。蛋白质补充物可以用浓度为20mg/100g补充物的L-酪氨酸、L-谷氨酰胺、L-肉碱、浓度为40mg/100g补充物的L-牛磺酸和硒强化。它可以进一步包含每日推荐剂量的矿物质，例如，钙、磷和镁。该补充物进一步可以包含每日推荐剂量的一种或多种氨基酸，该氨基酸选自L-亮氨酸、L-脯氨酸、醋酸L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、甘氨酸、L-天冬酰胺一水合物、L-色氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-组氨酸、L-甲硫氨酸、L-谷氨酸和L-天冬氨酸。另外，所述补充物可以用每日推荐剂量的维生素A、D和E强化。所述补充物可以包含提供至少40％的补充物能量的脂肪含量。这种补充物可以以粉末补充物或蛋白质条的形式提供。
本发明涉及治疗各种形式的肿瘤生长和癌症的方法，包括但不限于淋巴母细胞性白血病、***肿瘤和黑素瘤。
本发明涉及使用细菌PAL由氨和反式肉桂酸盐商业生产苯丙氨酸的方法。苯丙氨酸用于阿斯巴甜(一种甜味剂)和其它食品中，包括饮料、谷物、蛋糕、餐后甜点、蛋和奶酪食品、脂肪、油、鱼和其它海鲜、肉和肉制品、奶和奶制品、坚果、酱油和调味品、汤、糖、果酱和涂抹食品(spreads)和蔬菜。
进一步预期细菌PAL可用于生产除草剂和抗微生物剂，包括肠道菌素和红霉素。
第三方面，本发明提供一种以能够在治疗上使用该酶的量生产原核生物PAL或其生物活性片段、突变体、变体或类似物的方法。本发明涉及由细菌产生的PAL，所述细菌包括但不限于链霉菌属(Streptomyces)、堆囊菌属(Sorangium)、假单胞菌属(Pseudomonas)和蓝细菌如念珠藻属和鱼腥藻属。在一些实施方案中，PAL是由细菌种海洋链霉菌(Streptomycesmaritimus)、轮丝链霉菌(S.verticillatus)、纤维堆囊菌(Soragiumcellulosum)、点形念珠藻、Nostoc tobacum、多变鱼腥藻和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)产生的。在另一个实施方案中，原核生物PAL酶活性是使用cDNA或DNA序列产生的，上述序列来源于有时被描述为编码HAL活性或以PAL-HAL基序为特征但是具有不同于HAL的关键PAL残基的序列。
在一个宽泛的实施方案中，所述方法包括将编码原核生物PAL或其生物活性片段、突变体、变体或类似物的全部或一部分的cDNA或DNA转化到适合其表达的细胞内的步骤。在一些实施方案中，使用表达载体将DNA转移到合适的细胞或细胞系中用于其表达。在一个实施方案中，将cDNA转化到大肠杆菌中，并且重组细菌PAL作为融合蛋白过量表达。在进一步的实施方案中，生产原核生物PAL的方法包括以下步骤：(a)在合适的生长培养基中培养用编码完整原核生物PAL或生物活性变体、片段或突变体的cDNA转化的细胞至合适的密度，以产生种子培养物，(b)将转化的细胞引入生物反应器中，(c)向生物反应器中供应合适的生长培养基，和(d)分离转染的细胞与含有所述酶的培养基。
在一个实施方案中，重组PAL在诸如大肠杆菌BL21(DE3)/pLyseS(Invitrogen)的载体中作为N-末端八组氨酰标记的融合蛋白过量表达，该载体具有例如可用IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导的诱导型启动子。在另一个实施方案中，重组PAL在大肠杆菌BL21(DE3)/pLysS细胞中过量表达，没有N-末端标签。在另一个实施方案中，生产原核生物PAL的方法包括以下步骤：(1)在摇瓶中由甘油贮存物培养用于生物反应器/发酵罐的种子培养物；(2)以补料分批模式将该种子培养物引入到控制的生物反应器中；(3)在补充葡萄糖的培养基中培养所述培养物，培养条件为pH(7.8)，＞20％的溶解氧，最高1200rpm搅拌，30℃，直到达到OD600为70-100的细胞密度(约22-25小时)；(4)用0.4mM IPTG诱导所述培养物；(5)在22-26℃的较低温度下培养所述培养物，直到活性变化＜0.1IU/ml(约40-48小时，OD600一般为200)；和(5)通过连续离心收获细菌。在一个实施方案中，细胞培养基一般是成分确定的，并且由酵母提取蛋白、蛋白胨-胰蛋白胨、葡萄糖、甘油、酪蛋白氨基酸、痕量盐和磷酸缓冲盐组成。
第四方面，本发明提供一种纯化细菌PAL或其生物活性片段、突变体或类似物的方法。根据第一实施方案，培养并破碎转化的细胞团块，获得粗重组酶。将外源性物质从粗物质(bulk)中正常分离，以防止柱的污染。使用一种或几种色谱树脂进行色谱纯化。随后，将纯化的蛋白质配制到为在较长的一段时间内提供稳定的活性而设计的缓冲液中。在另一个实施方案中，纯化细菌PAL的方法包括以下步骤：(a)裂解含有重组PAL的细菌；(b)热处理裂解物以灭活病毒；(c)使用第二个连续离心步骤和/或深度过滤澄清该裂解液；(d)使澄清的裂解液通过炭过滤步骤；(e)使(d)中的滤出液通过最后的过滤步骤(如使用Sartorious Sartopore0.2μm滤器)；(f)使最终的滤出液通过疏水相互作用层析树脂，如丁基疏水相互作用层析；(g)使(f)中的洗脱物通过阴离子层析树脂，如Q离子交换柱；(h)利用正切流动过滤通过缓冲液交换回收终产物；和(i)将终产物灭菌。本领域技术人员将会容易地理解，可以省略或代替一个或多个层析步骤，或者可以在本发明的范围内改变层析步骤的顺序。最后，需要时可以进行适当的灭菌步骤。
第五方面，本发明涉及用于鉴定能够阻止、改善或处理升高的苯丙氨酸水平的细菌PAL的筛选试验，包括使含有升高水平的苯丙氨酸的细胞与细菌PAL接触，以及确定细菌PAL是否降低这种升高的苯丙氨酸水平。这些筛选试验也可以包括产生变体、随后检测该变体的体外苯丙氨酸转化活性的步骤，该变体在活性位点(例如来自海洋链霉菌的EncP的Gly 142、Thr-Ser-Gly三联体(143-145)、Asp 146、Leu 147、Asn 196、He 195、Leu 192、Leu 76、Asn 79、Met 400、Thr 428、Gln 432，相当于来自圆红冬孢酵母的PAL的残基Ser 210、Ala-Ser-Gly三联体(211-213)、Asp214、Leu 215、Asn270、Val269、Leu266、Leu 134、His137、Lys468、Glu496、Gln 500)处、在邻近该活性位点的区域中、或在整个多肽序列中包含保守或非保守置换。在某些实施方案中，该方法是高通量试验。在一个实施方案中，对细菌种的全基因组进行测序，并使用生物信息学方法对PAL同源物的存在进行筛选。在另一个实施方案，例如通过检测在体外将苯丙氨酸转化为反式肉桂酸盐的能力，证实了这些同源物的蛋白质产物的PAL催化活性。
第六方面，本发明提供使用细菌PAL组合物诊断疾病的方法，所述疾病包括但不限于全部或部分由PAH活性缺乏引起的疾病。在一个实施方案中，使用细菌PAL测定血样中的苯丙氨酸水平。在进一步的实施方案中，本发明涉及包含细菌PAL的诊断试剂盒，其用于监测苯丙氨酸水平升高的个体的血样。
通过以下详细描述，本发明的其它特征和优点将是明显的。但是应当理解，详述和具体实施例尽管说明了本发明的特定实施方案，但只是以举例说明的方式提供的，因为根据该详述，本领域技术人员将会明白在本发明的精神和范围内的各种改变和修改。
附图说明
图1.图1A：点形念珠藻PAL的基因序列(SEQ ID NO：1)；图1B：点形念珠藻PAL的蛋白质序列(SEQ ID NO：2)。
图2.图2A：多变鱼腥藻PAL的基因序列(SEQ ID NO：3)；图2B：多变鱼腥藻PAL的蛋白质序列(SEQ ID NO：4)。
图3.来自原核生物和真核生物的芳香族氨基酸氨裂合酶的亲缘关系树。序列从GenBank获得(括号中给出了登录号)并且使用邻接法用ClustalX(1.83)比对。
图4.点形念珠藻PAL(SEQ ID NO：2)和多变鱼腥藻PAL(SEQ IDNO：4)的蓝细菌蛋白质序列与EncP PAL(SEQ ID.No.5)和恶臭假单胞菌HAL(SEQ ID NO：6)的比对。强调了对应于PAL或HAL活性的活性位点残基。
图5.在12天的期限内，(A)非聚乙二醇化的NpPAL(1.0IU/mL)和(B)聚乙二醇化的NpPAL 1∶3 PAL∶PEG(Nippon Oil and Fat，NOFCorporation)(1.0IU/mL)对苯丙氨酸水平(μM)的影响。
图6.在12天的期限内，(A)非聚乙二醇化的AvPAL(1.0IU/mL)和(B)聚乙二醇化的AvPAL 1∶3 PAL∶PEG(Nippon Oil and Fat，NOFCorporation)(1.0IU/mL)对苯丙氨酸水平(μM)的影响。
图7.在90天的长期耐受性研究中，聚乙二醇化的NpPAL 1∶3PAL∶PEG(Nippon Oil and Fat，NOF Corporation)(1.0IU/mL)对苯丙氨酸水平(μM)的影响。
图8.图8A：在64位含有半胱氨酸的丝氨酸取代的多变鱼腥藻苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)蛋白质序列(AvPAL_C64S，SEQ ID NO：7)；图8B：在318位含有半胱氨酸的丝氨酸取代的多变鱼腥藻PAL的蛋白质序列(AvPAL_C318S，SEQ ID NO：8)；图8C：在503位含有半胱氨酸的丝氨酸取代的多变鱼腥藻PAL的蛋白质序列(AvPAL_C503S，SEQ ID NO：9)；图8D：在565位含有半胱氨酸的丝氨酸取代的多变鱼腥藻PAL的蛋白质序列(AvPAL_C565S，SEQ ID NO：10)；图8E：在503和565位含有半胱氨酸的丝氨酸取代的多变鱼腥藻PAL的蛋白质序列(AvPAL_C565SC503S，SEQ ID NO.11)。半胱氨酸的丝氨酸取代以粗体下划线标出。
图9.图9A：在37℃温育不同时间长度后，非聚乙二醇化AvPAL的第565位或者第565和503位的半胱氨酸的丝氨酸取代对体外PAL酶比活性的影响。图9B：在37℃温育不同时间长度后，聚乙二醇化AvPAL的第565位或者第565和503位的半胱氨酸的丝氨酸取代对体外PAL酶比活性的影响。
图10.图10A：通过变性条件(左图)或非变性条件(右图)下的凝胶电泳分析，AvPAL中的半胱氨酸的丝氨酸取代对溶液中蛋白质聚集体的形成的影响。图10B：通过SEC-HPLC分析，AvPAL中的半胱氨酸的丝氨酸取代对溶液中蛋白质聚集体的形成的影响。
图11.AvPAL中第565和503位的半胱氨酸的丝氨酸取代(dbl突变体)对各种PEG浓度下位点特异性聚乙二醇化的影响。
图12.通过SEC-HPLC分析，用0.05％Tween80或10mM EDTA处理AvPAL对溶液中蛋白质聚集体的形成的影响。
图13.图13A：通过SEC-HPLC分析，用二硫苏糖醇(DTT)处理AvPAL对溶液中蛋白质聚集体的形成的影响。图13B：通过SEC-HPLC分析，用DTT和N-乙基马来酰亚胺(NEM)处理AvPAL对溶液中蛋白质聚集体的形成的影响。
图14.与给予载体或4.0IU野生型聚乙二醇化AvPAL的ENU2小鼠相比，聚乙二醇化AvPAL中第565和503位的半胱氨酸的丝氨酸取代(AvPAL_C565SC503S)对给予0.25IU(上图)、1.0IU(中图)或4.0IU(下图)酶的ENU2小鼠的体内苯丙氨酸(Phe)水平的影响。
图15.与给予载体或4.0IU野生型聚乙二醇化AvPAL的ENU2小鼠相比，聚乙二醇化AvPAL中第565和503位的半胱氨酸的丝氨酸取代(AvPAL_C565SC503S)对给予0.25IU、1.0IU或4.0IU酶的ENU2小鼠的体重的影响。
图16.与给予载体或AvPAL∶PEG比例为1∶3的4.0IU野生型聚乙二醇化AvPAL的ENU2小鼠相比，在给予AvPAL∶PEG比例为1∶1.6(上图)、1∶2.4(中图)或1∶3(下图)的4IU酶的ENU2小鼠中，聚乙二醇化AvPAL中第565和503位的半胱氨酸的丝氨酸取代(AvPAL_C565S/C503S)对体内苯丙氨酸(Phe)水平的影响。
图17.与给予载体或AvPAL∶PEG比例为1∶3的4.0IU野生型聚乙二醇化AvPAL的ENU2小鼠相比，聚乙二醇化AvPAL中第565和503位的半胱氨酸的丝氨酸取代(AvPAL_C565SC503S)对给予AvPAL∶PEG比例为1∶1.6、1∶2.4或1∶3的4IU酶的ENU2小鼠体重的影响。
图18.聚乙二醇化AvPAL_C565SC503S的再聚乙二醇化对AvPAL体外比活性的影响。(上图)rAvPAL-PEG的比活性的恢复，其首先以1∶3(2mM赖氨酸残基∶6mM PEG，实心圆形)的PAL∶PEG比例聚乙二醇化，然后在所示的各种PAL∶PEG比例和赖氨酸残基和PEG分子浓度下再聚乙二醇化。(下图)rAvPAL-PEG的比活性的恢复，其首先以1∶1(2mM赖氨酸残基∶2mM PEG，实心正方形)或1∶3(2mM赖氨酸残基∶6mM PEG，实心圆形)的PAL∶PEG比例聚乙二醇化，然后在所示的各种PAL∶PEG比例和赖氨酸残基和PEG分子浓度下再聚乙二醇化。
图19.图19A：通过毛细管凝胶电泳(CGE)分析确定，提高再聚乙二醇化反应中的PAL∶PEG比例对rAVPAL-PEG的总体聚乙二醇化的影响，其中首先以1∶3(2mM赖氨酸残基∶6mM PEG)的PAL∶PEG比例进行聚乙二醇化。图19B：通过CGE分析确定，提高初次聚乙二醇化反应中的PAL∶PEG比例对rAVPAL-PEG的总体聚乙二醇化的影响，其中再聚乙二醇化反应以1∶3(2mM赖氨酸残基∶6mM PEG)的固定PAL∶PEG比例进行。
图20.首先以1∶3(2mM赖氨酸残基∶6mM PEG)的PAL∶PEG比例聚乙二醇化，然后在所示的各种PAL∶PEG比例和赖氨酸残基和PEG分子浓度下再聚乙二醇化，AvPAL_C565SC503S的再聚乙二醇化对AvPAL中特定赖氨酸残基的聚乙二醇化百分比的影响。在测试的所有条件下，第2位的赖氨酸残基(K2)为100％聚乙二醇化(未示出)。
图21.首先以1∶3(2mM赖氨酸残基∶6mM PEG)的PAL∶PEG比例聚乙二醇化，然后在相同的PAL∶PEG比例和赖氨酸残基和PEG分子浓度下再聚乙二醇化，AvPAL_C565SC503S的再聚乙二醇化对如表14所述皮下给药的ENU2小鼠的体内血浆苯丙氨酸(Phe)水平的影响。
发明详述
尽管PAL是一种普遍存在的高等植物酶，在关键步骤中催化苯丙氨酸非氧化脱氧基为肉桂酸，产生类苯基丙烷代谢物(Hahlbrock等人，Annu.Rev.Plant Phys.Plant Mol.Biol.40：347-369(1989))，但是PAL只在少数细菌中发现，参与“海洋链霉菌”(Xiang等人，J.Biol.Chem.277：32505-32509(2002))和纤维堆囊菌(Hill等人，Chem.Commun.1358-1359(2003))中的苯甲酰-CoA生物合成和轮丝链霉菌中的肉桂酰胺生物合成(Bezanson等人，Can.J.Microbiol.16：147-151(1970))。抑菌剂肠道菌素是海洋细菌“海洋链霉菌”的天然产物，其生物合成涉及大量不平常的特征(Hertweck等人，Chem.Biol.11：461-468(2004)；Piel等人，Chem.Biol.7：943-955(2000)；Piel等人，J.Am.Chem.Soc.122：5415-5416(2000)；Xiang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：15609-15614(2004))。其中包括形成罕见的聚酮合酶(PKS)起始单位苯甲酰辅酶A(CoA)(Moore等人.，Nat.Prod.Rep.19：70-99(2002))。最初的生化反应涉及新细菌苯丙氨酸氨裂合酶(PAL，EC 4.3.1.5)EncP将氨基酸L-苯丙氨酸转化为反式肉桂酸(Xiang等人，J.Biol.Chem.277：32505-32509(2002))。肉桂酸活化为其CoA硫酯，然后经过一轮β-氧化，产生苯甲酰辅酶A(Hertweck等人，Chem Bio Chem 2：784-786(2001)；Hertweck等人，Tetrahedron56：9115-9120(2000)；Xiang等人，J.Bacterid.185：399-404(2003))，苯甲酰辅酶A引发肠道菌素II型PKS链延伸七个丙二酰-CoA分子。
表征了第一个原核生物PAL编码基因(encP)(SEQ ID NO：5)，它的灭活导致消除了“海洋链霉菌”中的肉桂酸和肠道菌素的从头合成(Kalaitzis等人，J.Am.Chem.Soc.125：9290-9291(2003)；Xiang等人，J.Biol.Chem.277：32505-32509(2002))。在encP灭活的突变体中，通过补充肉桂酸和苯甲酸以及用质粒携带的encP互补，可以恢复肠道菌素的生物合成。此外，encP基因在天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)中在ermE*启动子控制下的异源表达导致在发酵培养物中产生桂酸(Xiang等人，J.Biol.Chem.277：32505-32509(2002))。encP基因编码522个氨基酸的蛋白质，该蛋白质显著地比真核生物PAL小接近200个氨基酸残基。尽管与植物PAL例如来自欧芹的PAL的序列同源(Rother等人，Eur.J.Biochem.269：3065-3075(2002))(CAA57056，30％相同和48％相似)，但是它与细菌组氨酸氨裂合酶(HALs，EC 4.3.1.3)例如来自恶臭假单胞菌的组氨酸氨裂合酶(Schwede等人，Biochemistry 27：5355-5361(1999))(A35251，36％相同和54％相似，SEQ ID NO：6，图4)以及与来自荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)的酪氨酸氨裂合酶(TAL)(Kyndt等人，FEBSLett.512：240-244(2002))具有更高的同源性(图3)。同源性包括位于苯丙氨酸/组氨酸/酪氨酸家族氨裂合酶的第143位的保守活性位点丝氨酸残基，它可能是4-亚甲基咪唑-5-酮(MIO)辅基中的修饰的脱氢丙氨酸残基的前体(Langer等人，Adv.Prot.Chem.58：175-188(2001)；Poppe，Curr.Opin.Chem.Biol.5：512-524(2001)；Schwede等人，Biochemistry27：5355-5361(1999))。EncP与AdmH(AAO39102，63％相同和76％相似)具有最高的序列同源性，AdmH是一种参与成团泛菌(Pantoeaagglomerans)中andrimid生物合成的推断的苯丙氨酸氨基变位酶，与来自球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)的酪氨酸氨基变位酶Sgc4相关(Christenson等人，J.Am.Chem.Soc.125：6062-6063(2003)；Christenson等人，Biochemistry 42：12708-12718(2003))。值得注意的是，由于encP与人蛋白质(HAL)具有密切的同源性，encP可能具有较低的免疫原性。也因为它们非常类似，可以突变encP以看起来象人HAL，encP的一种人源化形式。
对于化学上困难的分别除去组氨酸和苯丙氨酸的氨而言，HAL和PAL显示具有共同的机制。利用这两种酶，超亲电子辅基5亚甲基-3，5-二氢咪唑并-4-酮(MIO)通过对芳香环的Friedel-Crafits类型的攻击，活化它们各自底物的非酸性β氢原子。产生的σ复合物通过使任何碱不能接近该酶的结合袋而阻止从环上提取质子。环外双键的形成是氨去除、重芳构化和断裂的关键。MIO辅基再生并且形成产物尿刊酸酯或肉桂酸酯(Poppe等人，Angew.Chem.Int.Ed.44：3668-3688(2005))。
由于HAL与PAL之间具有高同源性，HAL和PAL的保守区被称为HAL/PAL保守区。这种高同源性可能在如NCBI的数据库中产生关于“PAL-HAL”蛋白质可能的酶活性的一些不确定性，该蛋白质例如用在NCBI数据库中列出的点形念珠藻和多变鱼腥藻的蛋白质序列错误标记。因此，有些一些PAL酶可能被错误标记成HAL酶。尽管PAL和HAL的活性位点非常相似，但是预测它们在一些关键残基上不同(Calabrese等人，Biochemistry 43(36)：11403-11416(2004)；Xiang等人，(2002)同上；Williams等人，(2005)同上)。特别是在HAL中，来自恶臭假单胞菌(SEQID NO：6)的甲硫氨酸382和谷氨酰胺414在所有HAL中高度保守，但是在迄今描述的所有(真核生物或原核生物)PAL中总是分别被赖氨酸和谷氨酰胺取代(图4)。因此可以称所有具有“PAL-HAL”区并具有赖氨酸382和谷氨酰胺414的同系物的蛋白质都具有PAL活性蛋白质的序列特征。这种相对较新描述的PAL特征(Williams等人，(2005)同上)使得可以正确标记一些酶以区分HAL到PAL，并且能够用于从已经公布的基因和蛋白质数据库中鉴定某些新的PAL酶。
本发明涉及这些原核生物PAL及其生物活性片段、突变体和变体的组合物，以及它们在治疗或工业方面的用途。
A.定义
除非另外说明，本申请，包括说明书和权利要求书中使用的下列术语，具有以下给出的定义。必须注意，当在说明书和所附权利要求书中使用时，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数形式，除非上下文中清楚地说明不是这样。标准化学术语的定义可见参考书，包括Carey和Sundberg，Advanced Organic Chemistry，3rd Edition，Vols.A and B(Plenum Press，New York 1992)。除非另外说明，本发明的实施将使用本领域技术之内的常规合成有机化学方法、质谱法、制备型和分析型色谱法、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学方法。参见，例如，T.E.Creighton，Proteins：Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company，1993)；A.L.Lehninger，Biochemistry(WorthPublishers，Inc.，4th Edition，2004)；Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(2nd Edition，1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick and N.Kaplan eds.，Academic Press，Inc.)；Remington′sPharmaceutical Sciences，18th Edition(Easton，Pennsylvania：MackPublishing Company，1990)。
无论是上文还是下文中，此处引用的所有出版物、专利和专利申请，都全文引入本文作为参考。
在整个文本中使用如下的氨基酸缩写：
丙氨酸：Ala(A)   精氨酸：Arg(R)
天冬酰胺：Asn(N) 天冬氨酸：Asp(D)
半胱氨酰：Cys(C) 谷氨酰胺：Gln(Q)
谷氨酸：Glu(E)   甘氨酸：Gly(G)
组氨酸：His(H)   异亮氨酸：Ile(I)
亮氨酸：Leu(L)   赖氨酸：Lys(K)
甲硫氨酸：Met(M) 苯丙氨酸：Phe(F)
脯氨酸：Pro(P)    丝氨酸：Ser(S)
苏氨酸：Thr(T)    色氨酸：Trp(W)
酪氨酸：Tyr(Y)    缬氨酰：Val(V)
“多核苷酸”是指由核苷酸单位组成的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，以及核酸类似物。核酸类似物包括非天然存在的碱基、参与除天然存在的磷酸二酯键之外的与其它核苷酸的键的核苷酸、或者包括通过除磷酸二酯键之外的键连接的碱基。因此，核苷酸类似物包括，例如但不限于，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、硼烷磷酸酯、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)等。例如可以使用自动DNA合成仪合成这些多核苷酸。术语“核酸”一般是指大的多核苷酸。术语“寡核苷酸”一般是指短的多核苷酸，通常不大于大约50个核苷酸。应当理解，当核苷酸序列用DNA序列(即，A、T、G、C)表示时，这也包括RNA序列(即，A、U、G、C)，其中“U”代替“T”。
“cDNA”是指单链或双链形式的与mRNA互补或相同的DNA。
在此使用常规表示法描述多核苷酸序列：单链多核苷酸序列的左手端为5′-末端；双链多核苷酸序列的左手方向被称为5′-方向。从5′至3′向新生RNA转录物上添加核苷酸的方向被称为转录方向。与mRNA具有相同序列的DNA链被称为“编码链”；位于与由DNA转录的mRNA具有相同序列的DNA链上并且位于RNA转录物5末端的5方向的序列被称为“上游序列”；位于与RNA具有相同序列的DNA链上并且位于编码RNA转录物3末端的3方向的序列被称为“下游序列”，
“互补”是指两个多核苷酸的相互作用表面的拓扑学相容性或匹配。因此，这两个分子可以描述为互补的，而且，接触表面的特征是彼此互补的。如果第一多核苷酸的核苷酸序列与第二多核苷酸的多核苷酸结合配偶体的核苷酸序列相同，则第一多核苷酸与第二多核苷酸互补。因此，序列为5′-TATAC-3′的多核苷酸与序列为5′-GTATA-3′的多核苷酸互补。
如果与目标核苷酸序列互补的序列与参照核苷酸序列基本相同，则该核苷酸序列与参照核苷酸序列“基本互补”。
“编码”是指诸如基因、cDNA或mRNA等多核苷酸中核苷酸的特定序列作为模板用于合成生物过程中的其它聚合物和大分子的的固有性质，这些聚合物和大分子具有确定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列和由其产生的生物学性质。因此，如果在细胞或其它生物***中，一个基因产生的mRNA的转录和翻译产生一种蛋白质，则该基因编码该蛋白质。用作基因或cDNA的转录模板的编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供)和非编码链都可以被称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其它产物。除非另外说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列只可以包含内含子。
“重组多核苷酸”是指具有自然界并不连接在一起的序列的多核苷酸。扩增的或装配的重组多核苷酸可以包含在合适的载体中，并且该载体可以用来转化合适的宿主细胞。包含重组多核苷酸的宿主细胞被称为“重组宿主细胞”。然后该基因在重组宿主细胞中表达，以产生例如“重组多肽”。重组多核苷酸也可以发挥非编码功能(例如，启动子、复制起点、核糖体结合位点等)。
“表达控制序列”是指调节与之可操作连接的核苷酸序列的表达(转录和/或翻译)的多核苷酸中的核苷酸序列。“可操作连接”是指两个部分之间的功能关系，其中一个部分的活性(例如，调节转录的能力)导致对另一个部分的作用(例如，序列的转录)。表达控制序列可以包括，例如但不限于，启动子序列(例如，诱导型或组成型)、增强子、转录终止子、起始密码子(即，ATG)、内含子剪接信号和终止密码子。
“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含与将要表达的核苷酸序列可操作连接的表达控制序列。表达载体包含足以用于表达的顺式作用元件；其它表达元件可以由宿主细胞或体外表达***提供。表达载体包括本领域已知的所有表达载体，如粘粒、质粒(例如，裸露的或包含于脂质体中的)和整合了重组多核苷酸的病毒。
“扩增”是指使多核苷酸序列复制从而延长为更大数目的多核苷酸分子的任何手段，例如通过逆转录、聚合酶链反应和连接酶链反应。
“引物”是指能够与指定的多核苷酸模板特异性杂交并且提供互补多核苷酸的合成起点的多核苷酸。当多核苷酸引物置于诱导合成的条件下时，即，在核苷酸、互补多核苷酸模板和聚合作用试剂如DNA聚合酶的存在下，这种合成发生。引物一般是单链的，但是也可以是双链的。引物一般是脱氧核糖核酸，但是许多种类的合成和天然存在的引物也可用于许多应用。引物与设计与之杂交的模板互补，以用作启动合成的位点，但是不需要反映模板的确切序列。在这种情况下，引物与模板的特异性杂交取决于杂交条件的严格性。引物可以用例如发色、放射性或荧光部分标记，并且用作可检测部分。
“探针”当用于多核苷酸时，是指能够与另一多核苷酸的指定序列特异性杂交的多核苷酸。探针与目标互补多核苷酸特异性杂交，但是不需要反映模板的确切互补序列。在这种情况下，探针与靶标的特异性杂交取决于杂交条件的严格性。探针可以用例如发色、放射性或荧光部分标记，并且用作可检测部分。
如果序列为第一序列的多核苷酸与序列为第二序列的多核苷酸特异性杂交，则第一序列是相对于第二序列的“反义序列”。
“特异性杂交”或“选择性杂交”是指当序列存在于复合混合物(例如，总细胞)DNA或RNA中时，一种核酸分子在严格条件下优先与特定核苷酸序列结合、双链体化或杂交。
术语“严格条件”是指在该条件下，探针优先与其目标亚序列杂交，而较低程度地与其它序列杂交，或者根本不杂交。在核酸杂交实验如Southern和Northern杂交中，“严格杂交”和“严格杂交洗涤条件”取决于序列，并且在不同的环境参数下是不同的。关于核酸杂交的详细指导可见Tissen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2″Overviewof principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays″，Elsevier，New York。通常，选择的高严格杂交和洗涤条件是在确定的离子强度和pH下比特定序列的热解链温度(Tm)低大约5℃。Tm是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。选择的非常严格条件等于特定探针的Tm。
对于Southern或Northern印迹法中在滤膜上具有超过100个互补残基的互补核酸的杂交，严格杂交条件的一个例子是50％的甲醛和1mg肝素，42℃，杂交进行过夜。高严格洗涤条件的一个例子是0.15M NaCl，72℃，大约15分钟。严格洗涤条件的一个例子是在65℃下用0.2×SSC洗涤15分钟(关于SSC缓冲液的说明，参见，Sambrook等人.(1989)同上)。通常，高严格洗涤之前为低严格洗涤，以除去背景探针信号。用于例如超过100个核苷酸的双链体的中严格洗涤的一个例子是在45℃下用1×SSC洗涤15分钟。用于例如超过100个核苷酸的双链体的低严格洗涤的一个例子是在40℃下用4-6×SSC洗涤15分钟。通常，特定杂交分析中的信噪比为无关探针的2×(或更高)表示检测到特异性杂交。
“多肽”是指由氨基酸残基、其有关的天然存在的结构变体和合成的非天然存在的类似物通过肽键连接组成的聚合物。例如，可以使用自动化多肽合成仪合成合成多肽。术语“蛋白质”一般是指大的多肽。术语“肽”一般是指短的多肽。
在此使用常规表示法来描述多肽序列：多肽序列的左手端为氨基端；多肽序列的右手端为羧基端。
“保守置换”是指多肽中的氨基酸被置换为功能上类似的氨基酸。以下六组各自含有彼此为保守置换的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
氨基酸也可以如下分组：
(1)疏水性：Met、Ala、VaI、Leu、He；
(2)中性疏水性：Cys、Ser、Thr；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：Asn、Gln、His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
“等位基因变体”是指占据同一基因座的一个基因的两个或多个多态性形式中的任意一个。等位基因变异是通过突变自然产生的，并且可导致群体内的表型多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽中没有改变)，或者可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。“等位基因变体”也指来源于遗传等位基因变体的mRNA转录物的cDNA，及其编码的蛋白质。
术语“相同”或百分“同一性”在用于两个或多个多核苷酸或多肽序列时，是指当进行最大对应性的比较和比对时，如使用以下序列比较算法之一或通过目视观察确定的，两个或多个序列或亚序列相同或具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基。
短语“基本同源”或“基本相同”在用于两个核酸或多肽时，是指当进行最大对应性的比较和比对时，如使用以下序列比较算法之一或通过目视观察确定的，两个或多肽序列或亚序列至少有40％、60％、80％、90％、95％、98％的核苷酸或氨基酸残基相同。在一些实施方案中，基本相同性存在于长度至少为约50个残基的序列区域上、至少约100个残基的区域上或至少约150个残基的区域上。在另一个实施方案中，在所比较的生物聚合物中的任一个或两个的全长上，序列是基本相同的。
对于序列比较，一般一个序列作为参照序列，测试序列与之进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参照序列输入计算机中，指定序列坐标(subsequence coordinates)，必要时，指定序列算法程序参数。序列比较算法然后基于指定的程序参数计算测试序列相对于参照序列的百分序列同一性。
例如，通过Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson & Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444(1988)的相似性检索法，通过计算机执行这些算法(WisconsinGenetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或者通过目视观察，可以进行比较序列的最佳比对。
有用的算法的一个例子是PILEUP。PILEUP使用渐进的逐对比对，产生一组相关序列的多序列比对，以显示相关性和百分序列同一性。它也制作树状图或***树图，显示用来产生比对的聚类关系。PILEUP使用简化的Feng & Doolittle，J.Mol.Evol.35：351-360(1987)的渐进比对法。使用的方法类似于Higgins & Sharp，CABIOS 5：151-153(1989)所述的方法。该程序可以比对高达300个序列，最大长度各为5,000个核苷酸或氨基酸。多重比对程序开始于两个最相似的序列的逐对比对，产生两个比对的序列的聚类(cluster)。这个聚类然后与下一个最相关的序列或对比序列的聚类进行比对。两个序列聚类通过两个序列的逐对比对的简单延伸进行比对。通过一系列渐进的逐对比对完成最终的比对。该程序通过为序列比较区指定特定序列和它们的氨基酸或核苷酸坐标以及通过指定程序参数而运行。例如，可以使用以下参数，将参照序列与另一个测试序列比较，以确定百分序列同一性关系：缺省空位权重(3.00)、缺省空位长度权重(0.10)和加权末端空位。可用于产生序列多重比对的另一个算法是Clustal W(Thompson等人，Nucleic Acid Research 22：4673-4680(1994))。
适用于确定百分序列同一性和序列相似性的算法的另一个例子是由Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)描述的BLAST算法。执行BLAST分析的软件可以通过国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公开获得。该算法涉及首先通过确定查询序列中长度为W的短字母来确定高得分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字母比对时，这些短字母语匹配或满足某些为阳性值的阈值得分T。T被称为邻近字母得分阈值(Altschul等人.(1990)，同上)。这些初始邻近字母命中作为种子来开始检索，以发现更长的含有它们的HSP。字母命中然后沿每条序列双方向延长，只要累积比对得分可以增加。对于核苷酸序列，使用参数M(对一对匹配残基的奖励得分；总是＞0)和N(对于错配残基的罚分；总是＜0)计算累积得分。对于氨基酸序列，利用打分矩阵计算累积得分。每个方向的字母命中的延长在以下情况时停止：累积比对得分比其达到的最大值减少了量X；由于一个或多个负得分残基比对的积累，累积得分变为0或0以下；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4和两条链的比较作为缺省值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)为3、期望值(E)为10和BLOSUM62打分矩阵作为缺省值(参见Henikoff& Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))。
除了计算百分序列同一性以外，BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计学分析(参见，例如，Karlin & Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。BLAST程序提供的相似性的一个量度是最小总概率(P(N))，它指示两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率。例如，如果在测试核酸与参照核酸的比较中最小总概率小于大约0.1、小于大约0.01或小于大约0.001，则认为该核酸类似于参照序列。
两个核酸序列或多肽基本相同的进一步的指示是第一核酸编码的多肽与第二核酸编码的多肽在免疫学上交叉反应，如下所述。因此，例如，当两个肽的区别仅在于保守置换时，一个多肽一般与第二多肽基本相同。两个核酸序列基本相同的另一个指示是两个分子在如此处所述的严格条件下彼此杂交。
“基本纯的”或“分离的”是指目标物质是存在的主要物质(即，以摩尔计，比组合物中的其它任何大分子物质都更丰富)，并且基本纯化的组分是其中目标物质占存在的所有大分子物质的至少约50％(以摩尔计)的组合物。通常，基本纯的组合物是指该组合物中存在的大分子物质中的大约80％至90％或更多是纯化的目标物质。如果组合物基本由单一大分子物质组成，目标物质纯化至基本均一性(通常常规检测方法在组合物中无法检测到污染物)。对于该定义，溶剂物质、小分子(＜500道尔顿)、稳定剂(例如，BSA)和元素离子种类不认为是大分子物质。在一些实施方案中，本发明的化合物或偶联物是基本上纯的或分离的。在一些实施方案中，本发明的化合物或偶联物相对于在其合成中使用的大分子起始物质是基本上纯的或分离的。在一些实施方案中，本发明的药物组合物包含基本上纯化的或分离的PAL多肽和活性剂的偶联物与一种或多种药学上可接受的赋形剂的混合物。
“天然存在的”当用于客体时是指该客体可以在自然界中发现的事实。例如，在生物体(包括病毒)中存在的、可以从天然来源中分离并且未在实验室中有意人工修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
术语“野生型”(wt)是指生物体的自然遗传形式。野生型不同于突变形式(具有遗传突变的生物体)。
术语“多肽”和“蛋白质”是指氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度的产物。因此，肽、寡肽、二聚体、多聚体等都包括在该定义内。全长蛋白质及其片段都包括在该定义中。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等。此外，对于本发明，“多肽”也指相对于天然序列包含诸如缺失、添加和置换(通常在性质上为保守的)等修饰的蛋白质，只要该蛋白质保持所需的活性。这些修饰可以是有意的，如通过定点诱变，也可以是无意的，例如通过产生蛋白质的宿主发生的突变或PCR扩增引起的错误。
此处使用的“类似物”或“衍生物”是与给定化合物例如肽具有大于约70％但小于100％的序列相似性的化合物，例如肽。这些类似物或衍生物可以包含非天然存在的氨基酸残基，例如包括但不限于高精氨酸、鸟氨酸、青霉胺和正缬氨酸，以及天然存在的氨基酸残基。这些类似物或衍生物也可以包含一种或多种D-氨基酸残基，并且可以在两个或多个氨基酸残基之间含有非肽连接。
术语“有效量”是指足以对个体的健康状况、病理学和疾病产生希望的结果或用于诊断目的的剂量。希望的结果可以包括剂量接受者的主观的或客观的改善。“治疗有效量”是指有效产生对健康的预期有益效果的药物的量。在任一个别情况中，适当的“有效”量可以由本领域技术人员使用常规实验确定。
“治疗”是指预防性治疗或治疗性治疗或诊断性治疗。
“预防性”治疗是给不显示疾病或病理症状(即，癌症)或只显示早期症状的个体进行的治疗。本发明的化合物或偶联物可以作为预防性治疗给予，以减少发病的可能性，或者如果已经发病，使疾病的严重程度最小化。
“治疗性”治疗是给显示疾病征兆或症状(即，癌症)的个体进行的治疗，目的是减少或消除所述征兆或症状。这些征兆或症状可以是生化的、细胞的、组织学的、功能性的、主观或客观的。本发明的化合物或偶联物可以作为治疗性治疗或为了诊断而给予。
“诊断”是鉴定病理状况的存在或性质。诊断方法在特异性和选择性方面不同。特定的诊断方法可能不提供对一种状况的明确的诊断，该方法能够提供帮助诊断的阳性指示就可以了。
“药物组合物”是指适合在包括人和哺乳动物的动物个体中作为药物使用的组合物。药物组合物包含药理学有效量的PAL多肽，也包含药学上可接受的载体。药物组合物包括包含活性成分和构成载体的惰性成分，以及由任意两种或多种成分的组合、复合或聚集、或一种或多种成分的解离、或一种或多种成分的其它类型的反应或相互作用直接或间接产生的任何产物。因此，本发明的药物组合物包括通过将本发明的化合物或偶联物与药学上可接受的载体混合制成的任何组合物。
“药学上可接受的载体”是指标准药物载体、缓冲液和赋形剂(如磷酸盐缓冲液、5％葡萄糖水溶液)和乳剂(如油包水型或水包油型乳剂)和各种类型的湿润剂和/或佐剂中的任何一种。合适的药物载体和制剂在Remington′s Pharmaceutical Sciences，19th Ed.(Mack Publishing Co.，Easton，1995)中有描述。药物载体取决于活性剂的预期的给药方式。典型的给药方式包括肠(例如，口服)或肠胃外(例如，皮下、肌肉内、静脉内或腹膜内注射；或局部、经皮或经粘膜给药)。“药学上可接受的盐”是能够配制为药用化合物或偶联物的盐，包括，例如，金属盐(钠、钾、镁、钙等)和氨或有机胺的盐。
“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”意思是一种物质是生物学或其它方面理想的，即，该材料可以对个体施用而不引起任何不希望的生物效应或以有害的方式与包含它的组合物的任何成分相互作用。
此处使用的术语“单位剂量形式”是指适合作为单一剂量用于人和动物个体的物理上分散的单位，每个单位含有预定量的本发明的化合物或偶联物，其计算的含量足以与药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂组合产生希望的效应。本发明的新单位剂量形式的规格取决于使用的特定化合物或偶联物和将要达到的效果和宿主中与每种化合物或偶联物有关的药效学。
“生理pH”或“生理范围中的pH”是指在大约7.2-8.0(含)的范围内的pH，更特别地，在大约7.2-7.6(含)的范围内的pH。
此处使用的术语“个体”包括哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的例子包括但不限于哺乳动物纲的任何成员：人、非人灵长类动物，如黑猩猩和其它猿和猴种；农畜，如牛、马、绵羊、山羊、猪；驯养动物，如兔、狗和猫；实验室动物，包括啮齿动物，如大鼠、小鼠和豚鼠，等等。非哺乳动物的例子包括但不限于鸟类、鱼类等。该术语不表示特定的年龄或性别。
在各种实施方案中，PAL变体的聚乙二醇化根据PAL∶PEG或PEG∶PAL的比例来描述。除非另外指出，此处使用的“PAL∶PEG”比例是指聚乙二醇化反应中PAL变体上的赖氨酸残基与PEG分子的比例。类似地，除非另外指出，此处使用的“PEG∶PAL”比例是指聚乙二醇化反应中PEG分子与PAL变体上的赖氨酸残基的比例。
B.基于结构的蛋白质工程化
已知许多利用主要基于蛋白质结构信息的合理优化来进行蛋白质工程化的方法(Brannigan等人，Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.3(12)：964-970(2002)；Marshall等人，Drug Discov.Today 8(5)：212-221(2003))。结构特征的***替代可以导致改善的蛋白质性质和/或底物特异性的重新设计。将一个基因家族的一个成员的功能补充到另一个同源成员中可以通过在紧邻底物结合附近引入有限数目的氨基酸取代来实现。通过产生改善的蛋白质变体使蛋白质功能改善可产生可用于工业、农业和治疗应用的蛋白质(Bocanegra等人，Biochemistry 32(11)：2737-2740(1993)；Failla等人，Fold Des.1(1)：35-42(1996)；Hayes等人，Proc Natl Acad Sci USA 99(25)：15926-15931(2002)；Voigt等人，Nat.Struct.Biol.9(7)：553-558(2002)；Malashkevich等人，Nat Struct Biol.2(7)：548-553(1995)；Wells等人，ProcNatl Acad Sci USA 84(15)：5167-5171(1987)；Wilks等人，Science242(4885)：1541-1544(1988))。
C.PAL的结构
野生型原核生物PAL的三维结构可以利用x射线晶体学来确定。PAL蛋白质是同源四聚体，每个单体主要由α-螺旋组成，并且可以再分为四个结构域——中心催化域，N-末端结构域，与恶臭假单胞菌组氨酸氨裂合酶结构(HAL，Schwede等人，Biochemistry 38(17)：5355-5361(1999))具有相似性的小C-末端结构域，以及另外一个***从完整四聚体分子的末端突出的C末端的结构域。在四聚体的全部4个单体中，N-末端前25个残基不可见，并且该区可能无序。对于PAL四聚体中的单体B，位于残基109-123和350-353之间的环区无序，对于单体A、C和D，103-123和350-353区无序。圆红冬孢酵母PAL的另外两个X-射线结构已经使用结晶过程中的反式肉桂酸盐和NH4离子添加而确定，分辨率为(P3221空间群)和(P21空间群；Calabrese等人，Biochemistry43(36)：11403-11416(2004))。用于结晶的较低的pH和这些结构的较低的分辨率导致这些结构中更严重的固有、的无序(特别是在N-末端区)以及不能将MIO辅因子上存在的额外的电子密度明确地分配给NH2加合物。
在这个从羧酸上催化消除各种基团的四聚体酶家族中存在大量的相关结构(使用DALI，Holm等人，J.Mol.Biol.233：123-138(1993))，该家族包括氨裂合酶(PAL、HAL和天冬氨酸氨裂合酶(AAL))、延胡索酸酶和精氨琥珀酸裂解酶(Schwede等人，Biochemistry 38(17)：5355-5361(1999))。另外，δ-晶状体蛋白禽类晶状体蛋白具有类似的折叠但是该结构家族的非酶形式(Schwede等人，(1999)同上)。
来自恶臭假单胞菌的HAL(等人，Eur.J.Biochem.268：6011-6019(2001)；Schwede等人，Biochemistry 27：5355-5361(1999)和最近来自圆红冬孢酵母的PAL(Calabrese等人，Biochemistry43：11403-11416(2004))的三维X-射线结构显示，这些四聚体酶的活性位点残基对于底物结合、催化和MIO的形成是重要的。除了H83和E414分别被缬氨酸和谷氨酰胺残基替代以外，HAL中的所有活性位点残基在EncP中都存在(Xiang，L.等人，J.Biol.Chem.277：32505-3250924(2002))。提出HAL中的H83结合并定向活性位点处的L-组氨酸的咪唑部分，而E414的羧酸基团在催化中可能作为基础起作用。
PAL的高分辨率三维蛋白质晶体结构可以用于涉及蛋白质工程化的方法中，以改善PAL的生化和生理学性质，和提高PAL的体内治疗有效性。另外，该结构提供了关于该结构的哪些区最具柔性(以除去和产生更紧密和稳定的PAL形式)、哪些残基位于活性位点附近(用于突变以提高活性和/或使蛋白质的大小最小化以及为基于结构的抑制剂设计提供信息)和哪些表面位置靠近免疫原性(例如在作图研究中确定的线性表位)和/或蛋白水解敏感部位(来自蛋白酶作图研究)的信息，允许引入位点特异性突变体直接破坏问题部位，或者表面聚乙二醇化或其它化学衍生化，以保护天然PAL上存在的敏感部位。
D.PAL的结构坐标的应用
PAL的高分辨率三维晶体结构可以用于计算机方法中，为突变、修饰或组合突变和修饰选择蛋白质区域。例如，可商购的程序GETAREA基于X-射线结晶学坐标计算氨基酸残基的表面暴露。
高分辨率三维晶体结构可以进一步用于计算机方法，以设计酶活性位点的配体。例如，可商购的用于对接和设计基于结构的小分子的软件程序可以用来设计PAL抑制剂(Billett等人，Biochim Biophys Acta524(1)：219-230(1978)；Janas等人，Acta Biochim Pol.32(2)：131-143(1985)；Zon等人，Phytochemistry 59(1)：9-21(2002)；Alunni等人，Arch BiochemBiophys.412(2)：170-175(2003))。
基于结构的PAL工程化
特定大分子的可靠三维结构或结构模型的阐明允许合理设计用于优化所述大分子的特定结构和/或功能的生产性方法(Penning等人，ChemRev.101(10)：3027-3046(2001))。优化方法包括但不限于辅酶特异性的重建(Bocanegra等人，Biochemistry 32(11)：2737-2740(1993))、蛋白质稳定性的提高(Malakauskas等人，Nat Struct Biol.5(6)：470-475(1998)；Jiang等人，Protein Sci.10(7)：1454-1465(2001)；Luo，Protein Sci.11(5)：1218-1226(2002)；Filikov等人，Protein Sci.11(6)：1452-1461(2002)；O′Fagain，Enz Microb Technol.33：137-149(2003)；Cammett等人，J MolBiol.327(1)：285-297(2003))、底物特异性的重新设计(Hedstrom等人，Science 255(5049)：1249-1253(1992)；Failla等人，Fold Des.1(1)：35-42(1996)；Malashkevich等人，Nat Struct Biol.2(7)：548-553(1995)；Wilks等人，Biochemistry 31(34)：7802-7806(1992)；Feil等人，Protein Eng.10(3)：255-262(1997)；Whittle等人.，3 Biol Chem.276(24)：21500-21505(2001))、配体或受体结合特异性的改变(Cunningham等人，Proc Natl AcadSci USA 88(8)：3407-3411(1991)；Reddy等人，Nat Biotechnol.14(13)：1696-1699(1996)；Doyle等人，Curr Opin Chem Biol.4(1)：60-63(2000))和生物活性的重建(Chen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(12)：5618-5622(1993)；Sarkar等人，Nat Biotechnol.20：908-913(2002)；Blatt等人.，J Interferon Cytokine Res.16(7)：489-499(1996))。
基于结构的工程化可以用来产生PAL变体，包括合理的突变体，如截短、缺失、***、剪接变体、点突变、置换、嵌合体、环再建突变体、环交换突变体、表面镶饰突变体以及随机产生的突变体(包括单独的或与合理产生的突变体组合的定向进化产生的突变体)。另外，可以制备包含PAL突变的PAL变体，其中为了位点特异性聚乙二醇化和/或其它化学衍生化已经引入突变。用于这些方法的PAL突变体包括与野生型圆红冬孢酵母PAL具有基本相同的功能活性的任何PAL变体，包括亲本PAL蛋白质的变体、片段和化学衍生物。
定向进化蛋白质优化
定向进化法随机突变目的基因，以探索蛋白质突变空间的更彻底更大的区域。存在许多定向进化法，包括易错PCR和随机***和缺失(RID)诱变以在整个DNA序列上引入多样性，和更聚集的或“定向的”产生多样性的方法，例如位点饱和诱变和其它基于寡核苷酸的诱变方法(Brannigan等人，(2002)同上)。另外，DNA序列重组法已经用于组合有利的突变位点，同时除去有害的突变，产生新的DNA序列(例如，DNA改组法、StEP、RACHITT、ITCHY)。最后，基于结构的定向进化技术已经用于为了治疗优势重新设计蛋白质(基于结构的组合工程化、SCOPE和蛋白质设计自动化、PDA方法)。SCOPE方法是基于半理性的蛋白质工程方法，它使用蛋白质结构信息与DNA操作技术的结合，设计和由非同源基因产生多交叉蛋白质变体文库(O′Maille等人，J Mol Biol.321(4)：677-691(2002))。在PDA中，突变空间的计算初筛允许只包含与特定蛋白质折叠相容的突变，从而将序列变体数减少至适合实验筛选的大小(美国专利6,403,312；Dahiyat等人，Proc Natl Acad Sci USA 94(19)：10172-10177(1997)；Dahiyat等人，Protein Sci.6(6)：1333-1337(1997)；Hayes等人，ProcNatl Acad Sci USA 99(25)：15926-15931(2002)Orencia等人，Nature StructBiol.8：238-242(2001)。
存在大量的实例，其中使用定向进化(与有效的选择或筛选方案结合)导致改善的催化功能和生物物理学性质(例如，降低的免疫原性、提高的稳定性)，其开始于最初的酶物质，并且为了改变和/或改善功能，对该物质进行突变(Vasserot等人，Drug Discovery Today 8(3)：118-126(2003))。例如，对许多不同的蛋白质使用定向进化和其它“随机”诱变方法已经获得了成功的突变体(磷酸丙糖异构酶，Hermes等人，Proc NatlAcad Sci USA 87(2)：696-700(1990)；β-内酰胺酶，Stemmer，W.P.，Nature370(6488)：389-391(1994)，Orencia，M.C.等人，Nature Struct Biol8：238-242(2001)，Voigt，C.A.等人，(2002)同上；对硝基苄基酯酶，Moore等人，Nature Biotechnol.14：458-467(1996)；半乳糖苷酶至岩藻糖苷酶，Zhang等人，Proc Natl Acad Sci USA 94(9)：4504-4509(1997)；天冬氨酸氨基转移酶，Yano等人，Proc Natl Acad Sci USA 95(10)：5511-5515(1998)；绿色荧光蛋白，Crameri等人，Nat Biotechnol 14(3)：315-319(1996)；辣根过氧化物酶，Lin等人，Biotechnol Prog 15：467-471(1999)；细胞色素P450，Joo等人，Nature 399(6737)：670-673(1999)；联苯基双加氧酶，Kumamaru等人，Nat Biotechnol 16(7)：663-666(1998)；砷酸盐解毒途径，Crameri等人，Nat Biotechnol 15(5)：436-438(1997)；头孢菌素酶，Crameri等人，Nature391(6664)：288-291(1998)；各种蛋白质，Shao等人，Curr Opin Struct Biol6(4)：513-518(1996)；各种蛋白质，Skandalis等人，Chem Biol 4：889-898(1997)；枯草杆菌蛋白酶，Cunningham等人，Protein Eng.1(4)：319-325(1987)；腈水解酶，DeSantis等人，J Am Chem Soc.125(38)：11476-11477(2003)；α-天冬氨酰二肽酶，Kong等人，Biochem Biophys Res Commun.289(1)：137-142(2001)；天冬氨酸氨基转移酶，Rothman等人，ProteinScience 13(3)：763-772(2004)；L-天冬氨酸酶，Wang等人，Biochem BiophysRes Commun.276(1)：346-349(2000)；和乳酸脱氢酶，Wilks等人，Biochemistry 31(34)：7802-7806(1992)。
这些研究反复证明了应用“随机”诱变技术开发具有提高的稳定性、活性和降解途径抗性的改善的酶变体的应用。进化的蛋白质克隆的结构分析导致了对与获得的物理和化学性质改善有关的分子改变的了解(Orencia等人，in Advances in Protein Chemistry：Evolutionary proteindesign，F.H.Arnold，Editor，Academic Press：San Diego，pp.227-259(2001))。鉴于涉及非活性位点残基的有益突变反复发生，应用定向进化技术得到的回报是特别明显的，其中距酶活性位点区以上的一些突变位点具有有益效果(Oue等人，J.Biol.Chem.274(4)：2344-2349(1999))。定向进化和其它随机诱变技术，与选择和筛选方法结合，能够用来开发对蛋白水解更稳定和化学加强的PAL形式，以在工业应用或酶替代疗法(例如，用于PKU)中使用。
E.修饰的PAL
以前的实验已经描述了PAL的修饰形式，如PAL突变体(Schuster等人，FEBS Lett.349(2)：252-254(1994)；Schuster等人，Proc Natl Acad SciUSA 92(18)：8433-8437(1995)；Langer等人，Biochemistry 36：10867-10871(1997)；El-Batal等人，Acta Microbiol Pol.49(1)：51-61(2000)；等人，Eur.J.Biochem.269：3065-3075(2002))和HAL突变体(Taylor等人，J.Biol.Chem.269(44)：27473-27477(1994)；Baedeker等人，Eur.J.Biochem.269(6)：1790-1797(2002))。
PAL动力学的优化-具有增强的催化活性的原核生物突变体
本发明的野生型PAL的生物活性位点可以根据需要修饰，以优化PAL动力学特征。Km-获得半数最大活性的底物浓度-与PAL将Phe水平维持在可接受的范围内(即，120μM至240μM)的治疗效果密切相关。Km是酶对底物的亲和力。通过控制亲和力，人们可以限制或控制任何酶对不同浓度的底物的效果。例如，如果Km为1000μM(圆红冬孢酵母)，则该酶的活性将降至大约12.5％，血液Phe水平为240μM，以及降至大约3％，血液Phe水平为60μM。如果Km为240μM，则该酶的活性将降至大约50％，血液Phe水平为240μM，以及降至大约12％，血液Phe水平为60μM。如果Km为120μM，则该酶的活性将降至大约70％，血液Phe水平为240μM，以及降至大约35％，血液Phe水平为60μM。最佳地，治疗目标是使用其活性足以降低Phe而且使其保持在大约120μM至大约240μM的最佳范围内的酶。具有高Km(即，1000μM)的酶在Phe水平降至正常范围内时将快速丧失活性，并且也需要施用高度浓缩的或大体积的剂量，这是不切实际的。另一方面，具有极低Km的酶可能快速消耗Phe水平，对于高苯丙氨酸血症来说这可能是致命的，但是可以用于控制癌症。
在一些实施方案中，生物活性修饰的PAL具有至少为大约0.1s-1或大于大约0.5s-1的kcat。在其它实施方案中，生物活性修饰的PAL具有至少为大约0.2s-1或大于大约1.0s-1的kcat。在其它实施方案中，生物活性修饰的PAL具有大约10μM至大约1000μM之间的Km。在其它实施方案中，生物活性修饰的PAL具有大约100μM至大约1000μM之间的Km。在其它实施方案中，生物活性修饰的PAL显示为野生型的大约2倍至大约1000倍的酶活性。在其它实施方案中，生物活性修饰的PAL显示比野生型高大约10％至大约100％的酶活性。这些生物活性修饰的PAL蛋白质可以使用本领域公知的方法形成，例如通过定点诱变形成。
除了H83和E414分别被缬氨酸和谷氨酰胺残基代替以外，HAL中的所有活性位点残基在EncP中都存在(Xiang，L.等人，J.Biol.Chem.277：32505-3250924(2002))。研究了HAL中的H83在结合和定向活性位点处的L-组氨酸的咪唑部分和在稳定酶结合的阳离子中间体中的作用(Xiang等人，J.Bacteriology 187(12)：4286-4289(2005)；Xiang等人，J.Bacteriology 188(14)：5331(2006))。提出E414的羧酸基团可能在催化中作为基础起作用。在该研究中，通过定点诱变产生了EncP突变体，以评价V83对EncP引起的肉桂酸形成的贡献。将缬氨酰替换为组氨酸产生了突变体V83H，其特征是PAL活性丧失。将缬氨酰替换为丙氨酸产生突变体V83A，它比野生型EncP V83A活性更高，对L-苯丙氨酸具有略低的亲和力，相对于野生型酶的23μM，其Km为120μM。但是，与野生型EncP相比，V83A具有更高的kcat，并且比野生型酶活性更高。
特殊的蛋白质变体：免疫原性降低的变体
目前使用许多策略来降低蛋白质的免疫原性。在一些实施方案中，使免疫应答最小化而引入的修饰不会破坏大分子的结构、功能或稳定性。使用的有效策略包括提高人序列含量(嵌合体和/或其它“人源化”方法)、改善溶液性质、去除抗体表位、引入化学衍生化(如聚乙二醇化)，和/或鉴定并去除MHC限制位。对于注射治疗剂，通过进行表位作图、然后进行合理诱变以修饰和/或以其它方式突变这些免疫原性位点，可以解决体内免疫反应性，该方法单独进行或与位点特异性聚乙二醇化(Hershfield等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7185-7189(1991)；Leong等人，Cytokine 16(3)：106-119(2001)；Lee等人，Pharm.Res.20(5)：818-825(2003))或其它化学衍生化方法组合进行，以降低蛋白质的免疫反应性至可以接受的水平。修饰抗原性表面蛋白区可降低免疫原性(Chirino等人，Drug Discov.Today 9(2)：82-90(2004))。一种改善方法包括构建大小较小的、保留催化活性的蛋白质(例如，使用吸光度测量进行活性测定)。第二种改善方法是蛋白质工程化结合ELISA筛选，也可以用来鉴定免疫反应性降低的突变体。另一种方法向聚乙二醇化衍生化引入额外表面Lys位点的点突变，使用测试嘌呤核苷磷酸化酶显示该方法降低了免疫原性(Hershfield等人(1991)同上)。一种替代途径采用位于蛋白质表位区的残基的突变，以除去免疫原性位点(Yeung等人，J Immunol.172(11)：6658-6665(2004))。在一种类似于抗体人源化的方法中，将来自人抗体的同源环区和/或残基替换为同源蛋白质的相应的环区。
改善蛋白质的溶液性质可以提高酶的比活性和/或降低免疫原性。细菌表达的重组蛋白的典型溶液性质是例如由于链间二硫键形成、疏水相互作用和/或二价阳离子所致的蛋白质凝集体形成(Chi等人，Pharm Res20(9)：1325-1336(2003))。重组表达的蛋白质的聚集可以提高免疫应答(Hermeling等人，Pharm Res 21(6)：897-903(2994)；Schllekens，NephrolDial Transplant 20(suppl 6)：vi3-9(2005))。一种改善方法包括将表面半胱氨酸残基替换为其它氨基酸残基(例如，丝氨酸)，以使链间二硫键形成的可能性最小化。例如，将两个表面半胱氨酸残基替换为丝氨酸残基可减少分支酸裂合酶的聚集，而对酶活性的影响最小(Holden等人，BiochimBiophys Acta 1594(1)：160-167(2002))。
除去蛋白质治疗性的蛋白水解加工位点，通过阻止蛋白酶体加工从而阻止剪切和加工为用于抗原递呈细胞结合的肽片段，也可以使免疫原性降低。在II类MHC决定簇侧翼区的改变中也观察到类似的现象，其阻止了向自身反应性T细胞呈显(Maverakis等人，Proc Natl Acad Sci，USA 100(9)：5342-5347(2003))。
表位作图
可以使用大量算法计算或者使用体外或体内方法通过实验确定蛋白质治疗性表位。计算机程序，如来自DNAStar的Lasergene程序套装中的“Peptide Companion”和“Protean”，常用来基于蛋白质的化学组成和构象估计蛋白质的表面表位区。蛋白质序列中的免疫原性区是基于亲水性指数具有计算的最高亲水性和基于计算的表面蛋白质区域的两亲性和其它构象参数具有最高的抗原性的区域。此外，蛋白质序列中的限制位可以基于潜在HLA结合的计算机模型预测来定位(Robinson等人，NucleicAcids Res.31(1)：311-314(2003)；De Groot等人，Novartis Found.Symp.254：57-72(2003))。另外，表位也可以使用体外生物化学方法(Tangri等人，Curr.Med.Chem.9(24)：2191-2199(2002))和基于细胞的体外方法(Stickler等人，J Immunother.23(6)：654-660(2000)；Stickler等人，JImmunol Methods 281(1-2)：95-108(2003))来确定。对于蛋白质工程，免疫原性的相对降低可以使用与Stickler等人(Toxicol Sci.77(2)：280-289(2004))的基于细胞的体外分析类似的试验来监测。
肽扫描分析(表位作图)涉及使用重叠肽文库，该文库覆盖酶序列的表面区，并且与针对覆盖整个酶蛋白质序列的重叠肽产生的兔多克隆抗体探针杂交，从而显示该酶中存在的线性表位。基于该酶的三维结构，通过随机突变表位区残基以除去表位识别位点，或者利用位点特异性突变在靠近这些表位位点的表面上引入Lys或Cys残基以提供聚乙二醇化位置，来突变通过实验鉴定的抗原性位点，从而覆盖和保护这些位点免于免疫原性识别。这些可能非免疫原性的酶突变体(或这些酶突变体的聚乙二醇化形式)的ELISA筛选提供了对显示降低的免疫反应性的酶突变体亚组的体外鉴定。
表面残基鉴定和突变
可以鉴定位于或靠近酶的免疫原性区的表面暴露的残基。这些位置是蛋白质中存在的溶剂可及的表面位置总数中的一部分，取决于与表面的接近程度以及与免疫原性/抗原性区的接近程度。利用X-射线结晶学、NMR或同源性建模确定的蛋白质的三维结构可以在商业化的软件程序中使用，用于计算大分子的溶剂可及的表面积。应用程序GETAREA 1.1(Fraczkiewicz等人，J.Comp.Chem.19：319-333(1998))提供的输出对圆红冬孢酵母PAL的表面可及性给出了可靠的评估。GETAREA和PARAREA及类似的程序基于Gauss-Bonnet原理利用连续能谱法通过参数化方法计算溶剂可及的表面积。PARAREA使用每个原子的邻居清单中的所有原子对发现Gauss-Bonnet通道中潜在的交叉点，而GETAREA使用由双球相交平面限定的交叉半空间更有效地计算溶剂暴露的顶部。
在天然PAL中，GETAREA鉴定了12个分布在四聚体PAL蛋白质整个表面上的表面暴露的Lys残基，以及一个部分暴露的表面Cys残基(Cys140)。这些位置直接可以进行聚乙二醇化衍生化。此外，PAL的三维结构可以用来鉴定可用于定点诱变的另外的表面残基。这些另外的位点可以使用标准蛋白质工程技术突变，以产生具有降低的免疫原性、提高的蛋白水解抗性和/或提高的稳定性/活性的更有利的PAL突变体。
提供具有改善的性质如降低的免疫原性的蛋白质突变体的蛋白质突变策略在本领域中是已知的。一种常用的方法是将表位中的每个非丙氨酸残基突变为Ala，并且将表位中的每个丙氨酸残基突变为Gly。其它方法通过突变或缺失从表位区中除去带电荷的和疏水性的残基。其它的突变策略引入位点特异性突变，然后是位点特异性化学衍生化。
截短也可以用于产生蛋白质改善。PAL相对于组氨酸氨裂合酶(HAL)的生物信息学分析已经提示了截短突变体(残基23-716和1-564)。另外，基于高度同源性HAL蛋白结构中不存在C-末端结构域区，PAL三维结构的分析提供了用于截短的替代区域。C-末端结构域缺失突变体，包括其中来自HAL的相应环区融合到PAL序列中以代替PAL结构的C-末端结构域突出区的突变体(计算具有主要表位区)，形成较小的、更强的并且预测具有较低免疫原性的PAL变体。
在另一种方法中，利用合理诱变的蛋白质工程结合定向进化能够获得PAL的突变形式。例如，合理设计以及实验和组合设计的实施已经提高了compstatin的活性(Morikis等人，Biochem.Soc.Trans.32(1)：28-32(2004))。合理诱变与定向进化的组合已经证明是有前途的(Bornscheuer等人，Curr.Opin.Chem.Biol.5(2)：137-143(2001)；Dwyer等人，Science304(5679)：1967-1971(2004))。
可以使用定向分子进化的蛋白质工程方法，将显示低于最佳酶活性的PAL突变形式针对活性进行进化，其中随机诱变步骤之后是对活性突变体的选择步骤，产生仅有具有活性的克隆的新蛋白质突变体库。例如，如果特定突变PAL(我们已经设计靠近该结构的含表位区引入表面赖氨酸残基)无活性，则对该突变体进行定向进化(突变该非活性突变体并且选择具有活性的转化体)产生新的突变体库，其中整个结构中含有使每个活性克隆恢复活性的这种有益的突变(表面赖氨酸位点)以及一部分其它随机突变。另外，能够杂交相同蛋白质的不同种类或不同蛋白质的类似序列的分子育种的定向进化技术(Crameri等人Nature，391：288-291(1998)；Minshull等人，Curr.Opin.Chem.Biol.3(3)：284-290(1999))可以替换人组氨酸氨裂合酶的序列，以将PAL的一些免疫原性最强的区域替换为不被免疫***识别的人序列。
PAL的突变形式可以通过以下方式获得：基于半经验方法制备杂交蛋白质变体，从而相对于纯基于定向进化的方法能够实现更定向水平的蛋白质设计，以及使用这些偏置蛋白质工程方法，对鉴定的蛋白质结构的这些区域提供更随机水平的突变操作。例如，PDA法产生通过计算预筛选的蛋白质变体文库，允许比纯随机或非偏蛋白质工程方法更快速的蛋白质性质优化(美国专利6,403,312；Dahiyat，Curr Opin Biotechnol.10(4)：387-390(1999)；Filikov等人，(2002)同上；Hayes等人，(2002)同上；Luo，P.等人.，(2002)同上)。类似地，SCOPE法基于结构的“等同”亚结构域构建杂交酶变体，允许从非同源性基因开始产生多重交叉的蛋白质变体文库，(O′Maille等人.，(2002)同上)。以类似的方式，Voigt等人开发的方法基于计算算法的应用构建杂合体，该算法鉴定可以重组而不破坏蛋白质三维结构完整性的蛋白质片段或“大纲”(Voigt等人.，(2002)同上)。计算分析也可以基于二级结构元件分配，鉴定蛋白质折叠中结构和功能上重要的位置的保守核心区(Mizuguchi等人，Bioinformatics16(12)：1111-1119(2000))。PAL的突变形式可以按照本领域任何方法的步骤获得。
作为备选酶取代物的HAL
基于恶臭假单胞菌HAL的结构，对来自海洋链霉菌的encP的结构已经进行了同源性模建。尽管比PAL小，但是海洋链霉菌的结构更类似于人PAL，使得encP成为氨裂合酶的免疫原性可能较低的形式，以用于PAL蛋白质工程。获得非免疫原性PAL变体的一种替代方法包括使海洋链霉菌encP或其它原核生物PAL突变以将免疫原性序列替换为人组氨酸氨裂合酶序列(HAL，Suchi等人，Biochim.Biophys.Acta1216(2)：293-295(1993))，采用突变，然后选择具有PAL活性的encP或其它原核生物突变体，以获得“人源化的”encP或其它原核生物PAL蛋白，该蛋白质可以在突变和活性选择步骤后进一步聚乙二醇化。
特殊的蛋白质变体：蛋白酶敏感性降低的变体
目前使用多种策略降低蛋白酶敏感性。在一些实施方案中，为使蛋白水解敏感性最小化而引入的修饰不会破坏大分子的结构、功能或稳定性。有效的策略包括给酶提供活性位点稳定物质，例如竞争性抑制剂(Gilbert等人，(1981)同上；美国专利6,548,644；6,451,986；6,433,158；6,461,849)，化学修饰敏感的Lys和/或Arg位点中的氨基以阻断胰蛋白酶结合位点，将胰凝乳蛋白酶敏感的Tyr、Phe和/或Trp残基突变为较小的中性氨基酸以消除切割敏感性，将PAL连接或偶联到其它保护性大分子(如Fc抗体结构域或肉毒杆菌神经素素的非毒性成分)上和/或靠近蛋白酶敏感的位点引入Lys或Cys位点以便后续使用PEG或其它化学保护基和稳定基进行化学衍生化。
F.化学修饰的PAL变体
大分子的化学修饰可以以非特异性的方式进行(产生衍生化的种类的混合物)，或者以位点特异性的方式进行(基于组合使用定点诱变和化学修饰对野生型大分子的反应性引导的衍生化和/或位点选择性修饰)，或者使用表达的蛋白质连接方法进行(Hofmann等人，Curr OpinBiotechnol.13(4)：297-303(2002))。在一些实施方案中，利用化学修饰降低免疫原性。聚乙二醇化是已经证明的一种降低蛋白质免疫原性的方法(Bhadra等人，Pharmazie 57(1)：5-29(2002))，但是也可以使用糖基化和其它化学衍生化方法，使用磷酸化、酰胺化、羧化、乙酰化、甲基化、产生酸加成盐、酰胺、酯和N-酰基衍生物(Davis，Science 303：480-482(2004))。
聚乙二醇化的蛋白质
使用PEG化学试剂与PAL蛋白质的一定范围的比例对PAL进行一系列不同的聚乙二醇化反应将为每个修饰方法提供PEG-PAL衍生物。可以使用吸光度分析与PAGE和非变性凝胶分析的组合，基于对每个衍生化PAL种类获得的残余活性，确定PEG衍生化的程度，从而确定最佳的聚乙二醇化程度。在确定最佳修饰的起始范围后，最佳PEG-PAL种类的比较动力学分析(包括Vmax和Km测定、底物结合常数、蛋白水解稳定性、活性的pH依赖性、活性的温度依赖性)和免疫反应性可以通过ELISA、免疫沉淀法和Western印迹法确定。也可以使用最佳衍生化条件，利用蛋白质工程产生最有利于聚乙二醇化的PAL突变体；通过使PAL蛋白的大小为最小，并且只修饰PAL表面的抗原性最强的区域，PEG修饰的成本将会降低，同时保持最大的酶活性和最小的免疫原性。类似地，可以利用位点特异性聚乙二醇化提供酶衍生物。
Lys、Arg和Cys残基的其它化学修饰，如磷酸化或其它化学修饰，可以用来掩蔽免疫原性区和/或蛋白水解敏感区。这些化学修饰包括Bednarsaki的聚合物添加方法和Altus Corporation的交联方法，用于提高PAL稳定性、降低免疫原性和改善蛋白酶抗性，是代表性的实例。Bednarsaki证明了聚合物添加提高了蛋白质的温度稳定性(Wang等人，J.Am.Chem.Soc.114(1)：378-380(1992))，而Altus Corporation发现戊二醛交联提高了酶稳定性。
为了发现聚乙二醇化是否有益于蛋白质如PAL的体内治疗半衰期，合成了多种不同的PEG∶PAL偶联物，在体外表征，并且在体内检测L-Phe的降低。为了优化聚乙二醇化的潜在作用和鉴定PEG连接的优选位点，使用一种设计策略，其中聚合物的长度、构象和PEG连接程度变化。
制备本发明的聚乙二醇化PAL的方法通常包括以下步骤：(a)在允许PAL连接到一个或多个PEG基团上的条件下使PAL与聚乙二醇反应，和(b)获得反应产物。因为PAL修饰的具***点可能显著改变偶联物的固有活性，使用不同类型和量的PEG。用于PAL聚乙二醇化的化学方法是使用甲氧基-PEG的NHS-酯(O-[(N-琥珀酰亚胺基氧羰基)-甲基]-O′-甲基聚乙二醇)对PAL的伯胺的酰化。使用甲氧基-PEG-NHS或甲氧基-PEG-SPA的酰化产生了酰胺键，该酰胺键消除了原来伯胺上的电荷。
本方法提供基本同源的聚合物：蛋白质偶联物的混合物。本文使用的“基本同源的”是指只观察到聚合物：蛋白质偶联物分子。聚合物：蛋白质偶联物具有生物活性，并且此处提供的“基本同源的”聚乙二醇化PAL制剂的同源性足以显示同源制剂的优点，例如，在批间药代动力学的可预测性方面易于临床应用。
预期用于本文所述的聚乙二醇化方法的聚合物分子可以选自水溶性聚合物或其混合物。水溶性聚合物可以选自，例如，聚乙二醇、单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚合物、聚氧乙基化多元醇(例如，甘油)、HPMA、FleximerTM和聚乙烯醇、单-(C1-C10)烷氧基-PEG、芳氧基-PEG、三氟代乙烷磺酰单甲氧基PEG、PEG丙醛、二琥珀酰亚胺基碳酸酯PEG、纤维素或其它基于碳水化合物的聚合物。选择的聚合物应当是水溶性的，以使它所连接的蛋白质在水性环境如生理环境中不沉淀。聚合物可以是分支的或未分支的。在一些实施方案中，对于终产物制品的治疗应用而言，聚合物将是药学可接受的。
在一些实施方案中，本文使用的水溶性聚合物是聚乙二醇，缩写为PEG。本文使用的聚乙二醇意在包括已经用于衍生化其它蛋白质的任何形式的PEG，如单-(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇。
聚乙二醇分子与蛋白质分子的比例将变化，它们在反应混合物中的浓度也将变化。通常，最佳比例(在反应效率方面，没有过量的未反应蛋白质或聚合物)将根据选择的聚乙二醇的分子量和存在的可用反应基团(通常为ε氨基)的数目来确定。关于分子量，通常，使用的聚合物的分子量越高，可以连接到该蛋白质上的聚合物分子的数目越少。类似地，当优化这些参数时应当考虑聚合物的分支。通常，分子量越高(或者分支越多)，聚合物：蛋白质比例越高。本发明涉及几种不同的线性PEG聚合物长度，包括但不限于5kDa和20kDa，双臂分支的PEG聚合物的偶联物，包括但不限于10kDa和40kDa。在一些实施方案中，对于此处预想的聚乙二醇化反应，平均分子量是大约2kDa至大约100kDa(术语“大约”是指+/-1kDa)。在其它实施方案中，平均分子量是大约5kDa至大约40kDa。水溶性聚合物与PAL的比例范围通常是从单PEG的1∶1至二PEG的2∶1，等等。
实施例6至8描述了在12天的时期中，来自圆红冬孢酵母的赖氨酸突变体R91KPAL的聚乙二醇化和非聚乙二醇化形式、蓝细菌点形念珠藻产生的PAL(NpPAL)和蓝细菌多变鱼腥藻产生的PAL(AvPAL)对ENU2或BTBRenu2小鼠中的苯丙氨酸水平的影响。该动物模型在苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因座处是纯合突变体，产生具有严重高苯丙氨酸血症的动物。因此，高血浆苯丙氨酸(Phe)水平使该动物成为用于评价苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)降低血浆Phe的能力的合适的模型。也在12天的时期中评价赖氨酸突变体R91K PAL和NpPAL的聚乙二醇化和非聚乙二醇化形式对该PKU动物模型中苯丙氨酸水平的影响。这些结果表明，分别与非聚乙二醇化的NpPAL和AvPAL相比，NpPAL和AvPAL的聚乙二醇化形式在PKU动物模型中导致苯丙氨酸降低的更多。此外，聚乙二醇化的NpPAL使升高的苯丙氨酸水平降低的效应维持10周的一段时间。这些研究表明，来自蓝细菌点形念珠藻和多变鱼腥藻的PAL的聚乙二醇化是降低PKU小鼠中苯丙氨酸水平的关键。该发现提示，细菌PAL的聚乙二醇化变体可以作为控制PKU的有效治疗剂。
本发明涉及免疫原性降低的聚乙二醇化的PAL变体。一个实施方案是免疫原性降低的点形念珠藻PAL(NpPAL)变体的聚乙二醇化形式。另一个实施方案是免疫原性降低的多变鱼腥藻PAL(AvPAL)变体的聚乙二醇化形式。特定实施方案涉及NpPAL或AvPAL变体，其中通过NpPAL或AvPAL变体与水溶性聚合物例如聚乙二醇(PEG)反应实现聚乙二醇化。在一些实施方案中，通过NpPAL或AvPAL变体与PEG以至少1∶1、至少1∶1.5、至少1∶2、至少1∶3或至少1∶4的PAL∶PEG比例反应一次实现聚乙二醇化。在一个实施方案中，PAL变体是AvPAL变体，使用1∶3的PAL∶PEG比例实现聚乙二醇化。制备本发明的聚乙二醇化PAL变体的方法在上文描述。
本发明还涉及为了降低免疫原性，将聚乙二醇化的PAL变体再聚乙二醇化。在一些实施方案中，通过NpPAL或AvPAL变体与PEG反应两次或多次实现聚乙二醇化，每次聚乙二醇化的PAL∶PEG比例为至少1∶1、至少1∶1.5、至少1∶2、至少1∶3或至少1∶4。在一些实施方案中，通过NpPAL或AvPAL变体与PEG反应两次、三次、四次、五次或更多次实现聚乙二醇化，每次聚乙二醇化的的PAL∶PEG比例为至少1∶1、至少1∶1.5、至少1∶2、至少1∶3或至少1∶4。在另一个实施方案中，PAL变体是AvPAL变体，并且第一次和第二次聚乙二醇化反应都使用1∶3的PAL∶PEG比例实现聚乙二醇化。
制备本发明的再聚乙二醇化PAL变体的方法通常包括以下步骤：(a)在允许PAL变体连接一个或多个PEG基团上的条件下使PAL变体与聚乙二醇反应，(b)获得反应产物，(c)在允许聚乙二醇化PAL变体连接到未被步骤(a)中的PEG占据的位置处的一个或多个PEG基团上的条件下，使聚乙二醇化的PAL变体与聚乙二醇反应，和(d)获得反应产物。因为PAL修饰的具***点可能显著改变PAL变体的固有活性，使用不同类型和量的PEG。用于PAL聚乙二醇化的化学方法是使用甲氧基-PEG的NHS-酯(O-[(N-琥珀酰亚胺基氧羰基)-甲基]-O′-甲基聚乙二醇)对PAL的伯胺的酰化。使用甲氧基-PEG-NHS或甲氧基-PEG-SPA的酰化产生了酰胺键，该酰胺键消除了原来伯胺上的电荷。
G.选择和筛选试验
为了产生和筛选活性PAL或HAL变体，最初的突变体克隆表达可以使用任何已知的载体表达***，如His-标签载体表达***，以利于用于蛋白质变体分离的高通量金属螯合物纯化步骤。可以使用三阶段筛选***鉴定有利的蛋白质变体。最初的阳性克隆鉴定可以使用转化和对于在苯丙氨酸营养缺陷型大肠杆菌菌株中生长的选择。第二轮筛选可以采用适合高通量处理的OD290吸光度测量(Hodgins，Biochem.Biophys.Res.Commun.，32：246-253(1968))。最后，可以利用对蛋白水解抗性(采用在蛋白酶混合物存在下的温育)或免疫原性降低(采用竞争性ELISA检测)的筛选鉴定有利的蛋白质变体。
H.优化的PAL蛋白的治疗应用和施用
1.高苯丙氨酸血症(HPA)的各种形式
本发明涉及对多种HPA患者群体的治疗，使用的方法包括单独使用或与其它治疗方案联合使用PAL组合物，用于控制HPA和/或PKU。特别是，预期可以使用PAL组合物治疗苯丙氨酸浓度低到一般不使用饮食干预的患者群体(即，轻度HPA患者)、中度PKU患者、经典或严重PKU患者，和它们的任何亚群。适合用PAL组合物治疗以改善轻度HPA的这些患者包括血清浓度小于200μM的孕妇和婴儿。各种患者群体和他们的不同的治疗需要，在本部分中进一步详细描述。
本发明的某些实施方案涉及通过给个体联合施用蛋白质限制性饮食和含有PAL或其生物活性变体、突变体或片段的组合物治疗经典严重PKU，其中与不进行所述联合施用时的所述浓度相比，蛋白质限制性饮食和PAL的联合施用对降低所述个体血浆中的苯丙氨酸浓度是有效的。另外，本发明还涉及治疗患有HPA的孕妇，包括给该女性联合施用蛋白质限制性饮食和PAL或其生物活性衍生物，与不进行所述联合施用时的所述浓度相比，蛋白质限制性饮食和PAL的联合施用对降低所述孕妇血浆中的苯丙氨酸浓度是有效的。在特定实施方案中，治疗预期用于Phe水平显示大于420μM的的患者。
本发明的其它实施方案需要给在施用PAL之前血浆Phe浓度大于180μM的患有HPA的任何个体施用有效导致该患者血浆Phe浓度降低的量的PAL组合物。本发明的方法可用于使用本文所述的PAL组合物治疗以Phe浓度升高大于300μM为特征的患有PKU的婴儿。“婴儿”在本申请中是指年龄在0至大约36个月之间的患者。
严重经典PKU的特征及其治疗方法
严重PKU表现为血浆Phe浓度大于1200μM，并且发现可高达4800μM。患有该疾病的患者必须用不含Phe的饮食治疗，以使其血浆Phe浓度降至临床上可接受的水平(一般小于600μM或小于300μM)。这些患者每天只能耐受最大250-350mg的饮食(Spaapen等人，Mol.GenetMetab.78：93-99(2003))。这样，这些患者在出生后7-10天开始使用Phe-限制性制品，并且在其一生中受到饮食限制。任何减轻拖累这些个体的严格饮食限制都将是有益的。
用于诊断经典Phe的个体的试验在下面进一步详述。这些试验揭示了经典严重PKU患者需要低苯丙氨酸饮食(Lucke等人，Pediatr.Neurol.28：228-230(2003))。因此，预期本发明的方法将需要通过监测个体的血浆Phe浓度来确定该患者患有经典PKU。然后通过单独施用原核生物PAL组合物或者低蛋白质饮食和PAL的联合方案治疗该患者，使得患者的血浆Phe浓度至少降低25％。在一些实施方案中，该方法使血浆Phe浓度降低30％。在其它实施方案中，该方法使将产生个体血浆Phe浓度降低40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多(例如，在患有严重经典PKU的患者的Phe浓度为4800μM时，90％的Phe浓度降低将产生480μM的血浆Phe浓度，该浓度足够低，需要极少的饮食限制)。当然，应当理解本发明的治疗方法(无论是用于治疗严重经典PKU还是本文所述的其它任何HPA)应当试图将患者的血浆Phe浓度尽可能地降低至接近大约120μM至大约360μM±15μM范围的水平，或降至大约120μM至大约240μM的最佳范围。
在一些实施方案中，所治疗的经典PKU患者的血浆Phe浓度从大于1000μM的非限制血浆Phe浓度的任意量降至低于600μM的任一血浆Phe水平。当然，即使PAL治疗与蛋白质限制性饮食联合产生较低的血浆Phe浓度降低，例如，降至800μM至大约1200μM之间的水平，这也被看作临床上有用的治疗结果，因为血浆Phe浓度在该范围的患者可以通过简单地限制饮食中蛋白质的量来控制其疾病，而不是食用限制Phe的制品，从而明显改善个体生活质量，并使患者对饮食限制的顺应性更高。
如果治疗使得患者可以耐受的饮食Phe水平可以任意增加，则被认为是治疗有效的结果。例如，预期作为进行PAL治疗的结果，患者将能够使其饮食Phe摄入量从250-350mg/天提高到350-400mg/天(即，该患者的Phe耐受表型从经典PKU患者改变为中度PKU患者)。当然，希望本文公开的治疗性干预允许患者使其饮食Phe摄入量从250-350mg/天提高到大于400-600mg Phe/天(即，该患者的Phe耐受表型从经典PKU患者改变为轻度PKU患者)，或者在某些情况下，使患者的摄入量大于600mg Phe/天(即，正常饮食摄入量)。
BH4-非应答性PKU患者的特征及其治疗方法
可以用本发明的方法治疗的第二组患者是经测定具有升高的血浆Phe浓度，即，大于200μM的任何浓度，但是已经诊断为对BH4治疗为非应答性(通过以下所述的BH4负荷试验确定)的个体。这些患者可以包括患有轻度PKU(即，血浆Phe浓度最高达600μM)的个体、患有中度PKU(即，血浆Phe浓度介于600μM至大约1200μM之间)的个体，以及患有经典严重PKU(即，血浆Phe浓度大于1200μM)的患者。
向BH4治疗非应答性患者联合给予PAL和蛋白质的量减少的饮食，以降低该患者的血浆Phe浓度。本发明的方法使得，与不使用PAL治疗的情况下使用相同饮食方案导致的血浆Phe浓度降低相比，施用PAL导致患者血浆Phe浓度降低更多。饮食限制可以是通过提供具有减量的Phe的合成医用蛋白质制品限制Phe摄入量的饮食，或者饮食限制可以只要求患者限制其蛋白质总摄入量，而允许患者吃限制量的正常食品。
对于经典PKU患者讨论的治疗结果引入本部分作为参考。患有中度PKU的患者(即，具有600μM至1200μM的非限制血浆Phe浓度的患者)的治疗结果包括患者的血浆Phe浓度至少降低25％。在一些实施方案中，该方法将使血浆Phe浓度降低30％。在其它实施方案中，该方法将使个体血浆Phe浓度降低40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多(例如，在患有中度经典PKU的患者的Phe浓度为1000μM时，90％的Phe浓度降低将产生100μM的血浆Phe浓度，该浓度足够低，而不需要或只需要很少的饮食限制)。
在一些实施方案中，所治疗的中度PKU患者的血浆Phe浓度从600μM至1200μM之间的血浆Phe浓度的非限制任意量降至低于300μM的任一血浆Phe水平。在一个实施方案中，用PAL(单独地或与饮食限制联合)治疗产生血浆Phe浓度降低，例如，降至200μM至大约400μM之间的水平，该水平被看作临床上有用的治疗结果，因为血浆Phe浓度在该范围的患者可以通过简单地限制饮食中蛋白质的量来控制其疾病，而不是食用限制Phe的制品。实际上，许多研究教导这些患者甚至可以食用正常的饮食。
如果治疗使患者可以耐受的饮食Phe水平能够任意增加，则被认为是治疗有效的结果。例如，预期作为进行PAL治疗(单独地或与其它治疗性干预联合)的结果，患者将能够使其饮食Phe摄入量从350-400mg/天提高到400-600mg/天(即，该患者的Phe耐受表型从中度PKU患者改变为轻度PKU患者)。当然，希望本文公开的治疗性干预允许患者使其饮食Phe摄入量从350-400mg/天提高到大于600mg Phe/天(即，正常饮食摄入量)。
即使所治疗的患者只表现为轻度PKU，即，具有400-600mg Phe摄入量/天的饮食容许量，他也将受益于本发明的基于PAL的治疗，因为希望产生尽可能地接近360μM±15μM的正常血浆Phe浓度。对于这些患者，有利的治疗结果将包括患者血浆Phe浓度至少降低25％。在一个实施方案中，该方法使血浆Phe浓度降低30％。另一个实施方案中，该方法使个体血浆Phe浓度降低40％、50％、60％或更多(例如，在患有中度经典PKU的患者的Phe浓度为600μM时，60％的Phe浓度降低将产生360μM的血浆Phe浓度，即可接受的正常血浆Phe浓度)。
在一些实施方案中，所治疗的轻度PKU患者的血浆Phe浓度从400μM至600μM之间的血浆Phe浓度的非限制任意量降至低于100μM的任一血浆Phe水平。当然，即使PAL治疗(单独地或与饮食限制联合)使血浆Phe浓度降低的不那么显著，例如，降至200μM至大约400μM之间的水平，这也被看作临床上有用的治疗结果。
如果治疗使得患者可以耐受的饮食Phe水平可以任意增加，则被认为是治疗有效的结果。例如，预期作为进行PAL治疗(单独地或与其它治疗性干预联合)的结果，患者将能够从400-600mg/天提高其饮食Phe摄入量(即，该患者的Phe耐受表型从轻度PKU患者改变为轻度HPA患者)，以使该患者具有大于600mg Phe/天的摄入量(即，正常饮食摄入量)。
此外，即使患者只表现为非PKU HPA的症状，即，具有最高600μM的升高的血浆Phe浓度，但是允许食用正常的蛋白质饮食，他也将受益于本发明的PAL治疗，因为已经证明升高的Phe浓度对这些个体的IQ具有显著的效果。而且，如下文所述，对具有特殊需要的个体例如孕妇和婴儿的PAL治疗性干预是特别重要的，如果该患者的血浆Phe水平在被认为是“安全的”低于200μM的水平之内的话。
母源性PKU及其治疗方法
计划受孕和已经怀孕的PKU女性中血浆Phe水平的代谢控制是重要的，因为无论胎儿的PAH状态如何，在子宫内即使暴露于中度升高的Phe水平也会对胎儿造成严重的后果。血浆Phe浓度的治疗性控制在第一个妊娠期特别重要，因为如果不能充分控制将会导致包括小头畸形、心理缺陷和先天性心脏病等疾病。
例如，关于苯丙酮尿症的NIH Consensus Statement(vol 17#3，2000年10月)报道，胎儿暴露于3-10mg/dL的母亲Phe水平产生24％的小头畸形发病率，而暴露于大于20mg/dL(即，大于1200μM)具有73％的小头畸形发病率。同样，在暴露于大于20mg/dL的母亲Phe水平的儿童中有超过10％发现先天性心脏病。重要的是，已经注意到大于6mg/dL的Phe水平显著降低儿童的IQ。因此，必须确保患有各种形式苯丙酮尿症的女性(甚至表现最轻度HPA的女性)的血浆Phe浓度必须严格控制，以避免母源性PKU综合征的风险。但是，已经在美国诊所使用的、PKU女性可接受的目标血浆Phe浓度水平是在10mg/dL至15mg/dL的范围内，这大大高于为孕妇推荐的2-6mg/dL水平或在英国和德国诊所用来减少发生母源性PKU综合征的风险的1-4mg/dL。
对于孕妇，另一个重要的考虑因素是她们的蛋白质总摄入量。在怀孕期间，女性食用足够的蛋白质是重要的，因为在怀孕期间建议低蛋白质饮食将导致肾发育延迟和随后肾单位数的减少，并且可能在成年期导致高血压(D′Agostino，N.Engl.J.Med.348(17)1723-1724，(2003))。下表提供了对各种个体的推荐饮食蛋白质总摄入量的示例性指导。
表1：美国饮食蛋白质要求指导
 年龄  推荐蛋白质总摄入量(g)
  婴儿  6个月或以下   13
 6个月-1岁   14
 1-3岁   16
  儿童  4-6岁   24
 7-10岁   28
  男性  11-14岁   45
 15-18岁   59
 19-24岁   58
 25-50岁   63
 51+   63
  女性  11-14岁   46
 15-18岁   44
 19-24岁   46
 25-50岁   50
 51+   50
  怀孕   60
  哺乳   65
从以上的示例性指导中可以看出，在美国，为育龄期女性(例如，小于51岁)推荐的蛋白质摄入量为大约44-50g/天，而孕妇需要大约60g/天的推荐摄入器。在加拿大和英国，为孕妇推荐的蛋白质摄入量在大约70g/天和52g/天的数量级中。因此，这组PKU患者比年龄相当的非妊娠PKU女性需要更多的蛋白质这一事实使得确保孕妇的血浆Phe浓度水平被紧密控制的需要进一步复杂化。
鉴于以上所述，预期本发明的PAL治疗对孕妇将特别有用。预期已怀孕或打算怀孕的患有任何HPA形式的女性将置于PAL治疗过程中，以确保她的血浆Phe浓度水平保持在尽可能地接近180μM至大约360μM。这种治疗过程将使该女性能够提高她的正常蛋白质摄入水平。
本文前面所述的关于血浆Phe浓度水平和这种Phe浓度应当降至的程度的讨论，引入关于孕妇的本部分中。
控制婴儿中的PKU及其治疗方法
如本文全文所述，已经确定了婴儿(年龄为0-3岁)中血浆Phe浓度的升高导致儿童的IQ显著下降。但是，如说明书其它部分已经描述的，血浆Phe浓度升高可达400μM的患者一般不接受任何饮食干预。因此，现有治疗对0-3岁的婴儿有显著不良影响。本申请涉及用含有PAL的治疗性组合物治疗具有大于360μM±15μM的非限制血浆Phe浓度的任何婴儿，以使个体血浆Phe浓度有益地降低。
在一些实施方案中，婴儿为0-3岁并且在PAL施用之前具有大约1200μM的非限制的血浆Phe浓度，并且所述施用降低血浆Phe浓度。在一个实施方案中，施用后血浆Phe浓度从大于1800降至大约1500μM、大约1200μM、大约1100μM、大约1000μM、大约900μM、大约800μM、大约700μM、大约600μM、大约550μM、大约500μM、大约450μM、大约400μM、大约350μM、大约300μM、大约275μM、大约250μM。在其它实施方案中，婴儿为0-3岁并且具有大于1200μM的非限制的血浆Phe浓度，在单独施用或与饮食联合施用PAL后，该血浆Phe浓度降至大约800μM、大约500μM或大约360μM。本领域技术人员应当理解，本发明涉及用PAL治疗具有大于360μM的非限制血浆Phe浓度的婴儿，以产生这种血浆Phe浓度的降低。上文中关于血浆Phe浓度治疗性降低的讨论引入本部分作为参考。此外，使初始非限制血浆Phe浓度降低超过10％的任何降低将被认为是婴儿治疗方案的治疗结果。应当理解，PAL治疗可以与饮食限制联合使用，以实现这些婴儿的血浆Phe浓度的治疗性降低。
表2列出了几个疾病状况，其中施用治疗有效量的PAL将是有益的。肠胃外、口服或其它标准给药途径和剂量可以使用标准方法加以确定。
表2：适合PAL蛋白质治疗的示例性疾病状况
  苯丙酮尿症
  高苯丙氨酸血症
  酪氨酸血症
  癌症
2.用于治疗的组合物
本发明涉及PKLVHPA的治疗性干预。这种干预最初基于PAL的使用，它可以单独使用或与饮食限制联合使用。此外，PAL和/或饮食限制还可以与其他治疗组合物联合，所述组合物设计成用于例如对抗PKU的其它表现，例如大的中性氨基酸以阻止Phe在脑中的积累(参见Koch等人，Mol.Genet.Metabol.79：110-113(2003))，或联合补充酪氨酸。本部分提供了关于可用于本文预期治疗的组合物的讨论。
PAL组合物
本发明涉及药物组合物，其包括治疗有效量的本发明的蛋白质或衍生产物组合物以及药学上可接受的稀释剂、稳定剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。这种药物组合物包含各种缓冲液内容物(例如Tris-HCl、磷酸盐)、pH和离子强度的稀释剂；添加剂如去污剂和增溶剂(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)，抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)，防腐剂(例如Thimerosol、苯甲醇)和填充物(例如乳糖、甘露醇)；参见，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版(1990，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.)第1435：1712页，其在此通过引用并入本文。活性成分的有效量是治疗、预防或诊断有效量，其可由本领域技术人员考虑如体重、年龄和治疗目标等因素后容易地确定。
本发明的PEG∶PAL组合物也可以包含缓冲剂以维持溶液pH在所需范围内。缓冲剂的例子包括乙酸钠、磷酸钠和柠檬酸钠。还可以使用这些缓冲剂的混合物。组合物中有效的缓冲剂量主要取决于使用的具体缓冲液和溶液pH。例如，乙酸盐是在pH 5时比在pH 6时更有效的缓冲液，所以在pH 5时可以比在pH 6时使用更少的乙酸盐。在一个实施方案中，本发明的组合物的pH范围是pH 3.0-7.5。
本发明的药物组合物还可以包括等渗调节剂，以使溶液等渗并且更适合于注射。一个例子是在0-150mM浓度范围内的氯化钠。最优选的试剂是在130-150mM浓度范围内的氯化钠。
如本文使用的，当涉及PEG∶PAL偶联物时，术语“治疗有效量”是指能够降低血清L-苯丙氨酸对患者有益的的量。该量将随个体而变化，并且将取决于多种因素，包括患者的身体总体状况。用于治疗的PAL的量使血清L-苯丙氨酸以可接受的速率降低，并且使该值保持在有益的水平上(通常至少大约30％，一般在10％至50％的范围内)。本发明的组合物的治疗有效量可以由本领域技术人员利用公开获得的材料和程序容易地确定。
本发明提供比天然PAL频率更低地施用PEG∶PAL偶联物。给药频率将根据接受治疗的疾病而改变，但通常是约每周一次。应理解实际使用的给药频率可能与本文公开的频率略微不同，这是由于不同个体对PEG∶PAL偶联物的应答存在差异；术语“约”旨在反映这种差异。
因此本发明可用于降低血清L-苯丙氨酸水平。最常见的，血清L-苯丙氨酸水平由于高苯丙氨酸血症而升高。在可用本发明治疗的疾病中包括与苯丙酮尿症相关的高苯丙氨酸血症。可以治疗可能导致血清L-酪氨酸水平升高(如在酪氨酸血症中所见)的疾病。另外，对于许多癌症相关疾病，降低血清L-苯丙氨酸和/或血清L-酪氨酸水平是有益的，也可以用本发明的PEG∶PAL偶联物进行治疗。
在一个实施方案中，根据本发明制备的PEG∶PAL偶联物通过肠胃外、皮下或肌肉内注射施用。但是，本领域技术人员应清楚其他递送途径也可有效用于本发明的组合物。
本文描述的方法使用药物组合物，其包含如上所述的分子，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂或运载体，和任选的其他治疗和/或预防成分。这类赋形剂包括液体诸如水、盐水、甘油、聚乙二醇、透明质酸、乙醇、环糊精、修饰的环糊精(即磺丁基***环糊精)等等。用于非液体制剂的合适赋形剂也是本领域技术人员已知的。
药学上可接受的盐可用于本发明的组合物，包括例如无机酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等等；和有机酸盐如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等等。关于药学上可接受赋形剂和盐的深入讨论可以获自Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版(Easton，Pennsylvania：MackPublishing Company，1990)。
此外，这类运载体中还可以存在辅助物，如湿润剂或乳化剂、生物缓冲剂、表面活性剂等等。生物缓冲剂实际上可以是任意溶液，其是药理学上可接受的，并为制剂提供所需pH，即生理可接受范围内的pH。缓冲液的实例包括盐水、磷酸缓冲盐溶液、Tris缓冲盐溶液、Hank′s缓冲盐溶液等等。
取决于预期施用方式，药物组合物可以采用固体形式、半固体或液体剂型，例如片剂、栓剂、丸剂、胶囊、粉剂、液体、悬浮剂、乳剂、软膏、洗剂等等，在一些实施方案中，采用适于精确剂量单次施用的单位剂型。所述组合物将包括有效量的选择的药物以及药学上可接受的载体，此外，可以包括其他药剂、佐剂、稀释剂、缓冲液等等。
通常，本发明的化合物或偶联物将作为药物制剂施用，包括那些适于口服(包括口腔和舌下)、直肠、鼻、局部、肺部、***或肠胃外(包括肌内、动脉内、鞘内、皮下和静脉内)施用或采用适于通过吸入或吹入施用的制剂。一种示例性的施用方式是使用方便的每日静脉内给药方案，其可以根据患病程度进行调整。
对于固体组合物来说，常规的无毒固体载体包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等等。药学上可施用的液体组合物可以例如通过将本文描述的活性化合物或偶联物和可选的药物佐剂在赋形剂(如水、盐水、水性葡萄糖、甘油、乙醇等等)中溶解、分散等等，从而形成溶液或悬液来制备。如果需要，待施用的药物组合物还可以包含微量的无毒辅助物如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、增强剂(tonicifying agents)等等，例如乙酸钠、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、油酸三乙醇胺酯等等。制备这类剂型的实际方法对本领域技术人员来说是已知的，或对他们来说是显而易见的；例如，参见上文引用的Remington′s Pharmaceutical Sciences。
对于口服施用来说，组合物通常采用片剂、胶囊或软胶囊的形式，或可以是水性或非水性溶液、悬液或糖浆。片剂和胶囊是优选的口服给药形式。用于口服使用的片剂和胶囊通常包括一种或多种常用的载体诸如乳糖和玉米淀粉。通常还添加润滑剂，诸如硬脂酸镁。当使用液体悬液时，活性剂可以与乳化剂和悬浮剂组合。如果需要，还可以添加调味剂、着色剂和/或甜味剂。用于掺入本文口服制剂的其他可选组分包括但不限于防腐剂、悬浮剂、增稠剂等等。
肠胃外制剂可以制备为常规形式，作为液体溶液或悬液，适于注射前在液体中溶解或悬浮的固体形式，或作为乳液。在一个实施方案中，利用合适的载体、分散剂或湿润剂和悬浮剂，根据本领域已知的技术配制注射用无菌悬液。注射用无菌制剂还可以是溶于无毒肠胃外可接受稀释剂或溶剂的注射用无菌溶液或悬液。可使用的可接受的赋形剂和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌、非挥发油、脂肪酯或多元醇通常被用作溶剂或悬浮介质。此外，肠胃外给药可以包括使用缓释或持续释放***，以维持剂量的恒定水平。
可以给患者施用治疗有效剂量的上述PEG∶PAL偶联物以治疗或缓解心血管疾病。在细胞培养物或实验动物中通过标准药学方法可以测定这种偶联物的毒性和治疗效果，例如通过测定LD50(50％群体的致死剂量)和ED50(50％群体的治疗有效剂量)。毒性和治疗效果的剂量比例是疗效指数，其可以表示为LD50/ED50的比例。在一些实施方案中使用显示高疗效指数的偶联物。
从细胞培养物分析和动物研究中获得的数据可用于配制给人使用的剂量范围。在一些实施方案中，剂量处于循环浓度范围内，其包括具有最低或者最小毒性的ED50。该剂量可以在该范围内变化，这取决于使用的剂型和使用的给药途径。可以从细胞培养物分析和动物模型确定治疗有效的剂量。
饮食蛋白质
除了给HPA/PKU患者施用PAL和相关的类似物外，还预期可以限制或改变患者的饮食蛋白质。本领域技术人员清楚用于治疗PKU的各种商品化供应的蛋白质制品。这类制品包括MAXIMAID、PHENEX 1、PHENEX2(Ross Laboratories，Liverpool，UK)、LOFENALAC、PHENYL-FREE(Mead-Johnson)等等。
本领域技术人员可以使用提到的蛋白质制品，其通常不含Phe浓度。所述蛋白质制品中经常添加PKU患者缺乏的氨基酸。这些氨基酸包括例如L-酪氨酸和L-谷氨酰胺。已经提出，可能希望向PKU患者的饮食中补充缬氨酸异亮氨酸和亮氨酸(参见美国专利4,252,822)。在某些临床表现中，PKU的毒性作用是由Phe阻断脑摄取其它氨基酸如酪氨酸和色氨酸而引起的。已经发现向PKU患者的饮食中补充过量的这些大中性氨基酸阻断了Phe向脑中的摄取并且降低了脑Phe水平。因此，预期对于本发明的方法而言，饮食方案可以进一步补充含有一种或多种这些氨基酸的组合物(Koch等人，Mol.Genet.Metabol.79：110-113(2003))。
此外，除了蛋白质限制外，众所周知还应提供L-肉碱和牛磺酸(通常发现于人乳和动物来源的其他食品)。在一些实施方案中，L-肉碱可以作为20mg/100g的蛋白补充剂提供，牛磺酸可以作为40mg/100g的蛋白质补充剂提供，以帮助提供这些因子通常存在于人乳和动物来源食品中的量。
此外，本领域技术人员可以查阅2000年国家科学院-国家研究委员会饮食参考摄取量(2000National Academy of Sciences-National Research CouncilDietary Reference Intakes)关于其他组分的进一步列表，如必需维生素和矿物质，这些应提供给患者以确保除了饮食蛋白质限制外提供其他补充剂。
根据上文关于总蛋白质量和优选血浆Phe浓度的讨论，本领域技术人员将能确定需要的饮食蛋白质限制的量，进而相应地调节患者的饮食。例如，大约11-14岁的男性应当接受45g蛋白质/天。在个体患有严重经典PKU时，其非限制的血浆Phe浓度可能大于1200μM，并且该个体的饮食蛋白质来源的大部分(如果不是全部的话)可能来自于粉末蛋白质补充物，该补充物可使其血浆Phe浓度降至小于600μM。通过对该个体施用PAL，治疗结果将是产生患者血浆Phe浓度的更大的降低，或者，治疗结果是个体的血浆Phe浓度降至相似的程度，但是个体能够耐受来自正常饮食而不是饮食制品的蛋白质。
类似地，对于患有中度PKU的大约11-14岁的男性，可以使用本发明的方法通过正常蛋白质摄取而不是通过限制制品，分批给予45g蛋白质/天。确定本发明的方法是否有效将需要定期确定患者的血浆Phe浓度，以确保血浆Phe浓度保持低于至少400μM。确定这种浓度的试验在下文描述。在一些实施方案中，达到小于或大约360μM的浓度。
3.鉴定和监测患者群体
如本文自始至终所讨论的，在本发明的各种实施方案中需要确定具体患者是否对PAL治疗产生应答，并在开始鉴定所治疗的PKU患者类别和治疗方案进行期间确定患者的苯丙氨酸浓度，以监测所述方案的效果。示例性的这类方法在下文描述。
BH4负荷试验
BH4负荷试验允许区别BH4缺乏导致的HPA或由于PAH缺乏导致的HPA的患者。
最简单的BH4负荷试验是施用外源BH4，并确定这种施用对血浆Phe浓度降低的影响。静脉内加载2mg/kg BH4最早由Danks等人，Lancet1：1236(1976)提出，由于已经可以获得更高纯度的BH4，因此能够利用口服大约2.5mg/kg体重的量的BH4进行该试验。最后，标准化的方法由Niederwieser等人提出，在该方法中施用7.5mg/kg单口服剂量的BH4(Niederwieser等人，Eur.J.Pediatr.138：441(1982))，尽管有些实验室仍然使用20mg BH4/kg体重以上的量。
为了使简单的BH4负荷试验产生可行的结果，患者的血液Phe水平需要高于400μM。因此，在进行负荷试验前该患者通常不进行PKU饮食两天。BH4检测试剂盒从Schircks Laboratories博士(Jona，Switzerland)处获得。该试剂盒推荐在摄入正常膳食后大约30分钟20mg BH4/kg体重的剂量。
Phe浓度的测定
有大量的方法用于确定血液中Phe的存在(Shaw等人，AnalyticaiMethods in Phenylketonuria-Clinical Biochemistry，In Bickett等人.Eds.，Phenylketonuria and Some Other Inborn Errors of Amino Acid Metabolism，Stuttgart，Georg Thiem Verlag，47-56(1971)。一般来说，使用荧光测定从患者的血清确定苯丙氨酸和酪氨酸浓度。该测定依赖于在亮氨酰丙氨酸存在下苯丙氨酸与茚三酮加热时荧光物质的形成(McCaman等人，J.Lab.Clin.Med.59：885-890(1962))。
最常用的测定Phe浓度的方法是Guthrie试验，其中从已经用患者的血样饱和的滤纸上穿孔圆盘。均匀的圆盘在已经接种了枯草芽孢杆菌并且含有枯草芽孢杆菌生长的特异性抑制剂的琼脂盘上温育。由于苯丙氨酸从均匀的圆盘上转移到琼脂上，Phe逆转了细菌生长的抑制，从而产生细菌生长区，通过与使用含有已知Phe量的圆盘进行的类似试验相比较，该生长区可能与苯丙氨酸浓度相关。
其它定量Phe浓度的方法包括HPLC、质谱法、薄层层析等。这些方法可以用来确定治疗前患者的血浆Phe浓度，以及监测治疗方案过程中的Phe浓度，以确定其有效性。
预期在治疗方案的整个时程中以方便的间隔监测患者的血浆Phe水平(例如，每日、每隔一日或每周)。通过这样定期地监测血浆Phe水平，医生将能够评价治疗的效果以及相应地调整PAL和/或饮食蛋白质的要求。
4.联合治疗
本发明的某些方法包括联合使用PAL和限制蛋白质饮食，以在患有各种形式的HPA的患者中达到治疗结果。为了在本文预期的联合治疗中达到适当的治疗结果，通常可以给个体施用有效产生所需治疗结果(即，血浆Phe浓度的降低和/或耐受更大量Phe/蛋白质摄入而不产生伴随的血浆Phe浓度升高的能力)的组合量的PAL组合物和饮食限制。该方法可以包括同时施用PAL组合物和饮食蛋白质治疗组合物。这可以通过施用一种组合物或药理学蛋白质制剂而实现，其中包括所有的饮食蛋白质需求并且也包括所述蛋白质制剂内的PAL。或者，在与PAL的药物制剂(片剂、注射剂或饮剂)大约相同的时间使用饮食蛋白质(补充或正常蛋白质膳食)。PAL也可以配制为蛋白质条或其它适合摄入的食品，如核仁巧克力饼(brownies)、薄烤饼、蛋糕。
在其它方案中，PAL治疗可以在饮食蛋白质治疗之前或之后，其间隔从数分钟到数小时。在蛋白质和PAL组合物分开施用的实施方案中，通常要确保在每次递送时间之间，相当一段时间没有到期，使得PAL仍然能够对患者发挥有利的作用。在这些情况下，预期将在饮食蛋白质摄入的2-6小时内(之前或之后)施用PAL，只延迟大约1小时。在一些实施方案中，预期PAL治疗是连续治疗，其中不确定地对患者施用每日PAL剂量。在其它情况下，例如对于只有较轻形式的PKU和HPA的孕妇，可能只继续PAL治疗，只要该女性怀孕和/或哺乳。
此外，除了仅基于PAL递送和饮食蛋白调节的治疗以外，本发明的方法还涉及与第三组合物的联合治疗，该第三组合物特异性针对HPA的一个或多个症状。例如，已知HPA引起的酪氨酸缺乏导致神经递质多巴胺和血清素的缺乏。因此，在本发明中，预期基于PAL和饮食蛋白质的方法可以进一步与L-多巴、卡比多巴和5-羟色氨酸神经递质联合，以改正饮食中酪氨酸量降低引起的缺陷。
由于PAL施用不产生酪氨酸(不同于PAH的施用)，这种治疗仍将导致酪氨酸是这些患者的必需氨基酸。因此，对于接受PAL和BH4联合治疗的患者来说，在饮食中补充酪氨酸可能是需要的。
I.PAL同源物的筛选和表征
本发明的另一方面是用于鉴定能够阻止、改善或降低升高的苯丙氨酸水平的细菌PAL的筛选试验，包括使含有升高的苯丙氨酸水平的细菌与细菌PAL接触，并确定细菌PAL是否降低这种升高的苯丙氨酸水平。在某些实施方案中，该方法是一种高通量分析。在一个实施方案中，对细菌种的完整基因组进行测序，并使用生物信息学方法针对PAL同源物的存在进行筛选。在另一个实施方案中，鉴定与encP具有同源性的基因，并进行相关蛋白质序列的BLAST分析，以确定同一性百分比。对于PAL活性必需的保守残基的存在，评价这些蛋白质的一级序列比对。所有HAL酶的第83位(来自恶臭假单胞菌的HAL)是组氨酸，而在具有PAL活性的酶中它是一种脂族氨基酸，例如，亮氨酸或缬氨酸。第83位的分析将阐明HAL注释的酶是否可能错误标记并且具有实际证明的PAL活性。例如，在大多数HAL酶中第413位是谷氨酰胺(Q)，接下来在所有HAL酶中在第414位是谷氨酸(E)。通过比较，在迄今鉴定的大多数PAL酶中，第414位是谷氨酰胺(Q)，接下来在第415位是天冬氨酸(D)或天冬酰胺。通过这种生物信息学方法确定为最有可能错误标记为原核生物PAL酶的代表性注释HAL酶包括来自球形红杆菌(Rhodobactersphaeroides)2.4.1(ZP 00005404)、来自Rubrobacter xylanophilusDSM9941(ZP 00188602)、来自发光光杆状菌LaumondiiTT01亚种(Photorhhabdus luminescens subsp.LaumondiiTT01)(NP 930421)、来自腾冲嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)(AA051415)的HAL酶。
在进一步的实施方案中，证实了这些同源物的蛋白质产物的PAL催化活性。在另一个实施方案中，将PAL同源物的基因组PCR扩增并克隆到pHIS8或类似载体中。推断的PAL蛋白在大肠杆菌中异源表达为His-标记的蛋白质，纯化并测定其PAL活性。PAL活性测定可以包括但不限于，在体外将苯丙氨酸转化为肉桂酸盐的能力，在体外不能将酪氨酸转化为对-香豆酸酯，检测HAL活性的试验，和表征该酶的动力学的试验。
J.原核生物PAL的生成
本发明的另一方面是一种生成原核生物PAL的方法。在一个实施方案中，重组PAL在诸如大肠杆菌BL21(DE3)/pLysS(Invitrogen)的载体中作为N-末端八组氨酰标记的融合蛋白过量表达，该载体具有例如可用IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导的诱导型启动子。在另一个实施方案中，重组PAL在不含N-末端标签的大肠杆菌BL21(DE3)/pLysS细胞中过量表达。用于生物反应器/发酵罐的种子培养物在摇瓶中从甘油贮存物生长。然后将这种种子培养物以补料分批模式加入受控生物反应器中。然后补充葡萄糖，并用碱(NH4OH)调控pH，搅拌可达1200rpm。添加O2保持大于20％的溶解氧。细胞在30℃温度下生长，直至达到OD600为70-100(约22-25小时)，然后用0.4mM IPTG诱导。使温度降至22-26℃，培养直至活性变化＜0.1IU/ml(大约40-48小时，OD600通常为200)。细胞培养基通常成分确定，并且由酵母提取蛋白、蛋白胨-胰蛋白胨、葡萄糖、甘油、酪蛋白氨基酸、痕量盐和磷酸缓冲盐组成。重组PAL产物在细胞内产生而不分泌。通过连续离心(Alfa-Laval、Carr、Ceba或等同设备)收集细菌。
K.原核生物PAL的纯化
本发明的另一方面描述一种纯化原核生物PAL或其生物活性片段、突变体、变体或类似物的方法。根据第一个实施方案，将转化的细胞群培养和裂解，产生粗重组酶。通常将外源性材料与粗制物分离以免弄脏柱子。利用一种或数种层析树脂进行层析纯化。随后，用设计成能在较长时间提供稳定活性的缓冲液配制纯化的蛋白质。在另一优选的实施方案中，纯化细菌PAL的方法包括：(a)利用压力匀浆器裂解包含重组PAL的细菌(但还可以通过其他物理方式如玻璃珠裂解)；(b)热处理；(c)利用第二次连续离心步骤和/或深层过滤净化该裂解物(例如用Cuono Zeta Plus或Maximizer，PallFiltron，或Millipore Millistak或Opticao滤器)；(d)通过木炭过滤步骤(例如用Millipore Millistak 40AC)；(e)通过最终过滤步骤(例如用SartoriousSartopore 0.2μm滤器)；(f)通过丁基疏水相互作用层析(例如用TosohBiosciences的Toyopearl Butyl 650M)；(g)通过Q离子交换柱(例如用BioRad的Macroprep High Q)；和(h)利用切向流过滤通过缓冲液交换回收终产物(例如用Sartorious Hydrosart或PES 100kDa膜)。本领域技术人员很容易理解，在本发明范围内层析步骤中的一个或多个可以省略或替换，或层析步骤的顺序可以改变。最终，可以按照要求进行合适的灭菌步骤。
现在已经大致描述了本发明，通过参考下列实施例可以更容易地理解本发明。提供这些实施例只是为了说明目的，而不是用于限制本发明的范围。已经尽力确保所使用的数字(例如量、温度等等)的准确性，但一些实验误差和偏差显然应当是允许的。
实施例1
点形念珠藻和多变鱼腥藻PAL的克隆
DNA操作
点形念珠藻基因组DNA购自ATCC(29133D)，并使用5′-C ACTGTCATATGAAT ATAACATCTCTACAACAGAACAT-3′(SEQ ID NO：12)和5′-GACAGTGGCGGCCGCTCACGTTGACTTTAAGCTCGAAAAAATATG-3(SEQ ID NO：13)PCR扩增PAL基因(ZP_00105927)。产生的PCR产物用NdeI和NotI消化，将1.7kb片段分别连接到有N-His标签和没有标签的pET-28a(+)和pET-30a(+)(Novagen)内。
多变鱼腥藻细胞购自ATCC(29413)。提取基因组DNA(Qiagen)，通过SOE-PCR扩增PAL基因(YP_324488)以除去NheI位点。使用引物1(5′-CACTGTGCTAGCATGAAGACACTATCTCAAGCACAAAG-3)(SEQ IDNO：14)和引物2(5′-GGAAATTTCCTCCATGATAGCTGGCTTGGTTATCAACATCAATTAGTGG-3′)(SEQ ID NO：15)扩增核苷酸1-1190，并使用引物3(5′-CCACTAATTGATGTTGATAACCAAGCCAGCTATCATGGAGGAAATTTCC-3)(SEQ ID NO：16)和引物4(5′-CACTGTGCGGCCGCTTAATGCAAGCAGGGTAAGATATCTTG-3)(SEQ ID NO：17)扩增核苷酸1142-1771。组合这两个PCR产物，以使用引物1和4扩增全长基因。产生的PCR产物用NheI消化，用Klenow(NEB)平端化，然后用NotI消化。将1.7kb片段连接到pET-28a(+)和pET-30a(+)(Novagen)中。
细菌菌株和培养条件
大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Stratagene)用pGro7(TaKaRa)转化，感受态BL21(DE3)pGro7细胞通过Inoue法准备(Sambrook和Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，2001))。这些细胞用pET-28-NpPAL转化，并在25ml含有50mg/L卡那霉素和20mg/L氯霉素的LB中37℃培养过夜。将20毫升这种培养物接种到1L含有卡那霉素、氯霉素和500mg/L L-***糖的LB培养基中，并于37℃生长。在OD600为0.6时，将培养物在冰上冷却。5分钟后，培养物用0.3mM IPTG诱导，并于20℃生长16小时。离心收集细胞。
BL21(DE3)pLysS细胞(Stratagene)用AvPAL转化，并且除了不使用***糖诱导外，与NpPAL相同地培养。
实施例2
NpPAL和AvPAL的纯化
培养物在台式离心机中以5,000g离心20分钟，并弃去上清液。细胞沉淀物在进一步处理之前一般冷冻于-70℃。融化后，细胞沉淀物在TBS(25mM Tris，150mM NaCl，pH 7.8)中悬浮至大约80光密度单位(600nm)。使细胞在12-14,000psi下两次通过APV压力匀浆器裂解。然后于55℃热处理粗裂解物2小时。裂解物以10,000g离心30分钟，保留上清液，并使用0.2μm真空滤器(Corning)过滤。
经序贯通过丁基650M柱(Tosoh BioSciences)和MacroPrep High Q柱(BioRad)，从澄清的裂解物中纯化PAL。通过SDS PAGE和反向HPLC确定，洗脱的产物显示高水平的纯度。
实施例3
聚乙二醇化PAL变体的生成
蛋白质的聚乙二醇化
聚乙二醇化采用文献方法的改良(Hershfield等人，(1991)同上；美国专利6,057,292；Lu等人，Biochemistry 40(44)：13288-13301(2001)；Nektar Therapeutics，2003年目录)。活化的PEG包括线性PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯(mPEG-SPA，MW 5kDa或MW 20kDa)和枝化PEG羟基琥珀酰亚胺(mPEG2-NHS酯，MW 10kDa或MW 40kDa)，这两个都在一端用甲氧基封端，并且可从Nektar Therapeutics获得；通常需要实验确定最佳聚乙二醇化的蛋白质(Veronese，F.M.等人，J.Bioactive Compatible聚合物s 12：196-207(1997))。最佳聚乙二醇化条件使用不同的PAL∶PEG比例(考虑蛋白质的摩尔比以及每个蛋白质单体中的赖氨酸数目)、不同的pH、不同的缓冲液、不同的温度和温育时间来确定。高PAL蛋白质∶PEG衍生化比例是必要的，因为天然PAL具有大量的赖氨酸(每个圆红冬孢酵母(Rt)和多变鱼腥藻(Av)单体分别为29和18个)，并且因为未修饰的PAL在小鼠中反复注射后显示免疫反应性，并且因为裸(野生型)PAL在接触蛋白酶后快速灭活。通过在-20℃冷冻终止聚乙二醇化反应，并通过SDS-PAGE、MALDI-TOF质谱法、活性评估、蛋白水解敏感性和免疫反应性分析样品。
在活性、蛋白水解和免疫评估之前，为了除去过量的未反应的PEG，使用Tube-O-透析器(GenoTechnology)在搅拌和4℃下用pH 8.5的0.05M磷酸钾缓冲液透析反应物过夜。使用NI蛋白质测定试剂盒(GenoTechnology)确定蛋白质浓度后，如前所述，使用标准反应条件对未衍生化的和PEG衍生化的PAL样品进行PAL活性测定。在体外表征后，使用PKU小鼠模型对最有希望的聚乙二醇化的治疗候选物进行体内试验。
表征
对于未修饰的蛋白质样品，使用PAL在280nm的消光系数(对于RtPAL和AvPAL分别为0.5和0.83mg mL-1cm-1)确定蛋白质浓度，对于聚乙二醇化的蛋白质样品，使用NI蛋白质分析(GenoTechnology)计算浓度，包括经处理除去了可能干扰精确蛋白质浓度测定的非蛋白质污染物的样品。
PEG-PAL产物使用MALDI-TOF MS表征，以确定连接到每个PAL单体上的PEG分子数，以及使用活性评估和SDS-PAGE和非变性凝胶分析来表征，以分别确定活性的保留、完全衍生化和四聚体PAL形成没有损失。对于PAL和PEG-PAL样品，MALDI-TOF质谱分析需要使用0.5M尿素或0.025M盐酸胍来改善亚单位解离和种类检测的可再现性。
PAL活性测定
PAL活性测定使用Cary紫外分光光度计(Cary 50)在动力学模式下进行。在室温下(25℃)通过290nm处吸光度的增加来监测反式肉桂酸盐的产生，从而分析PAL对L-苯丙氨酸底物的活性(Hodgins，(1968)，同上)。反式肉桂酸在290nm处的摩尔消光系数为10.2381升M-1cm-1。反应混合物在100mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.5中含有22.5mM苯丙氨酸。对于标准测量，最终酶浓度为0.0035mg/mL，但是对于动力学研究，调整该测定中的酶浓度以使每分钟290nm处的斜率在0.005至0.02的范围内。活性数据表示为比活性(μmol×min-1mg-1。一单位的PAL被定义为在室温下每分钟产生1μmol反式肉桂酸的酶量。
实施例4
体外半衰期和免疫原性的检测
生化表征后，使用三种不同的和互补的技术(Western印迹法、ELISA和免疫沉淀法(IP))，针对对于由注射天然PAL(非聚乙二醇化)的PKU小鼠产生的抗体的免疫反应性，筛选最有希望的PEG-PAL候选物。
对于Western印迹分析，PAL抗血清(来自注射天然PAL的小鼠)以1∶10,000的稀释度使用。作为阴性对照，来自缓冲液处理的小鼠的血清也以相同的稀释度使用。第二抗体，碱性磷酸酶偶联的山羊抗小鼠IgG(Promega)，稀释至1∶5,000，并且使用AP底物Western Blue(Promega)显色。ELISA检测使用Nunc/Immuno Maxisorp板(Nalge NuncInternational)按照标准程序进行，其中使用1mg/mL PAL的PBS溶液，并用PBS，0.05％Tween-20，2％BSA封闭。小鼠抗血清(来自接触天然PAL的小鼠)在EB封闭溶液(PBS，0.05％Tween-20，2％BSA)中1∶10,000稀释，HRP-山羊抗小鼠IgG用作第二抗体，TMB用于在450nm处检测。
使用免疫沉淀法检测PAL抗体结合。蛋白质样品(PAL或聚乙二醇化的PAL)在TTBS缓冲液(含0.1％Tween的Tris缓冲盐水)中温育，在加入抗体样品之前测定PAL活性。每个样品与8倍过量的阳性对照抗PAL血清一起温育，使用非免疫小鼠血清进行重复的阴性对照反应。温育后，根据珠子的小鼠IgG结合能力，添加过量的蛋白G Sepharose 4(50％，v/v)，在旋转条件下将样品再在4℃温育过夜。离心回收上清液，测定上清液中各个样品的PAL活性。不丢弃珠子沉淀物，使得能够通过Western印迹法进行进一步的分析。为了证实发生了抗体-珠子结合，利用Western印迹法检测珠子上的PAL抗原。PAL结合步骤后通过离心回收的珠子用TTBS和TBS缓冲液洗涤数次。这些漂洗后，向珠子中添加SDS-PAGE加样缓冲液，并且于95℃加热样品5分钟。然后使用PAL抗血清通过Western印迹法分析样品。与显示高抗体结合的天然未修饰的PAL相比，如通过Western印迹法检测到的，显示较差抗体结合的酶变体在沉淀珠子级分中具有相应极少的PAL，而显示在上清液中保留了较高的活性。
实施例5
蛋白酶敏感性的检测
对来自圆红冬孢酵母的天然PAL的蛋白酶作图研究表明了蛋白水解敏感性的主要位点。除去这些位点可以降低或消除蛋白水解敏感性并且有助于有效PKU酶替代物的开发。但是，蛋白水解敏感性的这些位点的消除可能导致酶活性的降低或损失。
在蛋白质工程已经产生了保留活性的改良的PAL(和PEG-PAL)突变体后，通过与胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶蛋白酶混合物温育，然后监测活性的保留(通过OD290测量)和减少的蛋白质切割(通过PAGE凝胶分析)，对蛋白酶抗性进行筛查，这能够鉴定出将用于体内试验的具有合适体外特性的突变体。
蛋白水解稳定性通过与蛋白酶混合物温育进行评价，所述蛋白酶混合物近似于肠环境并且含有2.3mM胰蛋白酶、3.5mM胰凝乳蛋白酶、3.05mM羧肽酶A和3.65mM羧肽酶B。蛋白水解试验包括酶温育，向PAL溶液中添加蛋白酶，确定所检测的不同蛋白质变体(进行或未进行聚乙二醇化或其它化学修饰的天然或突变蛋白质)的蛋白酶敏感性程度，包括蛋白酶暴露后活性保留和稳定性保留的时间过程。SDS-PAGE和MALDI-TOF质谱作图实验用来确定任何蛋白酶敏感部位的位置(Kriwacki，R.W.等人，J.Biomol.Tech.9(3)：5-15(1980))。这些作图结果对于确定蛋白酶敏感性的主要位点(如已经确定的两个主要位点)是非常重要的，使得可以使用聚乙二醇化保护和/或突变除去所有主要敏感性位点，从而从PAL结构上除去和/或保护敏感区。
实施例6
聚乙二醇化的NpPAL和AvPAL的生成
通常，NpPAL和AvPAL的聚乙二醇化包括将蛋白质与SUNBRIGHTME-200HS 20kDa NHS活化的PEG(NOF)混合。
聚乙二醇化方案，使用NHS活化的20kDa线性PEG的标准“HC”方法：
1)评价蛋白质中内毒素的存在：
将蛋白质溶液(0.1mL)用0.9ml新鲜MQ水稀释，并使用手持式Charles River装置(EndoPTS)以0.5EU/ml的灵敏度水平检测内毒素。如果内毒素大于0.5EU/ml，则先通过Mustang E过滤，然后通过SterogeneEtox树脂来减少内毒素，任选地通过进一步的层析纯化。通过pH 7.8的DEAE FF(Amersham)的减少是有限的，但是足够有效。
2)蛋白的浓缩和缓冲液交换：
将蛋白质浓缩为大于25mg/ml但小于或等于75mg/ml，并将缓冲液交换为50mM KPO4，pH 8.5。如果利用旋转过滤器准备该浓缩，则首先如下检测滤器的内毒素：只与缓冲液在低速和短时间(3000rpm，3分钟)下旋转，然后按照与步骤1中的蛋白质相同的方法检测保留的缓冲液的内毒素。50mM KPO4，pH 8.5的缓冲液批次记录/配方由水(足量至1L)、磷酸氢二钾(8.4913g/L 48.75mM)和磷酸二氢钾(0.17011g/L 1.25mM)组成。溶液通过0.2μm滤器过滤，并贮存在室温下。浓缩的产物缓慢通过Mustang E滤器acrodisc过滤(1-2mL/min)。在A280处检测用无菌TBS，pH 7.5稀释的样品和空白对照，以确定蛋白质浓度。NpPAL的消光系数为0.83，AvPAL为0.75。
3)NpPAL和AvPAL的聚乙二醇化：
使通常贮存在-80℃的PEG升温至室温。向PEG中加入KPO4缓冲液，通过以最大速度涡旋振荡，并且用手用力摇动试管，以确保所有大块悬浮，从而进行重悬浮。在PEG第一次变湿1分钟内向充分悬浮的PEG溶液中加入蛋白质，并通过非常轻柔的颠倒进行混合。把用铝箔包裹的试管置于振荡器的轴上，并在室温下非常轻柔地摇动3小时。试管用TBS(pH 7.5)充满并无菌过滤。悬浮液立即配制，或者贮存于4℃直到准备配制。
4)配制
配制缓冲液配方/批次记录由水(足量至1L)、Tris-碱(3.2mM)、Tris-HCl(16.8mM)和氯化钠组成；缓冲液通过0.2μm滤器过滤，并且于室温贮存。使用100MWCO再生纤维素膜，使用Vivalow 50(小批量)或Vivalfow 200(较大批量)，对缓冲液进行切向流动过滤。该溶液用MQ水、0.1N NaOH并再次用200mL冲洗。以50mL/min的横向流用TBS，pH 7.5平衡该溶液。确定渗透物的pH以确保pH为7.5。
通过首先用TBS稀释大约3倍，然后恢复到初始体积至少四次，对溶液进行缓冲液交换。对于Vivaflow 50和200，横向流一般是180-200mL/min。
终产物通过Mustang E过滤。在用1.9ml无菌新鲜水稀释0.1mL后评价内毒素的存在。如果内毒素大于1EU/mL，则使用Sterogene Etox凝胶减小内毒素。将配制好的和灭菌的聚乙二醇化NpPAL或AvPAL密封在小瓶中，并置于-70℃，直到准备用于体内研究。
实施例7
点形念珠藻PAL(NpPAL)及其聚乙二醇化形式在患PKU小鼠中的效果
本研究的目的是在皮下施用NpPAL或聚乙二醇化的NpPAL后确定血浆苯丙氨酸(Phe)水平。
在纯合ENU2小鼠(也称为BTBRenu2)小鼠中检测以下物质的效果：(1)剂量为3.0IU/mL的来自圆红冬孢酵母的赖氨酸突变体R91K PAL及其聚乙二醇化形式(1∶3PA∶PEG)(PEG来自Nippon Oil and Fat，NOF)；(2)剂量为0.6IU/mL至3.0IU/mL的NpPAL及其聚乙二醇化形式(1∶3PAL∶PEG NOF)；和(3)运载体。以经证明R91K PAL相对于野生型圆红冬孢酵母PAL具有提高的活性。R91K位于跨越Asp86至Leu101的螺旋中，接近该蛋白质的表面。所有溶液都含有少于1.0EU/mL的内毒素，并且贮存在-75-80℃。ENU2或BTBRenu2小鼠在苯丙氨酸羟化酶基因(PAH)基因座处是纯合突变体，导致动物具有严重的高苯丙氨酸血症。高血浆苯丙氨酸(Phe)水平使该动物成为适于评价苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)减少血浆Phe的能力的模型。
实验设计
表3：分组说明和剂量水平
  组号   N   施用   剂量水平(IU/小鼠)   检测物活性(IU/mL)   剂量体积(mL)
  1   2   R91K   1.0   3.0   0.33
  2   2   R91K1∶3PAL∶PEGNOF   1.0   3.0   0.33
  3   5   npPAL   0.2   0.6   0.33
  4   5   npPAL   0.4   1.2   0.33
  5   5   npPAL   0.6   1.8   0.33
  6   5   npPAL   1.0   3.0   0.33
  7   5   npPAL1∶3PAL∶PEGNOF   0.2   0.46   0.43
  8   5   npPAL1∶3PAL∶PEGNOF   0.4   0.92   0.43
  9   5   npPAL1∶3PAL∶PEGNOF   0.6   1.38   0.43
  10   5   npPAL1∶3PAL∶PEGNOF   1.0   2.30   0.43
  11   2   运载体   0.0   0.0   0.43
溶液在第1天通过皮下大丸注射在肩胛骨之间施用，第4天在右腹施用，第8天在左腹施用。使用25号针头和1cc或3cc注射器将溶液施用到皮下间隙。每只动物接受在上表所示剂量体积中的0.2、0.4、0.6或1.0IU的测试物。动物通过吸入氟烷(1-3％mg/kg)轻微麻醉，并且也手工加以约束。每个给药日在大致相同的时间进行剂量施用。
每日观察动物的发病率、死亡率和总体健康。特别是，观察注射部位发红或水肿的指征。在第-3、8、12天测量并记录体重，用作临床参数，但不用于确定剂量体积。在第-3天(P，S)、第2天(P)、给药前第4天(P)、第5天(P)、给药前第8天(P，S)、第9天(P，S)、第12天(P)和第23天(S)采血(P-血浆，S-血清)。每个时间点采集大约50-100μL全血(对于25-50μL血浆或血清)。从尾静脉采血。如以上时间表所示采集血浆或血清。刺破尾静脉并使用RAM Scientific Green-Top毛细采血管(#07 7250)采集小血滴。对于血清采集，将小血滴采集到不含添加物的试管中。收集血浆/血清并转移到贮存管中，贮存于-20℃(血浆)或-80℃(血清)。
结果
NpPAL短期给药研究的结果证明了聚乙二醇化的酶在降低过高的苯丙氨酸水平方面的效果。值得注意的是，非聚乙二醇化的NpPAL在任一次注射后，甚至在可能存在任何免疫原性应答之前，都不降低苯丙氨酸水平。因此，聚乙二醇化是NpPAL能够用于治疗PKU的绝对必要条件(图5)。
实施例8
多变鱼腥藻PAL(AvPAL)及其聚乙二醇化形式在患PKU小鼠中的效果
本研究的目的是在皮下施用AvPAL或聚乙二醇化的AvPAL后确定血浆苯丙氨酸(Phe)水平。
在纯合ENU2小鼠(也称为BTBRenu2)小鼠中检测以下物质的效果：应(1)剂量为3.0IU/mL的来自圆红冬孢酵母的赖氨酸突变体R91K PAL及其聚乙二醇化形式(1∶3PAL∶PEG)(PEG来自Nippon Oil and Fat，NOF)；(2)剂量为0.6IU/mL至3.0IU/mL的AvPAL及其聚乙二醇化形式(1∶3PAL∶PEG NOF)；和(3)运载体。已经证明R91K PAL相对于野生型圆红冬孢酵母PAL具有提高的活性。R91K位于跨越Asp86至Leu101的螺旋中，接近该蛋白质的表面。所有溶液都含有少于1.0EU/mL的内毒素，并且贮存在-75-80℃。ENU2或BTBRenu2小鼠在苯丙氨酸羟化酶基因(PAH)基因座处是纯合突变体，导致动物具有严重的高苯丙氨酸血症。高血浆苯丙氨酸(Phe)水平使该动物成为适于评价苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)减少血浆Phe的能力的模型。
实验设计
表4：分组说明和剂量水平
溶液在第1、4、8天通过皮下浓注施用到动物的后背。使用25号针头和1cc或3cc注射器将溶液施用到皮下间隙。每只动物接受上表所示的剂量体积中的0.2、0.4、0.6或1.0IU的测试物。动物通过吸入氟烷(1-3％mg/kg)轻微麻醉，并且也手工加以约束。每个给药日在大致相同的时间进行剂量施用。
每日观察动物的发病率、死亡率和总体健康。特别是，观察注射部位发红或水肿的指征。在第-3、8、12天测量并记录体重，用作临床参数，但不用于确定剂量体积。在第-3天(P，S)、第2天(P)、给药前第4天(P)、第5天(P)、给药前第8天(P，S)、第9天(P，S)、第12天(P)和第22天(S)采血(P-血浆，S-血清)。每个时间点采集大约50-100μL全血(对于25-50μL血浆或血清)。从尾静脉采血。如以上时间表所示采集血浆或血清。刺破尾静脉并使用RAM Scientific Green-Top毛细采血管(#077250)采集小血滴。对于血清采集，将小血滴采集到不含添加物的试管中。收集血浆/血清并转移到贮存管中，贮存于-20℃(血浆)或-80℃(血清)。
结果
AvPAL短期给药研究的结果证明了聚乙二醇化的酶在降低过高的苯丙氨酸水平方面的效果。值得注意的是，非聚乙二醇化的AvPAL在任一次注射后，甚至在可能存在任何免疫原性应答之前，都不降低苯丙氨酸水平。因此，聚乙二醇化是AvPAL能够用于治疗PKU的绝对必要条件(图6)。
实施例9
非聚乙二醇化和聚乙二醇化的R91K PAL和聚乙二醇化的NpPAL在患PKU小鼠中的长期(90天)耐受性研究
本研究的目的是评价聚乙二醇化和非聚乙二醇化的R91K PAL和聚乙二醇化的NpPAL长期(90天)给药在ENU/2小鼠(一种苯丙酮尿症疾病模型)中的药效学参数和免疫原性效应。
每个测试制备两批(R91K及其聚乙二醇化形式R91KPAL∶PEG1∶3，npPAL及其聚乙二醇化形式npPAL∶PEG 1∶3NOF，和运载体Tris-HCl)，一批用于本研究的前半部分，第二批用于本研究的后半部分。测试溶液贮存在-75℃至-80℃。总共使用55只(每个剂量组n＝3-7)纯合ENU2小鼠(aka BTBRenu2)，并且在任何情况下都不使用非初次实验的动物(以前注射过PAL的小鼠)。
实验设计
表5：分组说明和剂量水平
  组号   分组说明   施用   剂量数   N
  1   运载体对照，s.i.d.   Tris NaCl   90   3
  2   b.i.w.a   R91K   26   3
  3   第3周后b.i.w.b   R91K   22   3
  4   逐渐增加的剂量，s.i.d.   R91K   90   7
  5   逐渐降低的剂量，s.i.d.   R91K   90   7
  6   b.i.w.a   R91K 1∶3NOF   26   6
  7   第3周后b.i.w.b   R91K 1∶3NOF   22   6
  8   逐渐增加的剂量，s.i.d.   R91K 1∶3NOF   90   7
  9   逐渐降低的剂量，s.i.d.   R91K 1∶3NOF   90   7
  10   细菌PAL，s.i.w.c   npPAL 1∶3NOF   13   6
b.i.w.：每周两次；s.i.d.：每天一次；s.i.w.：每周一次
a在7天日程的第1天和第4天给药(例如，每个星期一和星期四)
b第3组和第7组在第1天和第8天给药，从第22天开始将与第2组和第6组一样进行相同的7天日程。
c在7天日程的第1天给药(例如，每个星期一)
表6：剂量水平
对第1、4、5、8、9组每天进行一次剂量施用，第2组和第6组(b.i.w.)每周在第1天和第4天给药2次，例如每个星期一和星期四。第3组和第7组(3周后b.i.w.)在第1天和第8天给药，然后在第22天再次给药，之后日程与第2组和第6组相同(每个星期一和星期四)。第10组每周给药一次。使用25或26号针头和1cc注射器，将测试溶液通过皮下注射(大丸注射)施用到肩胛骨之间的皮下空隙中。每个动物接受使用测试溶液活性(IU/mL)和剂量水平(IU/鼠)计算的预定剂量体积。在每个给药日，剂量施用大致相同的时间进行。
每日观察动物的发病率、死亡率和总体健康。特别是，观察注射部位发红或水肿的指征。每周一次(第-3、5、12...天，例如每个星期五)及在研究终止时测量并记录体重。如果发生死亡或垂死状态导致的未按期终止，则在此时记录体重。在每个时间点采集大约100μL全血(25μL血浆，25μL血清)。通过尾静脉穿刺从尾静脉采血。使用RAM ScientificGreen-Top毛细采血管(#077250)采集小血滴。对于血清采集，将血液采集到不含添加物的试管中。血液在湿冰上不超过2小时然后通过离心分离为血浆/血清，并贮存在-70℃至-80℃，直到在试验中进行评价。采血以提供血浆和血清，用于在以下几天测定苯丙氨酸和抗体滴度：-3(研究开始前)、9、17、24、31、38、45、52、59、66、73、80、87和91。在第89天，也采集第1、5、9、10组动物的血液和血浆。每周一个时间点也许不能提供准确的血液Phe对给药的应答情况。额外的时间点显示Phe水平是否在给药剂量之间变化。第9天的样品对于研究的完整性是非常重要的，因为它标记了在迄今尝试的所有给药方案中PD效应均丧失的时间。最后采集100μL的血样。
结果
图7所示的长期给药研究显示在10周期限内每周注射(NpPAL-PEG)多次后的连续效果。
实施例10
AvPAL变体(半胱氨酸突变体)的生成
在AvPAL多肽中进行氨基酸取代以减少细菌表达的重组蛋白中发生的聚集。蛋白聚集可能降低酶活性和/或增强体内免疫原性。一种这类形式的聚集是由于链间二硫键形成而发生的。为了将这种可能性降到最低，单独或组合地用丝氨酸残基代替各个AvPAL半胱氨酸残基。
AvPAL多肽在第64、235、318、424、503和565位具有6个半胱氨酸残基(SEQ ID NO：4)。产生了下列AvPAL单半胱氨酸突变体：AvPAL_C64S(SEQ ID NO：7)、AvPAL_C318S(SEQ ID NO：8)、AvPAL_C503S(SEQ IDNO：9)和AvPAL_C565S(SEQ ID NO：10)。还产生了AvPAL半胱氨酸双突变体，AvPAL_S565SC503S(SEQ ID NO：11)。图8显示这些AvPAL半胱氨酸突变体的氨基酸序列。
克隆
使用正向引物AvarPALfor(5′-CACTGTCATATGAAGACACTATCTCAAGCACAAAG-3′)(SEQ ID NO：18)和反向引物AvarPALrev(5′-CACTGTCTCGAGATGCAAGCAGGGTAAGATATCTTG-3)(SEQ ID NO：19)，从多变鱼腥藻基因组DNA(ATCC 29413-U，Qiagen DNeasy试剂盒)扩增AvPAL基因。将得到的PCR产物用Taq处理，然后连接到pCR2.1 TOPO TA(Invitrogen)中。将得到的质粒命名为lp40。
通过SOE-PCR添加5′NheI位点并除去内部NheI位点。使用正向引物N-Nhe-AvPAL(5′-CACTGTGCTAGCATGAAGACACTATCTCAAGCACAAAG-3′)(SEQ ID NO：20)和反向弓1物Nhe-AvPALrev(5′-GGAAATTTCCTCCATGATAGCTGGCTTGGTTATCAACATCAATTAGTGG-3′)(SEQ IDNO：21)从lp40扩增上游AvPAL片段，使用正向引物Nhe-AVPALfor(5′-CCACTAATTGATGTTGATAACCAAGCCAGCTARCATGGAGGAAATTTCC-3)(SEQ ID NO：22)和反向引物AvPALreV-r(5′-ACAGTGGCGGCCGCTTAATGCAAGCAGGGTAAGATATCTTG-3)(SEQ ID NO：23)从lp40扩增下游AvPAL片段。在单PCR反应中，使两个PCR产物退火并使用DNA聚合酶延伸，产生全长AvPAL基因，然后使用引物N-Nhe-AvPAL和AvPALrev-r扩增。产生的PCR产物用NheI消化，用Klenow平端化，用NotI消化，并连接到pET28a+载体(通过用Ndel消化、用Klenow平端化、用NotI消化而准备)。将得到的质粒命名为3p86-23。
通过PCR添加新的限制酶切位点。使用正向引物AVEcoRIfor(5′-CACTGTGAATTCATGAAGACAClATCTCAAGCACAAAG-3′)(SEQ IDNO：24)和反向引物AvSmalrev(5′-CACTGTCCCGGGTTAATGCAAGCAGGGTAAGATATCT-3′)(SEQ ID NO：25)从质粒3p86-23扩增AvPAL。产生的PCR产物用EcoRI和SmaI消化，并连接到EcoRI-和SmaI-消化的pIBX7载体中。将得到的质粒命名为7p56 Av3。
半胱氨酸突变体
通过定点诱变(QuickChange XL II，Stratagene)，将AvPAL基因中的两个半胱氨酸密码子(对应于AvPAL多肽的第503和565位)用丝氨酸密码子取代。使用正向引物Av_C503S(5′-GTCATTACGATGCACGCGCCT TCTATCACCTGCAACTGAG-3)(SEQ ID NO：26)和反向引物Av_C503Srev(5′-CTCAGTTGCAGGTGATAGA AGGCGCGTGCATCGTAATGAC-3)(SEQ ID NO：27)，通过PCR将质粒7p56Av3中第503位的半胱氨酸密码子转变为丝氨酸密码子。丝氨酸密码子用下划线标出，编码链中的G到C的突变(非编码链中的C到G的突变)用粗体表示。将得到的质粒命名为j282。使用正向引物Av_C565S(5′-CAGTTCAAGAT ATCTTACCCT CTTGCATTAACCCGGGCTGC-3′)(SEQ ID NO：28)和反向引物Av_C565Srev(5′-GCAGCCCGGGTTAATGCAAG AGGGTAAGATATCTTGAACTG-3)(SEQ ID NO：29)将质粒j282中将第565位的密码子转变为丝氨酸密码子。丝氨酸密码子用下划线标出，编码链中的G到C的突变(非编码链中的C到G的突变)用粗体表示。将得到的质粒命名为j298a。
AvPAL基因中对应于AvPAL多肽第64、318和565位的半胱氨酸密码子用类似地用丝氨酸密码子取代，使用下列引物对：C64S，正向引物Av_C64S(5′-GCAGGGTATTCAGGCATCTT TGATTACATTAATAATGCTGTTG-3)(SEQ ID NO：30)和反向引物Av_C64Srev(5′-CAACAGCATTATTAATGTAATCA AAGATGCCTGAATACCCTGC-3)(SEQ ID NO：31)；C318S，正向引物Av_C318S(5′-CAAGATCGTTACTCACTCCGAT CCTTCCCCAGTATTTGGGGC-3)(SEQ ID NO：32)和反向引物Av_C318Srev(5′-GCCCCAAATACTGGGGAAGG ATCGGAGTGAGTAACGATCTTG-3)(SEQ ID NO：33)；和C565S，正向引物Av_C565S(SEQ ID NO：28)和反向引物Av_C565Srev(SEQ ID NO：29)。丝氨酸密码子以下划线标出，编码链中的G到C的突变和非编码链中C到G的突变用粗体表示。
实施例11
AvPAL变体(半胱氨酸突变体)的体外酶活性
该研究的目的是确定AvPAL多肽中各个半胱氨酸残基的丝氨酸取代对体外苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)酶活性的影响。
AvPAL变体(即，半胱氨酸突变体)如实施例10所述克隆。将AvPAL半胱氨酸突变体表达质粒转化到细菌中，并且如实施例1所述表达AvPAL半胱氨酸突变体多肽，并且如实施例2所述纯化。
如实施例3所述检测野生型(WT)AvPAL和AvPAL半胱氨酸突变体的体外PAL酶活性。表7显示与非聚乙二醇化的WT AvPAL相比，第64位半胱氨酸残基的丝氨酸取代(AvPAL_C64S)降低了纯化的非聚乙二醇化AvPAL半胱氨酸突变蛋白的体外PAL比活性，但第503或565位中任一个或第503和565位两处的半胱氨酸残基的丝氨酸取代(分别为AvPAL_C503S，AvPAL_C565S和AvPAL_C565SC503S)对其不产生不利影响。
表7：AvPAL半胱氨酸突变体的比活性
  AvPAL蛋白   聚乙二醇化   比活性(U/mg)
  WTAvPAL   -   1.7
  AvPAL_C503S   -   1.9
  AvPAL_C64S   -   1.3
  AvPAL_C565S E1   -   2.0
  AvPAL_C565S E2   -   2.1
  AvPAL_C565S C503S   -   2.2
  WTAvPAL   +   1.1
  AvPAL_C565S C503S   +   1.1
为了确定丝氨酸残基的引入对聚乙二醇化AvPAL蛋白的酶活性是否有影响，如实施例6所述将WT AvPAL和半胱氨酸双突变体AvPAL_C565SC503S聚乙二醇化。表7显示第503和565位半胱氨酸残基的丝氨酸取代对聚乙二醇化AvPAL蛋白的体外PAL比活性没有不利影响。
实施例12
AvPAL变体(半胱氨酸突变体)的体外生化表征
本研究的目的是确定AvPAL多肽中各个半胱氨酸残基的丝氨酸取代对以下各项的影响：(1)增强的稳定性；(2)聚集体形成；和(3)位点特异性聚乙二醇化。
增强的稳定性
AvPAL中半胱氨酸残基的丝氨酸取代对体外稳定性的影响通过以下方法确定：将纯化的AvPAL半胱氨酸突变体(聚乙二醇化或非聚乙二醇化的)在37℃保存不同时段，然后如实施例3所述测定这些蛋白质的体外PAL比活性。
如实施例11所述制备野生型AvPAL和AvPAL半胱氨酸突变体(非聚乙二醇化或聚乙二醇化的)。
如图9A所示，非聚乙二醇化AvPAL蛋白的比活性在37℃至少稳定5天，并且第565位，或第503和565位两处半胱氨酸残基的丝氨酸取代对其没有不利影响。类似地，如图9B所示，聚乙二醇化AvPAL蛋白的比活性在37℃至少稳定6天。在37℃6天后，与野生型AvPAL和半胱氨酸AvPAL双突变体AvPAL_C565SC503S相比，半胱氨酸AvPAL单突变体AvPAL_C565S显示稍微降低的稳定性。
聚集体形成
AvPAL中半胱氨酸残基的丝氨酸取代对溶液中蛋白聚集体形成的影响通过以下方法确定：通过变性和非变性凝胶电泳或SEC-HPLC来分离纯化的、非聚乙二醇化的野生型AvPAL和AvPAL半胱氨酸突变体。
在变性条件(4-12％NuPAGE Bis-Tris)或非变性条件(8％Tris-Gly，pH 8.3)下通过凝胶电泳分离纯化的AvPAL制品。利用考马斯蓝染色分离的AvPAL蛋白。
通过SEC-HPLC分离纯化的AvPAL制品。在20mM磷酸钠、300mMNaCl、pH 6.9中将AvPAL蛋白上样到TSK凝胶柱(G3000SW×1，7.8mm×30cm，5μm(Tosoh Bioscience，LLC))，并采用0.5mL/min的流速进行洗脱。在Agilent系列1100分光计上分析分离的AvPAL蛋白。
根据凝胶电泳(图10A)或SEC-HPLC(图10B)判断，野生型AvPAL制品以及AvPAL_C503S和AvPAL_C64S制品中存在聚集体，但AvPAL_C565S和AvPAL_C565SC503S制品中不存在。
位点特异性聚乙二醇化
AvPAL中半胱氨酸残基的丝氨酸取代对位点特异性聚乙二醇化的影响通过以下方法确定：如实施例6所述将野生型AvPAL和半胱氨酸双突变体AvPAL_C503SC565S聚乙二醇化，然后比较下列AvPAL赖氨酸残基的相对聚乙二醇化：K2、K10、K32、K115、K145、K195、K301、K335、K413、K419、K493、K494和K522。
用8M尿素变性大约100μg(10μL，10μg/μL)非聚乙二醇化或聚乙二醇化的AvPAL蛋白。变性的蛋白质然后在100μL的反应体积中用pH 8.2的胰蛋白酶在37℃下消化过夜(约20小时)。通过在37℃用1μL 1M DTT处理1小时还原胰蛋白酶消化的蛋白质，然后用3μL 15％TFA终止反应。在C18反相柱上分离消化的蛋白质。通过减去相应的非聚乙二醇化肽的肽图计算每个聚乙二醇化AvPAL肽的聚乙二醇化百分比。
如图11所示，当AvPAL蛋白∶PEG的比例为1∶3时，可能除了K419之外，任意赖氨酸(K)残基的聚乙二醇化百分比不存在显著差异，其中半胱氨酸双突变体C565SC503S的聚乙二醇化百分比低于野生型AvPAL。但是，利用AvPAL蛋白∶PEG比例增加的半胱氨酸双突变体获得的结果(其中没有观察到剂量应答关系)，结合相对较小的聚乙二醇化百分比，表明K1419观察到的差异不可能是有意义的。因此，第503和565位半胱氨酸残基的丝氨酸取代看起来不影响AvPAL的位点特异性聚乙二醇化。
实施例13
AvPAL蛋白的聚集机制
进行研究以探索细菌表达的AvPAL蛋白的聚集机制。
浓缩纯化的AvPAL制品，并在37℃温育浓缩的蛋白质溶液2小时，以加速溶液中纯化的AvPAL蛋白的聚集。通过SEC-HPLC分离AvPAL蛋白来检测聚集。为了确定二硫键交联是否造成聚集，向浓缩蛋白质溶液中添加50mM二硫苏糖醇(DTT)，然后在37℃温育2小时。
如实施例2所述纯化在细菌中表达的AvPAL蛋白，并利用旋转滤器(Millipore Biomax-10K NMWL)进行浓缩。在Eppendorf Centrifuge 5415C中以大约15,000g离心蛋白质数分钟。对于倾向于聚集的半胱氨酸突变体(例如，AvPAL_C503S和AvPAL_C64S)，将蛋白质浓缩到大约20mg/mL，并在37℃温育2小时。对于不易聚集的半胱氨酸突变体(例如，AvPAL_C565S和AvPAL_C565SC503S)，将蛋白质浓缩到大约40mg/mL，并在37℃温育2小时。
如表8所示，在37℃温育2小时后，纯化的AvPAL半胱氨酸突变体AvPAL_C64S和AvPAL_C503S的制品形成聚集体。与预期一致，在37℃温育2小时前将AvPAL蛋白浓缩将加剧这种聚集。通过将浓缩蛋白质暴露于DTT可以阻断聚集，这表明该聚集是由于二硫键交联引起的。与此相反，在37℃温育2小时后纯化的AvPAL半胱氨酸突变体AvPAL_C565S和AvPAL_C565SC503S的制品不形成聚集体，这表明第565位的半胱氨酸残基通过二硫键交联参与AvPAL聚集。
表8：二硫键交联相关的AvPAL半胱氨酸突变体的聚集
  AvPAL蛋白   处理   聚集体形成
  AvPAL_C503S   37℃/2h   +
  AvPAL_C64S   37℃/2h   +
  AvPAL_C565S E1   37℃/2h   -
  AvPAL_C565S E2   37℃/2h   -
  AvPAL_C565SC503S   37℃/2h   -
  AvPAL_C503S   浓缩+37℃/2h   ++
  AvPAL_C64S   浓缩+37℃/2h   ++
  AvPAL_C565S E1   浓缩+37℃/2h   -
  AvPAL_C565S E2   浓缩+37℃/2h   -
  AvPAL_C565SC503S   浓缩+37℃/2h   -
  AvPAL_C503S   浓缩+DDT+37℃/2h   -
  AvPAL_C64S   浓缩+DDT+37℃/2h   -
  AvPAL_C565S E1   浓缩+DDT+37℃/2h   -
  AvPAL_C565S E2   浓缩+DDT+37℃/2h   -
  AvPAL_C565SC503S   浓缩+DDT+37℃/2h   -
为了确定哪些半胱氨酸残基作为游离巯基存在，将纯化的AvPAL制品在8M尿素存在下变性，用碘乙酰胺烷基化，用胰蛋白酶消化，并通过LC/MS进行分析。所有AvPAL半胱氨酸残基都被碘乙酰胺标记，提示细菌表达的AvPAL的所有半胱氨酸残基都作为游离巯基存在。
为了确定哪些半胱氨酸残基存在于天然蛋白质的表面，纯化的AvPAL制品首先用N-乙基马来酰亚胺(NEM)处理，然后在8M尿素存在下变性，用碘乙酰胺烷基化，用胰蛋白酶消化，并通过LC/MS进行分析。第235和424位的半胱氨酸残基未被NEM烷基化，第318位的半胱氨酸残基只被NEM部分烷基化，提示第64、503和565位的半胱氨酸残基位于天然AvPAL的表面上，第318位的半胱氨酸残基部分暴露于天然AvPAL的表面上。
为了确定哪些半胱氨酸残基参与链间二硫键交联，在37℃将67μL 0.7mg/mL纯化的非聚乙二醇化野生型AvPAL制品溶液在8M尿素中变性1小时，然后在100μL反应体积中用pH 8.2的胰蛋白酶的25℃消化过夜(约17.5小时)。分离胰蛋白酶消化的蛋白质并通过质谱法进行分析，其中鉴定对应于预测的二硫键对的肽并定量为总离子计数(TIC)。
表9显示检测到的二硫键对C503-C503、C503-C565、C565-C318和C565-C565。在纯化的AvPAL制品的二硫键对中，发现了第565位的半胱氨酸残基，并较低程度地发现了第503位的半胱氨酸残基。
表9：聚集体二硫键对
 二硫键对   结果(TIC/1000)
 C64-C318   n.d.#
 C64-C64   n.d.
 C64-C503   n.d.
 C64-C565   n.d.
 C503-C318   n.d.
  C503-C503   11
  C503-C565   112
  C565-C318   13
  C565-C565   37
  C318-C318   n.d.
#未检测到
进行研究以确定除了二硫键交联外的其他机制是否可能参与AvPAL蛋白聚集。
将纯化的AvPAL制品与0.05％Tween或10mM EDTA温育，然后如实施例12所述通过SEC-HPLC分离。Tween减少由疏水相互作用引起的蛋白质聚集，而EDTA减少由于存在二价阳离子引起的蛋白质聚集。如图12所示，暴露于0.05％Tween或10mM EDTA对AvPAL蛋白质聚集没有影响。10mM EDTA处理的AvPAL中第10分钟的附加峰是由于EDTA在210nm处的吸收。
为了进一步研究二硫键交联在AvPAL蛋白聚集中的作用，在通过SEC-HPLC分离前，纯化的AvPAL先通过DTT处理进行还原，然后脱盐。如图13A所示，通过DTT处理使AvPAL蛋白聚集降到最低，但在37℃温育18小时后聚集体再次形成。与此相反，如图13B所示，在DTT暴露后以及脱盐和37℃温育18小时前一旦AvPAL表面半胱氨酸通过N-乙基马来酰亚胺(NEM)处理被修饰(即烷基化)，则聚集体不再形成。
基于以上所述，细菌表达的AvPAL的聚集看起来仅仅是由于链间二硫键的形成，而不是因为疏水作用或二价阳离子的存在。第565和503位的半胱氨酸残基参与AvPAL制品中链间二硫键的形成。
实施例14
AvPAL变体(半胱氨酸突变体)及其聚乙二醇化形式在小鼠中的效应
这些研究的目的是确定AvPAL多肽第503和565位半胱氨酸残基的丝氨酸取代在小鼠中对体内苯丙氨酸(Phe)水平的影响。
基本如实施例8所述在纯合ENU2(也称为BTBRenu2)小鼠中检测了半胱氨酸双突变体AvPAL_C565SC503S的聚乙二醇化形式的体内活性。ENU2小鼠在PAH基因座处是纯合突变体，产生具有严重HPA的动物。高血浆Phe水平使得该动物成为评价PAL降低血浆Phe的能力的合适模型。
在第一项研究中，AvPAL半胱氨酸双突变体AvPAL_C565SC503S在各种剂量下进行检测。ENU2小鼠(雄性或雌性)分为5个剂量组：4个试验组(n＝4)和1个运载体组(n＝2)。每只小鼠给予8个每周皮下剂量的运载体、低剂量聚乙二醇化半胱氨酸双突变体AvPAL(0.25IU)、中剂量聚乙二醇化半胱氨酸双突变体AvPAL(1.0IU)、高剂量聚乙二醇化半胱氨酸双突变体AvPAL(4.0IU)或聚乙二醇化的野生型AvPAL(4.0IU)。在给药前和给药后48小时(最多到第57天)采集血浆，并分析Phe水平。也在给药前和给药后48小时(最多到第57天)采集血清，用于分析抗AvPAL抗体水平。小鼠从第一次给药前2天开始(最多到第40天)每周称重一次。
两只小鼠在研究过程中死亡，一只是运载体处理的小鼠，另一只是低剂量聚乙二醇化半胱氨酸双突变体AvPAL处理的小鼠。如图14所示，在每次皮下注射聚乙二醇化的半胱氨酸双突变体AvPAL后48小时，在血浆中观察到剂量依赖性的Phe水平降低。在相同的剂量下，用聚乙二醇化的野生型AvPAL或聚乙二醇化的半胱氨酸双突变体AvPAL处理的小鼠之间，血浆Phe水平没有差异。如图15所示，在用运载体、聚乙二醇化的野生型AvPAL或聚乙二醇化的半胱氨酸双突变体AvPAL处理的小鼠之间，体重没有显著性差异。没有观察到体重的显著性差异可能是因为雄性和雌性小鼠都在该研究中使用。
使用间接ELISA试验分析这些小鼠中的抗AvPAL滴度。在该试验中微量滴定板用AvPAL包被，封闭，然后暴露于适当稀释的来自每次小鼠采血的血清。结合到微量滴定板表面上的AvPAL被血清样品中存在的AvPAL特异性抗体识别并结合。用检测标记的山羊抗小鼠IgG抗体检测结合的抗AvPAL抗体。血清样品在开始时1∶50稀释，并且与来自于1∶50稀释的合并小鼠血清的“截点”相比进行分析。信号低于截点的样品报告为＜50，或“阴性”。其余的样品被认为是“阳性”，进一步以1∶3系列稀释，滴定到信号降至截点以下的稀释度。获得阳性信号(即，高于截点)的最高稀释倍数报告为该样品的滴度。在该滴度系列过程中，3倍的滴度改变也许不能反映检测的抗体的显著性差异，因为这种差异可能是截点水平上信号最小改变的结果。
如表10所示，聚乙二醇化的半胱氨酸双突变体AvPAL处理的小鼠中的抗AvPAL抗体滴度低于用相同剂量(4.0IU)的聚乙二醇化的野生型AvPAL处理的小鼠。尽管没有观察到明显的剂量应答，但是用高剂量(4.0IU)聚乙二醇化的半胱氨酸双突变体AvPAL处理的小鼠比用低剂量(0.25IU)聚乙二醇化的半胱氨酸双突变体AvPAL处理的小鼠具有更高的抗AvPAL抗体滴度。
表10：抗-AvPAL IgG滴度
 聚乙二醇化的AvPAL蛋白质   样品   前   D8   D15   D22   D29
  AvPAL_C565SC503S    (0.25IU)   S203 ＜50 50   ＜50   50   50
  S204 ＜50 50   50   50   450
  S205 ＜50 ＜50   ＜50   ＜50   ＜50
  S206 ＜50 ＜50   50   50   50
  AvPAL_C565SC503S(1.0IU)   S307 ＜50 ＜50   ＜50   ＜50   ＜50
  S308 ＜50 ＜50   ＜50   ＜50   ＜50
  S309 ＜50 ＜50   ＜50   ＜50   50
  S310 ＜50 ＜50   ＜50   ＜50   ＜50
  AvPAL_C565SC503S(4.0IU)   S411 ＜50 ＜50   ＜50   50   50
  S412 ＜50 ＜50   50   50   50
  S413 50 50   50   450   150
  S414 ＜50 ＜50   ＜50   ＜50   ＜50
  WT AvPAL(4.0IU)   S515 ＜50 ＜50   150   150   450
  S516 ＜50 ＜50   150   150   450
  S517 ＜50 ＜50   150   4050   12150
  S518 ＜50 ＜50   150   450   150
  聚乙二醇化的AvPAL蛋白质   样品 前   D36   D43   D50   D57
  AvPAL_C565SC503S    (0.25IU)   S203 ＜50   ＜50   150   150   ＜50
  S204 ＜50   ＞1350   ＞1350   ＞1350   450
  S205 ＜50   N/A*   N/A   N/A   N/A
  S206 ＜50   ＜50   50   50   ＜50
  AvPAL_C565SC503S(1.0IU)   S307 ＜50   50   150   ＞1350   150
  S308 ＜50   ＜50   ＜50   ＜50   ＜50
  S309 ＜50   450   ＞1350   ＞1350   450
  S310 ＜50   ＜50   50   50   ＜50
  AvPAL_C565SC503S(4.0IU)   S411 ＜50   50   150   50   50
  S412 ＜50   150   150   150   50
  S413 50   450   450   450   150
  S414 ＜50   150   150   150   150
  WT AvPAL(4.0IU)   S515 ＜50   450   1350   1350   150
  S516 ＜50   150   450   450   150
  S517 ＜50   4050   4050   4050   450
  S518 ＜50   50   50   50   ＜50
*未获得样品/数据
与4.0IU聚乙二醇化的野生型AvPAL相比，施用4.0IU聚乙二醇化的半胱氨酸双突变体AvPAL的小鼠中降低的抗AvPAL抗体滴度在整个研究中持续。
在第二项研究中，在不同的聚乙二醇化比例下检测了AvPAL半胱氨酸双突变体AvPAL_C565SC503S。将雄性ENU2小鼠分至5个剂量组：4个试验组(n＝4)和1个载体组(n＝2)。每只小鼠给予8个每周皮下剂量的运载体、低剂量聚乙二醇化半胱氨酸双突变体AvPAL(4IU和1∶1.6AvPAL∶PEG比)、中剂量聚乙二醇化半胱氨酸双突变体AvPAL(4IU和1∶2.4AvPAL∶PEG比)、高剂量聚乙二醇化半胱氨酸双突变体AvPAL(4IU和1∶3AvPAL∶PEG比)或聚乙二醇化的野生型AvPAL(4IU和1∶3AvPAL∶PEG比)。在给药前和给药后4天(最多到第61天)采集血浆，并分析Phe水平。也在给药前和给药后4天(最多到第57天)采集血清，用于分析抗AvPAL抗体水平。小鼠从第一次给药前2天开始(到第40天)每周称重一次。
一只运载体处理的小鼠在研究过程中死亡。如图16所示，在每次皮下注射聚乙二醇化的半胱氨酸双突变体AvPAL后4天，在血浆中观察到PEG比例依赖性的Phe水平降低。在相同的PEG比例下，用聚乙二醇化的野生型AvPAL或聚乙二醇化的半胱氨酸双突变体AvPAL处理的小鼠之间，血浆Phe水平没有差异。如图17所示，用聚乙二醇化的野生型AvPAL或聚乙二醇化的半胱氨酸双突变体AvPAL处理的小鼠的体重显著高于运载体处理的小鼠。
使用如上所述的间接ELISA试验分析这些小鼠中的抗AvPAL滴度。
如表11所示，在相同的AvPAL∶PEG比例(1∶3)下，聚乙二醇化的半胱氨酸双突变体AvPAL处理的小鼠中的抗AvPAL抗体滴度低于用相同剂量的聚乙二醇化的野生型AvPAL处理的小鼠。在抗AvPAL抗体滴度与AvPAL∶PEG比例之间观察到相反的剂量应答，这与蛋白质如AvPAL的聚乙二醇化与降低的体内免疫原性相关的预期一致。
表11：抗-AvPAL IgG滴度
  聚乙二醇化的AvPAL蛋白质   样品 前   D15   D28   D43  D64
  WT_AvPAL(PEG 1∶3NOF)   S101 ＜50   450   12150   4050  ＞1350
  S106 ＜50   450   450   450  4050
  S110 ＜50   50   50   150  450
  S117 ＜50   150   450   450  1350
  AvPAL_C565SC503S    (PEG1∶1.6)   S202 50   450   12150   1350  1350
  S207 ＜50   1350   12150   12150  36450
  S211 ＜50   450   1350   12150  12150
  S218 50   150   36450   26.57M  ＞36450
  AvPAL_C565SC503S    (PEG1∶2.4)   S303 ＜50   50   150   450  4050
  S308 ＜50   50   50   50  450
  S312 ＜50   50   150   450  4050
  S313 ＜50   50   450   1350  4050
  AvPAL_C565SC503S(PEG 1∶3)   S404 ＜50   50   50   450  450
  S409 50   50   50   150  450
  S414 ＜50   ＜50   50   450  1350
  S416 ＜50   ＜50   150   50  450
  运载体   S505 ＜50   ＜50   ＜50   ＜50  N/A*
  S515  50   ＜50   ＜50   ＜50  ＜50
*N/A：该时间点没有血清样品
上述结果表明，聚乙二醇化的半胱氨酸双突变体AvPALAvPAL_C565SC503S具有与聚乙二醇化的野生型AvPAL相当的体内PAL酶活性。由于非聚乙二醇化的野生型AvPAL没有可检测到的体内PAL酶活性(参见实施例8)，因此可以得出以下结论：AvPAL变体，包括聚乙二醇化的半胱氨酸双突变体AvPAL，AvPAL_C565SC503S，和聚乙二醇化的野生型AvPAL，具有比野生型AvPAL更高的苯丙氨酸转化活性。
上述结果也表明，聚乙二醇化的AvPAL变体，它由于第503和565位半胱氨酸到丝氨酸的取代而具有减少的体外蛋白质聚集，与聚乙二醇化的野生型AvPAL相比具有降低的免疫原性。由于聚乙二醇化本身与降低的免疫原性有关，因此结论是AvPAL变体与野生型AvPAL相比具有降低的体内免疫原性。
实施例15
AvPAL变体的再聚乙二醇化形式的产生
进行研究以确定AvPAL变体的聚乙二醇化形式是否能够进行再聚乙二醇化以提高聚乙二醇化的量，即，AvPAL赖氨酸残基上PEG分子的百分比，如果能，确定AvPAL变体的再聚乙二醇化形式是否保持体外酶活性并且具有任何改善的体内性质，即降低的免疫原性。
AvPAL变体的聚乙二醇化
半胱氨酸双突变体AvPAL，AvPAL_C565SC503S，基本如实施例6所述以不同的PAL∶PEG比例聚乙二醇化(即，AvPAL_C565SC503S：SUNBRIGHT ME-200HS 20kDa NHS-活化的PEG(NOF))。
简言之，标准反应混合物含有：7mg/ml(相当于2mM赖氨酸残基)AvPAL_C565SC503S和2、3、4或6mM mPEG20K-NHS(甲氧基聚乙二醇-羧甲基-N-羟基琥珀酰亚胺酯，20kDa，SUNBRIGHT ME-200HS，NOF)，在50mM磷酸钾缓冲液pH 8.5中，分别相当于1∶1、1∶1.5、1∶2或1∶3摩尔比的总AvPAL赖氨酸残基∶PEG分子(见表12)。在室温温育3小时后，将反应混合物的缓冲液交换为200mM磷酸钾pH 8.5，并使用切向流过滤(Vivaflow 50或200，聚醚砜或再生的纤维素膜，100kDaMWCO，Sartorius)浓缩到大于20mg/ml，准备用于下一步的再聚乙二醇化步骤。
表12：AvPAL的聚乙二醇化和再聚乙二醇化条件
聚乙二醇化的AvPAL变体的再聚乙二醇化
以不同的PAL∶PEG比例聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S基本如实施例6所述再聚乙二醇化，其中使用各种浓度的聚乙二醇化的酶，及不同量和不同比例的AvPAL酶中的赖氨酸残基和SUNBRIGHTME-200HS 20kDa NHS-活化的PEG(NOF)分子。
对于每个再聚乙二醇化反应，起始材料为在200mM磷酸钾pH 8.5中浓缩为大于20mg/mL的聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S(rAvPAL-PEG)。对于每个再聚乙二醇化反应分别称取mPEG20K-NHS，并重悬浮于最小体积的水中。必要时用缓冲液稀释的rAvPAL-PEG直接加到重悬浮的mPEG20K-NHS溶液中，以达到表12所示的终浓度。再聚乙二醇化反应在室温下进行3小时，然后通过用25mM TrisHCl，pH 7.3稀释2倍终止。使用切向流过滤法(Vivaflow 50或200，聚醚砜或再生的纤维素膜，100kDa MWCO，Sartorius)进行缓冲液交换，并且在10mM TrisHCl，135mM NaCl，1mM L-Phe pH 7.3中浓缩再聚乙二醇化的rAvPAL-PEG样品。需要时，利用离心浓缩将最终的再聚乙二醇化的rAvPAL-PEG样品进一步浓缩。
体外表征方法
总蛋白质测定：使用来自Pierce(cat#23227)的商品化测定试剂盒，使用牛血清白蛋白作为标准，通过二喹啉甲酸(BCA)分析测定聚乙二醇化的和再聚乙二醇化的rAvPAL-PEG样品的浓度。简言之，25μL样品和标准与200μL BCA试剂在37℃温育30分钟。使用SPECTRAma×PLUS微孔板分光光度计(Molecular Devices Corporation)读取562nm处的吸光度。
rAvPAL活性测定：如实施例3所述基于建立的PAL活性测定方案测定聚乙二醇化的和再聚乙二醇化的rAvPAL-PEG样品的比活性。简言之，在向1mL测定反应中添加蛋白质样品(25-50μL)后，监测由于L-Phe转化为反式肉桂酸引起的OD290的降低。必要时，在测定之前用测定稀释缓冲液(10mM TrisHCl，135mM NaCl，pH7.3)稀释样品。每个数据点代表三个独立测定的平均值。
毛细管凝胶电泳(CGE)：使用来自Beckman-Coulter的ProteomeLabSDS-MW分析试剂盒(cat#390953)进行CGE分析。聚乙二醇化的和再聚乙二醇化的rAvPAL-PEG和rAvPAL-PEG-RP1样品在SDS和β-巯基乙醇的存在下于95℃加热5分钟，然后上样到来自Beckman-Coulter的P/ACE MDQ毛细管电泳***中的毛细管(PA800CE，23cm熔融石英)中。CGE谱显示214nm处的紫外吸光度量。每个CGE样品含有10kDa迁移标记作为分析参照。毛细管在rAvPAL-PEG样品之间重新调整。
TNBS分析：三硝基苯磺酸(TNBS)分析用来提供对聚乙二醇化和再聚乙二醇化的rAvPAL-PEG样品中存在的游离胺基团的估计值。
肽图分析：如实施例10所述进行rAvPAL-PEG和rAvPAL-PEG-样品的胰蛋白酶肽图分析以确定AvPAL变体蛋白质上的赖氨酸残基处的聚乙二醇化百分。确定聚乙二醇化的量，即，再聚乙二醇化AvPAL_C565SC503S的AvPAL赖氨酸残基K10、K32、K115、K145、K195、K301、K335、K413、K493/K494和K522上的PEG分子的百分比。
聚乙二醇化和再聚乙二醇化的AvPAL变体的体外表征
rAvPAL酶活性：如图18(上图)所示，聚乙二醇化或再聚乙二醇化导致体外rAvPAL酶活性临时降低。这看起来是由于在靠近催化活性位点的特定酪氨酸残基处的可逆聚乙二醇化。与一次聚乙二醇化相比，再聚乙二醇化看起来提高了聚乙二醇化反应对rAvPAL酶活性的影响，即，临时降低其比活性，其随着时间逐渐恢复。聚乙二醇化反应中较高的PEG浓度与较大的比活性临时降低有关。但是，在4℃几周后，首先用多种PAL∶PEG比例及酶和PEG分子浓度(示出了AvPAL和PEG中赖氨酸残基的mM浓度)产生的再聚乙二醇化的rAvPAL-PEG的比活性，达到使用1∶3的PAL∶PEG比例(2mM赖氨酸残基∶6mM PEG，实心圆形)产生的单次聚乙二醇化的AvPAL-PEG的至少约80％。此外，聚乙二醇化和再聚乙二醇化的AvPAL-PEG酶在聚乙二醇化后具有相当的活性恢复速率。
如图18(下图)所示，首先使用1∶1的PAL∶PEG比例(2mM赖氨酸残基∶2mM PEG，实心正方形)产生聚乙二醇化的rAvPAL-PEG时，观察到类似的趋势。总之，尽管再聚乙二醇化临时影响AvPAL活性，但是与以1∶3的PAL∶PEG比例产生的单次聚乙二醇化的rAvPAL-PEG相比，再聚乙二醇化的rAvPAL-PEG的最终比活性在可接受的范围内。
聚乙二醇化和再聚乙二醇化的rAvPAL的CGE分析：CGE分析表明，相对于单次聚乙二醇化，再聚乙二醇化提高了聚乙二醇化的总程度。如图19A所示，再聚乙二醇化导致rAvPAL-PEG的电泳迁移率降低，暗示由于连接了额外的PEG分析导致分子大小增加。此外，聚乙二醇化程度与再聚乙二醇化步骤过程中使用的PEG浓度极好地相关。如图19B所示，无论第一个聚乙二醇化步骤中的反应条件如何，6mM或更高浓度的mPEG20K-NHS在提高rAVPAL-PEG的聚乙二醇化方面同样有效。总之，与单次聚乙二醇化的rAvPAL相比，再聚乙二醇化的rAvPAL-PEG清楚地显示降低的CGE迁移率，因此显示提高的分子量。
再聚乙二醇化后rAvPAL-PEG中的游离胺：进行TNBS分析以评估相对于单次聚乙二醇化的rAvPAL-PEG，再聚乙二醇化的rAVPAL-PEG中存在的游离胺基团的量。如表13所示，在较高的PEG浓度如6mM下再聚乙二醇化最显著地降低了rAvPAL蛋白上存在的游离胺的量，表明聚乙二醇化总体增加。在本文使用的条件下，可以化学修饰的非聚乙二醇化rAvPAL中的大多数游离胺在再聚乙二醇化被有效地聚乙二醇化。
表13：再聚乙二醇化的rAvPAL-PEG中存在的游离胺
 [AvPAL]μM   [游离胺]μM   游离胺/rAvPAL单体   摩尔PEG/摩尔rAvPAL
  rAvPAL   13.9   204.0   14.6   -
  2mM Lys∶6mM PEG   23.5   66.8   2.8   11.8
  2∶6和1∶3   22.9   42.3   1.8   12.8
  2∶6和2∶2   33.1   118.1   3.6   11.0
  2∶6和2∶4   32.9   96.3   2.9   11.7
  2∶6和2∶6   26.3   16.8   0.6   14.0
  2∶6和3∶6   30.5   37.2   1.2   13.4
再聚乙二醇化后赖氨酸残基的聚乙二醇化百分比：如图20所示，胰蛋白酶肽图分析表明再聚乙二醇化提高了rAvPAL-PEG上赖氨酸残基的聚乙二醇化百分比。除了AvPAL第10位的赖氨酸残基已经在单次聚乙二醇化步骤过程中100％聚乙二醇化以外，其余的未偶联的赖氨酸残基将在再聚乙二醇化时聚乙二醇化。最特别地，AvPAL第301位赖氨酸残基处的聚乙二醇化在再聚乙二醇化后提高了多达500％。存在较高浓度如6mM的活化mPEG20K-NHS的再聚乙二醇化条件看来在增加rAvPAL-PEG的聚乙二醇化程度方面比较低的PEG浓度如2mM更有效。
实施例16
再聚乙二醇化AvPAL-PEG变体在小鼠中的效应
如实施例15所述在第一次和第二次聚乙二醇化反应中都使用1∶3的PAL∶PEG比例产生的再聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S(rAvPAL-PEG-RP1)，与如实施例6和15所述使用1∶3的PAL∶PEG比例产生的单次聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S(rAvPAL-PEG)，在降低小鼠PKU模型的血浆Phe水平的能力以及诱导体内抗体应答方面进行比较。
如实施例3所述测定聚乙二醇化和再聚乙二醇化的AvPAL变体酶的比活性。发现rAvPAL-PEG-RP1具有比rAvPAL-PEG的比活性(1.47U/mg)低大约20％的比活性(1.17U/mg)。
基本如实施例8所述，分别检测了AvPAL_C565SC503S的聚乙二醇化和再聚乙二醇化形式，rAvPAL-PEG和rAvP AL-PEG-RP1，在纯合ENU2(也称为BTBRenu2)小鼠中的体内活性。研究设计在下面的表14中显示。
表14：用于比较AvPAL变体的聚乙二醇化和再聚乙二醇化形式的体内研究的设计
两组小鼠(第1组和第2组)分别皮下施用高(80mg/kg)每周剂量的rAvPAL-PEG或rAvPAL-PEG-RP1，持续8周，然后分别施用低(20mg/kg)每周剂量的rAvPAL-PEG或rAvPAL-PEG-RP1，持续6周。一组小鼠(第3组)施用高剂量的rAvPAL-PEG，然后施用低剂量的rAvPAL-PEG-RP1。给药前和给药后各天采集血浆，并分析Phe水平。如实施例8所述测定血浆Phe水平，获得的数据显示在图21中。也在给药前和给药后不同天采集血清，用于分析抗AvPAL抗体水平。如所述实施例14测定血清抗rAvPAL IgG滴度，获得的数据显示在表15中。
如图21所示，对于全部3个组，每周80mg/kg皮下施用rAvPAL-PEG(DP，实心圆形或实心倒三角形)或rAvPAL-PEG-RP1 2×PEG，空心圆形)7-8周导致血浆Phe水平稳定在＜200μM。稳定后，减至每周20mg/kg皮下施用rAvPAL-PEG导致血浆Phe水平在4天内＜200μM。用20mg/kgrAvPAL-PEG处理的ENU2小鼠(DP，实心圆形)中的血浆Phe水平低于用20mg/kg rAvPAL-PEG-RP1处理的小鼠(2×PEG，空心圆形或实心倒三角形)，这可能是由于单次聚乙二醇化的rAvPAL-PEG的比活性高于两次聚乙二醇化的rAvPAL-PEG-RP1的比活性。
如表15所示，注射rAvPAL-PEG-RP1的ENU2小鼠(第2组)中的抗AvPAL IgG滴度低于注射rAvPAL-PEG的小鼠(第1组和第3组)。这表明，再聚乙二醇化AvPAL变体以具有提高的聚乙二醇化量，特别是使用20kDa线性PEG分子，与降低的体内免疫原性相关。
表15：抗-AvPAL IgG滴度
 聚乙二醇化的AvPAL蛋白   样品   D-2   D14   D26   D42   D68
 rAvPAL-PEG   1-1   ＜50   50   150   150   150
  1-2   ＜50   50   1350   450   150
  1-3   150   450   4050   1350   1350
  1-4   150   1350   450   450   1350
 rAvPAL-PEG-RP1   2-1   ＜50   ＜50   50   150   50
  2-2   150   50   ＜50   50   ＜50
  2-3   ＜50   ＜50   ＜50   50   ＜50
  2-4 ＜50   ＜50   ＜50   ＜50   ＜50
 第1-8周rAvPAL-PEG，然后   3-1 50   450   1350   1350   450
 第9-14周rAvPAL-PEG-RP1   3-2 50   1350   1350   1350   1350
  3-3 ＜50   450   4050   1350   1350
  3-4 ＜50   50   450   150   450
总之，使用20kDa线性PEG分子再聚乙二醇化AvPAL-PEG变体以提高AvPAL中各赖氨酸残基处的聚乙二醇化百分比，与略微降低的体内酶活性相关，但是重要的是，与降低的体内免疫原性相关。
实施例17
原核生物PAL组合物的临床评价
以下实施例提供了关于用于临床评价本发明治疗方法中包含原核生物PAL或其生物活性变体、突变体和片段(“PAL”)的组合物的参数的指导。如本文全文所述，PAL将用于治疗HPA，包括HPA、轻度苯丙酮尿症(PKU)和经典PKU。进行临床试验，其将提供对口服或皮下PAL给药的安全性、药代动力学以及替代物和指定的临床终点的初始应答的评价。该试验将进行至少而不是必须限于24周，以收集100位可评价患者的足够的安全性信息。该试验的初始剂量将在约0.001到约1.0mg/kg/周之间变化。如果该剂量不导致患者血浆苯丙氨酸(Phe)水平的降低，或者不产生显著的直接临床益处(以提高每日口服Phe摄入量而不提高血浆Phe水平的能力衡量)，则根据需要应当增加剂量，并维持额外的最短时间，但不必限于24周，以确定安全性并评价进一步的效果。
安全性的检测将包括不良事件、***反应、完整的临床化学组(肾和肝功能)、尿分析和差别CBC。此外，还将监测其它参数，包括血液Phe水平的降低、神经心理学和认知试验，并还监测总体评价。本实施例还涉及检测药物在循环中的药代动力学参数，以及血液中PAL的一般分布和半衰期。可以预期这些检测将有助于将剂量与临床反应联系起来。
方法
血浆Phe水平升高的患者将经历基准医疗史和身体检查、神经心理学和认知测验，一套标准的临床实验室试验(CBC，Panel 20，CH50，UA)，尿蝶呤水平、二氢蝶啶还原酶(DHPR)水平和空腹血液(血浆)组的血清氨基酸检测。患者将到诊所进行密切的每周随访。在完成治疗周期一周后患者将回到诊所进行全面评价。如果需要升高剂量，则患者将遵循上面所列的相同方案。在该试验中自始至终都将监测安全性。
诊断和入选/排除标准
患者可以是男性或女性，具有经过遗传检测和血液Phe水平升高的证据证实的HPA或轻度PKU的书面诊断。该研究将包括没有正确地进行饮食控制的HPA或PKU患者。具有妊娠可能的女性患者必须是恰在每次给药之前为妊娠试验(尿β-hCG)阴性，并且必须建议在整个研究过程中使用医学上接受的避孕方法。如果患者怀孕或者哺乳；在加入研究之前30天内曾经接受过试验药物；或者具有医学状况、严重的间发性疾病或其它可能显著降低研究顺应性的情况，则必须从本研究中排除该患者。
饮食干预
在初步随机化和2周的治疗期后，所有研究参加者都将进行饮食咨询并且使用标准饮食和/或标准Phe-限制性饮食，补充专门的Phe医用食品，总共4-6周。饮食在家处理，并且在日志中记录饮食摄入量。对营养物和医用食品的摄入量和占推荐饮食摄入量(RDI)的百分比的分析在治疗组之间进行比较。
PAL安全性
如果在研究过程中没有发生显著的急性或慢性药物反应，则可以确定PAL治疗是安全的。如果在临床检查、临床试验或其他适当的研究中未观察到显著异常，则可以确定药物的更长期使用是安全的。
实施例18
聚乙二醇化的AvPAL变体的临床评价
聚乙二醇化的半胱氨酸双突变体AvPAL，AvPAL_C565SC503S，在人体中进行临床评价。该临床评价的目的是确定在PKU患者中的安全性、耐受性、药代动力学(PK)和有效性。血液苯丙氨酸(Phe)水平将作为临床终点。
1期
1期是在35名年龄在16-50岁之间的PKU患者中进行的标签公开的单剂量增加研究。主要目的是评价聚乙二醇化的半胱氨酸双突变体AvPAL，AvPAL_C565SC503S的安全性和耐受性，次要目的是评价聚乙二醇化的酶的PK和Phe减少。对各有5名个体的7个组按顺序施用剂量逐渐增加的0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3和1mg/kg聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S。每个组中的个体接受单剂量，然后随访共6周。纳入标准是筛查时的血液Phe水平和过去3年的平均血液Phe水平＞600μM。
2期
2期研究分为没有中断的两个部分：
●第1部分-16周-8周给药，然后剂量优化
●第2部分-40周-延长
2期是在35名PKU患者中进行的两部分的、标签公开的、剂量优化研究。在16周的持续时间内进行的第1部分包括施用聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S的剂量，每周一次，共8周，然后是一段时间的剂量优化。将每名患者的剂量调整为达到低于600μM的血液Phe浓度。主要目的是评价聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S多次给药的安全性和耐受性，次要目的是评价聚乙二醇化的酶对Phe浓度、免疫应答例如抗AvPAL抗体滴度和稳态PK的影响。在第2部分中，以个体优化的给药剂量和频率给个体施用聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S 40周。
3期
一旦1期和2期研究结束，额外的研究可能包括在大量患者中进行的6个月的3期双盲研究，以及在特殊群体，例如但不限于非PKU高苯丙氨酸血症(HPA)患者、BH4应答性PKU患者和非BH4应答性PHU患者中进行的额外研究。

Claims (44)

1.一种多变鱼腥藻苯丙氨酸氨裂合酶(AvPAL)变体，其中AvPAL的第503和565位半胱氨酸残基被丝氨酸残基取代，使得该AvPAL变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列相同，其中所述AvPAL变体是以聚乙二醇被聚乙二醇化的。
2.权利要求1的AvPAL变体，其中所述聚乙二醇化是通过AvPAL变体与NHS活化的聚乙二醇以每个AvPAL变体赖氨酸残基至少1.6个聚乙二醇的比例进行反应而实现的。
3.权利要求1的AvPAL变体，其中所述聚乙二醇化是通过AvPAL变体与NHS活化的聚乙二醇以每个AvPAL变体赖氨酸残基至少2.4个聚乙二醇的比例进行反应而实现的。
4.权利要求1的AvPAL变体，其中所述聚乙二醇化是通过AvPAL变体与NHS活化的聚乙二醇以每个AvPAL变体赖氨酸残基3个聚乙二醇的比例进行反应而实现的。
5.权利要求1-4任一项的AvPAL变体，其中所述AvPAL变体的第2、10、32、145、195、301、413、493和522位赖氨酸残基中至少有28%是聚乙二醇化的。
6.权利要求1-4任一项的AvPAL变体，其中所述AvPAL变体的第2、10、195、413、493和522位赖氨酸残基中至少51%是聚乙二醇化的。
7.权利要求1-4任一项的AvPAL变体，其中所述AvPAL变体的第2、10、195、493和522位赖氨酸残基中至少75%是聚乙二醇化的。
8.一种药物组合物，其包含权利要求1-7任一项所述的AvPAL变体和药学上可接受的载体。
9.权利要求1-7任一项所述的AvPAL变体在制备用于治疗个体中全部或部分由苯丙氨酸羟化酶(PAH)缺乏引起的疾病的药物中的应用。
10.权利要求9的应用，其中所述疾病的特征在于苯丙氨酸水平升高。
11.权利要求9的应用，其中所述个体具有正常PAH活性的10%或更低。
12.权利要求9的应用，其中在施用所述AvPAL变体之前，所述个体的血浆苯丙氨酸浓度大于200μM。
13.权利要求9的应用，其中所述药物被制备成降低所述个体血浆苯丙氨酸浓度的10%或更多。
14.权利要求9的应用，其中所述个体具有突变的PAH。
15.权利要求14的应用，其中所述突变的PAH在PAH的催化域中包含突变。
16.权利要求15的应用，其中所述突变包含一个或多个选自F39L、L48S、I65T、R68S、A104D、S110C、D129G、E178G、V190A、P211T、R241C、R261Q、A300S、L308F、A313T、K320N、A373T、V388M、E390G、A395P、P407S和Y414C的突变。
17.权利要求9的应用，其中所述个体是人。
18.权利要求9的应用，其中所述药物被制备成与蛋白质限制性饮食联合施用给所述个体。
19.权利要求17的应用，其中所述个体是怀孕女性。
20.权利要求17的应用，其中所述个体是0-3岁的婴儿。
21.权利要求20的应用，其中所述婴儿的血浆苯丙氨酸浓度为360μM至4800μM。
22.权利要求1-7任一项的Av-PAL变体在制备用于治疗个体苯丙氨酸水平升高的药物中的应用。
23.权利要求22的应用，其中在施用所述AvPAL变体之前，所述个体的血浆苯丙氨酸浓度大于200μM。
24.权利要求22的应用，其中所述药物被制备成降低所述个体血浆苯丙氨酸浓度的10%或更多。
25.权利要求22的应用，其中所述个体PAH活性缺乏。
26.权利要求25的应用，其中所述个体具有突变的PAH。
27.权利要求26的应用，其中所述突变的PAH在PAH的催化域中包含突变。
28.权利要求27的应用，其中所述突变包含一个或多个选自F39L、L48S、I65T、R68S、A104D、S110C、D129G、E178G、V190A、P211T、R241C、R261Q、A300S、L308F、A313T、K320N、A373T、V388M、E390G、A395P、P407S和Y414C的突变。
29.权利要求22的应用，其中所述个体是人。
30.权利要求22的应用，其中所述药物被制备成与蛋白质限制性饮食联合施用给所述个体。
31.权利要求29的应用，其中所述个体是怀孕女性。
32.权利要求29的应用，其中所述个体是0-3岁的婴儿。
33.权利要求32的应用，其中所述婴儿的血浆苯丙氨酸浓度为360μM至4800μM。
34.权利要求1-7任一项的Av-PAL变体在制备用于治疗个体苯丙酮尿症(PKU)的药物中的应用。
35.权利要求34的应用，其中所述PKU是经典严重的PKU。
36.权利要求34的应用，其中所述个体PAH活性缺乏。
37.权利要求36的应用，其中所述个体具有突变的PAH。
38.权利要求37的应用，其中所述突变的PAH在PAH的催化域中包含突变。
39.权利要求38的应用，其中所述突变包含一个或多个选自F39L、L48S、I65T、R68S、A104D、S110C、D129G、E178G、V190A、P211T、R241C、R261Q、A300S、L308F、A313T、K320N、A373T、V388M、E390G、A395P、P407S和Y414C的突变。
40.权利要求34的应用，其中所述个体是人。
41.权利要求34的应用，其中所述药物被制备成与蛋白质限制性饮食联合施用给所述个体。
42.权利要求40的应用，其中所述个体是怀孕女性。
43.权利要求40的应用，其中所述个体是0-3岁的婴儿。
44.权利要求43的应用，其中所述婴儿的血浆苯丙氨酸浓度为360μM至4800μM。
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