CN116478975B - 高活性苯丙氨酸解氨酶突变体及其表达菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高活性苯丙氨酸解氨酶突变体及其表达菌株。本发明采用定向进化对苯丙氨酸解氨酶进行基因突变，并通过高通量筛选获得酶活性显著提高的苯丙氨酸解氨酶突变体，反应1 h，对苯丙氨酸降解率达到38%以上，酶活提升67%以上。并通过蛋白标签的添加，将降解率提升至100%。本发明提供的苯丙氨酸解氨酶突变体及其表达菌株，可将累积的苯丙氨酸代谢掉，避免其在体内蓄积，从而达到治疗苯丙酮尿症的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一种高活性苯丙氨酸解氨酶突变体及其表达菌株，属于生物医药技术领域。
背景技术
芳香族氨基酸裂解酶家族（EC 4.3.1.23-1.25与4.3.1.3）成员包括：苯丙氨酸解氨酶（PAL）、酪氨酸解氨酶（TAL）、组氨酸解氨酶（HAL）。具体地，具有苯丙氨酸解氨酶的PAL具有催化L-苯丙氨酸脱氨形成反式肉桂酸，其在高等植物、酵母、菌类中被发现。由于其能降解苯丙酸的特殊能力，PAL蛋白常被用于治疗基因缺陷的疾病苯丙酮尿症。
苯丙酮尿症(Phenylketonuria)，简称PKU，是先天性氨基酸代谢障碍中最常见疾病，也是一种常染色体隐性遗传病，因苯丙氨酸羟化酶基因突变，导致酶活性降低，苯丙氨酸及其代谢产物在体内蓄积导致的疾病。一般在出生后3-6个月开始出现症状，临床表现有智力、运动发育落后、皮肤毛发色素减少、鼠尿臭味等。如果未得到及时治疗，高量的苯丙氨酸累积会引起较为严重的医学问题，例如癫痫发作、智力障碍等。
目前，常见治疗苯丙酮尿症的药物大多是化学药物，存在较高的毒副作用、容易产生耐药性等缺点，生物药物中，现阶段治疗PKU的特效药是注射PEG修饰后的重组PAL蛋白（PEG-PAL），可以将人血浆中的苯丙氨酸浓度降低至较为安全的浓度水平，但PEG-PAL会引起较为严重的免疫反应；不同于PEG-PAL侵入性制剂及治疗方法，国内外也有口服PAL制剂的研究，口服递送的优势是无免疫排斥反应，但是缺点亦较为明显，口服的PAL会被肠胃内的胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等分解。无论是侵入式注射剂，还是口服式蛋白剂，首要解决的都是在减少药物用量的前提下提高PAL蛋白的催化活性及稳定性，因此天然PAL的定向改造尤为重要。
酶的定向进化（Directed evolution），是一种蛋白质的非合理设计，可以人为的创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外改造基因，并定向选择出所需性质的突变酶。酶的定向进化分为理性设计和非理性设计。酶分子的理性设计是指，利用生物化学、晶体学、光谱学等方法对天然酶或其突变体行研究，获得酶分子特征、空间结构、结构和功能之间关系以及氨基酸残基功能等方面的信息，以此为依据对酶分子进行改造；相对应的是，不需要准确的结构信息，通过随机突变、基因改组、定向筛选等方法对其进行改造，称之为酶分子的非合理设计。其中非理性设计的实用性强、成本低，可以通过酶学性质筛选随机突变，获得酶活性显著提升的突变酶分子。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明通过酶的定向进化技术获得苯丙氨酸解氨酶活性显著提升的突变酶分子，并提供了表达该突变体的工程菌株。
本发明的第一个目的是提供一种高活性苯丙氨酸解氨酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的苯丙氨酸解氨酶突变为氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的苯丙氨酸解氨酶突变体。
进一步地，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的苯丙氨酸解氨酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第二个目的是提供一种编码所述苯丙氨酸解氨酶突变体的基因。
本发明的第三个目的是提供一种携带所述基因的表达载体。
进一步地，所述表达载体采用pET23b或pET28a为载体。
本发明的第四个目的是提供一种表达所述苯丙氨酸解氨酶突变体的表达菌株。
进一步地，所述表达菌株还包括采用SUMO蛋白标签、GST蛋白标签或GroE蛋白标签促进苯丙氨酸解氨酶突变体表达。
进一步地，所述表达菌株是以大肠杆菌为宿主。
进一步地，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21 DE3。
本发明的第五个目的是提供所述苯丙氨酸解氨酶突变体在制备治疗苯丙酮尿症的药物中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明采用定向进化对苯丙氨酸解氨酶进行基因突变，并通过高通量筛选获得酶活性显著提高的苯丙氨酸解氨酶突变体，反应1 h，对苯丙氨酸降解率达到38%以上，酶活提升67%以上。并通过蛋白标签的添加，将降解率提升至100%。本发明提供的苯丙氨酸解氨酶突变体及其表达菌株，可将累积的苯丙氨酸代谢掉，避免其在体内蓄积，从而达到治疗苯丙酮尿症的目的。
附图说明
图1为混合标准样品液相检测色谱图；
图2为苯丙氨酸标准样品液相检测标准曲线；
图3为不同来源苯丙氨酸解氨酶的活性比较；
图4为AVPAL突变酶分子活性检测；
图5为AVPAL突变酶苯丙氨酸降解能力14天稳定性检测；
图6为表达元件优化后活性检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例中所涉及的各个参数的测定方法：
苯丙氨酸作为反应的底物，通过检测苯丙氨酸在反应体系中的降低情况，建立并优化了液相色谱检测方法，该法能实现对苯丙氨酸和肉桂酸的同步检测，检测采用岛津高效液相色谱LC-2050C，检测条件参数如下：
色谱柱：Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；
流动相：1%乙酸和乙腈；
柱温：40 ℃；
流速：0.8 mL/min；
梯度洗脱：
0-8 min，1%乙酸—乙腈(95: 5)渐变至1.5%乙酸—乙腈(0: 100)；
8-13 min，保持1%乙酸—乙腈(0: 100)；
13-14 min， 1%乙酸—乙腈(0: 100)渐变至1.5%乙酸—乙腈(95: 5)；
14-23 min，保持1%乙酸—乙腈(95: 5)。
检测：紫外，波长260 nm；
进样量：10µL。
在以上条件下，对混合标准样品进行上机检测，如图1所示，结果表明1%的乙酸-乙腈体系中的两种被检测物质得到良好分离，峰形正常，并且可以实现连续进样检测；基于以上检测方法，建立了高效液相色谱测定溶液中苯丙氨酸的标准曲线，如下图2所示。
实施例中SOC培养基：
2% 胰蛋白胨 、0.5% 酵母提取物、0.05% NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl2、10mMMgSO4、20 mM D-葡萄糖，调节至pH7.5。
实施例1：苯丙氨酸解氨酶降解苯丙氨酸能力的研究
选择了5种不同来源的苯丙氨酸解氨酶，分别为AVPAL（氨基酸序列SEQ ID NO.1）、RtPAL（氨基酸序列SEQ ID NO.3）、ZmPAL（氨基酸序列SEQ ID NO.4）、TcPAL（氨基酸序列SEQID NO.5）、RsPAL（氨基酸序列SEQ ID NO.6）。其中鱼腥藻（Anabaena variabilis）来源的PAL为主要研究对象(命名为AVPAL，核苷酸序列SEQ ID NO：2)，以质粒pET28a作为表达载体，以其核苷酸序列设计引物进行扩增，目的基因经过PCR扩增后通过infusion方法连接至表达载体，验证序列无误后进行发酵检测。
具体如下：质粒pET28a使用BamHI和HindIII双酶切后按照诺唯赞胶回收盒(DC301-01)说明进行纯化回收。使用引物AVPAL-F和AVPAL-R以及pUC57-AVPAL作为模板，PCR扩增得到AVPAL片段，胶回收纯化(DC301-01)；使用引物RtPAL-F和RtPAL -R以及pUC57-RtPAL作为模板，PCR扩增得到RtPAL片段，胶回收纯化(DC301-01)；使用引物ZmPAL-F和ZmPAL -R以及pUC57-ZmPAL作为模板，PCR扩增得到ZmPAL片段，胶回收纯化(DC301-01)；使用引物TcPAL-F和TcPAL -R以及pUC57-TcPAL作为模板，PCR扩增得到TcPAL片段，胶回收纯化(DC301-01)；使用引物RsPAL-F和RsPAL -R以及pUC57-RsPAL作为模板，PCR扩增得到RsPAL片段，胶回收纯化(DC301-01)；将纯化后的上述片段使用诺唯赞infusion连接试剂盒(C115-01)进行连接，电转化大肠杆菌BL21 DE3，经过测序验证得到含有正确的阳性克隆：pET28a-AVPAL、pET28a-RtPAL、pET28a-ZmPAL、pET28a-TcPAL、pET28a-RsPAL；挑取阳性克隆单克隆制备种子液，经发酵、诱导、测定苯丙氨酸解氨酶活性，经检测不同来源PAL的苯丙氨酸降解活性排序为：AVPAL＞RtPAL＞ZmPAL＞RsPAL＞TcPAL，结果如图3所示。
表1 扩增引物
实施例2：AVPAL的定向进化
以鱼腥藻（Anabaena variabilis）来源的苯丙氨酸解氨酶(命名为AVPAL，SEQ IDNO：2)作为模板，使用易错PCR的方法构建随机突变文库。以质粒pET23b作为表达载体，目的基因经过易错PCR扩增后通过infusion方法连接至表达载体；以发明人自主研发的高通量筛选技术进行突变蛋白的活性筛选。
具体如下：质粒pET23b、使用BamH I和HindIII双酶切后按照胶回收盒 (DC301-01)说明进行纯化回收；pUC57-AVPAL作为模板，AVPAL-F、AVPAL-R作为引物，利用易错PCR的方法进行扩增，得到AVPAL随机突变序列；胶回收纯化(DC301-01)，将纯化后的上述片段使用T4 DNA连接酶进行连接，电转化大肠杆菌BL21 DE3，二代测序验证易错PCR的突变效率，得到突变文库。
挑取大量单克隆至SOC液体培养基中，37℃振荡培养12 h，按照2％(v/v)接种量接种扩大培养12 h，5000×g离心10min收集菌体，0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 7 .0)洗2遍去除表面杂质，重悬于含有1 mM苯丙氨酸的0 .1 M磷酸盐缓冲液(pH 7 .0)中，细胞终浓度(1 .8±0 .7)×109 cfu/L，每小时取样测定反式肉桂酸(TCA)浓度。筛选得到AVPAL若干突变体，分别为17B12、17C1、18H1、21H3、23B2、23G8、24G4；反应1 h，AVPAL苯丙氨酸降解率为23％，18H1降解率为27％，酶活提升17％；反应1 h，23G8苯丙氨酸降解率为38.5％，酶活提升率为67.5％。经测序比对发现17B12、17C1、21H3为无义突变，18H1的突变位点为A7G、K32R、I330V，突变后氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示； 23G8的突变位点为Q292K，突变后氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。综上所述， 23G8酶活表现较好且存在有效突变，可作为候选蛋白进行下一步研究，结果如图4所示。
对23G8苯丙氨酸降解能力稳定性进行测试：将保存在pH为7.5的含15％甘油的磷酸盐缓冲液中，并在-80℃冻存的菌体，按照CFU为1×109与pH为2.5的人工胃液1/1混合，一小时后开始测定其苯丙氨酸降解能力，间隔24小时后再次测定其苯丙氨酸降解能力，连续测定14天，探究胃酸对其降解活性的影响，结果如图5所示， 23G8在14天内苯丙氨酸降解能力稳定。
实施例3：表达元件优化
合成生物学基础技术的目标在于创造一个包含合成和设计基因的改良生物体，为进一步提高工程菌株活性，以23G8为示例，通过优化表达元件，构建得到23G8-1、23G8-2、23G8-3多株工程菌株。添加了元件SUMO蛋白标签后，23G8-1降解率为100％，较23G8提高143％；添加了GST蛋白标签后，23G8-2降解率为80％，较23G8提高95％；添加了GroE蛋白标签后，23G8-3降解率为100％，较23G8提高143％。综上所述，23G8-1、23G8-2、23G8-3具有优异的苯丙氨酸降解活性，可作为候选菌株进行进一步研究，结果见图6。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.一种高活性苯丙氨酸解氨酶突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如SEQID NO.1所示的苯丙氨酸解氨酶突变为氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的苯丙氨酸解氨酶突变体。
2.根据权利要求1所述苯丙氨酸解氨酶突变体，其特征在于，所述氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的苯丙氨酸解氨酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种编码权利要求1所述苯丙氨酸解氨酶突变体的基因。
4.一种携带权利要求3所述基因的表达载体。
5.根据权利要求4所述表达载体，其特征在于，所述表达载体采用pET23b或pET28a为载体。
6.一种表达权利要求1或2所述苯丙氨酸解氨酶突变体的表达菌株。
7.根据权利要求6所述表达菌株，其特征在于，所述表达菌株还包括采用SUMO蛋白标签、GST蛋白标签或GroE蛋白标签促进苯丙氨酸解氨酶突变体表达。
8.根据权利要求6所述表达菌株，其特征在于，所述表达菌株是以大肠杆菌为宿主。
9.根据权利要求8所述表达菌株，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21 DE3。
10.权利要求1或2所述苯丙氨酸解氨酶突变体在制备治疗苯丙酮尿症的药物中的应用。
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