CN110564867B - 一种秦川牛cfl1基因的snp分子标记及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子遗传学领域，提供了一种秦川牛CFL1基因的SNP分子标记及其检测方法，以包含CFL1基因的待测秦川牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增秦川牛CFL1基因；用限制性内切酶HinfI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定秦川牛CFL1基因第2052位的碱基多态性。由于这一突变位点与秦川牛肉用性状(体长，胸宽，胸深，体重)密切关联，且该方法是一种在DNA水平上筛查和检测与秦川牛生长性状密切相关的分子遗传标记的方法，因此，可用于秦川牛的辅助选择和分子育种，以加快秦川牛良种繁育速度。

Description

一种秦川牛CFL1基因的SNP分子标记及其检测方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及以秦川牛的功能基因的单核苷酸多态性(SNP)作为分子遗传标记，特别涉及一种秦川牛CFL1基因的SNP分子标记及其检测方法。

背景技术

在肉牛育种中，人们期望通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密连锁的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

分子育种，即分子标记辅助选择育种(Molecular Mark-Assist Selection,MAS)，该技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良，它是利用现代分子生物学和传统遗传育种相结合的方法，进行新品种选育。

基因多态性是指不同物种或者同一物种内的不同个体间基因组序列的差异，这些差异是由于染色体中DNA等位基因中核苷酸改变引起，主要是包括碱基的替换、***、缺失以及重复序列拷贝数的变化。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)是由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心的学者Lander(1996)提出的一类遗传标记***，就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。SNP作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。SNP是基因组中存在的一种数量非常丰富的变异形式，占人类基因组中遗传多态性的90％以上。SNP与罕见的变异不同，通常在种群中频率等于或小于1％的此种变异被称为突变，而只有频率大于1％时才被称为单核苷酸多态性。它的变异形式有：颠换、转换、***和缺失等，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。具有转换型的碱基变异的SNPs约占2/3。

根据基因组中单核苷酸多态性产生的位置，可分为以下3类：基因编码区单核苷酸多态性(Coding-region SNPs,cSNPs)、基因周边单核苷酸多态性(Perigenic SNPs,pSNPs)以及基因间单核苷酸多态性(Intergenic SNPs,iSNPs)。

研究表明，位于编码区内的cSNP比较少，由于它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此，编码区内的cSNP的研究更受关注。基因编码区内的cSNP又可分为2种：一种是编码区内的同义cSNP(Synonymous cSNP)，即SNP所致编码序列的改变并不会影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列的改变；另一种是编码区内的非同义cSNP(Non-Synonymous cSNP)，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而导致蛋白质中氨基酸序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。

由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs：即DNA序列测定方法、聚合酶链反应—单链构象多态(Polymerase Chain Reaction-SingleStrand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP)与DNA测序结合法、等位特异性PCR(Allele Specific PCR，AS-PCR)方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。

本研究检测基因SNPs所使用的限制性片段长度多态性-聚合酶链反应(Restriction Fragment Length Polymorphism-Polymerase Chain Reaction，RFLP-PCR)方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后设计上下游引物用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖、聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。RFLP-PCR方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。

Cofilin是一种低分子量的肌动蛋白结合蛋白，分子量为20kDa，在体内调节肌动蛋白的装配，该蛋白家族广泛分布于生物体内各种细胞内，包括肌肉细胞和非肌肉细胞。CFL1(Cofilin 1)基因是肌动蛋白结合蛋白cofilin家族的新成员，在细胞迁移、增殖、吞噬以及各类癌症的发生发展中都发挥着重要作用。有研究表明，cofilin的表达形式会随着健康小鼠肌细胞的生长发育而发生相应的改变，也即骨骼肌在胚胎发育时期，均能检测到CFL1基因和CFL2基因的表达，但是，随着肌肉生长发育的进行，当生肌细胞完全分化到终末期时，CFL2基因逐渐取代CFL1基因的表达，直至CFL1基因表达消失，且CFL1^-/-敲除型胚胎，表现为小鼠胚胎发育9.5天后死亡，不能正常成活完成胚胎发育。因此，CFL1基因遗传变异或SNP位点在动物生产实践中对多种生长发育相关性状具有重要作用。

关于动物CFL1基因遗传变异的研究国内外多见于人、鼠等动物，而未有大型家畜牛CFL1基因遗传变异或SNP研究的报道。由于目前中国秦川牛CFL1基因遗传变异领域的研究匮乏，使该基因位点的功能研究及该基因遗传变异与经济性状(如：产肉、生长发育等性状)关联的研究成为空白。

发明内容

本发明解决的问题在于提供牛CFL1基因单核苷酸多态性检测方法及其应用，利用PCR-RFLP方法针对其基因位点上的同义突变可能导致的mRNA稳定性及定位改变、基因内顺式调控元件的活性变化、基因转录强度改变这一过程进行检测，提前淘汰产生同义突变的个体，加快具有优质经济性状黄牛种群的建立。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种秦川牛CFL1基因的SNP分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述序列自5’端起第2052位是SNP位点，其碱基为T或C。

进一步的，所述SNP分子标记的CC基因型个体的生长速度显著高于TT基因型和TC基因型个体。

本发明还提供一种引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，其中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供一种用于上述SNP标记的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求3所述的引物对。

本发明还提供上述秦川牛CFL1基因的SNP分子标记在动物育种中的应用。

本发明还提供上述秦川牛CFL1基因的SNP分子标记在鉴定动物生长性状中的应用。

一种秦川牛CFL1基因的单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤：

以包含CFL1基因的待测秦川牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增秦川牛CFL1基因；用限制性内切酶HinfI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定秦川牛CFL1基因第2052位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P为：

上游引物：5’-CTTTTTCTTTGGCTGCTATTC-3’

下游引物：5’-TCTCCTTGCCCTCCTCCAGGATGAG-3’

进一步的，所述的PCR扩增反应程序为：

94℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，每个循环-1℃，72℃延伸25s，18个循环；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸25s，20个循环；72℃延伸10min。

进一步的，所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3％。

进一步的，CFL1基因第2052位碱基多态性为：TT型表现：367bp和28bp；TC型表现：395bp、367bp和28bp；CC型表现：395bp。

有益效果：

本发明利用RFLP-PCR方法对黄牛CFL1基因第2052位点上的突变可能产生编码蛋白构象发生变化的单核苷酸多态性进行检测，当位点由T突变为C时，在转录过程中肽链138位天冬酰胺发生同义突变，导致mRNA稳定性及定位的改变，影响基因内顺式调控元件的活性，导致基因转录强度改变。由于cofilin的高度保守性，CFL1基因位点的突变，直接导致具有重要生理功能的CFL1基因所编码蛋白的空间构型也发生相应变化，从而导致肌肉生长发育相关生物学功能的改变。

本发明公开了与秦川牛生长性状相关的功能基因CFL1的核苷酸多态性，该核苷酸多态性能够作为一个分子遗传标记，利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。

针对上述CFL1基因的SNP多态性，本发明还公开了其检测方法，通过设计特定的PCR引物扩增片段，能够用RFLP-PCR方法简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。

本发明对CFL1基因的SNP进行了基因分型和基因频率分析，以及与秦川牛生长性状之间进行了关联分析；结果显示CFL1基因的核苷酸多态位点能够成为分子遗传辅助育种的标记。

本发明提供的检测方法为CFL1基因的SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国秦川牛生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的秦川牛种群。

附图说明

图1为秦川牛血样基因组DNA电泳检测图；

图2为秦川牛CFL1基因PCR扩增的395bp片段的电泳图；

图3为秦川牛CFL1基因第2外显子395bp PCR产物利用限制性内切酶HinfI切割后，电泳检测CFL1基因多态性的电泳结果图；由于28bp较小，故在琼脂糖凝胶电泳分析中不可见；

图4为秦川牛CFL1基因2052位SNP的不同基因型测序峰图。

具体实施方式

本发明以CFL1基因保守序列设计引物对P扩增CFL1基因第2外显子395bp片段，以秦川牛基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物经测序后寻找该扩增片段的单核苷酸多态位点；针对发现的单核苷酸多态位点进行生长性状关联性分析，并提供其检测方法，使得CFL1基因的核苷酸多态性成为一种能够快速、方便检测的分子遗传标记，为加快建立具有优质经济性状的秦川牛种群提供依据。

a、秦川牛CFL1基因多态性的检测

1、秦川牛血样的采集及处理

取秦川牛血样10mL，加入0.5mol/L的EDTA 500μL抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80℃保存备用。

本发明采用秦川牛品种，具体如表1所示。

表1秦川牛样品来源表

2、血样基因组DNA的提取

(1)将冷冻血样室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf管，加入等体积PBS缓冲液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色。

(2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h。DNA抽提缓冲液的配制：0.6057g的Tris、18.612g的EDTA和2.5g的SDS加超纯水500mL，灭菌、调pH至8.0，4℃保存备用。

(3)加蛋白酶K 3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化至澄清。

(4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次。

(5)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。

(6)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min。

(7)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

(8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净。

(9)干燥后的DNA溶于80～100μL的TE-缓冲液或超纯水，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

(10)500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到50μg/mL。

(11)5℃保温10h左右。

(12)等体积苯酚、氯仿、异戊醇(25：24：1)和氯仿分别抽提一次。

(13)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中。

(14)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA。

(15)倒掉液体，70％乙醇洗涤后晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

3、DNA池的构建

(1)1％琼脂糖凝胶电泳检测

选部分DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，选择DNA样品条带均一、无拖尾、无降解的样品进行DNA池的构建。

(2)OD值测定

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA质量(ng)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数

(3)品种DNA池的构建

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，然后从秦川牛100个浓度为50ng/μL的DNA样品中取10μL混合构建成品种DNA池；

秦川牛血样基因组DNA的检测结果见图1，从图中可以看出秦川牛基因组DNA的质量非常高。

4、PCR扩增

以秦川牛DNA池为模版，用设计的引物对P进行PCR扩增，PCR总反应体系为25μL，见表2；PCR总反应程序，见表3。

表2 PCR反应体系

体系成分	体积(μL)
		2*Reaction Mix	12.5
上游引物(10pmol/L)	1.0
		下游引物(10pmol/L)	1.0
Taq DNA聚合酶(0.5U/μL)	0.3
		DNA模板(50ng/μL)	1.0
灭菌超纯水(H<sub>2</sub>O)	9.2
		总体积	25.0

表3 PCR反应程序

5、PCR产物纯化和测序

PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图2所示，可以清楚看到395bp的条带；之后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒(北京天根生物公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤如下：

(1)首先向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。

(3)向胶块中加入等体积溶液PC，60℃水浴放置10分钟左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

(4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

(5)向吸附柱中加入700μL漂洗液，12000rpm离心1分钟，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。

(6)向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000rpm离心1分钟，倒掉废液，将离心吸附柱放入收集管中，12000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，彻底晾干。

(7)将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液，室温放置2分钟。12000rpm离心1分钟收集DNA溶液。

(8)为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤7。

把以秦川牛DNA池为模板的PCR纯化产物送上海生物工程有限公司进行双向测序。秦川牛CFL1基因目的片段395bp的测序结果如图4所示。

对测序峰图进行分析，其中在同一位点有两个不同峰的是发生了单核苷酸突变；位于秦川牛CFL1基因的第2052位出现了T、C两种检测结果，即为筛查到的秦川牛CFL1基因的SNP多态性，该位点是为T或C的碱基多态性。

b、秦川牛CFL1基因T>C突变多态性的RFLP-PCR检测

由于筛查到的碱基多态性为非自然酶切位点，不能被常用的内切酶进行PCR-RFLP来鉴定。因此，通过改变突变位点向后一位碱基A为C，引入限制性内切酶HinfI酶切位点。当秦川牛CFL1基因第2052位未发生T>C突变时，即为突变前T，通过引入酶切，利用引物对P扩增的CFL1基因序列gaatc，为限制性内切酶HinfI识别位点，可直接通过HinfI对扩增的395bp目的片段酶切进行基因分型。

1、RFLP-PCR引物设计

针对测序峰图包含的第2052位的T>C突变，利用引物设计软件Primer5.0，设计酶切引物对P，通过引物酶切，在突变位点的上下游区段设计引物，具体引物设计为：

上游引物：5’-CTTTTTCTTTGGCTGCTATTC-3’

下游引物：5’-TCTCCTTGCCCTCCTCCAGGATGAG-3’

上述引物能够扩增秦川牛CFL1基因第2外显子395bp片段。

2、RFLP-PCR反应条件

PCR产物扩增体系和反应条件分别如表2和表3所述，PCR扩增产物的1.5％琼脂糖凝胶电泳图谱如图2所示，可以看到设计的引物对P能够扩增395bp的片段。

3、PCR扩增产物的HinfI酶切

(1)20μL HinfI酶切反应体系：10μL PCR产物，10×buffer(缓冲液)

2.0μL，HinfI(10U/μL)为0.6μL，7.4μL灭菌纯水(H₂O)。

(2)酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化12～16h。

(3)HinfI消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析。

用3.0％的琼脂糖凝胶，120V电压电泳1小时，核酸染料染色检测酶切结果，用BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像分析***照相分析，并判型、记录其基因型；

由于PCR-RFLP扩增的395bp片段中不包含其它的HinfI酶切识别位点，当CFL1基因第2052位未发生T>C突变时，PCR扩增的CFL1基因产物被限制性内切酶HinfI识别后，在g^aatc对扩增片段酶切，将扩增片段切为2段；而当CFL1基因第2052位发生突变时，不能形成新的限制性内切酶HinfI酶切识别位点，扩增片段不能被酶切；

由于秦川牛为2倍体动物，所以当发生T>C的突变时，可形成3种不同的基因型，分别为TT、TC、CC，其PCR-RFLP检测的凝胶结果图如图3所示：

其中，TT基因型为野生型，它的两条DNA链的SNP位点均能被HinfI酶切，表现为367bp和28bp条带；发生突变后的基因型CC两条链的SNP位点均不能被酶切，表现为395bp条带；杂合子TC两条链中的一条SNP位点能够被识别而另一条不能被识别，表现为395bp，367bp和28bp条带；由于28bp较小，故在琼脂糖凝胶电泳分析中不可见，但395bp和367bp片段能鉴别TT型和TC型，根据条带的个数和条带的大小，如图3所示的凝胶电泳检测结果能够很清楚的判定是否发生了点突变，将三种基因型区分开，从而检测其SNP多态性。

(4)不同基因型个体PCR产物的测序验证

利用ABI 377和ABI 3730测序仪对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序；同时，进行SNP位置分析，结果表明包含395bp、367bp和28bp条带的杂合子TC基因型个体其第2052位的测序图的确表示为T或C，如图4c所示，自左向右第4个峰为双峰；而TT基因型、CC基因型分别为T、C，分别如图4a，图4b所示。

c、秦川牛CFL1基因第2052位的SNP作为分子标记在不同秦川牛群体多态性中的应用

1、群体单核苷酸多态性的检测

利用上述的SNP多态性检测方法对秦川牛488份DNA样品，进行SNP多态性的鉴定；统计其SNP位点的频率分布情况。

2、SNP位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+……+N_Aan)/2N。式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个不同的复等位基因；统计结果见表4。

表4秦川牛CFL1基因第2213位SNP基因频率分布表

从表4可以看出:秦川牛的C等位基因频率分别远高于T等位基因，这表明等位基因C可能与生长性状相关。

3、基因效应的关联分析

基因型数据：HinfI识别的基因型(TT、TC和CC)

生长性状数据：体尺数据(体高、十字部高、体长、胸围、胸宽、胸深、

尻长、坐骨端宽、腰角宽、体重)

关联分析模型：

利用SPSS(16.0)软件分析基因位点、公畜、场别效应、年龄和品种效应与生长性状的相关性。先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，利用多元线性模型分析基因型效应。

模型如下：

y_ijklmn＝μ+Genotype_i+S_j+B_k+F_l+Age_m+Xn+e_ijklmn

其中：y_ijklm为个体表型记录；F_l场别效应；S_j为种公畜效应；B_k：品种效应；Age_m为年龄效应；Xn为各种二级和二级以上互作效应,如：Age×Genotype，S_j×Genotype等；e_ijklmn为随机误差；运用SPSS(16.0)软件对数据进行分析，并用最小二乘法拟合线性模型，对各基因型间体尺指标进行差异显著性检验。

结果表明(见表5)：对于HinfI可识别的第2052位的SNP位点，CC基因型为优势基因型；对于体长、胸宽、胸深和体重，CC基因型个体的数值均显著高于TT和TC基因型个体，研究表明体重性状与产肉性状呈正相关，这说明CC基因型可以成为一个提高秦川牛产肉性状育种速度的分子遗传标记。

表5 HinfI多态位点与秦川牛体尺之间的方差分析

注：大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种秦川牛CFL1基因的SNP分子标记及其检测方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3196

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcccggcagc agctgcagcg cctctcgtct tgtaggctct cctagctatc gccttttcgc 60

ttccggaaac atggtgagct gcaggctacg gcgccgcggg ggaggtggcc gcgagtcgat 120

catctgggcg cgcgagaggg aaagggggcg caacgtcggc accctcttcc ccagctcctg 180

ggtctggacg agggtctcgt gctgaggggc gggcggcgcc aggacgcgcg tgcgcgcccg 240

cgggcgccgg ggagggttgg cttggacgtc gctcgcgcgc cccctgggct cccttcccct 300

cccccacccg gctgctgcgc ccgcgcggcc cagggccgtg ggggaggggt ccagggcgcg 360

cgcgcccccg tcccctcgcg gggccgccga gagtcgcttc tcggggacgc gcgtctctac 420

tggaacacgc ggcatccaaa cccgggcccg gggcgacgga ggaaaagcgc gcgagcggtc 480

ttcgcgcgcg ccccccaccc aagggctgtt cctgtctccg cgtcaccctc cctctcgagc 540

ggggtccgtc tcgagagcag gtggcaggga tgcccgcgag gggcgggggc ggtgcggctg 600

gcgggggatg cgggggtgtc ctggcgcagg cgccatcgat taggggcttg caccgcgcgt 660

cacagagcgg accgcgaagg agtcctcggc tgtcctccca ggctggcgag cccctgaagg 720

cgagccgggt tcgcggagta cacccggcgg agactgggac ggcgctcccg gccggcgcgt 780

gcgcacacgg tcaggcctgg ccgctgggcc agaagccgtg gactaacggg gccttcggct 840

ctcccggatg gggcctgagg gtggagtctc gtttagggaa gtgacccagg cgggcaccgc 900

ccggaaacca ccccgtcccc tgtgttcggc ccgagggctg cgagagccga aggttgtgta 960

acttgcccag gcctgcagcg cagggggccg ataagctcgt cggcgcaggc gattccattg 1020

ggttgaggcc ttccgagatg cagctgccgc tgggtatgag tttttttttt ttttcgggga 1080

gggggctgat tctagccgat ctgctttcac cgcctactcc ggaagcggct caatcacgtg 1140

gccggcttcc tctgcagttc cgggagcggg ggcagatttc accgtggacc gtcactccct 1200

ccctggctag ggtgtcccgc aacacgacct acaagtttaa agagctctca gagactgtgg 1260

gcacttgact ttggaccgct gactcctgtc agcgacttgg gggcctgcat ttttcccttg 1320

tgaggcctta attaggggtt tgttgttgct ttggtttggg gagaccccgg cagagaagga 1380

aatgtgtaat aactgctttg aaccgtgctg atgggcttgc tggaactgtt gagtactttt 1440

ggtgggtcct ggttctatgg agatgactag gatctggatc cctttctgct ctacgtgaag 1500

ttctgagtca gcactttatg caaaagctga gactgcgtag aaaacggggt cagtagtctg 1560

tcggttcttt taatttggac tcacatcttg gccgaggctc tgcttctcac aggtcttgga 1620

tctctagcct gcaggatgtc ggggtgggga ggaatgctgt tgaattatgc gatcaaaggt 1680

ctctttttct ttggctgcta ttctgggatt gtgtcacatc tgatcctttg acggtgacct 1740

gggtgggaaa atagtgtcac tagtcctagg aaggggatga gtagtgacct cttggggctg 1800

aggactgtac tttgttggcc tctagacaga tctcctaaca aagcaaaaga gggacttcag 1860

ggcatgtccc agaaactgtc tcctcacgag gtgcgtgtgg tgtggctcat cctctaggcc 1920

tccggtgtgg ctgtctctga tggggtcatc aaagtgttca acgacatgaa agtgcgtaag 1980

tcgtcgacac cagaggaagt gaagaagcgc aagaaggcgg tgctcttctg cctgagtgag 2040

gacaagaaga atatcatcct ggaggagggc aaggagatcc tggtgggtga cgtgggccag 2100

acggtagacg acccctatgc cacctttgtc aagatgctgc cagacaagga ctgccgctac 2160

gccctctatg atgcaaccta cgagaccaag gagagcaaga aggaggacct ggtgttcatc 2220

ttctggtgag ctcctcctgc aggcactttc ccctttgacc tgctctagct ctgccccacc 2280

cccctttccc aggacaggaa ggtctgtggc tccggcttaa tccagacgcc tgcgtgtcag 2340

aggagggtgt tgtaataaaa cacttgtcaa tgaggaactt gatgaaagcg tgaatgctgg 2400

ggcctagctc aggggtttct ggaagttatt tatcgcttga gggcacttgc tggatttgga 2460

ggcaagttct cttgattctt ttctcttcca gggcccctga gtgtgcaccc cttaagagca 2520

aaatgatcta tgccagctcc aaggacgcca tcaagaagaa gctgacgggt aagggccagc 2580

attggtggcg ccatatgccc ttgtgcttgg gccttggctg ctgggtgggg tgaatggcat 2640

ggcccaggag atccctgccc gctggaaggc agcctggtcc cctccatctg ttcagactgg 2700

ctccttccca gctgcagcac cccccacccc cacccttcct gctcacagat gctccctctt 2760

cttccctaca gggatcaagc atgaattaca agcaaactgc tacgaggagg tcaaggaccg 2820

ctgcaccctt gcagagaagc tggggggcag cgctgtcatc tccctggagg gcaagccttt 2880

gtgagccccc tccagccccc tgcctggagc atctggcagc cccagacctg cccacggggg 2940

ttgcaggctg cccccttcct gccagaccgg aggggctggg gggaatccca gcagggggag 3000

ggcagtccct tcaccccagt tgccaaacag cccccccgac cccctggacc ttcctcctcc 3060

ctccacccct gacggttctg gccttcccaa accgcttttg atcttgattc ctcttgggtt 3120

gaaacagacc aagttccccc cccaggaacc cctgtttggg gggggcctgt atttttttta 3180

acgacacccc agttcc 3196

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctttttcttt ggctgctatt c 21

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tctccttgcc ctcctccagg atgag 25

Claims (4)

1.秦川牛CFL1基因的SNP分子标记的检测引物在秦川牛育种或鉴定秦川牛生长性状中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记在如SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第2052位的碱基为T或C，所述检测引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述SNP分子标记为CC基因型的秦川牛体长、胸宽、胸深和体重均高于所述SNP分子标记为TT和TC基因型的秦川牛，选育SNP分子标记为CC基因型的秦川牛。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

以包含CFL1基因的待测秦川牛全基因组DNA为模板，使用所述检测引物， PCR扩增秦川牛CFL1基因；用限制性内切酶HinfI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定秦川牛CFL1基因第2052位的单核苷酸多态性。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3%。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述电泳结果如下：TT基因型的秦川牛电泳条带表现为367 bp和28 bp；TC基因型的秦川牛电泳条带表现为395 bp、367 bp和28 bp；CC基因型的秦川牛电泳条带表现为395 bp。

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