CN101629209B

CN101629209B - 一种检测黄牛Six6基因单核苷酸多态性的方法

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Publication number: CN101629209B
Application number: CN2009100235951A
Authority: CN
Inventors: 陈宏�; 淮永涛; 蓝贤勇; 王璟; 马亮; 屈玉娇; 任刚; 赖新生; 胡沈荣; 雷初朝
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2009-08-14
Filing date: 2009-08-14
Publication date: 2011-12-28
Anticipated expiration: 2029-08-14
Also published as: CN101629209A

Abstract

本发明公开了一种检测黄牛Six6基因单核苷酸多态性的方法，以包含Six6基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛Six6基因；用限制性内切酶HhaI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛Six6基因第2015位的单核苷酸多态性；由于Six6基因功能涉及日增重、体高、体重、体斜长、坐骨端宽等生长性状，本发明提供的检测方法为Six6基因的SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

Description

一种检测黄牛Six6基因单核苷酸多态性的方法

生物技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及一种检测黄牛Six6基因第2015位单核苷酸多态性的方法。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。因此，通常所说的SNPs包括碱基的替换、***、缺失以及重复序列拷贝数的变化。一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起；具有转换型变异的SNPs约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。

在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNPs，根据它们在基因组中分布的位置可分为基因编码区SNPs(cSNPs)、基因周边SNPs(pSNPs)和基因间SNPs(iSNPs)等三类。总的说来，cSNP比较少，因为在外显子内的变异率仅占周围序列的1/5，但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义，因此倍受关注。根据对遗传性状的影响，cSNPs又可分为两种：一种是同义cSNPs，即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的“含义”相同；另一种是非同义cSNPs，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因此，对编码区SNPs的非同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要影响；尤其对于无义密码子突变来说，更可能会导致所编码的蛋白发生重大变化，从而影响它的功能发挥，对个体的表现型产生重要影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。

由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs：即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。

RFLP-PCR方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后引入限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖、聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。RFLP-PCR方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。

Six基因家族已于斑马鱼、人类以及小鼠等许多物种中被鉴定出来。在脊椎动物中，Six基因家族的成员广泛地在许多组织中表达，其在调控胚胎正常的形态发育、器官发育及细胞的分化上扮演着重要的角色。Six6基因属于腺垂体分泌过程中的转录调控因子，主要参与调控体内一些发育相关基因的表达，或者称之为选择基因(selector gene)。这类基因是发育调控基因的最基层层次，其表达受上级发育调控基因和同层次上的其他同源异型基因的作用；从它们表达的多肽组成及性质看，又是一种转录调控因子，直接调节实施基因(realization gene，属结构基因范畴)的表达活性。因此，Six6基因遗传变异或SNP位点在动物生产实践中对胚胎形成、生长激素的调控、垂体分泌、眼睛发育调控等具有重要的作用。

目前，对于Six6基因的研究多在小鼠、海洋鱼及人类上，主要在前脑发育、胚胎发育形成以及眼睛晶状体发育中做出了大量的研究。关于动物Six6基因遗传变异的研究国内外多见于小鼠、海洋鱼等动物，未见黄牛Six6基因遗传变异或SNP研究的报道。目前中国黄牛Six6基因遗传变异领域的研究匮乏，该基因位点的功能研究及其遗传变异与经济性状(如：日增重、出生重、体高、体斜长、胸围、坐骨端宽等性状)关联的研究仍是空白。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种检测黄牛Six6基因单核苷酸多态性的方法，利用RFLP-PCR方法针对其基因位点上的无义密码子突变可能导致编码蛋白构象发生变化的单核苷酸多态性进行检测，提前淘汰掉产生无义密码子突变的个体，加快具有优质经济性状黄牛种群的建立。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种检测黄牛Six6基因单核苷酸多态性的方法，以包含Six6基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛Six6基因；用限制性内切酶HhaI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛Six6基因第2015位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P为：

上游引物：gggctgactg ctgggctta 19；

下游引物：gggcaactca gatgtcacac tcgctggc 28。

所述的PCR扩增反应程序为：

94℃预变性4min，；94℃变性30s，65.5℃退火30s，72℃延伸15s，30～35个循环；72℃延伸10min。

所述聚丙烯酰胺凝胶电泳为聚丙烯酰胺凝胶的质量浓度为10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

所述根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛Six6基因第2015位的单核苷酸多态性为：TT基因型表现为209bp和70bp条带；TC基因型表现为209bp、182bp、70bp和27bp条带；CC基因型表现为182bp、70bp和27bp条带；其中，单核苷酸多态性CC基因型为无义密码子突变。

本发明利用RFLP-PCR方法对黄牛Six6基因第2015位点上的无义密码子突变可能产生编码蛋白构象发生变化的单核苷酸多态性进行检测，当第2015位点由T突变为C时，原有的终止信号TGA发生突变，导致在转录的过程中转录不能及时终止，从而继续延伸直到下次出现转录终止信号TGA为止。当发生突变时，转录过程mRNA多延伸12个碱基，相应的蛋白质多编码了4个氨基酸(肽链由223个氨基酸变为227个氨基酸)，使具有重要生理功能的腺垂体分泌过程中的转录调控因子Six6基因所编码蛋白的空间二、三级构型发生变化，以至影响蛋白的生物学功能；由于，黄牛为二倍体，因此当Six6基因第2015位点的SNP为CC型时为无义密码子突变。

本发明提供的黄牛Six6基因单核苷酸多态性检测方法，针对第2015位点由T突变为C的转换突变，通过引物设计人为的在下游引物的3’端引入碱基错配，当由T变为C时，PCR扩增Six6基因后在错配位置形成限制性内切酶HhaI识别位点，而突变没有发生时，PCR扩增Six6基因后不能形成HhaI识别位点；通过电泳检测分型可以准确、快速、方便的检测Six6基因单核苷酸多态性：不包含279bp条带为CC基因型个体；不包含182bp条带为TT基因型个体；同时包含209bp和182bp条带为TC基因型个体；进而对种群的Six6基因SNP的等位基因频率变化监控。

由于Six6基因功能涉及日增重、体高、体重、体斜长、坐骨端宽等生长性状，本发明提供的检测方法为Six6基因的SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

附图说明

图1为黄牛Six6基因PCR产物电泳

图2为成功引入HhaI酶切位点PCR产物电泳；

图3为黄牛Six6基因包含终止密码子的279bp PCR产物的HhaI酶切电泳结果；

图4为黄牛Six6基因SNP的不同基因型测序图。

具体实施方式

本发明利用RFLP-PCR方法对黄牛Six6基因第2015位点无义密码子突变可能产生编码蛋白构象发生变化的单核苷酸多态性进行检测，下面结合对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

a、黄牛Six6基因含终止密码子区域PCR引物的设计

以NCBI所公布的海福特牛(NC_007308)序列为参考，利用Primer 5.0设计能够扩增包含黄牛Six6基因终止密码子区域的PCR引物，其引物序列如下：

上游引物：gggctgactg ctgggctta 19；

下游引物：agaccaagca acccagcg 18；

以上述引物对黄牛基因组扩增，能够扩增包含黄牛Six6基因(NC_007308序列)终止密码子区域1765bp～2147bp的383bp的基因片段，扩增后片段的电泳检测如图1所示，其中，泳道1～10为检测片段，泳道M为Marker；对扩增的片段进行测序鉴定后，其中，第1988bp～2047bp的序列为如下所示：

cacttcggcc atctccatca cttccagtgattgcccgcca；

当第2015bp(即Six6基因CDS区第667位)的T突变为C时，导致编码第223位的密码子由TGA(如划线所示序列)突变为CGA，从而形成终止密码子突变，即由223Ter突变为223Arg，这样使得翻译延伸12bp，到下一个终止密码子TGA(如框线所示的序列)才终止，所编码的肽链延长了4个氨基酸残基<精氨酸(Arg)～谷丙氨酸(Gln)～精氨酸(Arg)～缬氨酸(Val)>；

由于在2015bp处(SNP位点)无自然酶切位点，不能通过直接酶切检验，而如果在2017bp处人工设计PCR引物错配，由A错配为C；当2015bp由T突变为C时，PCR扩增Six6基因产物的第2014bp～2017bp序列为gcgc，形成了限制性内切酶HhaI的酶切位点，当在2015位点没有突变时，PCR扩增Six6基因产物的第2014bp～2017bp序列为gtgc，限制性内切酶HhaI不能识别；这样就可以对该位点SNP多态性进行检测；因此设计PCR扩增引物P为：

上游引物：gggctgactg ctgggctta 19；

下游引物：gggcaactca gatgtcacac tcgctggc 28；

其中，引入的错配碱基为下游引物第27bp的C；引物P对应扩增的基因片段是Six6基因的1765bp～2043bp的279bp的片段，扩增后片段的电泳检测如图2所示，其中，泳道1～8为检测片段，泳道M为Marker；

当用限制性内切酶HhaI对引物P对应扩增的基因片段酶切消化时，由于1835bp～1838bp还有一处识别位点，因此，能够被切成2段或3段片段。

b、以引物P进行PCR扩增待测黄牛的Six6基因片段

1、黄牛样本采集及基因组DNA提取

1)黄牛样本的采集

本发明具体以3个中国地方黄牛品种的种群作为检测对象，具体采集样本见表1：河南南阳牛(269)，陕西秦川牛(236)，河南平顶山市郏县红牛(435)；

表1黄牛样本的采集

品种	样品数	样品名称	样品来源	采样方式
					南阳牛(NY cattle)	269	血样	采自河南省南阳市黄牛良种繁育场(国家级黄牛保种场)	静脉采血16号针头
秦川牛(QC cattle)	236	血样	采自采自陕西省秦川牛场、陕西省秦川牛良种繁育中心和陕西省大荔县	静脉采血16号针头
					郏县红牛(JX cattle)	435	血样	采自河南省平顶山市郏县郏县红牛育种中心及各村镇	静脉采血16号针头

2)血样基因组DNA的分离、提取、纯化

1)冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf离心管，加入等体积PBS液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色；

2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h；

3)加蛋白酶K至3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清；

4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次；

5)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

6)加氯仿、异戊醇混合液(24∶1)500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

7)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管，直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min；

8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；

9)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净；

10)干燥后的DNA溶于80～100μL的TE液，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

11)500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到50μg/mL；

12)5℃保温10h左右；

13)等体积苯酚、氯仿、异戊醇(25∶24∶1)和氯仿分别抽提一次；

14)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中；

15)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA；

16)倒掉液体，70％乙醇洗涤后晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

3)PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mLEppendorfPCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；

PCR反应体系见表2：

表2PCR反应体系

灭菌超纯水(H₂O)	10.8μL
		2×buffer(内含Mg²⁺、dNTPs等)	12.5μL
引物P上游引物(10pmol/L)	0.5μL
		引物P下游引物(10pmol/L)	0.5μL
Taq DNA聚合酶(2.5U/μL)	0.25μL
		DNA模板(50ng/μL)	0.45μL
总体积	25μL

25μL反应体系包括0.625U Taq DNA聚合酶(北京天根科技有限公司)，2×Buffer 12.5μL(内含Mg²⁺、dNTPs等)(北京天根科技有限公司Mix)，50ng/μL含Six6基因的黄牛基因组DNA 0.45μL，10pmol/μL上、下游引物各0.5μL；

PCR反应程序：

94℃预变性4min；

72℃延伸10min；

对3个黄牛品种的940个样本的基因组DNA进行PCR扩增，获得940个个体的黄牛Six6基因中包含该SNP位点的279bp的DNA片段。

c、HhaI酶切消化PCR扩增的Six6基因片段

1、HhaI酶切反应消化体系(25～30μL)：10～15μL PCR产物，10×缓冲液(含BSA)2.5～3.0μL，HhaI(10U/μL)为1.0～1.5μL，11.5～16.5μL灭菌纯水(H₂O)；

2、酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化5～10h。

d、HhaI消化PCR产物后聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

1)制作10％的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)，200V电压电泳52min，EB染色；

2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像***成像；

3)根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析SNP多态性：

用BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像***照相分析，判断SNP的多态性：

Six6基因的第2015bp由T突变为C时，由于引入了碱基错配，PCR扩增的Six6基因产物的第2014bp～2017bp序列为gcgc，限制性内切酶HhaI识别后在gcg/c对扩增片段酶切，切取27bp的下游引物片段，将扩增片段切为3段；而Six6基因的第2015bp没有发生突变，限制性内切酶HhaI不能识别碱基错配引入的酶切位点，将扩增片段切为2段；

由于黄牛为2倍体，所以黄牛基因组的Six6基因的第2015位的SNP的多态性的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果为：

TT基因型表现为209bp和70bp条带；TC基因型表现为209bp、182bp、70bp和27bp条带；CC基因型表现为182bp、70bp和27bp条带；由于27bp较小，故在聚丙烯酰胺电泳分析中不太清楚，但通过209bp和182bp条带还是能够准确的鉴别TT基因型、TC基因型和CC基因型：不包含279bp条带为CC基因型个体；不包含182bp条带为TT基因型个体；同时包含182bp和209bp条带为TC基因型个体；

如图3所示，其中，泳道1不包含279bp条带，其为CC基因型个体，包含182bp和70bp条带(27bp由于基因片段太小，电泳效果显示不明显)，泳道2、泳道5不包含182bp条带，为TT基因型个体，包含209bp和70bp条带，泳道3同时包含182bp和209bp条带，为杂合子TC基因型个体，包含(209bp、182bp和70bp条带(27bp由于基因片段太小，电泳效果显示不明显)，泳道M为Marker I(600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp)。

4)不同基因型个体PCR产物的测序验证

利用ABI 377和ABI 3730测序仪对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序；同时，进行SNP位置分析，结果表明包含182bp和209bp条带的杂合子TC基因型个体其2015位的测序图的确表示为T或C，如图4a所示，自左向右第7个峰为两个峰，而CC基因型、TT基因型分别为C、T，如图4b、c所示。

e、黄牛Six6基因SNP位点的频率统计分析

1)基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+N_Aa3+N_Aa4+......+N_Aan)/2N

其中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。

在不同黄牛品种Six6基因SNP中的T等位基因频率变化幅度在61.73％～73.73％，C等位基因频率变化幅度在26.27％～38.27％之间，如表4所示。上述基因频率的计算公式为：

P_T＝(2n_TT+n_TC)/2n

P_C＝(2n_CC+n_TC)/2n

其中，n_TT：TT基因型数，n_TC：TC基因型数，n_CC：CC基因型数，n：总数；

在所分析的中国黄牛群体中C等位基因频率在26.27％～38.27％之间，符合动物分子标记育种中SNP大于5.0％～10％的要求，具备群体遗传多样性特征，可作为标记位点进行育种。

表4黄牛Six6基因第2015位SNP基因频率分布表

核苷酸序列表

<110>西北农林科技大学

<120>一种检测黄牛Six6基因单核苷酸多态性的方法

<160>2

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成的引物对P上游引物

<400>1

gggctgactg ctgggctta 19

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成的引物对P下游引物

<400>2

gggcaactca gatgtcacac tcgctggc 28

Claims

1.一种检测黄牛Six6基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，以包含Six6基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛Six6基因；用限制性内切酶HhaI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛Six6基因第2015位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P为：

上游引物：gggctgactg ctgggctta 19；

下游引物：gggcaactca gatgtcacac tcgctggc 28；

根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛Six6基因第2015位的单核苷酸多态性为：TT基因型表现为209bp和70bp条带；TC基因型表现为209bp、182bp、70bp和27bp条带；CC基因型表现为182bp、70bp和27bp条带；其中，单核苷酸多态性CC基因型为无义密码子突变。

2.如权利要求1所述的检测黄牛Six6基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的PCR扩增的反应程序为：

94℃预变性4min；94℃变性30s，65.5℃退火30s，72℃延伸15s，30～35个循环；72℃延伸10min。

3.如权利要求1所述的检测黄牛Six6基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，聚丙烯酰胺凝胶的质量浓度为10％。