CN101816644B - 一种紫杉醇与苯丙氨酸的组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种紫杉醇与苯丙氨酸的组合物及其制备方法，其中，该组合物中紫杉醇与苯丙氨酸的重量比为1∶0.01～0.8。本发明还提供了该组合物注射液的制备方法，以及该组合物在制备用于抗癌药物中的用途。

Description

一种紫杉醇与苯丙氨酸的组合物及其制备方法

1、技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种紫杉醇与苯丙氨酸的组合物及其制备方法，以及在制备用于治疗卵巢癌、乳腺癌及非小细胞肺癌等药物中的用途。

2、背景技术

紫杉醇属紫杉类药物(Taxoids)。紫杉类药物是由紫杉的树干、树皮或针叶中提取或半合成的有效成分。1971年美国化学家Wani等从知叶红豆杉Taxus breuifilia树皮中分离出具有抗癌活性的紫杉烷二萜化合物--紫杉醇。紫杉醇具有独特的抗肿瘤作用，属有丝***抑制剂或纺垂体毒素(Spindle poison)，和目前常用的化疗药作用机理不同，它是诱导和促进微管的装配。紫杉醇具有聚合和稳定微管的作用，它能与微管蛋白质结合，形成稳定的微管束，致使快速***的肿瘤细胞在有丝***阶段被牢牢固定，将癌细胞停止在G2晚期或M期，抑制细胞复制，阻止癌细胞增殖，使癌细胞复制受阻断而死亡。这一奇特的功效引起了NCI(美国国立癌研究所)的高度重视，促进了临床试验工作的进行。现在通过多年的临床应用证明，紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌及非小细胞肺癌的一线和二线治疗，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效，而且在众多的临床试验和临床应用过程中发现其临床适应症还有进一步扩展的可能。

据文献报道，肿瘤病人滴注紫杉醇后血浆中药物呈双相消除，消除t_1/2平均为5.3-17.4小时。89-98％的药物与血浆蛋白结合，血浆C_max与剂量及滴注时间相关。尿中仅有少量原形药排出。由海南轻骑海药研制的紫杉醇注射液II期临床试验显示：333例进入临床研究，167例接受了紫杉醇的单药化疗，166例接受了紫杉醇加顺铂或阿霉素或其它药物治疗，紫杉醇单药化疗的有效率如下：卵巢癌37％，乳腺癌39％，非小细胞肺癌31％，小细胞肺癌40％，鼻咽癌67％，紫杉醇联合化疗的有效率如下：卵巢癌38％，乳腺癌44％，非小细胞肺癌31％，小细胞肺癌40％，鼻咽癌44％。由此可见，紫杉醇是非常有效的抗癌药物，也是最主要的抗癌药物。

紫杉醇在水中的溶解度很小，几乎不溶于水(＜0.004mg/mL)，口服生物利用度差，只能通过静脉注射给药，而且，对注射液的理化稳定性的要求也日益提高。现在临床常用的紫杉醇制剂是用聚氧乙烯蓖麻油与无水乙醇1∶1混合制成的油剂，其中的聚氧乙烯蓖麻油起到增加紫杉醇水溶性的作用，但是聚氧乙烯蓖麻油量大时会在体内降解，释放组胺，从而引起过敏反应。虽然紫杉醇的抗癌效果很好，但是它靶向癌细胞的能力并不是很强。这些都限制了紫杉醇在临床上的应用。

下图是紫杉醇的结构式：

为了克服紫杉醇水溶性差及副作用的问题，同时防止紫杉醇在溶液型注射液中的氧化、水解，使制品的理化稳定性明显提高，使紫杉醇注射液在应用过程中的安全性大大增强，临床上迫切需要一种药物来解决这些问题。

苯丙氨酸是人体八种必需的氨基酸之一，研究表明，以氨基酸为载体把抗癌药物的分子或基因导入癌瘤区，就能达到既抑制癌瘤生长，又能降低原肿瘤药物的毒副作用，而这些氨基酸载体中以苯丙氨酸为最理想，其效果是其他氨基酸的3-5倍。同时，苯丙氨酸也是注射剂中常用的增溶剂之一。

3、发明内容

本发明通过大量实验惊奇的发现，紫杉醇与苯丙氨酸以一定比例组合后，解决了其水溶性和稳定性的问题，副作用也相应的减小，方便临床用药，并且加入苯丙氨酸可起到协同增效作用，比单用紫杉醇更能增强抗癌活性。

本发明的目的是提供含有紫杉醇与苯丙氨酸的组合物，该组合物增强抗癌活性及降低副作用。

本发明的另一目的是提供含有紫杉醇与苯丙氨酸的组合物的注射液，该注射液的水溶性及稳定性好，可以较长时间贮存。

本发明的再一目的是提供含有紫杉醇与苯丙氨酸的组合物的注射液的制备方法，该方法制得的紫杉醇与苯丙氨酸的组合物的注射液制备成本低，质量可控。

本发明的还一目的是提供含有紫杉醇与苯丙氨酸的组合物在制备抗癌药物中的应用。

本发明提供了含有紫杉醇与苯丙氨酸的组合物及其制备方法，技术方案如下：

本发明提供的含有紫杉醇与苯丙氨酸的组合物，其特征在于，所述的紫杉醇与苯丙氨酸的重量比为1∶0.01～0.8。

所述的含有紫杉醇与苯丙氨酸的组合物，其特征在于，紫杉醇与苯丙氨酸的重量比优选为1∶0.05～0.5。

所述的含有紫杉醇与苯丙氨酸的组合物，其特征在于，紫杉醇与苯丙氨酸的重量比进一步优选为1∶0.1～0.3。

所述的含有紫杉醇与苯丙氨酸的组合物，其特征在于，紫杉醇与苯丙氨酸的重量比再一步优选为1∶0.2。

所述的含有紫杉醇与苯丙氨酸的组合物，其特征在于，紫杉醇与苯丙氨酸的组合物为注射液。

所述的含有紫杉醇与苯丙氨酸的组合物的注射液，其特征在于，注射液中的增溶剂为聚氧乙烯蓖麻油，溶剂为无水乙醇。

所述的含有紫杉醇与苯丙氨酸的组合物的注射液，其特征在于，聚氧乙烯蓖麻油和无水乙醇的体积比为1∶2。

所述的含有紫杉醇与苯丙氨酸的组合物的注射液，其特征在于，含有紫杉醇与苯丙氨酸组合物的注射液的制备方法为：

(1)配辅液：聚氧乙烯蓖麻油加干燥的分子筛，充氮，密封三天备用；活性炭活化后密封在干燥器中备用；分子筛用无水乙醇洗至乙醇透明，挥去乙醇，干燥，放凉密封在干燥器中备用；将聚氧乙烯蓖麻油、乙醇和活性炭混合(不锈钢容器)，超声搅拌。

(2)辅液无菌压滤：用微孔滤膜无菌压滤，称重，计算需补加无水乙醇量；

(3)溶主药：主药在真空干燥箱内干燥，精密称取主药，加入到步骤(2)的滤液中，补加无水乙醇冲洗，充高纯氮气，密封，轻摇，超声至样品完全溶解；

(4)溶液无菌压滤：将溶液超声，用微孔滤膜无菌压滤；

(5)分装及封口：分液器洗净，烘干；初滤液调节装量，边分装边冲高纯氮气；分装后迅速封口，即得。

所述的含有紫杉醇与苯丙氨酸的组合物，其特征在于在制备抗癌药物中的应用。

本发明的含有紫杉醇与苯丙氨酸的组合物及其制备方法与最接近的现有相近技术相比，

具有以下优点：

本发明通过加入苯丙氨酸，提高了紫杉醇的水溶性，方便临床用药；

大大降低了过敏等副作用，同时，还增加了其抗癌活性；

本发明通过对紫杉醇处方和注射液工艺的改进，使所制得的紫杉醇注射液稳定性提高，同时，所得产品起效快；

剂量可控，外观优良；

制作工艺简单，使用可靠、方便，安全实用，能降低生产成本，适用于实现工业化生产。

以下通过实验例进一步阐述本发明的紫杉醇与苯丙氨酸的组合物的有益效果，但不应将此理解为本发明的紫杉醇与苯丙氨酸的组合物仅具有下列有益效果。

实验例1溶剂乙醇与增溶剂聚氧乙烯蓖麻油的配比及稳定性筛选实验

以乙醇与聚氧乙烯蓖麻油不同的体积比混合后在低温下考察溶液是否稳定。

1、实验方法

聚氧乙烯蓖麻油加17.5％(m/v)干燥的分子筛，充氮、密封三天备用。活性炭在121℃活化2小时，密封在干燥器中备用。分子筛用无水乙醇洗至乙醇透明，挥去乙醇，150℃干燥5小时，放凉密封在干燥器中备用。

将干燥好的聚氧乙烯蓖麻油与乙醇按不同体积比混合，测试在低温下溶液稳定性。

2、实验结果和结论

表1乙醇与聚氧乙烯蓖麻油的配比及稳定性筛选实验

结论：以上试验表明，乙醇与聚氧乙烯蓖麻油体积比为2∶1时最为稳定，液体粘稠度适宜，易于过滤，有利于生产。

实验例2制备工艺中的条件筛选

处方及工艺依据分析表明，制备工艺主要有两个关键条件：干燥、充氮。干燥主要因主药难溶于水，且增溶剂与水不混溶。充氮主要防止主药的氧化和聚氧乙烯蓖麻油的腐败。

1、实验方法

制备三种制剂，分别比较在对聚氧乙烯蓖麻油进行干燥处理和未处理所制备的紫杉醇注射液的外观及充氮和未充氮条件下制备的制剂的有关物质含量。

制剂一：按照“制备方法”中提及的制备制剂一；

制剂二：“配辅液”过程中，聚氧乙烯蓖麻油不经过分子筛干燥，其他部分按照“制备方法”中提及的制备制剂二；

制剂三：“配辅液”过程中，聚氧乙烯蓖麻油加分子筛干燥后不充氮，其他部分按照“制备方法”中提及的制备制剂三；

2、实验结果和结论

(1)干燥处理

对聚氧乙烯蓖麻油进行干燥处理和未处理所制备的紫杉醇注射液制剂一和制剂二的外观进行考察，结果如下：

表2聚氧乙烯蓖麻油干燥处理和未处理制备的注射液比较

筛选结果表明，对聚氧乙烯蓖麻油进行干燥处理后，与未处理比较，不论放置5或10天，溶液外观均显澄清。

(2)充氮

对充氮与未充氮的制剂一和制剂三进行有关物质考察(10天)，结果如下：

表3充氮与未充氮的制剂比较

筛选结果表明，制剂充氮放置10天，与未充氮放置10天的制剂比较，1％对照面积、杂峰面积和有关物质含量均明显小于未充氮处理的制剂。

结论：筛选结果表明，应对聚氧乙烯蓖麻油制备过程进行充分干燥处理，同时对溶液进行充氮，以保证制剂的稳定性。

实验例3处方工艺筛选实验

1、实验方法

按照上述设计原则，按表1配制不同处方。研究紫杉醇有关物质、含量、药液pH及颜色的变化情况。

表4紫杉醇注射液处方筛选

2、实验结果和结论

取无菌压滤的溶液，测定紫杉醇的有关物质、含量、药液的pH及澄清度与颜色。结果见表5。

表5紫杉醇注射液处方筛选检测结果

结论：通过以上A、B、C、D四处方的筛选，得知处方A黏稠度高不易压滤、且在低温下不稳定，处方B、C和D的溶液均具有理想的物理稳定性和化学稳定性，都可以作为本制剂的处方，由于处方D设计较经济，因此，以处方D为本品的首选处方。

实验例4影响因素实验

按照专利中提到的制备方法制备本发明组合物的注射液。任意选择一组本发明组合物的注射液(批号0306011)置于光照(照度4500Lx)、高温(60℃)和低温(4℃)的条件下，于5、10天分别取样，考察性状、澄明度、PH值、有关物质和含量，测定结果与0月数值比较，考察处方和工艺的适应性及包材的影响，结果见表6。

表6影响因素实验

结论：从表中数据可以看出，本发明的组合物置于光照、高温和低温的条件下的测定结果与0月数值比较，其性状、PH值和含量均无明显改变，澄明度和有关物质均符合规定。试验结果表明，本处方和工艺适应性好，稳定可行，包材安瓿对主药的稳定性无影响。

实验例5配伍实验

紫杉醇与苯丙氨酸组合物制备的注射液与5％葡萄糖注射液及0.9％氯化钠注射液配伍，测试其稳定性及是否存在配伍禁忌。

表7本发明组合物的注射液与5％葡萄糖注射液配伍试验

表8本发明组合物的注射液与0.9％氯化钠注射液配伍试验

结论：试验结果表明，本品与5％葡萄糖注射液或0.9％氯化钠注射液配伍后，外观、澄明度、PH值和峰面积均没有显著变化，即溶液在12小时内稳定，无配伍禁忌。

实验例6溶解度实验

本实验例是利用本发明组合物所制备的注射液与市售同类药品泰素进行溶解度对比研究。

1、药品

本发明的紫杉醇与苯丙氨酸的组合物的注射液采用处方6的配比制备；

泰素：市购(30mg/支)。

2、方法

将本发明组合物与泰素分别溶于5mL水中，超声振荡一段时间至不再有固体溶解，过滤，将所得固体干燥称重，可大约得知本发明组合物与泰素的溶解度值。

3、结果

泰素的溶解度为1.2mg/mL，而本发明组合物的溶解度为3.3mg/mL。实验结果表明，本发明组合物的溶解度是泰素的2.75倍，即明显提高了水溶性。

实验例7体内外抗肿瘤比较实验

材料与药品

药品：本发明组合物：以处方6的配比自制；

      泰素：市购。

动物：ICR品系小白鼠，18～22g，雌雄各半。

瘤株：荷瘤小鼠S₁₈₀，瘤株卵巢瘤细胞AO_10/17。

仪器：Olympus显微镜BHT(日本制造)；PB303电子天平(瑞士制造)；HL-2920P酶标自动分析仪(中国262工厂制造)；SHEL·LAB-2300二氧化碳培养箱(美国SHELDON制造)。

1、体外抗肿瘤比较实验-对卵巢癌细胞株AO _10/17 的细胞毒作用

1.1、方法

采用MTT法检测。取瘤株AO_10/17，复苏后在含10％小牛血清的完全RPMI1640培养液中，定期传代，待细胞生长至对数增长期，以胰酶EDTA消化，Hank′s液洗两次，悬浮于10％小牛血清的RPMI1640培养液中，调整细胞浓度0.3×10⁶/mL，取96孔平底培养板，每孔加入上述细胞悬液100μL待用。实验设溶剂对照组、泰素组和本发明组合物组。本发明组合物和泰素分6个浓度，均以46.86μL/mg的起始浓度对倍稀释。其浓度分别为46.86，23.43，11.72，5.86，2.93，1.47μL/mg，每个剂量设同种浓度下的溶剂对照。按上述剂量给培养板每孔加入受试物100μL，另选6孔加入100μL新鲜培养液作为本底，每个剂量做3个平行样。于37℃、5％二氧化碳条件下作用4h，形成紫蓝色结晶，弃上清液，用新鲜完全培养液洗两次，加入100μL/孔DMSO溶解形成的深蓝色颗粒，用HL-2920P酶标自动分析仪，在570nm波长下读取光密度(OD)。根据下列公式，计算杀伤百分率。

杀伤百分率＝(1-实验光密度/本底光密度)×100

平行测试3次。

1.2、结果与结论

本发明组合物和泰素对AO_10/17瘤株的细胞毒作用见表9。

表9本发明组合物和泰素对AO_10/17瘤株的细胞毒作用

本发明组合物和泰素本身的杀瘤率为本发明组合物和泰素的杀瘤率分别减去相对应溶剂的杀瘤率，结果见表10。

表10本发明组合物和泰素的杀瘤率

结论：从表中数据可见，3次试验结果均显示，本发明组合物的本身杀瘤率比泰素本身的杀瘤率高2倍左右，即本发明组合物的活性更好。

2、体内抗肿瘤比较试验-对小鼠S180实体瘤的影响

2.1、方法

取接种7～10d的S₁₈₀实体瘤小鼠1只，于无菌操作下取瘤块，将瘤体剪成小块，用玻璃匀浆器研碎，加灭菌生理盐水稀释成1∶4的瘤细胞悬液。另取ICR小鼠60只，经右侧腋窝Sc接种液0.2mL/只。接种后次日随机分为6组，每组10只，雌雄各半。分生理盐水阴性组，溶剂对照组，本发明组合物组和泰素组，静注，一天一次，0.2mL/10g体重，连续4天，于接种后第9天处死各组动物，称体重，分离瘤体并称重，计算瘤体比(每100g体重所含瘤重求抑瘤率。疗效评价按下式)：

肿瘤抑制率＝(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100平行测试3次。

2.2、结果与结论

本发明组合物和泰素对S₁₈₀瘤株的影响的实验结果见表11。

表11本发明组合物和泰素对S₁₈₀瘤株的影响

(mean±s)

结论：本发明组合物与泰素对小鼠S₁₈₀实体瘤的瘤体重均有抑制作用，且3次实验均显示，本发明组合物的活性明显比泰素的活性好。

4、具体实施方式

以下通过实施例和实验例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例本发明的紫杉醇与苯丙氨酸的组合物注射液的制备

1、处方

处方1：

紫杉醇                12g

苯丙氨酸              0.6g

聚氧乙烯蓖麻油        671g

无水乙醇              1072g

全量                  2000mL

共制成                1000支

处方2：

紫杉醇                12g

苯丙氨酸              2.4g

聚氧乙烯蓖麻油        670g

无水乙醇              1072g

全量                  2000mL

共制成                1000支

处方3：

紫杉醇                12g

苯丙氨酸              6g

聚氧乙烯蓖麻油        666g

无水乙醇              1072g

全量                  2000mL

共制成                1000支

处方4：

紫杉醇                30g

苯丙氨酸              1.5g

聚氧乙烯蓖麻油        1679g

无水乙醇              2680g

全量                  5000mL

共制成                1000支

处方5：

紫杉醇                30g

苯丙氨酸              3g

聚氧乙烯蓖麻油        1677g

无水乙醇              2680g

全量                  5000mL

共制成                1000支

处方6：

紫杉醇                30g

苯丙氨酸              6g

聚氧乙烯蓖麻油        1674g

无水乙醇              2680g

全量                  5000mL

共制成                1000支

处方7：

紫杉醇              30g

苯丙氨酸            9g

聚氧乙烯蓖麻油      1671g

无水乙醇            2680g

全量                5000mL

共制成              1000支

处方8：

紫杉醇              30g

苯丙氨酸            15g

聚氧乙烯蓖麻油      1665g

无水乙醇            2680g

全量                5000mL

共制成              1000支

处方9：

紫杉醇              60g

苯丙氨酸            3g

聚氧乙烯蓖麻油      3357g

无水乙醇            5360g

全量                10000mL

共制成              1000支

处方10：

紫杉醇              60g

苯丙氨酸            6g

聚氧乙烯蓖麻油      3354g

无水乙醇            5360g

全量                10000mL

共制成              1000支

处方11：

紫杉醇                60g

苯丙氨酸              12g

聚氧乙烯蓖麻油        3348g

无水乙醇              5360g

全量                  10000mL

共制成                1000支

处方12：

紫杉醇                60g

苯丙氨酸              18g

聚氧乙烯蓖麻油        3342g

无水乙醇              5360g

全量                  10000mL

共制成                1000支

处方13：

紫杉醇                60g

苯丙氨酸              30g

聚氧乙烯蓖麻油        3330g

无水乙醇              5360g

全量                  10000mL

共制成                1000支

2、制备方法

(1)配辅液：聚氧乙烯蓖麻油加17.5％(m/v)干燥的分子筛，充氮、密封三天备用。活性炭在121℃活化2小时，密封在干燥器中备用。分子筛用无水乙醇洗至乙醇透明，挥去乙醇，150℃干燥5小时，放凉密封在干燥器中备用。

将聚氧乙烯蓖麻油、乙醇和0.05％活性炭混合(不锈钢容器)，超声搅拌30分钟(超声水浴温度不超过45℃，如热即取出搅拌，降冷再继续)。

(2)辅液无菌压滤：用2张0.22μm微孔滤膜无菌压滤(氮气罐压力在0.15-0.3mpa之间，滤液接受容器应透明可视且口径要小，以减少溶剂挥发)，称重，计算需补加无水乙醇量。

(3)溶主药：主药在真空干燥箱内干燥24小时(真空度0.09，温度42-45℃)，精密称取主药，加入步骤(2)的滤液中，补加无水乙醇冲洗，充高纯氮气，密封，轻摇，超声至样品完全溶解(目测无颗粒)。

(4)溶液无菌压滤：将溶液超声10分钟，用2张0.22μm微孔滤膜无菌压滤，接受容器要干净(不能残留碱液、180℃干热灭菌三小时)。

(5)分装：分液器洗干净，先用70-75％乙醇浸泡，再用无水乙醇冲洗，100℃烘干。初滤液调节装量，边分装边冲高纯氮气，压力在0.01-0.05mpa。

(6)封口：迅速封口，以防氮气溢出，即得。

Claims (7)

1.一种含有紫杉醇与苯丙氨酸的组合物，其特征在于，所述的紫杉醇与苯丙氨酸的重量比为1∶0.1～0.3。

2.如权利要求1所述的含有紫杉醇与苯丙氨酸的组合物，其特征在于，所述的紫杉醇与苯丙氨酸的重量比为1∶0.2。

3.如权利要求1～2任一项所述的含有紫杉醇与苯丙氨酸的组合物，其特征在于，所述的含有紫杉醇与苯丙氨酸的组合物为注射液。

4.如权利要求3所述的含有紫杉醇与苯丙氨酸的组合物的注射液，其特征在于，注射液中的增溶剂为聚氧乙烯蓖麻油，溶剂为无水乙醇。

5.如权利要求4所述的含有紫杉醇与苯丙氨酸的组合物的注射液，其特征在于，所述的聚氧乙烯蓖麻油和无水乙醇的体积比为1∶2。

6.如权利要求5所述的含有紫杉醇与苯丙氨酸的组合物的注射液，其特征在于，所述的含有紫杉醇与苯丙氨酸组合物的注射液的制备方法为：

(1)配辅液：聚氧乙烯蓖麻油加干燥的分子筛，充氮，密封三天备用；活性炭活化后密封在干燥器中备用；分子筛用无水乙醇洗至乙醇透明，挥去乙醇，干燥，放凉密封在干燥器中备用；将聚氧乙烯蓖麻油、乙醇和活性炭混合于不锈钢容器中，超声搅拌；

(2)辅液无菌压滤：用微孔滤膜无菌压滤，称重，计算需补加无水乙醇量；

(3)溶主药：主药在真空干燥箱内干燥，精密称取主药，加入到步骤(2)的滤液中，补加无水乙醇冲洗，充高纯氮气，密封，轻摇，超声至样品完全溶解；

(4)溶液无菌压滤：将溶液超声，用微孔滤膜无菌压滤；

(5)分装及封口：分液器洗净，烘干；初滤液调节装量，边分装边冲高纯氮气；分装后迅速封口，即得。

7.如权利要求1～2任一项所述的含有紫杉醇与苯丙氨酸的组合物在制备抗癌药物中的应用。