CN100443080C - 一种预防及治疗癌症的药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种预防及抗肿瘤的药物组合物。本发明所述的预防及治疗癌症的药物组合物，其包括抗癌有效量的常规的治疗或预防癌症的化学合成药物和芹黄素或芹黄素的衍生物及其盐。本发明的组合药物在相同疗效的情况下大大减少了芹黄素和其它抗癌药物的用量，同时毒副作用减少；芹黄素与其它抗癌药物一起使用具有协同作用，可以提高肿瘤细胞对临床常用抗癌药物的敏感性，降低了肿瘤细胞的耐药性，提高了疗效；芹黄素可以与多种常规的抗癌药物配伍，均能大量减少药物的剂量，使用效果明显。
Description
技术领域
本发明涉及一种预防及抗肿瘤的药物组合物。
背景技术
芹黄素，又名芹菜素(apigenin，4’，5，7，-trihydroxyflavone)，是无毒的源于植物的食物源化合物。芹黄素是一种常见的食物性的类黄酮，它低毒，无诱变性，广泛分布于许多水果和蔬菜中，包括欧芹、洋葱、橙子、茶、甘菊、麦芽和某些调味品。芹黄素被用做一种健康食品添加剂，最近发现它有抗癌的功能。
癌症是世界上严重危害健康和生命的疾病，在美国，癌症已经成为85岁以下人群死亡的主要原因，至今仍没有好的治疗手段。利用抗癌药物进行的化学治疗癌症(简称化疗)是治疗癌症的重要手段，抗肿瘤药物主要抑制癌细胞的生长和扩散，从而达到治疗的目的。但是，许多肿瘤细胞会逐渐产生耐药性从而抵抗药物的作用，使得癌症复发而导致治疗失败。同时，许多抗癌药物具有一定的毒性，在治疗过程中产生不小的毒副作用，损害病人的健康。因此，除了开发新的抗癌药物外，克服肿瘤细胞耐药性降低用药剂量从而提高现有抗癌药物疗效也是研究的重要目标。肿瘤的快速生长需要营养，营养物质的提供需要血管，肿瘤的新血管发生是肿瘤生长必不可少的条件。因此，抑制肿瘤血管生成已成为一种新的重要的治疗和预防癌症的手段。血管内皮生长因子VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)在肿瘤血管生成中起重要作用，而VEGF的合成受低氧诱导因子HIF-1(Hypoxia-Inducible Factor1)的调节。因此抑制HIF-1的表达可以起到抑制血管生成与肿瘤生长的作用。
大多数癌症的五年存活率出现下降，但是机理仍然不清楚。尽管顺铂，紫杉醇和其他化疗药已经广泛用于治疗癌症，但是癌症细胞已逐渐对这些广泛使用的药物产生的抗性，最终导致病人的死亡。因此，当务之急，我们必须寻找新的癌症治疗药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有更好疗效、且毒副作用大大减少的抗肿瘤药物组合物。本发明通过两种不同抗癌药物的组合使用，达到相互协同、提高疗效、减少毒副作用和耐药性的作用。
由于芹黄素广泛存在于植物性食物中，又具有抑制肿瘤细胞生长和血管生成的作用，因而可用于肿瘤的预防，如用于生产健康食品。尽管已经知道芹黄素能抑制一些种类的肿瘤细胞系的生长，包括结肠癌，乳腺癌，和***癌等，但是它对化疗药物的增强作用以及其它化疗试剂与它联合使用的效果还是未知的。
低氧诱导因子HIF-1和血管内皮生长因子VEGF在血管生成中起重要作用，抑制这两种因子的表达会导致肿瘤的生长受抑制。研究发现芹黄素具有很强的抑制多种肿瘤细胞HIF-1和VEGF表达的能力，体内和体外实验结果表明芹黄素是一个很好的肿瘤血管生成抑制剂，具有潜在的肿瘤治疗和预防应用前景。芹黄素抑制肿瘤细胞引起的血管生成，能够被用来抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长，也能抑制血管生长的刺激因子：血管内皮生长因子VEGF和低氧诱导因子HIF-1α。同时，该物质可以提高肿瘤细胞对临床常用抗癌药物的敏感性，降低了肿瘤细胞的耐药性，提高了疗效。有数据显示，芹黄素具有成为治疗和预防癌症的药物的潜能。
而芹黄素和常规化疗药物联合使用时，就成为非常有效的预防和治疗癌症的药物。芹黄素不仅单独可以抑制多种肿瘤细胞的生长，最为主要的是它可以促进多种抗癌药物的疗效，增进这些药物抑制癌细胞生长(尤其是一些耐药肿瘤细胞)和肿瘤生长的疗效，降低药物的IC50(使细胞对药物的敏感性提高从而减少用药)。因此，它可以和某些抗癌药物合用，克服癌细胞的耐药性，减少用药量，提高治疗效果。
本发明所述的预防及治疗癌症的药物组合物，其包括抗癌有效量的化疗药物和芹黄素或芹黄素的衍生物及其盐。
所述的化疗药物是指常规的治疗或预防癌症的化学合成药物，如顺铂(Cisplatin)、紫杉醇(Paclitaxel)、阿霉素(Doxorubicin)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、表鬼臼毒素吡喃葡糖苷(Etoposide)、丝裂霉素C(Mytomycin C)等。
所述的芹黄素及其衍生物为下式的化合物A或其酯、糖苷、药学上生成的盐、氢氧化物、氮氧化物或者其他的化合物的形式：
其中R1、R2、R3位点可以为OH、H或OCH2，可以相同也可以不同。
试验表明，当芹黄素或芹黄素的衍生物及其可药用盐与顺铂的重量比为12～18∶1时，其在预防和治疗结肠癌时的使用效果较好；重量比为1.5∶1～3∶1时，在预防和治疗肺癌或卵巢癌时的使用效果较好。
试验表明，当芹黄素或芹黄素的衍生物及其可药用盐与紫杉醇的重量比为100～300∶1时，在预防和治疗***癌时的使用效果较好；重量比为150～300∶1时，在预防和治疗卵巢癌时的使用效果较好。
试验表明，当芹黄素或芹黄素的衍生物及其可药用盐与阿霉素的重量比为1.5～4∶1时，其在预防和治疗***癌时的使用效果较好；重量比为8∶1～16∶1时，其在预防和治疗结肠癌时的使用效果较好。
试验表明，当芹黄素或芹黄素的衍生物及其可药用盐与5-氟尿嘧啶的重量比为10∶1～30∶1时，其在预防和治疗前结肠癌时的使用效果较好；重量比为6∶1～15∶1时，其在预防和治疗***癌时的效果较好。
试验表明，当芹黄素或芹黄素的衍生物及其可药用盐与表鬼臼毒素吡喃葡糖苷的重量比为1∶1.5～1∶2时，其在预防和治疗***癌时的使用效果较好。
试验表明，当芹黄素或芹黄素的衍生物及其可药用盐与丝裂霉素C的重量比为15～30∶1时，其在预防和治疗***癌时的效果较好；重量比为3～6∶1时，其在预防和治疗结肠癌时的效果较好；重量比为1～2∶1时，其在预防和治疗肺癌时的效果较好。
两种组分联合使用时，芹黄素或芹黄素的衍生物、盐、氢氧化物、氮氧化物、酯的剂量范围以及其它化药的剂量范围为临床正常使用剂量范围，具体使用时根据病情和医生指导即可。
本发明所述的预防及治疗癌症的药物组合物，可以用于治疗或降低卵巢癌早期恶性病变的发生率、减少和抑制***癌的早期恶性病变、抑制肺癌早期恶性病变的频率和发生、抑制结肠癌早期恶性病变、抑制或处理卵巢癌的恶性病变等。
本发明的有益效果：
1、相同疗效的情况下大大减少了芹黄素和其它抗癌药物的用量，同时毒副作用减少；
2、芹黄素与其它抗癌药物一起使用具有协同作用，可以提高肿瘤细胞对临床常用抗癌药物的敏感性，降低了肿瘤细胞的耐药性，提高了疗效；
3、芹黄素可以与多种常规的抗癌药物配伍，均能大量减少药物的剂量，使用效果明显。
附图说明
图1显示***癌细胞PC-3和DU-145的生长受芹黄素的抑制
图2显示结肠癌细胞Colo-205和HCT-116的生长受芹黄素的抑制
图3显示肺癌细胞A549和H460的生长受芹黄素的抑制
图4显示芹黄素增强抗癌药物阿霉素对***癌细胞PC-3的抑制作用
图5显示芹黄素增强抗癌药物阿霉素对结肠癌细胞Colo-205和HCT-116的抑制作用
图6显示芹黄素增进肺癌细胞对阿霉素的敏感性
图7显示芹黄素提高***癌细胞PC-3和Du145对表鬼臼毒素吡喃葡糖苷的敏感度
图8显示芹黄素增强抗癌药物丝裂霉素C对***癌细胞PC3和DU145的抑制作用
图9显示芹黄素增强抗癌药物丝裂霉素C对结肠癌细胞Colo-205和HCT-116的抑制作用
图10显示芹黄素增强抗癌药物丝裂霉素C对肺癌细胞A549和H460的抑制作用
图11显示芹黄素增强抗癌药物5-氟尿嘧啶对***癌细胞PC3和DU145的抑制作用
图12显示芹黄素增强抗癌药物5-氟尿嘧啶对结肠癌细胞HC116的抑制作用
图13显示芹黄素顺铂对结肠癌细胞HCT116和Colo-205的作用
图14显示芹黄素增强抗癌药物顺铂对肺癌细胞A549和H460的抑制作用
图15显示芹黄素增强卵巢癌细胞A2780/CP70(A)和PC-3(B)对顺铂的敏感性
图16显示芹黄素大幅度增加顺铂对A2780/CP70细胞的凋亡的诱导作用
图17显示芹黄素大大增加紫杉醇(paclitaxel)杀死***癌细胞PC-3(A)和卵巢癌A2780/CP70(B)的作用。
图18显示芹黄素提高顺铂对卵巢肿瘤(A)和***癌(B)生长的抑制作用，提高紫杉醇对***癌的抑制作用(C)
图19显示芹黄素抑制卵巢癌细胞增殖，并诱导卵巢癌细胞的凋亡
图20显示芹黄素抑制卵巢肿瘤生长
图21显示芹黄素抑制卵巢癌细胞低氧诱导因子HIF-1α的表达
图22显示芹黄素抑制卵巢癌细胞血管内皮生长因子VEGF的表达
图23显示芹黄素抑制肿瘤新血管的生成
图24显示芹黄素提高卵巢肿瘤对顺铂的敏感性并大幅度的增加顺铂对血管生成的抑制作用
具体实施方式
试验方法
1、细胞培养：***癌细胞PC-3和DU-145，卵巢癌细胞A2780/CP70培养在RPMI 1640培养基中，内含10％胎牛血清，2mM L-谷氨酸盐，1％青霉素/链霉素。结肠癌细胞Colo-205生长在RPMI 1640培养基中，内含10％胎牛血清，2mM L-谷氨酸盐，1.5g/L碳酸氢钠，4.5g/L葡萄糖，10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，1.0mM丙酮酸钠，和1％青霉素/链霉素。结肠癌细胞HCT-116生长在McCoy’s 5a培养基中，内含10％胎牛血清，1.5mM L-谷氨酸盐，和1％青霉素/链霉素。肺癌细胞A549和H460 cells培养在RPMI1640培养基中，内含10％胎牛血清，2mM L-谷氨酸盐和1％青霉素/链霉素。所有细胞都培养在37度含5％二氧化碳的培养箱中。
2、所用抗癌药物
阿霉素，反转录酶和RNA聚合酶抑制剂；顺铂，破坏DNA抑制DNA修复；表鬼臼毒素吡喃葡糖苷，促进DNA切割；丝裂霉素C，DNA合成与核***抑制剂；5-氟尿嘧啶，DNA合成抑制剂；紫杉醇，影响细胞微管结构。
3、细胞增殖测定
细胞增殖用常规的MTT方法进行。细胞接种到96孔板中，每孔细胞1×104。一天后去掉旧培养基，换上新鲜的含有所试药物的培养基，处理24小时。然后每孔加入10μL of5mg/ml噻唑蓝(thiozolyl blue tetrazolium bromide)试剂。37度2小时后加入100μL溶剂DMSO。5小时后于470nm波长下测光吸收。对照组细胞的生长速率定为1，药物处理组的数值与其比较，并代表相对生长速率。
试验例1
用上述试验方法，测试***癌细胞PC-3和DU-145的生长受芹黄素的抑制，结果见图1。
试验例2
用上述试验方法，测试结肠癌细胞Colo-205和HCT-116受芹黄素的影响，结果见图2。
试验例3
用上述试验方法，测试肺癌细胞A549和H460受芹黄素的影响，结果见图3。
试验例4
用上述试验方法，测试芹黄素增强抗癌药物阿霉素对***癌细胞PC-3的抑制作用，结果见图4。
试验例5
用上述试验方法，测试芹黄素增强抗癌药物阿霉素对结肠癌细胞Colo-205和HCT-116的抑制作用(药物浓度都为微摩尔级)，结果见图5。
试验例6
用上述试验方法，测试芹黄素增进肺癌细胞A549和H460对阿霉素的敏感性，结果见图6。
试验例7
用上述试验方法，测试芹黄素提高***癌细胞PC-3和DU145对表鬼臼毒素吡喃葡糖苷的敏感度，结果见图7。
试验例8
用上述试验方法，测试芹黄素增强抗癌药物丝裂霉素C对***癌细胞PC3和DU145的抑制作用(药物浓度都为微摩尔级)，结果见图8。
试验例9
用上述试验方法，测试芹黄素增强抗癌药物丝裂霉素C对结肠癌细胞Colo-205和HCT-116的抑制作用(药物浓度都为微摩尔级)，结果见图9。
试验例10
用上述试验方法，测试芹黄素增强抗癌药物丝裂霉素C对肺癌细胞A549和H460的抑制作用(药物浓度都为微摩尔级)，结果见图10。
试验例11
用上述试验方法，测试芹黄素增强抗癌药物5-氟尿嘧啶对***癌细胞PC3和DU145的抑制作用(药物浓度都为微摩尔级)，结果见图11。
试验例12
用上述试验方法，测试芹黄素增强抗癌药物5-氟尿嘧啶对结肠癌细胞HC116的抑制作用(药物浓度都为微摩尔级)，结果见图12。
试验例13
用上述试验方法，测试芹黄素增强抗癌药物顺铂对结肠癌细胞HC116和Colo-205的抑作用(药物浓度都为微摩尔级)，结果见图13。
试验例14
用上述试验方法，测试芹黄素增强抗癌药物顺铂对肺癌细胞A549和H460的抑制作用(药物浓度都为微摩尔级)，结果见图14。
肺癌、***癌和直肠癌是常见的癌症，当前常用的化疗有毒副作用，可以引起比如恶心呕吐和导致正常细胞的死亡。多聚酚类物质属天然化合物，存在于蔬菜水果和中草药中。芹黄素(芹黄素)是多聚酚类物质，具有抗氧化和免疫作用。通过以上试验可见，***癌细胞PC-3和DU-145当用15μM芹黄素处理时，对常用抗癌药物阿霉素，表鬼臼毒素吡喃葡糖苷，丝裂霉素C和5-氟尿嘧啶的敏感性明显增加。对于直肠癌细胞HCT-116和colo-205，芹黄素大大提高这些细胞对阿霉素、丝裂霉素C、5-氟尿嘧啶、和顺铂的敏感度。而对于肺癌细胞A549和H460，芹黄素则提高阿霉素、丝裂霉素C、和顺铂的效果。细胞对药物的敏感性通过测量细胞增殖或凋亡来衡量。加入芹黄素后使各种药物的IC50减小2-3倍，多者可达10倍以上。
试验例15
顺铂抵抗的卵巢癌细胞A2780/CP70(图15A)和***癌细胞PC-3(图15B)被接种到96孔板中，接种浓度每孔1×104个细胞，培养过夜。接着给细胞换新鲜的培养液，新鲜培养液中含有所示的各种浓度的顺铂，或者含有各种浓度的顺铂加上芹黄素(15μM)。24小时后，用MTT试剂盒检测细胞增殖。试验结果见图15A和B所示。由图15可见，芹黄素大幅度增加顺铂对卵巢癌和***癌细胞的生长抑制作用。
接种顺铂抵抗的卵巢癌细胞至培养盘中。第二天，用顺铂(10μM)，芹黄素(10μM)，或者顺铂(10μM)加上芹黄素(10μM)处理细胞24小时，处理后收集细胞，然后用Annexin V试剂盒(Roche)分析细胞的凋亡情况。见图16，芹黄素大幅度增加顺铂对A2780/CP70细胞的凋亡的诱导作用。
试验例16：芹黄素增加紫杉醇(paclitaxel，又称taxol)杀死癌细胞的作用。
接种***癌细胞PC-3和A2780/CP70细胞至96孔板中，培养过夜。吸出旧的培养液，然后换上含有不同浓度紫杉醇的新鲜培养液，或者含不同浓度的紫杉醇加上20μM芹黄素的新鲜培养液。48小时后，用MTT检测细胞活力。结果见图17A和图17B，图17A显示芹黄素大幅度增加紫杉醇导致的PC-3细胞的死亡，IC50为50.33nM，比只用紫杉醇处理组的IC50值577.19nM低十一倍。图17B显示芹黄素大幅度增加紫杉醇导致的A2780/CP70细胞的死亡，IC50为225.02nM，比只用紫杉醇处理组的IC50值503.44低两倍。
试验例17：芹黄素提高顺铂对卵巢肿瘤生长的抑制作用
(A)卵巢癌细胞A2780/CP70接种到4周龄的雌性裸鼠两侧腹部(3百万细胞/一侧接种)。12天待肿瘤直径大小约5毫米后，把裸鼠随即分成4组，每组5只，开始用药处理，药物采用腹腔注射。顺铂的使用为6mg/kg，一周三次注射。芹黄素的使用为5mg/kg，一天一次注射。从用药的第一天起测量肿瘤体积，其相对体积定为1。用药9天后，处死裸鼠。(●)对照组，注射等体积的溶剂；(■)顺铂处理组；(△)芹黄素处理组；(□)芹黄素(一天用药一次)顺铂(一周三次用药)联合处理组。芹黄素提高顺铂对卵巢肿瘤生长的抑制作用结果见图18A。初始肿瘤体积设定为1，肿瘤体积变化以相对值表示。
(B)***癌细胞PC3接种到4周龄的雄性裸鼠两侧背部(3百万细胞/一侧接种)。待肿瘤直径大小约5毫米后，把裸鼠随即分成4组，每组5只，开始用药处理，药物采用腹腔注射。顺铂的使用为6mg/kg，一周三次注射。芹黄素的使用为5mg/kg，一天一次注射。从用药的第一天起测量肿瘤体积，20天后处死小鼠取出肿瘤。(●)对照组，注射等体积的溶剂；(■)芹黄素处理组；(△)顺铂处理组；(□)芹黄素(一天用药一次)顺铂(一周三次用药)联合处理组。芹黄素提高顺铂对***肿瘤生长的抑制作用结果见图18B。肿瘤体积以立方毫米表示。
(C)***癌细胞PC3接种到4周龄的雄性裸鼠两侧背部(3百万细胞/一侧接种)。待肿瘤直径大小约5毫米后，把裸鼠随即分成4组，每组5只，开始用药处理，药物采用腹腔注射。紫杉醇的使用为5mg/kg，一周2次注射。芹黄素的使用为5mg/kg，一天一次注射。从用药的第一天起测量肿瘤体积，20天后处死小鼠取出肿瘤。(●)对照组，注射等体积的溶剂；(■)芹黄素处理组；(△)紫杉醇处理组；(□)芹黄素(一天用药一次)紫杉醇(一周两次用药)联合处理组。芹黄素提高紫杉醇对***肿瘤生长的抑制作用结果见图18C。肿瘤体积以立方毫米表示。
由试验例15～17可见，芹黄素可以提高肿瘤细胞对常用抗癌药物的敏感度，降低这些药物的IC50(抑制细胞生长50％所需药物浓度)(少则2-3倍，多则10倍以上)，从而增强抗癌药物的治疗效果。体内动物实验表明芹黄素促进临床常用抗癌药物顺铂、紫杉醇对卵巢和***肿瘤生长的抑制作用。
试验例18
芹黄素抑制卵巢癌细胞增殖，并诱导卵巢癌细胞的凋亡。A，接种A2780/CP70细胞和人纤维原GM847细胞(作为对照用，用以表明芹黄素对正常细胞的作用很小，而对肿瘤细胞作用大)到96孔板中，细胞浓度每孔4×103个细胞，培养过夜。吸出旧的培养液，加入100μl含芹黄素或不含芹黄素的新鲜培养液。细胞继续培养24小时，用MTT法测细胞增殖。结果见图19A。B，培养A2780/CP70细胞或GM847细胞至70-80％培养皿饱和度时，然后用芹黄素处理细胞24小时。用胰酶消化细胞，收集细胞，然后用PBS洗细胞一次，接着根据Annexin-V-Folus试剂盒的说明染细胞。结果见图19B。C，A2780/CP70细胞用芹黄素处理24小时，收集细胞，抽提DNA。1.8％琼脂糖凝胶电泳，上样量8μg DNA。图19c显示芹黄素促进顺铂诱导的细胞DNA断裂。泳道1：分子量标准；泳道2：对照组；泳道3：10μM顺铂；泳道4：20μM芹黄素；泳道5：20μM芹黄素加10μM顺铂。D，用20μM芹黄素处理A2780/CP70细胞，用western(免疫印记)方法检测caspase-3(胱冬酶)和PARP的剪切情况。caspase-3和PARP的剪切表明细胞凋亡的发生。结果见图19D。
试验例19：芹黄素抑制肿瘤生长。
卵巢癌细胞A2780/CP70细胞被接种到受精9天的鸡胚中，孵育9天使肿瘤生长。同时，处理组接受7.5μM的芹黄素，而对照组接受同样量的溶剂。9天以后，把肿瘤切下来并且称重。A：对照组和芹黄素处理组有代表性的肿瘤B：数据来自两个不同实验，表示为平均值±标准差，每个实验有20个胚胎(10个属于对照组，10个属于处理组)。结果见图20A和图20B。
由试验例18～19可见，芹黄素抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长。
试验例20：芹黄素抑制OVCAR3细胞和A2780/CP70细胞中HIF-1α的表达
OVCAR3细胞和A2780/CP70细胞被培养至80-90％融合，然后用如图所述的各浓度的芹黄素处理细胞。只加溶剂处理的细胞作为对照。用免疫印记的方法(如材料与方法描述)检测HIF-1α和HIF-1β的蛋白水平。HIF-1β用做内参来监测上样量的准确和转膜效率。结果见图21。
试验例21：芹黄素抑制卵巢癌细胞OVCAR3和A2780/CP70中的VEGF的表达
接种OVCAR3细胞和A2780/CP70细胞至12孔板中，培养至90％融合。然后换含有芹黄素的新鲜培养液，继续培养15小时。用ELISA方法(如材料和方法中所述)检测培养液中VEGF的浓度。数据来自于三个独立实验，表示为平均值±标准误，每个独立实验有三个重复。结果见图22。
试验例22：芹黄素抑制肿瘤新血管的生成
把卵巢癌细胞A2780/CP70和基质胶(matrigel)混和，然后接种到9天龄的鸡胚的绒毛***上。100小时后，把肿瘤取下，新生成的血管在显微镜下进行计数。图23A为对照图片，没有处理的卵巢肿瘤周围血管生成情况；图23B是用了15μM芹黄素后的图片，芹黄素处理的卵巢癌肿瘤周围血管生成情况。
试验例23：芹黄素提高卵巢肿瘤对顺铂的敏感性并大幅度的增加顺铂对血管生成的抑制作用
接种有顺铂抵抗性的A2780/CP70细胞至100mm的平皿中，培养细胞到90-100％融合。收集细胞，将细胞与基质胶(matrigel)混合(细胞与matrigel比例为2∶1)，该混合液中含有2.5μM顺铂，10μM芹黄素，或者同时含2.5μM顺铂和10μM芹黄素，接种混合物至受精9天的鸡胚中。10天以后，收集肿瘤，称重。在100倍放大的显微镜下对肿瘤中血管的数量计数。至少从五个不同的视野计数。数据来自两个不同实验，表示为平均值±标准差(n＝8)。图24A为有代表性的肿瘤形态，图24B为肿瘤重量；图24C为相对血管数量。由此可见，芹黄素提高卵巢肿瘤对顺铂的敏感性并大幅度的增加顺铂对血管生成的抑制作用。
以上种种试验表明，芹黄素抑制肿瘤细胞引起的血管生成，能够被用来抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长，也能抑制血管生长的刺激因子：血管内皮生长因子VEGF和低氧诱导因子HIF-1α。同时，该物质可以提高肿瘤细胞对临床常用抗癌药物的敏感性，降低了肿瘤细胞的耐药性，提高了疗效。我们的数据显示，芹黄素具有成为治疗和预防癌症的药物的潜能。而芹黄素和常规化疗药物联合使用时，就成为非常有效的预防和治疗癌症的药物。
在本发明试验中使用了卵巢癌细胞系A2780/CP70和OVCAR-3，以及***癌细胞系PC-3做为研究模型。结果发现，生理浓度下的芹黄素可以选择性地抑制这些卵巢癌细胞的增殖，同时诱导细胞的凋亡(图16)。在同样的实验条件下，芹黄素对人的正常纤维原细胞的作用甚微(图16)。芹黄素可能通过抑制PI3K(磷脂酰肌醇-3-磷酸激酶)-AKT通路，以及诱导p53，p21和BAX，和活化胱冬酶(caspase)级联反应来抑制卵巢癌细胞的生长。此外，还发现芹黄素能在体内抑制卵巢癌细胞的肿瘤生长(图15，17，21)，增加药物抵抗的某些肿瘤细胞对药物处理的敏感性(图5-17)。
根据类黄酮的日进食量，研究中所使用的芹黄素的浓度时没有毒性的，对人体来说是生理范围内的。结果表明，芹黄素用抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤生长的能力，同时芹黄素能增加其它化疗药的作用，可以作为一种针对卵巢癌，***癌，以及其它癌症的化疗药物或预防药物。
在本发明研究中发现芹黄素可以抑制肿瘤血管生成。血管生成指新的血管的形成。一个肿瘤在没有新的血管形成的情况下不能生长，因为肿瘤需要新形成的血管提供营养和氧气。血管生成可以被许多因子诱导，其中十分重要的是血管内皮生长因子(VEGF)。许多肿瘤细胞都能合成VEGF，这些由肿瘤产生的VEGF能诱导新的血管的形成。VEGF的生成主要受低氧诱导因子-1调控(HIF-1)。低氧诱导因子-1是一个转录因子，由HIF-1α和HIF-1β两个亚基组成。HIF-1α是HIF-1专有的亚基，当细胞内氧的浓度下降时或某些生长因子刺激时，HIF-1α被诱导。HIF-1β即芳香羟受体核易位子，它与芳香羟受体形成异聚体，不受细胞氧浓度或生长因子的调节。HIF-1在许多肿瘤细胞中过度表达，它的活性水平与成瘤性和血管生成相关。VEGF和它的上游因子HIF-1是所有癌症治疗的靶点。因此，将芹黄素与化疗药物联合使用可以使用于所有癌症的治疗。
对培养的卵巢癌，肺癌，结肠癌和***细胞系，芹黄素能抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡(图1-4，19)。
研究芹黄素和常用的抗癌药物顺铂的联合使用效果。顺铂抵抗的卵巢癌细胞系A2780/CP70和***癌细胞系PC-3做为研究模型。如图15所示，芹黄素处理能大大增加细胞对顺铂的敏感性。抑制50％A2780/CP70细胞增殖所需的顺铂浓度(IC50)大约是20μM，加上15μM的芹黄素能降低顺铂的IC50至5μM(降低4倍)。对PC-3细胞有相似的结果，顺铂对PC-3的IC50接近22μM，加上15μM的芹黄素，顺铂的IC50降低到3μM(降低7倍)。这些结果表明顺铂与芹黄素联合使用以后，顺铂对肿瘤细胞的毒性作用大大增强了。
细胞凋亡可以作为一个衡量肿瘤细胞对芹黄素和顺铂敏感性的一个指标。在本发明实验中使用了A2780/CP70细胞。如图16所示，10μM的顺铂在24小时内可以导致很少量的A2780/CP70细胞凋亡，10μM的芹黄素24小时内能引起大约12％的细胞凋亡，而两种药物同时使用有25％的细胞会凋亡。
研究联合使用芹黄素和紫杉醇的对细胞凋亡的影响。***癌细胞系PC-3和卵巢癌细胞系A2780/CP70用做研究模型。如图17所示，在紫杉醇处理的情况下，20μM的芹黄素能显著诱导PC-3的凋亡。紫杉醇对PC-3的IC50为577.19nM，加上芹黄素后降低为50.33nM。20μM的芹黄素同样也能增加A2780/CP70细胞的凋亡(图17)。加上芹黄素后，紫杉醇对A2780/CP70的IC50从503.44nM降低到225.02nM。这些结果都显示，联合使用紫杉醇和芹黄素能大大增加肿瘤细胞的死亡，具有治疗效果。
为了进一步验证芹黄素可以提高对耐药肿瘤对药物敏感性的提高，本发明又选择了几种常见耐药肿瘤细胞，比如卵巢癌细胞，***癌细胞，肺癌细胞，直肠癌细胞，使用了阿霉素，表鬼臼毒素吡喃葡糖苷，丝裂霉素C和5-氟尿嘧啶等临床常见抗癌药物。结果表明，芹黄素不仅可以单独对这些肿瘤细胞的增殖又抑制作用，更为重要的是，它可以提高这些被试细胞对各种抗癌药物的敏感性。由于肿瘤细胞的耐药发生是当前癌症治疗中一个非常普遍现象且是导致最终治疗失败的重要原因，而芹黄素又是一食物源且无毒腹副作用的天然物质，因此，它的这一特性对今后的癌症化疗具有潜在的巨大应用前景。
体内实验研究表明(如图18，图24所示)，芹黄素能大大增加顺铂、紫杉醇对A2780/CP70、PC3诱导的肿瘤形成的抑制。结果显示2.5μM的顺铂只能轻微抑制A2780/CP70细胞引起的肿瘤形成(图24)，因为A2780/CP70是具有顺铂抵抗性的细胞。10μM的芹黄素对A2780/CP70细胞引起的肿瘤形成有40％的抑制，而同时使用顺铂和芹黄素可以达到70％的抑制(图24B)。这一结果在裸鼠动物模型中得到进一步的印证(图18A)。血管形成的结果与肿瘤生长的结果一致。只用顺铂处理仅能轻微抑制肿瘤细胞诱导的血管形成(图24C)，芹黄素能抑制30％的肿瘤血管生成，而顺铂和芹黄素联合处理时对肿瘤血管生成的抑制能达到60％。综上所述，本发明的结果表明芹黄素能增加卵巢癌细胞A2780/CP70对顺铂的敏感性，同时增加过去常用的肿瘤治疗药物的作用。这些结果表明芹黄素与其它化疗药物包括顺铂联合使用可以做为一种有效的治疗卵巢癌和其它癌症的方法。
实施例1
卵巢癌细胞A2780/CP70接种到4周龄的雌性裸鼠两侧背部(3百万细胞/一侧接种)。待肿瘤直径大小约5毫米后，把裸鼠随即分成4组，每组5只，开始用药处理，药物采用腹腔注射。顺铂的使用为6mg/kg，一周三次注射。芹黄素的使用为5mg/kg，一天一次注射。从用药的第一天起测量肿瘤体积，9天后处死小鼠取出肿瘤(结果见图18A)。芹黄素和顺铂联合使用大大提高了对卵巢肿瘤的抑制作用。
实施例2
***癌细胞PC3接种到4周龄的雄性裸鼠两侧背部(3百万细胞/一侧接种)。待肿瘤直径大小约5毫米后，把裸鼠随即分成4组，每组5只，开始用药处理，药物采用腹腔注射。顺铂的使用为6mg/kg，一周三次注射。芹黄素的使用为5mg/kg，一天一次注射。从用药的第一天起测量肿瘤体积，20天后处死小鼠取出肿瘤(结果见图18B)。芹黄素和顺铂联合使用大大提高了对***肿瘤的抑制作用。
实施例3
***癌细胞PC3接种到4周龄的雄性裸鼠两侧背部(3百万细胞/一侧接种)。待肿瘤直径大小约5毫米后，把裸鼠随即分成4组，每组5只，开始用药处理，药物采用腹腔注射。紫杉醇的使用为5mg/kg，一周2次注射。芹黄素的使用为5mg/kg，一天一次注射。从用药的第一天起测量肿瘤体积，20天后处死小鼠取出肿瘤(结果见图18C)。芹黄素和紫杉醇联合使用大大提高了对***肿瘤的抑制作用。
Claims (24)
1、一种预防及治疗癌症的药物组合物，其包括抗癌有效量的常规治疗或预防癌症的化学合成药物和芹黄素，其中，所说的常规治疗或预防癌症的化学合成药物是指紫杉醇、阿霉素、5-氟尿嘧啶、表鬼臼毒素吡喃葡糖苷或丝裂霉素C。
2、如权利要求1所述的预防及治疗癌症的药物组合物，其特征在于：所说的常规的治疗或预防癌症的化学合成药物是指紫杉醇，并且芹黄素与紫杉醇的重量比为100～300∶1。
3、权利要求2所述的预防及治疗癌症的药物组合物在制备预防或治疗***癌药中的应用。
4、如权利要求1所述的预防及治疗癌症的药物组合物，其特征在于：所说的常规的治疗或预防癌症的化学合成药物是指紫杉醇，并且芹黄素与紫杉醇的重量比为150～300∶1。
5、权利要求4所述的预防及治疗癌症的药物组合物在制备预防或治疗卵巢癌药中的应用。
6、如权利要求1所述的预防及治疗癌症的药物组合物，其特征在于：所说的常规的治疗或预防癌症的化学合成药物是指阿霉素，并且芹黄素与阿霉素的重量比为1.5～4∶1。
7、权利要求6所述的预防及治疗癌症的药物组合物在制备预防或治疗***癌药中的应用。
8、如权利要求1所述的预防及治疗癌症的药物组合物，其特征在于：所说的常规的治疗或预防癌症的化学合成药物是指阿霉素，并且芹黄素与阿霉素的重量比为8∶1～16∶1。
9、权利要求8所述的预防及治疗癌症的药物组合物在制备预防或治疗结肠癌药中的应用。
10、如权利要求1所述的预防及治疗癌症的药物组合物，其特征在于：所说的常规的治疗或预防癌症的化学合成药物是指5-氟尿嘧啶，并且芹黄素与5-氟尿嘧啶的重量比为10∶1～30∶1。
11、权利要求10所述的预防及治疗癌症的药物组合物在制备预防或治疗结肠癌药中的应用。
12、如权利要求1所述的预防及治疗癌症的药物组合物，其特征在于：所说的常规的治疗或预防癌症的化学合成药物是指5-氟尿嘧啶，并且芹黄素与5-氟尿嘧啶的重量比为6∶1～15∶1。
13、权利要求12所述的预防及治疗癌症的药物组合物在制备预防或治疗***癌药中的应用。
14、如权利要求1所述的预防及治疗癌症的药物组合物，其特征在于：所说的常规的治疗或预防癌症的化学合成药物是指表鬼臼毒素吡喃葡糖苷，并且芹黄素与表鬼臼毒素吡喃葡糖苷的重量比为1∶1.5～1∶2。
15、权利要求14所述的预防及治疗癌症的药物组合物在制备预防或治疗***癌药中的应用。
16、如权利要求1所述的预防及治疗癌症的药物组合物，其特征在于：所说的常规的治疗或预防癌症的化学合成药物是指丝裂霉素C，并且芹黄素与丝裂霉素C的重量比为15～30∶1。
17、权利要求16所述的预防及治疗癌症的药物组合物在制备预防或治疗***癌药中的应用。
18、如权利要求1所述的预防及治疗癌症的药物组合物，其特征在于：所说的常规的治疗或预防癌症的化学合成药物是指丝裂霉素C，并且芹黄素与丝裂霉素C的重量比为3～6∶1。
19、权利要求18所述的预防及治疗癌症的药物组合物在制备预防或治疗结肠癌药中的应用。
20、如权利要求1所述的预防及治疗癌症的药物组合物，其特征在于：所说的常规的治疗或预防癌症的化学合成药物是指丝裂霉素C，并且芹黄素与丝裂霉素C的重量比为1～2∶1。
21、权利要求20所述的预防及治疗癌症的药物组合物在制备预防或治疗肺癌药中的应用。
22、一种预防及治疗癌症的药物组合物，其包括抗癌有效量的顺铂和芹黄素，并且芹黄素与顺铂的重量比为12～18∶1或1.5∶1～3∶1。
23、权利要求22所述的预防及治疗癌症的药物组合物，当组合物中芹黄素与顺铂的重量比为12～18∶1时，在制备预防或治疗结肠癌药中的应用。
24、权利要求22所述的预防及治疗癌症的药物组合物，当组合物中芹黄素与顺铂的重量比为1.5∶1～3∶1时，在制备预防或治疗肺癌药或卵巢癌药中的应用。
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