CN102656274B

CN102656274B - 生产头孢拉定的方法

Info

Publication number: CN102656274B
Application number: CN201080057051.8A
Authority: CN
Inventors: 哈罗德·莫洛·穆迪; 西奥多瑞斯·约翰内斯·格德弗里德·玛丽亚·杜勒恩·范
Original assignee: DSM Sinochem Pharmaceuticals Netherlands BV
Current assignee: Centrient Pharmaceuticals Netherlands BV
Priority date: 2009-12-14
Filing date: 2010-12-14
Publication date: 2014-10-15
Anticipated expiration: 2030-12-14
Also published as: HK1176644A1; CN102656274A; ES2591106T3; WO2011073166A2; WO2011073166A3; EP2513327B1; EP2513327A2

Abstract

本发明涉及制备头孢拉定的方法，所述方法包括将D-二氢苯基甘氨酸(DHPG)转化为活化形式(DHPGa)；并在存在酶的情况下在水性反应混合物中使7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)与活化形式的D-二氢苯基甘氨酸(DHPGa)反应以形成头孢拉定，所述方法特征在于方法的至少步骤(a)和步骤(b)在厌氧条件下进行。

Description

生产头孢拉定的方法

技术领域

本发明涉及用于在厌氧条件下制备头孢拉定的酶方法。

发明背景

在生产头孢拉定的化学方法中，二氯甲烷用作溶剂时，7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)中的氨基用二氢苯基甘氨酸(DHPG)侧链酰化。例如，在二氯甲烷中的D(-)-α-2，5-二氢苯基甘氨酸甲基邓钠盐和新戊酰氯可被添加至7-ADCA和1，8-二氮杂双环-(5，4，0)-十一碳-7-烯(DBU)在二氯甲烷中的溶液中。所得的反应混合物包含具有保护基团的头孢拉定。受保护的中间产物(诸如具有保护基团的头孢拉定)的用途就生产头孢菌素(例如头孢拉定)的化学方法而言是特有的。为去除保护基团，水和HCl被添加至反应混合物。反应混合物和添加的酸性溶液形成两相体系，其随后被分为两个单独的相：有机相，其包含大部分二氯甲烷和新戊酸，带有一些残留水；和水相，其包含溶液中的水、头孢拉定和HCl，以及残留二氯甲烷。典型地，通过生产头孢拉定的所述化学方法和随后对反应混合物的分离获得的酸性水溶液的pH低于3.2。随后，通过pH改变从水相中回收形成的头孢拉定；可添加络合剂。可添加例如DMF或喹啉以产生固体头孢拉定络合物，其随后被转化为头孢拉定。

一般性的半合成抗生素并且特别是头孢拉定的化学合成的大的缺点是，使用有机溶剂诸如二氯甲烷和DMF进行这些化学方法。这使得这些方法环境不友好，因为产生了大量的化学/溶剂废物。

酶的引入带来了半合成抗生素合成中的重大突破，所述酶能在水性环境中将侧链(例如PG、HPG、DHPG，都以酰胺或酯的活化形式)与核心(例如7-ADCA或6-APA)偶联，因而避免消耗有机溶剂。

WO97/04086公开了通过将母体β-内酰胺与活化形式的侧链反应酶促生产β-内酰胺类抗生素，包括通过7-ADCA与活化形式的DHPG(DHPGa)反应制备头孢拉定。该公开文本除描述了合成反应，即活性侧链与母体β-内酰胺的反应之外，还描述了通过目标产物和活性侧链的水解会形成侧链酸。在头孢拉定的酶生产的情况下形成的侧链酸是D-二氢苯基甘氨酸(DHPG)。WO 97/04086此外还公开了在存在野生型E.coli酰化酶的情况下对头孢拉定进行的酶合成，其示出，当青霉素酰化酶被固定到特定的载体上时，会获得增加的合成/水解(S/H)比。在WO 97/04086的方法中，已实现了高达68％的从7-ADCA和二氢苯基甘氨酸甲酯到头孢拉定的转化率。在WO2005/003367中，WO97/04086的酶方法被进一步改进，导致至少70％的7-ADCA到头孢拉定的转化率同时保持D-二氢苯基甘氨酸(DHPG)在反应混合物中的浓度低于2wt.％。

药典指出，当头孢拉定被用作活性药物成分(API)时，其不应含有超过5.0％的头孢氨苄。头孢氨苄的分子结构与头孢拉定的分子结构非常相似，仅有的差异是侧链：头孢拉定的情况下为DHPG和头孢氨苄的情况下为PG。

头孢拉定是不稳定的并在氧的影响下被转化为头孢氨苄。由于该原因，头孢拉定在其工业生产之后，通常在氧被减到最少的条件下存储和操作。例如，合适的包装是在密封袋中在真空下进行。通常，生产方法之后获得的头孢拉定应含有少于由药典指出的5.0％的头孢氨苄，以在头孢拉定的直到其最后有效期的存储期间，允许形成一些头孢氨苄。

头孢氨苄在头孢拉定中存在的另一个原因是在合成中使用的DHPG已被一些PG污染。对于工业级的DHPG，PG的量可高至2％并通常在1％左右。DHPG还不稳定并应小心存储和操作以防止氧化为PG。头孢拉定的化学合成导致具有约1.0-1.5％头孢氨苄的产物。

本发明人现已发现，在由7-ADCA和活化形式的DHPG酶合成头孢拉定的条件下以及还在DHPG的活化期间，实际上可发生更多的氧化，这导致较之化学合成路线的含有过高水平的头孢氨苄的头孢拉定。得到了高于药典规定的那些水平的水平，例如在5-10％之间。因而本发明的目的是提供在所获得的头孢拉定在存储之后还仍符合药典的规定的条件下由7-ADCA和DHPG酶合成头孢拉定的方法。

发明详述

缩写词表

6-APA：6-氨基青霉烷酸

7-ADCA：7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸

DHPG：D-二氢苯基甘氨酸

DHPGa：活化形式的D-二氢苯基甘氨酸

DHPGM：D-二氢苯基甘氨酸甲酯

DMF：N，N-二甲基甲酰胺

DCME：二氯甲烷

HPG：D-羟苯基甘氨酸

PG：D-苯基甘氨酸

PGM：D-苯基甘氨酸甲酯

在第一方面中，本发明提供了制备头孢拉定的方法，所述方法包括(a)将D-二氢苯基甘氨酸(DHPG)转化为活化形式(DHPGa)以及(b)在存在酶的情况下，在水性反应混合物中将7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)与活化形式的D-二氢苯基甘氨酸(DHPGa)反应，以形成头孢拉定，其特征在于，方法的至少步骤(a)和步骤(b)在厌氧条件下进行。本发明的方法的优点是，较之不在厌氧条件下进行的相同方法，获得了含有更低量的头孢氨苄的头孢拉定。

厌氧条件在本文中被定义为下述那些条件：在所述条件下，用于生产头孢拉定的方法中的至少一个或若干或优选地所有步骤在较之不在厌氧条件下的氧水平已被减少50％，优选地减少至少75％，更优选地减少至少90％，最优选地减少至少95％的氧水平下进行，最优选地在无氧的情况下进行。有多种可用来获得上文定义的厌氧条件的措施：

a.方法可在存在除氧剂的情况下进行，除氧剂即与氧反应使得反应性的氧的有效浓度被减小的化合物。合适的除氧剂是抗坏血酸、偏亚硫酸氢盐、二硫苏糖醇、巯基乙醇、连二亚硫酸盐(dithiotrite)和亚硫酸氢盐。最优选的是亚硫酸氢盐。

b.在方法中使用的原材料、试剂、溶剂和/或水中的一种或多种可被脱气。脱气的合适的方法是使得原材料、试剂、溶剂和/或水处于真空条件下，从而去除氧；或者，可用惰性气体冲洗原材料、试剂、溶剂和/或水，以置换氧。合适的惰性气体是氮、氦、氩和其他惰性气体。最优选的是氮。

c.方法可在包含惰性气体的气氛中进行。合适的惰性气体是氮、氦、氩和其他惰性气体。最优选的是氮。

优选地，通过应用上文列出的措施(a)、(b)和(c)的任何组合来实施方法，例如(a)+(b)或(a)+(c)或(b)+(c)。最优选地，通过应用所有措施(a)+(b)+(c)来实施方法。

在本发明的方法中，活化形式的DHPGa可以是酰胺或酯，优选地DHPGa是酯，诸如，甲酯或乙酯。在本发明方法的优选的实施方式中，DHPG被转化为酯，这通过使DHPG与醇接触以形成包含对应的侧链酯的混合物来实现。本发明方法中使用的醇可从由甲醇和乙醇组成的组中选择，因而分别形成侧链甲酯和乙酯。

方法的步骤(b)可如WO2005/003367中公开的进行，只要其在厌氧条件下进行，WO2005/003367的内容通过引用并入本文。因而，可通过使7-ADCA与DHPGa厌氧反应，进行步骤(b)，这导致至少70％，优选地至少80％，更优选地至少90％的DHPGa到头孢拉定的转化率，其中DHPGa到CEF的转化率＝(nCEF/nDHPGa)*100％，其中nCEF＝形成的头孢拉定的总量(以摩尔计)；且nDHPGa＝添加至反应混合物的DHPGa的总量(以摩尔计)。

反应混合物中的DHPGa可以多种方式添加。在例如分批方法中，最初即在反应开始时可添加所有的DHPGa。也可以在反应过程期间将DHPGa的至少一部分添加至反应混合物。

例如通过控制反应混合物的pH和/或温度，在整个反应过程中，反应混合物中的DHPG浓度可被保持低于2wt.％，优选地低于1.5wt.％，优选地低于1wt.％，更优选地低于0.8wt.％。应用的pH和温度可在宽的范围内变化。形成头孢拉定的反应例如可在-5和35℃之间，优选地在0和30℃之间的温度下进行。更优选地，反应在5℃和25℃之间的温度下进行。形成头孢拉定的反应可在例如在6和9之间的pH下进行。优选地，反应在6.3和8.5之间的pH下进行。反应混合物的pH可以若干方式，例如通过添加酸(例如无机酸，特别是硫酸、盐酸或硝酸)化学地调节至期望的pH值。通过添加碱(例如氢氧化钠或氨)，pH也可被调至期望的pH值。

通过在反应物7-ADCA和DHPGa的稀释的浓度下操作，或通过使用具有改进的特性(例如改进的S/H-比)的酶(所述酶可以是野生型酶或突变酶)，在整个反应过程中，反应混合物中的DHPG浓度也可被保持低于2wt.％，优选地低于1.5wt.％，优选地低于1wt.％，更优选地低于0.8wt.％。根据本发明，保持低的DHPG浓度允许提高转化率。这可另外例如通过应用充分长的停留时间来实现。

包括步骤(a)和(b)的本发明方法也可如WO 2008/110527中公开的进行，只要其根据本发明在厌氧条件下进行，WO 2008/110527的内容通过引用并入本文。在该方法中，在根据本发明的方法的步骤(a)中厌氧形成DHPGa不作为固体中间产物被分离。方法可例如包括下述步骤：

a)用醇厌氧转化DHPG以形成包含对应侧链酯的混合物；在该步骤中侧链酯的形成优选地以一定转化率得到混合物，所述转化率以被如下定义的“比率”表示：

且其中所述比率选地≥85％，更优选地≥90％，更优选地≥95％，更优选地≥96％，更优选地≥97％，更优选地≥98％，最优选地≥99％；

b)通过将在步骤a)中得到的混合物与7-ADCA以及酶混合以形成头孢拉定，来厌氧形成头孢拉定，条件是在步骤(a)中形成的侧链酯不作为固体中间产物被分离。

在本发明方法的转化步骤(步骤(a))中，在厌氧条件下用醇转化DHPG以形成包含对应侧链酯的混合物。用在本发明方法中的醇可从由甲醇和乙醇组成的组中选择，由此分别形成侧链甲酯和乙酯。最优选的醇是甲醇。步骤(a)可以若干方式进行。

转化步骤(a)的一种实施方式包括在20和120℃之间的温度，更优选在40和100℃之间的温度下回流加热混合物，所述混合物包含选自由D-苯基甘氨酸和DHPG组成的组的游离侧链、基于将形成的期望酯所选择的醇(例如获得甲酯的甲醇或获得乙酯的乙醇)和强酸(诸如硫酸)。当使用甲醇作为醇时，温度优选地在60和80℃之间。当使用乙醇作为醇时，温度优选地在65和100℃之间。合适的条件可在如EP-A-0544205中公开的对比例1和2中找到。

转化步骤(a)的另一实施方式包括先前实施方式的改进并包括将作为液体或气体的醇添加至反应混合物，同时从反应中蒸馏出醇和水(例如如在EP-A-0544205中描述的)。

得到包含DHPGMe的混合物的转化步骤(a)的非常优选的实施方式包括下述步骤：

1.在20和120℃之间的温度，更优选地在20和100℃之间的温度，更优选地在40和100℃之间的温度，最优选地在60和80℃之间的温度下，将包含DHPG、甲醇和强酸(诸如硫酸)的反应混合物回流一定时间，例如在0.5和5小时之间，优选地在1小时和3小时之间，更优选地在1.5和2.5小时之间；随后

2.在40和100℃之间，优选地在60和90℃之间，更优选地在70和80℃之间的温度下浓缩混合物。该步骤期间的压强最初可以是大气压并且在浓缩步骤期间可被降低至优选地50mbar或更小，更优选地降低至40mbar或更小，更优选地降低至30mbar或更小，最优选地降低至20mbar或更小。继续浓缩步骤直到在浓缩步骤前存在的水的超过30％被去除，优选地水的超过40％被去除，优选地水的超过50％被去除，优选地水的超过70％水被去除，优选地水的超过80％被去除和最优选地水的超过90％被去除。

3.添加甲醇，优选地添加量为获得浓缩步骤前的反应混合物的初始体积的量或少于反应混合物的初始体积的量，例如≤90％或≤80％或≤70％或≤60％或≤50％或≤40％或≤30％或≤20％的反应混合物的初始体积的量。添加的甲醇的量还可以超过反应混合物的初始体积的量。

4.任选地重复步骤1-3一次或多次，优选地至少一次，优选地2次，更优选地3次，更优选地4次，更优选地5次，更优选地6次，更优选地7次，更优选地8次，更优选地9次，更优选地10次。已发现，通过重复这些步骤，甲酯形成的如上文定义的“比率”显著增加。例如，在进行步骤(a)-(c)仅一次后，可获得在75-85％之间的“比率”，重复步骤(a)-(c)一次后，可获得在85-95％之间的“比率”，在重复步骤(a)-(c)2次后，可获得在95-97％之间的“比率”，在重复步骤(a)-(c)3次后，可获得在97-98％之间的“比率”，在重复步骤(a)-(c)4次后，可获得在98-99％之间的“比率”，在重复步骤(a)-(c)5次后，可获得在99-99.5％之间的“比率”，在重复步骤(a)-(c)超过5次后，可获得超过99.5％的“比率”。

得到包含侧链乙酯的混合物的转化步骤(a)的另一非常优选的实施方式包括下述步骤：

1.在20和120℃之间，更优选地在20和100℃之间，更优选地在40和100℃之间，最优选地在65和100℃之间的温度下，将包含DHPG、乙醇和强酸(诸如硫酸)的反应混合物回流一定时间，例如在0.5和5小时之间，优选地在l小时和3小时之间，更优选地在1.5和2.5小时之间；随后

2.在40和100℃之间，优选地在60和90℃之间，更优选地在70和80℃之间的温度下浓缩混合物。该步骤期间的压强初始可以是大气压并且在浓缩步骤期间可被降低至优选地50mbar或更小，更优选地降低至40mbar或更小，更优选地降低至30mbar或更小，最优选地降低至20mbar或更小。继续浓缩步骤直到在浓缩步骤前存在的水的超过30％被去除，优选地水的超过40％被去除，优选地水的超过50％被去除，优选地水的超过70％被去除，优选地水的超过80％被去除和最优选地水的超过90％水被去除。

3.添加乙醇，优选地添加量为获得浓缩步骤前的反应混合物的初始体积的量或少于反应混合物的初始体积的量，例如≤90％或≤80％或≤70％或≤60％或≤50％或≤40％或≤30％或≤20％的反应混合物的初始体积的量。添加的乙醇的量还可以超过反应混合物的初始体积的量。

4.任选地重复步骤1-3一次或多次，优选地至少一次，优选地2次，更优选地3次，更优选地4次，更优选地5次，更优选地6次，更优选地7次，更优选地8次，更优选地9次，更优选地10次。已发现，通过重复这些步骤，甲酯形成的如上文定义的“比率”显著增加。例如，进行步骤(a)-(c)仅一次后，可获得在75-85％之间的“比率”，重复步骤(a)-(c)一次后，可获得在85-95％之间的“比率”，重复步骤(a)-(c)2次后，可获得在95-97％之间的“比率”，重复步骤(a)-(c)3次后，可获得在97-98％之间的“比率”，重复步骤(a)-(c)4次后，可获得在98-99％之间的“比率”，重复步骤(a)-(c)5次后，可获得在99-99.5％之间的“比率”，重复步骤(a)-(c)超过5次后，可获得超过99.5％的“比率”。

步骤(a)的所有实施方式中，优选地使用下述的醇对DHPG的摩尔：介于3和25之间，更优选地在5和25之间和最优选地在6和10之间。并且，在步骤(a)的所有实施方式中，优选地使用了下述的强酸(以当量计，例如一摩尔盐酸是一当量和一摩尔硫酸是两当量)对游离侧链的摩尔比：介于0.9和10之间，更优选地在1和5之间和最优选地在2和3之间。本领域技术人员能根据所选择的侧链和醇优化反应条件而不需要过度实验。

在步骤(b)中形成头孢拉定之前，在步骤(a)中获得的混合物可被纯化，以获得具有高的如上文定义的“比率”的混合物。将在本发明方法的步骤(b)中使用的混合物的比率优选地≥85％，更优选地≥90％，更优选地≥95％，更优选地≥96％，更优选地≥97％，更优选地≥98％，最优选地≥99％。

纯化步骤的一个实施方式包括从DHPG酯中沉淀并去除DHPG。这可通过如下来实现：添加合适的碱(诸如NaOH、氨、KOH)将在步骤(a)中获得的混合物的pH值调至在2和6.5之间，优选地在2.5和5之间，最优选地在3和4之间。在另一实施方式中，在步骤(a)中获得的反应混合物可被添加至合适量的水或醇或水和醇的混合物，随后通过添加合适的碱(诸如NaOH，氨，KOH)将pH值调至在2和6.5之间，优选地在2.5和5之间，最优选地在3和4之间。在将pH调至期望的值后，可通过添加合适的碱将pH保持在期望的值。在这些条件下，可形成包含游离侧链的沉淀物。在合适的时间之后，可使用已知技术，过滤出沉淀物。滤液包含侧链酯。为了在本发明的方法的步骤(b)中直接使用，使滤液的pH达到pH在1和6之间，优选地在1和4之间，最优选地在1.5和3之间，之后使用已知技术通过蒸发去除醇。

纯化步骤的另一实施方式包括两相或多相体系的形成，所述体系包含含有侧链酯衍生物和少量游离侧链的有机相以及含有游离侧链以及任选地盐的水相。这可通过如下来实现：添加合适的碱(诸如NaOH，氨，KOH)，将步骤(a)中获得的混合物的pH值调至介于7.5和10之间，优选地在8.5和9.5之间，最优选地在8.8和9.2之间。在另一实施方式中，在步骤(a)中获得的反应混合物可被添加至合适量的水、醇或水和醇的混合物，随后通过添加合适的碱(诸如NaOH，氨，KOH)，将pH值调至介于7.5和10之间，优选地在8.5和9.5之间，最优选地在8.8和9.2之间。将pH调至期望的值后，可通过添加合适的碱将pH保持在期望的值。任选地，水可以是盐(例如NaCl)水溶液形式。游离侧链也可以形成沉淀。多相体系中的各相可以使用已知技术分离。任选地有机相可以用水或盐水溶液洗涤。洗涤的水相可被再循环至合适的工艺流，以避免产率损失。该工艺流可以是在步骤(a)后或所述的pH调节后所获得的反应混合物。

纯化步骤的非常优选的实施方式结合两个先前的实施方式，即首先将在步骤(a)中获得的混合物的pH调至介于2和6.5之间，优选地在2.5和5之间，最优选地在3和4之间，过滤掉形成的沉淀，随后将获得的滤液的pH调至介于7.5和10之间，优选地在8.5和9.5之间，最优选地在8.8和9.2之间，并使用已知技术分离所获得的多相体系中的各相。

已令人吃惊地发现，在先前的两种实施方式(其中多相体系在7.5和10之间，优选地在8.5和9.5之间，最优选地在8.8和9.2之间的pH下形成)中，可产生游离碱形式的优选地选自由DHPG-甲酯和DHPG-乙酯组成的组的酯，其中所述酯具有下述性质：

●e.e.(对映体过量)优选地等于或大于90％，更优选地等于或大于95％，优选地等于或大于96％，优选地等于或大于97％，优选地等于或大于98％和最优选地等于或大于99％；且

●优选地20摩尔％或更小，更优选地10摩尔％或更小，更优选地5摩尔％或更小，更优选地2摩尔％或更小，最优选地1摩尔％或更小的盐含量，以盐摩尔数相对于酯摩尔数来表示；

●优选地≥85％，更优选地≥90％，更优选地≥95％，更优选地≥96％，更优选地≥97％，更优选地≥98％，最优选地≥99％的如上文定义的“比率”。

在本发明方法的步骤(b)中，头孢拉定通过如下来形成：将在步骤(a)中获得的混合物(任选地如上文描述地纯化)与7-ADCA和合适的酶(优选地固定化酶)混合以形成相应的半合成β-内酰胺化合物，全部都在厌氧条件下。在酶偶联之后，可使用已知方法回收头孢拉定。例如，可使用向上搅拌，通过底筛排放酶反应器。所得的头孢拉定悬浮液可接着过滤通过玻璃过滤器。由于酶偶联反应之后存在少量的DHPG，所以最终的头孢拉定的结晶可在高浓度的头孢拉定下进行，得到高产率。

可使用适于在根据本发明的方法中使7-ADCA与活化形式的DHPG反应以制备头孢拉定中用作催化剂的任何酶。此类酶例如是以一般术语“青霉素酰化酶”已知的酶，或青霉素G酰化酶，其也被称为青霉素G酰胺酶或苄基青霉素酰化酶(EC 3.5.1.11)。青霉素G酰化酶指来自微生物(尤其是细菌)的一组能对青霉素的6-酰基或头孢菌素的7-酰基进行水解的水解酶。可基于其底物特异性或基于其分子结构，对青霉素酰化酶进行分类，这在很多种出版物中有描述，例如见WO 03/055998和WO98/20120。

可从中获得青霉素酰化酶的微生物是例如Acetobacter(特别是Acetobacter pasteurianum)，Aeromonas，Alcaligenes(特别是Alcaligenesfaecalis)，Aphanocladium，Bacillus sp.(特别是Bacillus megaterium)，Cephalosporium，Escherichia(特别是Escherichia coli)，Flavobacterium，Fusarium(特别是Fusarium oxysporum和Fusarium solani)，Kluyvera，Mycoplana，Protaminobacter，Proteus(特别是Proteus rettgari)，Pseudomonas和Xanthomonas(特别是Xanthomonas citrii)。

在本发明的一种实施方式中，酶可被固定在载体上。在固定化形式中，酶可容易分离并再循环。固定化酶本身是已知的并可商购获得，例如如在WO 92/12782中描述的分离的并如在EP 222462和WO 97/04086中描述的固定的E.coli青霉素酰化酶。用于制备根据本发明的头孢拉定的方法可例如依据所使用的酶在任何合适的pH和温度下进行。例如，包括使7-ADCA与DHPGa反应以形成头孢拉定的方法可在存在野生型青霉素酰化酶的情况下并在低于15℃的温度下进行。优选地，包括使7-ADCA与DHPGa反应以形成头孢拉定的方法在存在野生型青霉素酰化酶的情况下在低于15℃的温度下并在至少7.0的pH下进行。

对于相对于野生型E.coli酰化酶具有增大的S/H比的酶，如果反应在较高温度(例如高于15℃优选地在15和30℃之间)和较低pH下(例如低于7.7，优选地在6和7.5之间)进行，则获得提高的转化率。因此，本发明还涉及包括使7-ADC与DHPGa在厌氧条件下反应以形成头孢拉定的方法，所述方法在存在酶的情况下并在至少15℃、优选地介于15和30℃之间下的温度下进行，所述酶是具有比野生型E.coli酰化酶更高的S/H比、优选地更高的S/H_ini的酰化酶。优选地，在存在酶(其为具有比野生型E.coli酰化酶更高的S/H比的酰化酶)的情况下使7-ADC与DHPGa形成头孢拉定的反应在至少15℃，优选地在15和30℃的温度下和低于7.7，优选地在6和7.5之间的pH下进行。

这是出人意料地，因为在具有较低S/H比的酶的情况下，已发现在较低的温度和较高的pH下实现最高转化率。当具有提高的S/H比的酰化酶具有比野生型E.coli酰化酶的酶活性更低的酶活性时，上述效果特别显著。

具有比野生型的E.coli酰化酶更高S/H比的酰化酶可以是任何酶。该酶可以例如是突变体青霉素酰化酶。可从任何已知的青霉素酰化酶开始，来制备青霉素酰化酶的突变体或酰化酶突变体。经过突变的酰化酶例如是通过本领域已知的重组DNA方法，通过用新的残基去取代一个氨基酸残基，从野生型酰化酶获得的。

在本发明的一种优选的实施方式中，该酶是具有氨基酸取代的突变体青霉素酰化酶，所述取代处于相应于E.coli的青霉素酰化酶β-亚基的β-亚基第24位。在一种优选的实施方式中，相应于E.coli的青霉素酰化酶β-亚基的β-亚基第24位的L-苯丙氨酸已在该位置被L-丙氨酸取代，如WO98/20210所述。该突变可被应用于来自E.coli的Pen G酰化酶，但是也可对来自其它来源的PenG酰化酶使用。对氨基酸位置的编号对应于野生型的E.coli青霉素G酰化酶的氨基酸序列的编号。

如本文中所定义的，合成/水解(S/H)比应被理解为：在酶反应期间的特定时刻，合成产物与水解产物的摩尔比。合成产物应被理解为是由活性侧链和β-内酰胺核心形成的β-内酰胺抗生素。水解产物应被理解为活化侧链的相应的酸。

S/H比是反应物浓度、活性侧链与β-内酰胺核心的摩尔比、温度、pH和酶的函数。在理想状况中，在同样的条件下进行比较实验，其中，对特定的待测酶相对对照酶(优选是E.coli PenG酰化酶)进行测试。

在酶酰基化反应期间，S/H比通常会降低。优选地，在相等的转化率下，对不同的青霉素酰化酶的S/H比进行比较。最为常见地，对0％的转化率(因此时间t＝0)处的所谓初始S/H比(S/H_ini)进行比较，其因此是对S/H比的量度。可通过下述方法来测定具有足够精确的S/Hini：进行酰基化反应，直至达到足够高的转化率，使得可对产物(特别是水解产物)进行精确的测量，然后以S/H_ini对转化率作图，将其外推至转化率为0％处。通过外推来测定初始S/H比可能是必要的，因为在低转化率下形成的水解产物对于S/H_ini的精确测定来说太少了。可用本领域内已知的曲线拟合算法来获得更为可靠的外推。为进行精确测定，必须要有足够的数据点。足够的数据点意味着至少三个数据点，其应当表示出至少0.5％的转化率差异。

酶活性通常可被定义为：在酶酰基化反应中的特定时刻，每单位时间，对每单位量的已溶解或被固定的酶而言，被转化或合成的反应物或产物的摩尔量。优选地，应用固定形式的酶，按照每单位量的被固定的酶来定义酶活性。每单位数量的酶的酶活性通常也被称为特定酶的比活性。

可用多种方法来进行根据本发明的方法，例如采用分批培养或连续培养。优选地，根据本发明的方法以分批过程来进行。分批培养可以是分批培养、补料分批培养、分批和补料分批模式的组合、重复补料分批模式或任何其它组合。

通过根据本发明的方法形成的头孢拉定可以以任何方式结晶。

优选地，根据此后所述的优选实施方式，获得具有增大的稳定性的头孢拉定水合物。

优选地，根据本发明的方法包括从水溶液结晶头孢拉定。所述水溶液可含有优选地小于30vol.％，更优选地小于20vol.％，更优选地，小于10vol.％，更优选地，小于5vol.％(相对液体总体积而言)的有机溶剂或有机溶剂的混合物。优选地，有机溶剂是具有1-7个碳原子的醇，例如一元醇，特别是甲醇或乙醇；二醇，特别是乙二醇；或三醇，特别是甘油。优选地，水溶液含有至少70vol.％的水，更优选地，至少80vol.％，更优选至少90vol.％，最优选至少95vol.％的水(相对液体总体积而言)。

水溶液可以含有7-ADCA和/或DHPG。

头孢拉定可以任何形式被结晶出来，典型地，以头孢拉定水合物的形式。本发明不限于特定的头孢拉定水合物。典型地，所述头孢拉定水合物是头孢拉定一水合物。头孢拉定水合物的水含量例如在3重量％至6重量％的范围内。

优选地，从下述水溶液中结晶出头孢拉定，在所述水溶液中，mCEF/(m7-ADCA+mCEF)之比＞0.7，优选＞0.8，更优选＞0.9，并且，其中，xDH在0至2wt.％之间，优选在0至1wt.％之间，其中，

mCEF＝水溶液中头孢拉定的摩尔量；

m7-ADCA＝水溶液中7-ADCA的摩尔量；并且

xDH＝水溶液中DH相对水溶液总重的浓度。水溶液总重包括水溶液中存在的液相的重量和任何固体组分例如头孢拉定水合物的重量。

已经发现，可通过根据本发明的方法来高效获得优选的水溶液，从而获得增加的转化率和低的DH浓度。

已经发现，从优选的水溶液中结晶出头孢拉定得到品质提高的结晶头孢拉定。

因此，本发明还涉及一种方法，所述方法包括：在反应混合物中，存在酶的情况下，使7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)与活化形式的D-二氢苯基甘氨酸(DHPGa)反应，形成头孢拉定；并且，从水溶液中结晶出头孢拉定，在所述水溶液中，mCEF/(m7-ADCA+mCEF)之比＞0.7，优选＞0.8，更优选＞0.9，并且，其中，xDH在0至2wt.％之间，优选在0至1wt.％之间。

优选地，水溶液中7-ADCA的浓度在水溶液总重的0至5wt.％之间，优选在0至2wt.％之间。已经发现，这导致结晶头孢拉定的品质被进一步改进。

可通过任何合适的方法来制备包含头孢拉定的水溶液。

优选地，根据本发明的制备头孢拉定的方法包括：在所述结晶之前，将酶与头孢拉定分离。例如通过将反应混合物过筛，可以例如从包含头孢拉定的反应混合物中分离出酶，以使酶与头孢拉定分离。在反应混合物中，部分头孢拉定可以头孢拉定水合物的形式存在，且该方法可包括将头孢拉定水合物溶解，以及从得到的溶液中分离出酶。可以根据任何合适的方法，例如过滤或离心，将酶从包含溶解的头孢拉定的水溶液中分离。

在根据本发明的方法的一种实施方式中，所形成的部分头孢拉定在反应混合物中作为头孢拉定水合物存在，且该方法进一步包括将至少部分所述头孢拉定水合物溶解。

可以任何合适的方法来溶解头孢拉定水合物。对头孢拉定水合物的溶解可以例如在pH等于或大于8下进行，更优选地，在8.3至9.5之间的pH下进行，最优选地，在8.5至9之间的pH下进行，或在小于3.0，更优选地小于2.5的pH下，最优选地在小于2.0的pH下进行。在一种优选的实施方式中，溶解头孢拉定水合物例如是通过对反应混合物的pH进行调节来实现的，特别是将反应混合物的pH值增大至8或大于8，优选地，8.3至9.5之间的pH值，最优选地，8.5至9之间的pH值。可以通过加入合适的碱，例如氢氧化钠或氨，使反应混合物的pH增加至目标pH值。所述溶解可以分批或连续进行。也可以从反应混合物中分离出头孢拉定水合物，并将分离出的头孢拉定水合物溶解以形成水溶液。

从包含头孢拉定的水溶液中结晶出头孢拉定可在任何合适的温度下进行。出人意料地，我们发现当在升高的温度下进行结晶时，实现了提高的产物品质。在这些温度下结晶出的头孢拉定可以是化学制备或酶制备的。

因此，本发明还涉及制备头孢拉定晶体的方法，其特征在于，所述方法包括从水溶液中结晶出头孢拉定，以形成头孢拉定晶体，其中所述结晶在45至65℃之间的温度下进行，优选在45至60℃之间，优选在48至55℃之间进行。最优选地，结晶在49至52℃之间的温度下进行。通过在反应混合物中在存在酶的情况下使7-ADCA与DHPGa反应以形成头孢拉定的酶方法中所制备的头孢拉定，优选地，通过根据本发明的方法制备的头孢拉定，可有利地在上文公开的温度下被结晶出来。但是，所述用于结晶的温度不限于通过酶方法制备出的头孢拉定的结晶，其可以例如有利地用于通过化学方法(例如，在不存在酶的情况下)制备出的头孢拉定的结晶。

通过在反应混合物中存在酶的情况下使7-ADCA与DHPGa反应以形成头孢拉定的酶方法所制备的头孢拉定，优选地，通过根据本发明的方法制备的头孢拉定，也可在35至60℃之间的温度下结晶，例如，在35至55℃之间的温度下，例如在35至45℃之间的温度下结晶。

从包含头孢拉定的水溶液中结晶出头孢拉定的操作可在任何合适的pH下进行。优选地，结晶出头孢拉定的操作可在4.0至6.0之间的pH下进行，优选在4.5至5.5之间的pH下，更优选地，在4.7至5之间的pH下进行。出人意料地发现，在进行结晶的优选pH范围内头孢拉定晶体的产率会提高。在本发明的方案内，可用多种方法对水溶液的pH进行调节，例如通过化学方法，加入酸，例如无机酸，特别是硫酸、盐酸或硝酸。优选地，所述结晶是连续进行的。

出人意料地发现，应用优选条件得到表现出增大的稳定性的头孢拉定水合物，增大的稳定性是通过在稳定性测试中450nm波长处的吸光度降低来测得的。

根据本发明的方法还包括：在使得制备出的头孢拉定水合物在450nm处的吸光度小于0.050，优选小于0.040，最优选小于0.030，通常大于0.005的pH和温度下来进行所述的结晶。

在根据本发明的方法的一种实施方式中，酶反应在存在亚硫酸氢钠的情况下进行。优选地，酶反应中存在的亚硫酸氢钠在1至25mM之间，优选在5至15mM之间。出人意料地，酶反应期间亚硫酸氢钠的存在会进一步减小制备出的头孢拉定的有色性(coloration)。

在根据本发明的方法中，在头孢拉定结晶期间也可以存在亚硫酸氢钠。优选地，在头孢拉定结晶以形成头孢拉定一水合物晶体期间存在的亚硫酸氢钠的量在5至250mM之间，更优选在25至150mM之间。可以任何合适的方法从水溶液中分离出头孢拉定水合物并进行干燥。

在另一方面中，本发明涉及能够通过本文描述的方法获得的头孢拉定水合物。优选地，头孢拉定水合物具有下述特性：

a.≤5％的头孢氨苄，更优选地≤4％的头孢氨苄，更优选地≤5％的头孢氨苄甚至更优选地≤2％的头孢氨苄和最优选地≤1％的头孢氨苄，和/或

b.在450nm下低于0.2，优选地低于0.15，更优选地低于0.1，更优选地低于0.05的吸光度。优选地头孢拉定水合物具有在0.001和0.2之间，优选地在0.002和0.15之间，更优选地在0.004和0.1之间，更优选地在0.005和0.05之间，和更优选地在0.010和0.040之间的吸光度；和/或

c.在压力(stress)稳定性测试中的高颜色稳定性，即在40℃、相对湿度75％下储存8周后，头孢拉定水合物的有色性为450nm处的吸光度小于0.20、更优选地小于0.15，最优选地小于0.10；和/或

d.不含或基本上不含有机溶剂。优选地头孢拉定水合物含≤100ppmDMF，更优选地≤75ppm DMF，更优选地≤50ppm DMF，更优选地≤25ppm DMF，甚至更优选地≤10ppm DMF和最优选地没有可检测出的DMF，和/或头孢拉定水合物含有≤200ppm DCME，更优选地≤150ppmDCME，更优选地≤100ppm DCME，更优选地≤50ppm DCME，更优选地≤25ppm DCME，甚至更优选地≤10ppm DCME和最优选地没有可检测出的DCME。

根据本发明的头孢拉定水合物可具有上文列出的特性(a)至(d)的任何组合，例如a+b或a+c或a+d或b+c或b+d或c+d，a+b+c或a+b+d或a+c+d或b+c+d或a+b+c+d。优选至少具有特性a的组合：a+b或a+c或a+d或a+b+c或a+b+d或a+c+d或最优选的a+b+c+d。

材料和方法

使用了来自气体供应网(grid)的氮气而没有进一步纯化。

DHPG从Shanghai Comfort Biochemical Co获得。

实施例

对比例

a)D-二氢苯基甘氨酸-甲酯(DHPGM)溶液的合成

将具有如通过电位检验(potentiometric assay)测量的99.11％含量并具有0.58％的D-苯基甘氨酸(PG)含量的153g DHPG悬浮在280ml甲醇中，并在60分钟内加料121g浓硫酸(加料期间，温度保持在15-20℃)。混合物保持回流2小时并在减压(p＝100mBar，T＝75-80℃)下浓缩。接着，添加140ml甲醇，并且将混合物再次在回流下保持1小时，并在减压下浓缩。该过程重复另外六次。最后，添加140ml甲醇；溶液回流另一小时并冷却至环境温度。在20℃下，在15分钟内，用浓氨水将pH增加至2.1。添加87ml水。在减压和40-50℃下蒸馏甲醇。最后获得了具有2.0的pH并含有40.87％DHPGM和2.0％PGM的374g溶液。

b)酶合成头孢拉定

用37g固定化的Escherichia coli PenG酰化酶突变体Phe-B24-Ala填装具有175μm筛底的反应器。随后在20℃下添加22.3g 7-ADCA、0.03gEDTA和50g水，并且用25％氨水将pH调至7.2。在步骤a)(上文)中所获得的46g DHPGM溶液在180分钟内以恒速被加料到反应器中。pH用氨保持在7.2。温度保持在20℃。60分钟后，添加0.1g固体头孢拉定(晶种)。240分钟后，用25％硫酸将pH减小至6.0。

c)回收头孢拉定

用向上搅拌，通过底筛排放反应器。所得的头孢拉定悬浮液过滤通过玻璃过滤器。所得的母液被转移回反应器。该一系列步骤被重复五次。随后，用3×10ml水洗涤酶。合并头孢拉定湿滤饼、母液和洗涤水，并且将温度降低至2℃。用25％硫酸将pH减小至1.8，并将所得的溶液过滤通过0.45μm过滤器。经过滤的头孢拉定溶液被加热至48℃，用浓氨水将pH提高至2.6并添加1.0g固体头孢拉定(晶种)。15分钟后，在40分钟内将pH增加至4.8。随后，将悬浮液在20℃下搅拌另外30分钟。将悬浮液过滤通过玻璃过滤器，并用2×20ml水和2×25ml丙酮洗涤湿滤饼。干燥之后，获得具有7.3％的头孢氨苄含量的19.0g头孢拉定一水合物。

实施例1

a)通用的；原材料的准备

氮气通过连续通过Varian CP17971水分过滤器和Varian CP17970过滤器过滤来纯化。在使用之前，用氮气对硫酸，甲醇，水和酶脱气，直到出口中的氧含量已低于100ppm。使用了存储13个月后具有1.14％的PG含量的DHPG。在封闭的设备中并在氮气下进行全合成。

b)合成DHPGM溶液

将具有如通过电位检验测量的99.11％含量的并具有1.14％的D-苯基甘氨酸(PG)含量的153g DHPG悬浮在280ml甲醇中，并用氮气对悬浮液脱气。在60分钟内加料121g浓硫酸(加料期间，温度保持在15-20℃)。混合物保持回流2小时并在减压(p＝100mBar，T＝75-80℃)下浓缩。用氮气打破真空(压强从真空增加至大气压)。添加140ml甲醇，并且将混合物再次在回流下保持1小时，并在减压下浓缩。该过程重复另外六次。最后，添加140ml甲醇；溶液回流另一小时并冷却至环境温度。

在20℃下在15分钟内用浓氨水将pH增加至2.1。添加87ml水。在减压和40-50℃下蒸馏甲醇。最后，获得具有2.0的pH并含有44.96％DHPGM和0.87％PGM的374g溶液。显然，当合成在氮气下进行时，较之对比例(2.00％)，形成了更少的PGM(0.87％)。

c)酶合成头孢拉定

用37g固定化Escherichia coli PenG酰化酶突变体Phe-B24-Ala填装具有175μm筛底的反应器。在20℃下添加22.3g 7-ADCA、0.03g EDTA、0.4g过硫酸钠和50g水，并用氮气对悬浮液脱气。用25％氨水将pH调至7.2。

将在步骤b)(上文)中所获得的46g DHPGM溶液在180分钟内以恒速被加料到反应器中。pH用氨保持在7.2。温度被保持在20℃。60分钟后，添加0.1g固体头孢拉定(晶种)。240分钟后，用80％硫酸将pH减小至6.0。

d)回收头孢拉定

用向上搅拌，通过底筛排放反应器。所得的头孢拉定悬浮液过滤通过玻璃过滤器。所得的母液被转移回反应器。该一系列步骤被重复五次。随后，用3×10ml水洗涤酶。合并头孢拉定湿滤饼、母液和洗涤水，并且将温度降低至2℃。用80％硫酸将pH减小至1.8，并将所得的溶液过滤通过0.45μm过滤器。经过滤的头孢拉定溶液被加热至48℃，用浓氨水将pH提高至2.6并添加1.0g固体头孢拉定(晶种)。15分钟后，在40分钟内将pH增加至4.8。随后，将悬浮液在20℃下搅拌另外30分钟。将悬浮液过滤通过玻璃过滤器，并用2×20ml水和2×25ml丙酮洗涤湿滤饼。干燥之后，获得具有1.74％的头孢氨苄含量的25.6g头孢拉定一水合物。

实施例2

以与施例1相同的方式进行该实验，但是所述实验用具有0.63％的PG含量的新鲜制备的DHPG开始。最后获得具有1.03％的头孢氨苄含量的25.6g头孢拉定一水合物。

Claims

1.制备头孢拉定的方法，所述方法包括：

(a).将D-二氢苯基甘氨酸(DHPG)转化为活化形式的D-二氢苯基甘氨酸(DHPGa)；

(b).在水性反应混合物中，在存在青霉素G酰化酶的情况下，将7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)与活化形式的D-二氢苯基甘氨酸反应，以形成头孢拉定，

其特征在于，所述方法的至少步骤(a)和步骤(b)在厌氧条件下进行。

2.根据权利要求1的方法，其中所述厌氧条件通过如下产生：

a.存在一种或多种除氧剂的情况下，进行所述方法的步骤(a)和(b)；

b.使在权利要求1的所述方法的步骤(a)和步骤(b)中使用的原材料、试剂、溶剂和/或水中的一种或多种脱气；

c.在包含惰性气体的气氛下进行权利要求1的所述方法的步骤(a)和步骤(b)；或

d.a+b、a+c、b+c或a+b+c的组合。

3.根据权利要求2的方法，其中通过用氮气冲洗原材料、试剂、溶剂和水中的一种或多种来获得脱气。

4.根据前述权利要求的任一项的方法，特征在于所述活化形式的D-二氢苯基甘氨酸是酰胺或酯。

5.根据权利要求4的方法，其中步骤(a)包括用醇转化DHPG以形成包含对应的DHPG酯的混合物。

6.根据权利要求5的方法，其中所述醇是甲醇或乙醇。

7.根据权利要求5的方法，其中所述醇是甲醇。

8.根据前述权利要求1-3任一项的方法，其中在步骤(b)中的所述反应获得至少70％的7-ADCA到头孢拉定的转化率，并且其中DHPG在反应混合物中浓度低于2wt.％。

9.根据权利要求5的方法，其特征在于，在进行步骤(b)之前，在步骤(a)中形成的所述DHPG-酯不作为固体中间产物被分离。