CN100500840C - 青霉素酰化酶晶体和固定化青霉素酰化酶 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种青霉素酰化酶晶体和固定化青霉素酰化酶，它们可分别由下列方法制备得到：将蛋白质浓度为8～12mg/ml、纯度在25u/mg蛋白以上的青霉素酰化酶纯化溶液，加入含有沉淀剂聚乙二醇、pH为6.0～7.0的缓冲溶液中进行结晶，其中聚乙二醇的重量占缓冲溶液体积的9～13%；将所述的青霉素酰化酶晶体加入含有双功能交联剂的缓冲***中进行交联反应制得固定化青霉素酰化酶。该固定化青霉素酰化酶具有对温度、酸碱、有机溶剂、蛋白酶不敏感，机械强度高，酶的含量及纯度高，使用方便，颗粒形状规则等特点。

Description

青霉素酰化酶晶体和固定化青霉素酰化酶

技术领域

本发明涉及一种青霉素酰化酶晶体和固定化青霉素酰化酶。

背景技术

半合成β-内酰胺类抗生素的生产主要有化学法和酶法两种。国内半合成β-内酰胺类抗生素的生产主要采用化学法，通过6-APA(6-氨基青霉素烷酸)、7-ADCA(7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸)、7-ACA(7-氨基头孢烷酸)等酰基受体与酰基供体的化学酰化反应而合成。化学合成步骤繁琐，并且需要在二氯甲烷等高毒性有机溶剂中进行。酶法合成β-内酰胺类抗生素与化学方法相比具有很多优点：1、酰基供体不需要用毒性相当强的试剂进行羧基活化，或只需要较温和的条件，如以酸或酯的形式；2、酶催化反应的特异性使得无须对抗生素母核上的羧基进行保护；3、高度特异性和高催化活性避免产物的外消旋，减少副反应(如果酶足够纯)；4、不需要像化学合成那样采用高毒性有机溶媒等。因此酶法合成β-内酰胺类抗生素是一种更“干净”的工业生产方法，可以解决环境和工业的矛盾，降低工业成本，具有替代化学合成方法的趋势。

工业上应用的酶多是固定化的酶。传统的酶固定化方法主要有四种：包埋法、吸附法、共价法、交联法(张伟、杨秀山.酶的固定化技术及其应用.自然杂志，2000，22(5)：282-286)。20世纪60年代科研人员在研究羧肽酶-A晶体结构时发现用双功能交联试剂交联酶晶体，酶在获得稳定性时仍然保持活性(F.A.Quiocho，F.M.Richards.Intermolecular cross linking of aprotein in the crystalline state：Carboxypeptidase-A.J Biochemistry，1964，52：833-839)。

青霉素酰化酶的固定化常采用共价法，即将青霉素酰化酶共价连接在特殊的惰性载体上而达到固定化的目的。用传统方法固定化的青霉素酰化酶虽然得到广泛应用，但在稳定性方面仍然存在不足，尤其是在极端pH、高温、以及有机溶剂中的稳定性较差，因而限制了其应用。

发明内容

本发明的要解决的技术问题是：提供一种青霉素酰化酶晶体及其应用交联法制得的一种固定化青霉素酰化酶。

上述技术问题之一是通过下列技术方案来解决：一种青霉素酰化酶晶体，其可采用下列批量沉淀结晶的方法制备得到：将蛋白质浓度为8～12mg/ml、青霉素酰化酶纯度在25u/mg蛋白以上的青霉素酰化酶纯化溶液，加入含有沉淀剂聚乙二醇(PEG)、pH为6.0～7.0的缓冲溶液中进行结晶，其中聚乙二醇的重量占缓冲溶液体积的9～13％。

其中，该沉淀剂聚乙二醇的分子量为4000～8000道尔顿。

该缓冲溶液较佳的为磷酸盐溶液(PBS)。

上述技术问题之二是通过下列技术方案来解决：一种固定化青霉素酰化酶，将上述的青霉素酰化酶晶体加入含有双功能交联剂的缓冲***中进行交联反应制得。

其中，优选的青霉素酰化酶晶体的直径在50～200μm。

而所述的双功能交联剂可以为戊二醛、丁二醛、丙二醛或己二醛等。

常用的双功能交联剂为戊二醛，其在缓冲溶液中的浓度为0.05～0.1％(v/v)。

所述的缓冲***较佳的是pH为6～9的磷酸盐缓冲液。

另外，所述的青霉素酰化酶晶体加入上述的磷酸盐缓冲液中时，使其浓度最好为1～20mg/mL。

而该交联反应的时间一般为10～30分钟。

本发明得到的一种固定化青霉素酰化酶，是一种交联青霉素酰化酶晶体，其与传统共价固定化的青霉素酰化酶相比有以下明显优点：

1.交联酶晶体相对于传统固定化酶对温度、酸碱、有机溶剂、蛋白酶都不敏感，机械强度也明显增强。

2.交联酶晶体中无惰性载体，酶的含量及纯度均较高，提高了酶的反应速度和反应专一性。

3.交联酶晶体以固体形态存在，且不溶于水和有机溶剂，使用方便，只需直接加入而不必进行溶剂转换，同时回收再生也很方便，只需通过过滤、离心或直接倾出溶剂即可；易于干燥，无需成本较高的冷冻干燥。

4.交联酶晶体颗粒形状规则，孔径均一，有利于底物的进出。大分子物质如蛋白质、核酸、多糖和高分子聚合物都不能进入晶体内部进行反应。

附图说明

图1是本发明中不同直径的交联固定化青霉素酰化酶晶体的相对活性比较；

图2是本发明中直径100μm的交联固定化青霉素酰化酶晶体的物理稳定性试验结果；

图3是本发明交联固定化青霉素酰化酶晶体(简称晶体酶)、现有溶液酶和现有固定化酶对pH稳定性的试验结果；

图4是本发明交联固定化青霉素酰化酶晶体(简称晶体酶)和现有溶液酶对温度稳定性的试验结果；

图5是本发明交联固定化青霉素酰化酶晶体(简称晶体酶)和现有溶液酶对蛋白酶稳定性的试验结果；

图6是本发明交联固定化青霉素酰化酶晶体(简称晶体酶)、现有溶液酶和现有固定化酶对有机溶剂(DMF)稳定性试验结果。

具体实施方式

实施例1  青霉素酰化酶晶体的制备

(1)青霉素酰化酶纯化溶液的制备

常温下首先对溶液态青霉素酰化酶(购自浙江海德尔公司)进行纯化，采用常规的硫酸铵分级沉淀、超滤、疏水层析和离子交换层析方法，可以将青霉素酰化酶纯化到25u/mg以上，这种纯度的青霉素酰化酶可以比较容易的利用沉淀结晶方法获得晶体。纯化好后保存在4℃冰箱的蛋白质贮备液中，4℃下12000rpm离心10min，以除去变性蛋白质和杂质沉淀，上清用0.22μm膜过滤，Lowry法测定蛋白质浓度：105mg/ml；

(2)青霉素酰化酶晶体的制备

取1.14ml蛋白贮存液，加入7.06ml pH6.0、0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS)，100rpm缓慢搅拌下慢慢加入50(w/v)％PEG-8000贮存液1.8ml，用6mol/L NaOH调节pH至6.0，混合液略显浑浊，最终蛋白质浓度为12mg/ml，PEG浓度为9(w/v)％；将得到的样品静置于25℃恒温培养箱中，48h后取出，1000rpm离心收集晶体并用pH6.0、0.1M PBS洗涤3次以上，尽量去除PEG及溶解蛋白，得到200μm左右的青霉素酰化酶晶体。

实施例2  青霉素酰化酶晶体的制备

按实施例1的方法和步骤，沉淀剂PEG-8000换用PEG-4000，使结晶母液蛋白质浓度为8mg/ml，PEG浓度为13％，结晶周期为3天，其他条件相同，得到50μm左右的青霉素酰化酶晶体。

实施例3  青霉素酰化酶晶体的制备

按实施例1的方法和步骤，使结晶母液蛋白质浓度为10mg/ml，PEG-8000浓度为12％，其他条件相同，得到100μm左右的青霉素酰化酶晶体。

实施例4  交联固定化青霉素酰化酶的制备

取大约100mg实施例3的100μm的青霉素酰化酶晶体，用pH6.0、0.1mol/L PBS稀释至10ml，4℃下100rpm缓慢搅拌过程中加入25％戊二醛溶液20μl，使其浓度为0.05(v/v)％，反应30min后立即1000rpm离心收集晶体，并用0.05mol/L、pH7.5PBS洗涤数遍，以去除未反应戊二醛，得到100μm左右颗粒大小的交联固定化青霉素酰化酶晶体。

实施例5  交联固定化青霉素酰化酶的制备

取大约100mg实施例3的青霉素酰化酶晶体，用pH6.0、0.1mol/L PBS稀释至10ml，常温下100rpm缓慢搅拌过程中加入25％戊二醛溶液30μl，使其浓度为0.075％(v/v)，反应20min后立即1000rpm离心收集晶体，并用0.05mol/L、pH7.5 PBS洗涤数遍，以去除未反应戊二醛，得到100μm左右颗粒大小的交联固定化青霉素酰化酶晶体。

实施例6  交联固定化青霉素酰化酶的制备

取大约200mg实施例3的青霉素酰化酶晶体，用pH6.0、0.1mol/L PBS稀释至10ml，20℃下100rpm缓慢搅拌过程中加入25％戊二醛溶液40μl，使其浓度为0.1(v/v)％，分别反应10min后立即1000rpm离心收集晶体，并用0.05mol/L、pH7.5PBS洗涤数遍，以去除未反应戊二醛，得到100μm左右颗粒大小的交联固定化青霉素酰化酶晶体。

实施例7  交联固定化青霉素酰化酶的制备

按照实施例4的方法和步骤，取实施例2的青霉素酰化酶晶体，制备得到50μm左右颗粒大小的交联青霉素酰化酶晶体。

实施例8  交联固定化青霉素酰化酶的制备

取大约100mg实施例2的青霉素酰化酶晶体，用pH6.0、0.1mol/L PBS稀释至10ml，20℃下100rpm缓慢搅拌过程中加入25％丙二醛溶液30μl，反应20min左右后立即1000rpm离心收集晶体，并用0.05mol/L、pH7.5PBS洗涤数遍，以去除未反应丙二醛，得到50μm左右颗粒大小的交联青霉素酰化酶晶体。

实施例9  交联固定化青霉素酰化酶的制备

按照实施例5的方法和步骤，取实施例1的青霉素酰化酶晶体，制备得到200μm左右颗粒大小的交联青霉素酰化酶晶体。

实施例10  交联固定化青霉素酰化酶的制备

取大约100mg实施例1的青霉素酰化酶晶体，用pH6.0、0.1mol/L PBS稀释至10ml，4℃下100rpm缓慢搅拌过程中加入25％丁二醛溶液20μl，反应30min后立即1000rpm离心收集晶体，并用0.05mol/L、pH7.5PBS洗涤数遍，以去除未反应丁二醛，得到200μm左右颗粒大小的交联青霉素酰化酶晶体。

实施例11  交联固定化青霉素酰化酶的制备

取大约10mg实施例2的青霉素酰化酶晶体，用pH9.0、0.1mol/L PBS稀释至10ml，20℃下100rpm缓慢搅拌过程中加入25％己二醛溶液40μl，反应10min后立即1000rpm离心收集晶体，并用0.05mol/L、pH7.5PBS洗涤数遍，以去除未反应己二醛，得到100μm左右颗粒大小的交联青霉素酰化酶晶体。

应用实施例1

比较实施例4、7和9不同直径大小的用相同方法交联固定化青霉素酰化酶晶体的相对活性(u/mg)，发现交联青霉素酰化酶晶体颗粒直径越小，相对活性越高，以颗粒直径50μm左右为最佳，结果如图1。

应用实施例2

对实施例7获得的交联青霉素酰化酶晶体进行物理稳定性试验，保存在pH7.5、0.05mol/L PBS中，放置一周，无蛋白溶解出，结果表明交联酶晶体的物理稳定性很好，结果如图2。

应用实施例3

对实施例4获得的交联固定化青霉素酰化酶晶体与上述现有溶液酶以及商品载体固定化青霉素酰化酶(购自德国柏林试剂公司)分别进行pH稳定性、温度稳定性、蛋白酶稳定性、有机溶剂DMF(二甲基甲酰胺)稳定性试验，结果表明本发明的交联固定化青霉素酰化酶晶体对各种极端条件的稳定性方面均优于载体固定化酶及溶液酶，尤其是在对温度和有机溶剂的稳定性方面，结果如图3-6所示。

应用实施例4

(1)用pH6.0、0.1mol/L PBS配制6-APA浓度100mmol/L、D-PGME(对羟苯基甘氨酸甲酯，sigma)浓度分别200、300mmol/L的反应液10ml，加入6ml DMF，使DMF浓度达到30％(v/v)，补充重蒸水至20ml，100rpm搅拌，加入500u实施例4得到的交联青霉素酰化酶晶体，20℃反应2h。

(2)对反应后样品进行HPLC分析，外标法测定产物氨苄青霉素含量，并以氨苄青霉素的产率计算底物6-APA的转化率。

结果表明底物6-APA的转化率分别达到82.3％、89.6％。

应用实施例5

按照上述应用实施例的方法和步骤，改变6-APA浓度为200mmol/L，D-PGME浓度分别400、600mmol/L，其他条件相同，最终结果表明底物6-APA的转化率分别达到85.9％、93.1％。

每次反应完成后，将交联固定化青霉素酰化酶晶体1000rpm离心收集，洗净，待重复利用，15批反应后，酶活保留85％以上。

上述实施例中未特殊说明的试剂均为市售的分析纯。

Claims (9)

1、一种青霉素酰化酶晶体的制备方法，其包括：将蛋白质浓度为8～12mg/ml、纯度在25u/mg蛋白以上的青霉素酰化酶纯化溶液，加入含有沉淀剂聚乙二醇、pH为6.0～7.0的缓冲溶液中进行结晶，其中聚乙二醇的重量占缓冲溶液体积的9～13％。

2、根据权利要求1所述的青霉素酰化酶晶体的制备方法，其特征在于该沉淀剂聚乙二醇的分子量为4000～8000道尔顿。

3、根据权利要求1或2所述的青霉素酰化酶晶体的制备方法，其特征在于该缓冲溶液为磷酸盐溶液。

4、一种固定化青霉素酰化酶的制备方法，其包括权利要求1所述的制备方法的步骤，以及将所制得的青霉素酰化酶晶体加入含有双功能交联剂的缓冲***中进行交联反应的步骤。

5、根据权利要求4所述的固定化青霉素酰化酶的制备方法，其特征在于所述的双功能交联剂为戊二醛、丁二醛、丙二醛或己二醛。

6、根据权利要求5所述的固定化青霉素酰化酶的制备方法，其特征在于所述的双功能交联剂为戊二醛，其在缓冲***中的浓度为0.05～0.1％(v/v)。

7、根据权利要求4所述的固定化青霉素酰化酶的制备方法，其特征在于该交联反应的时间为10～30分钟。

8、根据权利要求4所述的固定化青霉素酰化酶的制备方法，其特征在于所述的缓冲***为pH是6～9的磷酸盐缓冲液。

9、根据权利要求8所述的固定化青霉素酰化酶的制备方法，其特征在于所述的青霉素酰化酶晶体加入上述的磷酸盐缓冲液中，使其浓度为1～20mg/mL。

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