CN105524917A - 基于磁珠法提取血液基因组dna的试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本案涉及基于磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒,包括细胞裂解液、蛋白酶k溶液、磁珠分散液、第一清洗液、第二清洗液和洗脱液;细胞裂解液包括有胍类化合物、氯化钠和吐温20;磁珠分散液中的磁珠采用内核为超顺磁性四氧化三铁,表面包覆有硅羟基,粒径为200-800nm的磁珠;第一清洗液包括有Tris碱、EDTA、异丙醇和水;第二清洗液为乙醇溶液;洗脱液为Tris碱或去离子水。本案的试剂盒操作简洁,可使血液基因组DNA提取工作效率得到大幅度提升;无需对红细胞进行预处理,直接采用细胞裂解液裂解血液细胞后,即可加入磁珠分散液结合基因组DNA,提取量高,适用于高通量实验。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域,具体涉及一种基于磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒及其使用方法。
背景技术
近年来分子生物学技术飞速发展,基因组水平上的研究已成为广大研究者们研究的热点。分子生物学的很多常规实验都需要以提取基因组DNA为前提,无论是基因测序、PCR扩增、还是构建BCA文库等,而且提取到的基因组DNA浓度、纯度、分子量范围和一级结构的完整性都会影响到下游分子生物学实验。近年来精准医疗和体外诊断技术蓬勃发展,需要处理的样品量日益庞大,因此高效、方便、可靠、高通量的DNA提取方法成为相关研究领域的迫切需求。
DNA的提取方法很多,如酚/氯仿抽提法、高盐沉淀法等传统提取方法,由于其提取效率低下,难以实现工业化应用,仅在科研领域尚有少量应用。目前市场上商品化的血液基因组DNA提取方法主要是离心柱法,其原理是根据DNA与离心柱上所修饰化学基团之间的氢键、静电等作用力,在高盐溶液中离心柱特异性吸附DNA,漂洗蛋白质和其它杂质后,用低盐溶液洗脱得到基因组DNA。离心柱型试剂盒较传统的DNA提取方法操作简单,缺点为需要在离心管中操作,需要反复的离心清洗后方可获得DNA产物,操作过程需要将离心柱频繁转出和转入离心管、并配合大量离心工作,导致操作时间随之增加并且需要大量人工,针对一个或几个样品其操作效率可以接受,但针对大规模高通量DNA提取工作依然不理想。当前,基因测序、精准医疗等研究领域单个项目需要处理的DNA样品数量就可以达到几万、几十万甚至上百万个,研究者们迫切需要开发一种更加高效、方便的血液基因组DNA提取方法。
近几年来磁珠法开始应用于不同体系DNA的提纯工作中。磁珠表面修饰有特殊化学基团,在不同条件下可以对DNA分子形成特异性吸附或者解吸附作用,再加上其本身拥有顺磁性的特性,富集DNA后与母液分离操作非常方便。但现有技术中的方法是需要在对红细胞进行预处理后,对大体积的血液DNA样本进行提取。该方法虽可对大体积的血液样本进行快速提取,可随着样本增多,由于红细胞的预处理步骤,则提取时间明显增加,实验人员的工作量也相应增加。
发明内容
针对现有技术存在的不足,本发明的目的在于提供了一种基于磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒及其使用方法。该试剂盒可以从200μL新鲜或冷冻抗凝血中提取高纯度基因组DNA,提取量可达到8-12μg,所得基因组DNA产物可直接应用于临床体外检测使用;且提取步骤简便快捷,提取效率高。
为实现上述目的,本发明通过以下技术方案实现:
一种基于磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒,包括有分别独立分装的细胞裂解液、蛋白酶k溶液、磁珠分散液、第一清洗液、第二清洗液和洗脱液;
其中,所述细胞裂解液包括有胍类化合物、氯化钠和吐温20;所述胍类化合物选自盐酸胍、异硫酸氰胍或其组合;
所述磁珠分散液中的磁珠采用内核为超顺磁性四氧化三铁,表面包覆有硅羟基,粒径为200-800nm的磁珠;
所述第一清洗液包括有Tris碱、EDTA、异丙醇和水;
所述第二清洗液为乙醇溶液;
所述洗脱液为Tris碱或去离子水。
优选的是,所述的基于磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒,其中,所述细胞裂解液中胍类化合物的浓度为5-7mol/L,氯化钠的浓度为0.2-0.5mol/L,吐温20的体积分数为0.5%-2%。
优选的是,所述的基于磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒,其中,所述磁珠分散液为磁珠浓度为20-40μg/μL的去离子水溶液。
优选的是,所述的基于磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒,其中,所述第一清洗液中Tris碱的浓度为30-100mmol/L,EDTA的浓度为6-20mmol/L,异丙醇的体积分数为45%-65%。
优选的是,所述的基于磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒,其中,当所述洗脱液为Tris碱时,Tris碱的浓度为0.9-1.1mmol/L。
一种使用如上述方案中任一项所述的基于磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒的提取方法,包括:
步骤一:向反应杯中依次加入待测血样、蛋白酶k溶液和细胞裂解液,置于涡旋振荡器上混合充分,随后在55-60℃下裂解8-10分钟;
步骤二:向反应杯中依次加入磁珠分散液和异丙醇,置于涡旋振荡器上混合充分,随后将反应杯置于磁板架上静置直至磁珠吸附完全,除去清液;
步骤三:依次使用第一清洗液和第二清洗液对磁珠进行清洗;
步骤四:将磁珠置于45℃真空烘箱中真空干燥3-5分钟,取出,加入洗脱液,置于涡旋振荡器上充分混合,随后置于55-60℃中静置5min;
步骤五:将磁珠与洗脱液分离,即获得含目标DNA的洗脱液。
优选的是,所述的基于磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒的提取方法,其中,所述反应容器为48孔板。
本发明的有益效果是:
1、操作简洁,可使血液基因组DNA提取工作效率得到大幅度提升。本案配合48孔板与磁板架的使用,使得血液中全基因组DNA提取工作无需在离心管中进行,直接在48孔板中进行操作,可使用自动移液器完成自动加液,不需要频繁使用离心机。2块48孔板可同时处理96个样品,仅需要用时约40-60min,对比当前离心柱法DNA提取实验,后者需配合甩板离心机等昂贵设备,依然需要大于1h方可完成;并且使用离心柱法,操作人员进行较大数量样品操作时,需花费大量精力用于离心柱转入和转出离心管的操作,工序繁忙、容易产生操作失误。
2、无需对红细胞进行预处理,直接采用细胞裂解液裂解血液细胞后,即可加入磁珠分散液结合基因组DNA。
3、DNA提取产量高达8-12μg。该方法基于磁珠法开发,磁珠表面修饰有可以对DNA进行特异性吸附的化学基团,在高盐、低pH值下可以实现快速吸附,在低盐、高pH值下又可以快速解离,DNA提取产量高。
4、无需使用苯酚、氯仿等有机溶剂,对操作人员安全无毒副作用。
5、工作效率得到了大幅度提升,适用于高通量实验。
附图说明
图1为本案实施例1中从血液中抽提基因组DNA产物的电泳胶图(孔道1-2:2份Omega离心柱法平行实验;孔道3-5:3份采用本案试剂盒提取法的平行实验)。
图2为本案实施例2中从血液中高通量提取全基因组DNA产物的的电泳胶图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1
一种基于磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒,包括独立分装的:
细胞裂解液:6M的盐酸胍、0.5M的氯化钠与体积分数1%的吐温20混合溶液。具体配制方法:称取573g盐酸胍和29g氯化钠,加入800mL去离子水搅拌溶解,加入10mL吐温20,继续加入去离子水定容到1L。
蛋白酶k溶液:蛋白酶k溶液是一种成熟的市售商品,它是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶,从林伯氏白色念球菌中纯化得到。蛋白酶k溶液就是将蛋白酶k溶于水中所得到的溶液。
磁珠分散液:浓度为20mg/mL的磁珠混悬液,磁珠内核为四氧化三铁(Fe3O4),表面包覆了SiO2层。具体配制方法:称取2g磁珠,加入到100mL去离子水中,超声分散均匀。
第一清洗液:40mM的Tris-HCl、10mM的EDTA的50%(v/v)的异丙醇水溶液。具体配制方法:称取0.63gTris-HCl和0.29gEDTA,加入80mL50%(v/v)的异丙醇水溶液进行充分溶解,继续加入50%(v/v)的异丙醇水溶液定容到100mL。
第二清洗液:80%(v/v)的乙醇溶液。
洗脱液:1mM的Tris碱水溶液,pH值为8.0。具体配制方法:称取12mgTris碱,加入8去离子水进行充分溶解,继续加入去离子水定容到100mL,用浓盐酸调节pH值至8.0。
使用上述试剂盒对血液基因组DNA产物进行提取:
步骤一:4℃或室温下解冻冷冻的血样;水浴锅稳定到58℃;涡旋混合仪的振动频率设定为1150rpm。
步骤二:用移液器按顺序向48孔板中加入200μL血样、10μL蛋白酶k溶液和200μL细胞裂解液,平行3个样品,涡旋振荡30秒充分混匀,置于水浴锅中裂解10分钟。
步骤三:取出48孔板,分别加入100μL磁珠分散液、300μL异丙醇,将48孔板置于涡旋混合仪振荡5分钟后,将48孔板装入48孔板专用磁板架上静置20秒至磁珠吸附完全,保持48孔板固定于磁板架上,直接倒扣弃去上清液,然后呈倒扣状态置于吸水纸上,彻底去除上清液残留;
步骤四:将48孔板从磁板底座上取下,向样品孔中分别加入500μL第一清洗液,将48孔板置于涡旋混合仪上振荡25秒,将48孔板重新装回磁板架静置20秒至磁珠吸附完全,保持48孔板固定于磁板架上,直接倒扣弃去上清液,然后呈倒扣状置于吸水纸上,彻底弃去上清液残留;随后用第二清洗液重复以上清洗操作两次;
步骤五:将清洗完毕的48孔板连同磁板架一起置于45℃真空烘箱中真空干燥3分钟,取出48孔板,向样品孔中分别加入150μL洗脱液,将48孔板置于涡旋混合仪上振荡1分钟,将48孔板置于水浴锅中静置5分钟;
步骤六:将48孔板从涡旋混合仪上取下,将48孔板放置于磁板架上静置20秒,保持48孔板固定于磁板架上,转移洗脱液至新的离心管中,即获得了目标DNA产物于澄清的洗脱液中。
实验同时对相同DNA样品,使用Omega柱式法血液基因组DNA提取试剂盒进行了2份平行对照实验。
琼脂糖凝胶电泳检测:对所得5份DNA回收产物,分别取2μL上样,进行琼脂糖凝胶电泳,胶图(见图1)显示所获得DNA产物条带清晰完整,没有降解,每份提取的DNA条带亮度与Omega柱式法结果相当。
OD值检测:使用超微量紫外-可见光分光光度计对5份DNA回收样品进行了OD值检测(见表1)。检测结果显示使用本方法从血液中提取得到的基因组DNA产物含量高且纯度良好。
表1实施例1中从血液中抽提基因组DNA产物的OD值检测结果
注:样品1-2:Omega柱式法实验结果;样品3-5:本试剂盒及方法实验结果。
实施例2
使用实施例1的试剂盒对16份血液基因组DNA进行高通量抽提实验:
步骤一:4℃或室温下解冻冷冻的血样;水浴锅稳定到58℃;涡旋混合仪的振动频率设定为1150rpm。
步骤二:用多通道自动移液器向48孔板中按顺序加入200μL血样、10μL蛋白酶k溶液、200μL细胞裂解液,平行16份样品,涡旋振荡30秒充分混匀,置于水浴锅中裂解10分钟。
步骤三:取出48孔板,用多通道自动移液器向16个样品孔中分别加入100μL磁珠分散液、300μL异丙醇之后,将48孔板置于涡旋混合仪振荡5分钟,将48孔板放置到48孔板用磁板架上静置20秒至磁珠吸附完全,保持48孔板固定于磁板架上,直接倒扣弃去上清液,然后呈倒扣状态置于吸水纸上,彻底去除上清液残留;
步骤四:将48孔板从磁板底座上取下,用多通道自动移液器向样品孔中分别加入500μL第一清洗液,之后将48孔板置于涡旋混合仪上振荡25秒,将48孔板重新装回磁板架上静置20秒至磁珠吸附完全,保持48孔板固定于磁板架上,直接倒扣弃去上清液,然后呈倒扣状置于吸水纸上,彻底弃去上清液;用第二清洗液重复以上清洗操作两次;
步骤五:将清洗完毕的48孔板连同磁板架一起置于45℃真空烘箱中真空干燥3分钟,取出48孔板,用多通道自动移液器向样品孔中分别加入150μL洗脱液,将48孔板置于涡旋混合仪上振荡1分钟后,将48孔板放于水浴锅中静置5分钟;
步骤六:将48孔板从涡旋混合仪上取下,将48孔板放置于磁板架上静置20秒,保持48孔板固定于磁板架上,用多通道自动移液器转移洗脱液至PCR板中,获得目标DNA产物于澄清的洗脱液中。
琼脂糖凝胶电泳检测:对所得16份DNA回收产物,分别取2μL上样,进行琼脂糖凝胶电泳,胶图(见图2)显示所获得全基因组DNA产物平行性好,条带清晰,无拖尾和杂带,表明提取的基因组DNA完整性好,且无其它DNA污染。
OD值检测:使用超微量紫外-可见光分光光度计对16份基因组DNA回收产物进行了OD值检测(见表2)。检测结果显示使用本方法对血液基因组DNA进行提取得到的DNA产物含量高且纯度良好。
表2实施例2中从血液中高通量抽提基因组DNA产物的OD检测值
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (7)
1.一种基于磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒,其特征在于,包括有分别独立分装的细胞裂解液、蛋白酶k溶液、磁珠分散液、第一清洗液、第二清洗液和洗脱液;
其中,所述细胞裂解液包括有胍类化合物、氯化钠和吐温20;所述胍类化合物选自盐酸胍、异硫酸氰胍或其组合;
所述磁珠分散液中的磁珠采用内核为超顺磁性四氧化三铁,表面包覆有硅羟基,粒径为200-800nm的磁珠;
所述第一清洗液包括有Tris碱、EDTA、异丙醇和水;
所述第二清洗液为乙醇溶液;
所述洗脱液为Tris碱或去离子水。
2.如权利要求1所述的基于磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒,其特征在于,所述细胞裂解液中胍类化合物的浓度为5-7mol/L,氯化钠的浓度为0.2-0.5mol/L,吐温20的体积分数为0.5%-2%。
3.如权利要求1所述的基于磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒,其特征在于,所述磁珠分散液为磁珠浓度为20-40μg/μL的去离子水溶液。
4.如权利要求1所述的基于磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒,其特征在于,所述第一清洗液中Tris碱的浓度为30-100mmol/L,EDTA的浓度为6-20mmol/L,异丙醇的体积分数为45%-65%。
5.如权利要求1所述的基于磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒,其特征在于,当所述洗脱液为Tris碱时,Tris碱的浓度为0.9-1.1mmol/L。
6.一种使用如权利要求1-5中任一项所述的基于磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒的提取方法,其特征在于,包括:
步骤一:向反应容器中依次加入待测血样、蛋白酶k溶液和细胞裂解液,置于涡旋振荡器上混合充分,随后在55-60℃下裂解8-10分钟;
步骤二:向反应容器中依次加入磁珠分散液和异丙醇,置于涡旋振荡器上混合充分,随后将反应容器置于磁板架上静置直至磁珠吸附完全,除去清液;
步骤三:依次使用第一清洗液和第二清洗液对磁珠进行清洗;
步骤四:将磁珠置于45℃真空烘箱中真空干燥3-5分钟,取出,加入洗脱液,置于涡旋振荡器上充分混合,随后置于55-60℃中静置5min;
步骤五:将磁珠与洗脱液分离,即获得含目标DNA的洗脱液。
7.如权利要求6所述的基于磁珠法提取血液基因组DNA的试剂盒的提取方法,其特征在于,所述反应容器为48孔板。
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