CN102154264B - 一种快速提取血液总核糖核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速提取血液总核糖核酸的方法，属于核酸纯化领域。首先向全血中加入快速红细胞裂解液，对混合物进行离心分离，取出离心分离的沉淀物，在其中加入悬浮液，再依次加入裂解液和蛋白酶K溶液，混匀后加入无水乙醇，再混匀后转入硅膜吸附柱中，进行吸附离心，加入去蛋白液和脱氧核糖核酸酶溶液，进行两次去蛋白离心，加入漂洗液进行脱盐离心，最后干燥离心后，加入无核糖核酸酶的水洗脱离心，得到核糖核酸溶液。本发明方法具有高效、快速、简洁的特点，纯化的RNA可用于芯片分析、体外翻译和分子克隆等等多种下游实验。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速提取血液总核糖核酸的方法，属于核酸纯化领域。
背景技术
外周血在人和动物体内免疫反应及代谢中发挥着重要作用，作为一种特殊的组织由于其易获得性，在基础和临床研究中具有很重要的地位。外周血可作为造血***疾病研究中的分子标志以及用于体外诊断***的开发，还可用于血液***外众多***疾病的分子监测。其中，有效提取外周血核糖核酸(以下简称RNA)过程中最重要的一步。但由于血液本身的易凝固性，以及血液内多种细胞的复杂性，以及其不像实体组织那样可以冻存后再提取RNA，使得血液高质量的RNA的提取非常艰难，尤其应用基因芯片对之进行全基因表达谱扫描时，对RNA的质量和数量要求就更为严格。
从血液中提取RNA面临的最大难题之一是RNA非常不稳定：研究表明在采血后的短短几个小时内RNA即迅速且显著降解，另外部分RNA在采血后受到诱导，表达增加。这种RNA降解和基因的体外诱导表达会导致在分析体内基因转录本丰度时出错，甚至低丰度的信息丢失。而传统的离心柱法提取血液RNA需要先从全血中分离出白细胞，并且需要过滤步骤后才能开始和吸附柱结合。在与吸附柱结合前的步骤繁琐，并且需要40分钟以上。
发明内容
本发明的目的是提出一种快速提取血液总核糖核酸的方法，采用一种新的快速红细胞裂解液使红细胞膜裂解和血浆分散，并且通过十六烷基三甲基硫酸铵成分能立刻和RNA形成复合体沉淀，以保证核糖核酸的完整性，并使提取过程高效、快速。
本发明提出的快速提取血液总核糖核酸的方法，包括以下步骤：
(1)向100～400微升全血中加入快速红细胞裂解液，加入的体积比为：全血∶红细胞裂解液＝1∶5，颠倒混匀8～10次，得到混合物；
(2)对上述混合物进行离心分离，离心分离的转速为7300转/分钟，离心分离时间为3分钟，取出离心分离的沉淀物；
(3)在上述沉淀物中加入240微升悬浮液，研磨至沉淀完全溶解，加入200微升裂解液，混匀，再加入20微升蛋白酶K溶液，充分颠倒混匀，55℃下放置10分钟，颠倒混匀，得到溶液；
(4)在上述溶液中加入240微升无水乙醇，混匀后转入硅膜吸附柱中，进行吸附离心，离心吸附的转速为12000转/分钟，离心吸附时间为1分钟，倒去废液；
(5)向步骤(4)的硅膜吸附柱中加入350微升去蛋白液，进行第一次去蛋白离心，去蛋白离心转速为12000转/分钟，去蛋白离心时间为15秒，倒去废液；
(6)向步骤(5)的硅膜吸附柱中加入活性单位为0.375Kunitz的脱氧核糖核酸酶溶液80微升，室温下放置15分钟后，再加入350微升去蛋白液，进行第二次去蛋白离心，去蛋白离心转速为12000转/分钟，去蛋白离心时间为15秒，倒去废液；
(7)向步骤(6)的硅膜吸附柱中加入500微升漂洗液，室温下静置2分钟，进行脱盐离心，脱盐离心的转速为12000转/分钟，脱盐离心时间为15秒，倒去废液；重复该步骤一次；
(8)对步骤(7)的硅膜吸附柱进行干燥离心，干燥离心的转速为12000转/分钟，干燥离心时间为2分钟，将吸附柱置于室温下2～5分钟，去除吸附材料中的漂洗液；
(9)在步骤(8)的硅膜吸附柱中加入30～50微升无核糖核酸酶的水，室温下放置2分钟后，进行洗脱离心，洗脱离心的转速为12000转/分钟，洗脱离心时间为2分钟，得到核糖核酸溶液。
上述方法中，所述的快速红细胞裂解液的各组分的质量为：
氯化铵 60～100克
碳酸氢钾 15～20克
乙二胺四乙酸四钠 6～8克
十六烷基三甲基硫酸铵 5～10克
将上述各组分称重后混合，加去离子水，得到混合液，用氢氧化钠溶液调混合液的pH值至7.2～7.4，并使混合液体积为1000毫升。
上述方法中，所述的悬浮液的配方为：
酒石酸钠 11.5～17.25克
盐酸胍 573～764克
乙基苯基聚乙二醇(NP40) 5～10毫升
将上述各组分量取后混合，加去离子水，并使混合液体积为1000毫升
本发明提出的快速提取血液总核糖核酸的方法，其优点是：
1、本发明方法使用了一种新的快速红细胞裂解液，因此使血液总核糖核酸的提取过程具有高效、快速、简洁的特点，可以直接从全血中分离纯化总核糖核酸，无需先进行白细胞的分离，例如本发明方法的实施例2中从100微升小鼠全血中提取总核糖核酸只需25分钟。
2、使用本发明方法纯化的总核糖核酸完整性好，纯度高，可用于反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(Real Time RT-PCR)、芯片分析、核糖核酸印记杂交(Northern blot)、点杂交(Dot blot)、体外翻译、核糖核酸酶保护分析和分子克隆等多种下游实验。
附图说明
图1是本发明方法的实施例1，从400微升人全血中提取总核糖核酸的电泳检测图。
其中，泳道1：脱氧核糖核酸分子量标准(MarkerIII)。泳道2：使用本发明方法纯化的总核糖核酸。
图2是本发明方法的实施例2，从100微升小鼠全血中提取总核糖核酸的电泳检测图。
其中，泳道1：脱氧核糖核酸分子量标准(MarkerIII)。泳道2：使用本发明方法纯化的总核糖核酸。
具体实施方式
本发明提出的快速提取血液总核糖核酸的方法，包括以下步骤：
(1)向100～400微升全血中加入快速红细胞裂解液，加入的体积比为：全血∶红细胞裂解液＝1∶5，颠倒混匀8～10次，得到混合物；
(2)对上述混合物进行离心分离，离心分离的转速为7300转/分钟，离心分离时间为3分钟，取出离心分离的沉淀物；
(3)在上述沉淀物中加入240微升悬浮液，研磨至沉淀完全溶解，加入200微升裂解液，混匀，再加入20微升蛋白酶K溶液，充分颠倒混匀，55℃下放置10分钟，颠倒混匀，得到溶液；
(4)在上述溶液中加入240微升无水乙醇，混匀后转入硅膜吸附柱中，进行吸附离心，离心吸附的转速为12000转/分钟，离心吸附时间为1分钟，倒去废液；
(5)向步骤(4)的硅膜吸附柱中加入350微升去蛋白液，进行第一次去蛋白离心，去蛋白离心转速为12000转/分钟，去蛋白离心时间为15秒，倒去废液；
(6)向步骤(5)的硅膜吸附柱中加入活性单位为0.375Kunitz的脱氧核糖核酸酶溶液80微升，室温下放置15分钟后，再加入350微升去蛋白液，进行第二次去蛋白离心，去蛋白离心转速为12000转/分钟，去蛋白离心时间为15秒，倒去废液；
(7)向步骤(6)的硅膜吸附柱中加入500微升漂洗液，室温下静置2分钟，进行脱盐离心，脱盐离心的转速为12000转/分钟，脱盐离心时间为15秒，倒去废液；重复该步骤一次；
(8)对步骤(7)的硅膜吸附柱进行干燥离心，干燥离心的转速为12000转/分钟，干燥离心时间为2分钟，将吸附柱置于室温下2～5分钟，去除吸附材料中的漂洗液；
(9)在步骤(8)的硅膜吸附柱中加入30～50微升无核糖核酸酶的水，室温下放置2分钟后，进行洗脱离心，洗脱离心的转速为12000转/分钟，洗脱离心时间为2分钟，得到核糖核酸溶液。
上述方法中，所述的快速红细胞裂解液的各组分的质量为：
氯化铵 60～100克
碳酸氢钾 15～20克
乙二胺四乙酸四钠 6～8克
十六烷基三甲基硫酸铵 5～10克
将上述各组分称重后混合，加去离子水，得到混合液，用氢氧化钠溶液调混合液的pH值至7.2～7.4，并使混合液体积为1000毫升。
上述方法中，所述的悬浮液的配方为：
酒石酸钠 11.5～17.25克
盐酸胍 573～764克
乙基苯基聚乙二醇(NP40) 5～10毫升
将上述各组分量取后混合，加去离子水，并使混合液体积为1000毫升。
以下介绍本发明方法的实施例。
实施例1：从人的全血中提取总RNA。
(1)向400微升人全血中加入快速红细胞裂解液，加入的体积比为：全血∶红细胞裂解液＝1∶5，颠倒混匀8～10次，得到混合物。其中的红细胞裂解液，其制备方法是：将氯化铵65克、碳酸氢钾18克、乙二胺四乙酸四钠6.5g和十六烷基三甲基硫酸铵9克混合，加去离子水，得到混合液，用氢氧化钠溶液调混合液的pH值至7.3，并使混合液体积为1000毫升。
(2)对上述混合物进行离心分离，离心分离的转速为7300转/分钟，离心分离时间为10分钟，取出离心分离的沉淀物。
(3)在上述沉淀物中加入240微升悬浮液10毫升将上述各组分量取后混合，加去离子水，并使混合液体积为1000毫升)，研磨至沉淀完全溶解，加入200微升裂解液，混匀，再加入20微升蛋白酶K溶液，充分颠倒混匀，55℃下放置10分钟，颠倒混匀，得到溶液。其中的悬浮液，其制备方法是：将酒石酸钠12克、盐酸胍573克和乙基苯基聚乙二醇(NP40)10毫升混合，加去离子水，并使混合液体积为1000毫升。
(4)在上述溶液中加入240微升无水乙醇，混匀后转入硅膜吸附柱中，进行吸附离心，离心吸附的转速为12000转/分钟，离心吸附时间为1分钟，倒去废液。
(5)向步骤(4)的硅膜吸附柱中加入350微升去蛋白液，进行第一次去蛋白离心，去蛋白离心转速为12000转/分钟，去蛋白离心时间为15秒，倒去废液。
(6)向步骤(5)的硅膜吸附柱中加入活性单位为0.375Kunitz的脱氧核糖核酸酶溶液80微升，室温下放置15分钟后，再加入350微升去蛋白液，进行第二次去蛋白离心，去蛋白离心转速为12000转/分钟，去蛋白离心时间为15秒，倒去废液。
(7)向步骤(6)的硅膜吸附柱中加入500微升漂洗液，室温下静置2分钟，进行脱盐离心，脱盐离心的转速为12000转/分钟，脱盐离心时间为15秒，倒去废液；重复该步骤一次。
(8)对步骤(7)的硅膜吸附柱进行干燥离心，干燥离心的转速为12000转/分钟，干燥离心时间为2分钟，将吸附柱置于室温下2～5分钟，去除吸附材料中的漂洗液；
(9)在步骤(8)的硅膜吸附柱中加入30～50微升无核糖核酸酶的水，室温下放置2分钟后，进行洗脱离心，洗脱离心的转速为12000转/分钟，洗脱离心时间为2分钟，得到核糖核酸溶液。
图1所示是实施例1中从400微升人全血中提取总核糖核酸的电泳检测图，图中泳道1：脱氧核糖核酸分子量标准(MarkerIII)，泳道2：使用本发明方法纯化的总核糖核酸。
实施例2：从小鼠的全血中提取总RNA。
(1)向100微升小鼠全血中加入快速红细胞裂解液，加入的体积比为：全血∶红细胞裂解液＝1∶5，颠倒混匀8～10次，得到混合物。其中的红细胞裂解液，其制备方法是：将氯化铵65克、碳酸氢钾18克、乙二胺四乙酸四钠6.5g和十六烷基三甲基硫酸铵9克混合，加去离子水，得到混合液，用氢氧化钠溶液调混合液的pH值至7.3，并使混合液体积为1000毫升。
(2)对上述混合物进行离心分离，离心分离的转速为7300转/分钟，离心分离时间为3分钟，取出离心分离的沉淀物；
(3)在上述沉淀物中加入240微升悬浮液，研磨至沉淀完全溶解，加入200微升裂解液，混匀，再加入20微升蛋白酶K溶液，充分颠倒混匀，55℃下放置10分钟，颠倒混匀，得到溶液。其中悬浮液的制备方法是：酒石酸钠12克、盐酸胍573克和乙基苯基聚乙二醇(NP40)10毫升混合，加去离子水，并使混合液体积为1000毫升。
(4)在上述溶液中加入240微升无水乙醇，混匀后转入硅膜吸附柱中，进行吸附离心，离心吸附的转速为12000转/分钟，离心吸附时间为1分钟，倒去废液。
(5)向步骤(4)的硅膜吸附柱中加入350微升去蛋白液，进行第一次去蛋白离心，去蛋白离心转速为12000转/分钟，去蛋白离心时间为15秒，倒去废液。
(6)向步骤(5)的硅膜吸附柱中加入活性单位为0.375Kunitz的脱氧核糖核酸酶溶液80微升，室温下放置15分钟后，再加入350微升去蛋白液，进行第二次去蛋白离心，去蛋白离心转速为12000转/分钟，去蛋白离心时间为15秒，倒去废液。
(7)向步骤(6)的硅膜吸附柱中加入500微升漂洗液，室温下静置2分钟，进行脱盐离心，脱盐离心的转速为12000转/分钟，脱盐离心时间为15秒，倒去废液；重复该步骤一次。
(8)对步骤(7)的硅膜吸附柱进行干燥离心，干燥离心的转速为12000转/分钟，干燥离心时间为2分钟，将吸附柱置于室温下2～5分钟，去除吸附材料中的漂洗液；
(9)在步骤(8)的硅膜吸附柱中加入30～50微升无核糖核酸酶的水，室温下放置2分钟后，进行洗脱离心，洗脱离心的转速为12000转/分钟，洗脱离心时间为2分钟，得到核糖核酸溶液。
图2所示是实施例2中从100微升小鼠全血中提取总核糖核酸的电泳检测图，其中泳道1：脱氧核糖核酸分子量标准(MarkerIII)，泳道2：使用本发明方法纯化的总核糖核酸。
本发明方法的上述实施例中，所用的裂解液、硅膜吸附柱、脱氧核糖核酸酶溶液、去蛋白液、漂洗液和DNA分子量标准(Marker III)等均由天根生化科技(北京)有限公司生产。
Claims (1)
1.一种快速提取血液总核糖核酸的方法，其特征在于该方法包括以下各步骤：
(1)向100～400微升全血中加入快速红细胞裂解液，加入的体积比为：全血∶红细胞裂解液＝1∶5，颠倒混匀8～10次，得到混合物，其中所述的快速红细胞裂解液的各组分的质量为：
氯化铵 60～100克
碳酸氢钾 15～20克
乙二胺四乙酸四钠 6～8克
十六烷基三甲基硫酸铵5～10克
将上述各组分称重后混合，加去离子水，得到混合液，用氢氧化钠溶液调混合液的pH值至7.2～7.4，并使混合液体积为1000毫升；
(2)对上述混合物进行离心分离，离心分离的转速为7300转/分钟，离心分离时间为3分钟，取出离心分离的沉淀物；
(3)在上述沉淀物中加入240微升悬浮液，研磨至沉淀完全溶解，加入200微升裂解液，混匀，再加入20微升蛋白酶K溶液，充分颠倒混匀，55℃下放置10分钟，颠倒混匀，得到溶液，其中所述的悬浮液的配方为：
酒石酸钠 11.5～17.25克
盐酸胍 573～764克
乙基苯基聚乙二醇5～10毫升
将上述各组分量取后混合，加去离子水，并使混合液体积为1000毫升；
(4)在上述溶液中加入240微升无水乙醇，混匀后转入硅膜吸附柱中，进行吸附离心，离心吸附的转速为12000转/分钟，离心吸附时间为1分钟，倒去废液；
(5)向步骤(4)的硅膜吸附柱中加入350微升去蛋白液，进行第一次去蛋白离心，去蛋白离心转速为12000转/分钟，去蛋白离心时间为15秒，倒去废液；
(6)向步骤(5)的硅膜吸附柱中加入活性单位为0.375Kunitz的脱氧核糖核酸酶溶液80微升，室温下放置15分钟后，再加入350微升去蛋白液，进行第二次去蛋白离心，去蛋白离心转速为12000转/分钟，去蛋白离心时间为15秒，倒去废液；
(7)向步骤(6)的硅膜吸附柱中加入500微升漂洗液，室温下静置2分钟，进行脱盐离心，脱盐离心的转速为12000转/分钟，脱盐离心时间为15秒，倒去废液；重复该步骤一次；
(8)对步骤(7)的硅膜吸附柱进行干燥离心，干燥离心的转速为12000转/分钟，干燥离心时间为2分钟，将吸附柱置于室温下2～5分钟，去除吸附材料中的漂洗液；
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