CN101747426B - 一种合成普兰林肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固相合成普兰林肽的方法,包括以下步骤:1)由Fmoc-Tyr(tBu)-OH和取代度为0.3-1.5mmol/g的氨基树脂,得到Fmoc-Tyr(tBu)-氨基树脂;2)将Fmoc-Tyr(tBu)-氨基树脂依肽序逐步偶联剩余的保护氨基酸;3)利用碘进行固相氧化使巯基成环;4)裂解普兰林肽-树脂得到普兰林肽粗肽;5)纯化得到普兰林肽。本发明工艺采用Fmoc固相合成策略,利用多种偶联剂体系和二肽片段偶联法,采用固相氧化,具有反应操作简单、成本低、且收率较高等特点,适合规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种合成多肽的合成方法,尤其涉及降血糖多肽药物的固相合成方法。
背景技术
最先,人们从胰岛的β细胞分泌物中发现了一种能减缓食物在小肠吸收速度的多肽,即由37个氨基酸残基构成的多肽激素(amylin)。该多肽激素通过抑制高血糖素来减少肝糖的产生,减少患者食欲,协助机体调节血糖水准,但该多肽激素在溶液中并不稳定,易水解,粘稠性大,易凝结的特性,不适合做成药物用于治疗。经人工筛选,进行结构改造,合成了一种稳定的类似物,上述多肽激素与合成的类似物之间的差异在于前者第25,28和29位上氨基酸被脯氨酸所取代,这种合成的类似物就是普兰林肽。
普兰林肽用于辅助治疗I型及II型糖尿病,主要用于单用胰岛素,以及联合应用胰岛素和磺脲类药物无效的患者。
普兰林肽的化学分子式为:
发明内容
本发明提出了一条较适当的路线,操作方便、时间较短,收率较高、适合规模化生产。
为实现上述目的,本发明提供一种合成普兰林肽的方法,包括以下步骤:
1)用固相合成方法由Fmoc-Tyr(tBu)-OH和取代度为0.3-1.5mmol/g的氨基树脂,得到Fmoc-Tyr(tBu)-氨基树脂;
2)将Fmoc-Tyr(tBu)-氨基树脂依肽序逐步偶联剩余的保护氨基酸;
3)使两个半胱氨酸巯基侧链保护基脱除,利用碘进行固相氧化;
4)裂解普兰林肽-树脂得到普兰林肽粗肽;
5)经过纯化得到普兰林肽。
所述的步骤1)中Fmoc-Tyr(tBu)-氨基树脂取代值范围在0.3-1.5mmol/g,优选为0.3-0.5mmol/g。固相合成方法特指多肽的固相合成法。氨基树脂一般为Rink Amide MBHA树脂,Sieber树脂,Rink AmideAM树脂,Rink Amide树脂或Rink Amide BHA树脂,优选Rink Amide树脂。
所述的步骤2)中“保护氨基酸”是指C端采用Fmoc保护的氨基酸,有些氨基酸如,Lys,Cys,Asn,Thr,Gln,Arg,His,Ser,Tyr也需要其它保护基保护,详细参见下文的“本发明合成方法示意”。其中,氨基酸偶联体系为固相偶联体系:DIC或DIEA中的一个或两个,与HOBT、HOAT、Cl-HOBT、HBTU、HATU、PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上,组成偶联体系。例如:DIC+HOAT,DIEA+HBTU,DIEA+HOAT+HBTU或DIEA+HOBT+PyBOP等。
偶联体系优选的组合为:HOBT、HOAT、Cl-HOBT中的任意一个或一个以上与DIC组合;例如:HOBT+DIC,Cl-HOBT+DIC或者HOBT+Cl-HOBT+DIC;
或偶联体系优选的组合为:DIEA与HOBT、HOAT或Cl-HOBT中的任意一个或一个以上与HBTU、HATU、PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上组成多组分偶联体系。例如:DIEA+HOBT+HBTU,DIEA+HOAT+HATU,DIEA+HOBT+HOAT+PyAOP,DIEA+HOBT+HATU+PyBOP,DIEA+Cl-HOBT+PyBOP或DIEA+HOBT+HOAT+HBTU+PyAOP。其中所述的“多组分偶联剂”可以是3组分偶联剂、4组分偶联剂、5组分偶联剂、6组分偶联剂、7组分偶联剂或8组分偶联剂。
实验发现,采用本发明的多种偶联剂体系,能够显著提高反应效率。
进一步说步骤2)合成C端第四位氨基酸、C端第五位氨基酸的偶联采用Fmoc-Gly-Ser(ΨMe,Me pro)-OH。选用Fmoc-Gly-Ser(ΨMe,Mepro)-OH效果好于单独选用Fmoc-Ser(tBu)-OH和Fmoc-Gly-OH。Fmoc-Gly-Ser(ΨMe,Me pro)-OH为受Fmoc保护2肽片段。其中Fmoc-Gly-Ser(ΨMe,Me pro)即Fmoc-Gly-Ser(psiMe Me pro)-OH,默克公司上海办事处品牌商标名为:Novabiochem,产品货号:05-20-1127-1GM。
实验发现,受Fmoc保护二肽片段溶解性好,易于偶联,与单独选用Fmoc-Ser(tBu)-OH和Fmoc-Gly-OH相比,反应会更加完全,且得到的副产物少;有利于纯化,并能大大提高收率;
所述的步骤3)利用碘进行固相氧化,目的是使巯基成环。碘用量范围是普兰林肽摩尔比的5-20倍,优选15倍;氧化时间范围是4-16小时,优选6小时。固相氧化法反应时间较短,方便操作,容易控制,对设备要求低,成本低,适合规模化生产;
所述的步骤4)裂解试剂是:切割试剂是三氟乙酸(TFA),捕获试剂是水、三异丙基硅烷、三乙基硅烷、苯甲硫醚、苯甲醚和乙二硫醇等试剂的一种或几种的组合。优选TFA/苯甲硫醚/乙二硫醇/苯甲醚体积比为90/5/3/2,室温下反应2-3小时,其中乙二硫醇是指1,2-乙二硫醇。裂解液用量是肽树脂重量的10-12倍,沉降***用量是裂解液体积的10-12倍。
步骤5)经过反相高效液相纯化得到普兰林肽。
本发明工艺采用Fmoc固相策略合成长肽,中间采用二肽片段而非通常的逐个偶联法,同时利用固相氧化,具有反应操作简单、成本低、且收率较高等特点,反应的总收率可达20%,适合规模化生产,具有可观的经济实用价值,同时在多肽药物设计合成领域具有广泛的应用前景。
本发明合成方法示意如下:
其中:
Fmoc-Tyr(R1)-OH代表:N-芴甲氧羰基-侧链R1保护酪氨酸
Fmoc-Thr(R1)-OH代表:N-芴甲氧羰基-侧链R1保护苏氨酸
Fmoc-Asn(R2)-OH代表:N-芴甲氧羰基-侧链R2保护天冬酰胺
Fmoc-Ser(R2)-OH代表:N-芴甲氧羰基-侧链R2保护丝氨酸
Fmoc-Gly-OH代表:N-芴甲氧羰基甘氨酸
Fmoc-Val-OH代表:N-芴甲氧羰基缬氨酸
Fmoc-Pro-OH代表:N-芴甲氧羰基脯氨酸
Fmoc-Leu-OH代表:N-芴甲氧羰基亮氨酸
Fmoc-Ile-OH代表:N-芴甲氧羰基异亮氨酸
Fmoc-Phe-OH代表:N-芴甲氧羰基苯丙氨酸
Fmoc-Ser(R1)-OH代表:N-芴甲氧羰基-侧链R1保护丝氨酸
Fmoc-His(R2)-OH代表:N-芴甲氧羰基-侧链R2保护组氨酸
Fmoc-Ala-OH代表:N-芴甲氧羰基丙氨酸
Fmoc-Arg(R3)-OH代表:N-芴甲氧羰基-侧链R4保护精氨酸
Fmoc-Gln(R2)-OH代表:N-芴甲氧羰基-侧链R2保护谷氨酰胺
Fmoc-Cys(R2)-OH代表:N-芴甲氧羰基-侧链R2保护半胱氨酸
Boc-Lys(R4)-OH代表:N-叔丁氧羰基-侧链R4保护赖氨酸
DICPDI代表:二异丙基碳二亚胺
PyBOP代表:六氟磷酸苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基磷
HOBt代表:1-羟基苯并三氮唑
TFA代表:三氟乙酸
DIPEA代表:二异丙基乙胺,即DIEA
DCM代表:二氯甲烷
DMF代表:N,N’-二甲基甲酰胺
DBLK代表:哌啶的DMF溶液
R1代表:tBu(叔丁基);
R2代表:Trt(三苯基甲基);
R3代表:Pbf(2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基);
R4代表:Boc(叔丁氧羰基);
氨基树脂高分子载体为Rink Amide树脂、Rink Amide-MBHA树脂、Rink Amide-BHA树脂、Rink Amide-AM树脂或Sieber树脂。
RinkAmide-MBHA树脂
RinkAmide-BHA树脂
RinkAmide-AM树脂
具体实施方式
实施例1、Fmoc-Tyr(tBu)-Rink Amide Resin的合成
在500ml的反应柱中加入30克Rink Amide Resin(Sub=0.8mmol/g),加入DMF洗涤两次,每次5分钟,再用DMF溶胀30分钟。用20%DBLK脱除Rink Amide Resin的Fmoc保护基,脱除完毕用DMF洗4遍,DCM洗两遍,并用茚三酮检测法进行检测。称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH(2.89g,6.3mmol),HOBt(1.02g,7.56mmol),HBTU(2.37g,6.24mmol),全部混合后,加入DMF(30ml)、DCM(30ml),冰浴下加入DIEA(2.14ml、12.6mmol)搅拌5min,活化完后加入反应柱,开始反应。2小时后结束反应,洗涤完毕,取样检测替代度,量取乙酸酐(16.2ml、180mmol)、吡啶(13.8ml、180mmol)加入反应柱中进行封闭,封闭两小时,茚三酮检测法检测,树脂无色,可停止封闭,再进行洗涤,取样测得取代值为0.4mmol/g。
利用同样的策略分别可以得到Fmoc-Tyr(tBu)-Sieber树脂、Fmoc-Tyr(tBu)--Rink Amide BHA树脂、Fmoc-Tyr(tBu)--Rink Amide AM树脂等氨基树脂;
实施例2、Fmoc-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Rink Amide树脂及AA1-35-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Rink Amide树脂的合成。其中AA1-35-Thr(tBu)-Tyr(tBu)是指全保护线型普兰林肽。
将Fmoc-Tyr(tBu)-Rink Amide MBHA树脂用DMF洗涤干净后,用20%DBLK脱除Fmoc保护基,脱除完毕后用DMF洗四遍,DCM洗两遍,并用茚三酮检测法进行检测。称取Fmoc-Thr(tBu)-OH(7.15g,18mmol),HOBt(2.91g,21.6mmol),全部混合后,加入DMF(30ml)、DCM(30ml),冰浴下加入DIC(4.2ml、27mmol),活化完后加入反应柱,开始反应。反应2小时,用茚三酮检测法检测,树脂透明,则再继续反应0.5小时后结束反应,用DMF洗三遍。重复上述步骤依肽序偶联下一个保护氨基酸。得到全保护线型普兰林肽-Rink Amide MBHA树脂。
利用同样的策略分别可以得到全保护线型普兰林肽--Rink Amide树脂、全保护线型普兰林肽-Rink Amide BHA树脂、全保护线型普兰林肽-Rink Amide AM树脂及全保护线型普兰林肽-Sieber树脂。
实施例3、普兰林肽的固相氧化
称取碘(15.24g、60mmol),溶解在DMF(100ml)中,溶解完毕后加入反应柱,开始氧化反应。氧化4小时结束反应。DMF洗涤,每次100ml,洗至树脂恢复浅黄色,再用DCM洗涤100ml,洗两次。甲醇收缩树脂,得到全保护普兰林肽-氨基树脂。
实施例4、普兰林肽的固相氧化
称取碘(7.6g、30mmol),溶解在DMF(100ml)中,溶解完毕后加入反应柱,开始氧化反应。氧化6小时结束反应。DMF洗涤,每次100ml,洗至树脂恢复浅黄色,再用DCM洗涤100ml,洗两次。甲醇收缩树脂,得到全保护普兰林肽-氨基树脂
实施例5、称取碘(22.84g,90mmol)溶解在DMF(100ml)中,溶解完毕后加入反应柱,开始氧化反应。氧化16小时结束反应。DMF洗涤,每次100ml,洗至树脂恢复浅黄色,再用DCM洗涤100ml,洗两次。甲醇收缩树脂,得到全保护普兰林肽-氨基树脂
实施例6、普兰林肽的裂解
称取50g全保护普兰林肽-氨基树脂至1L圆底烧瓶中。加入配制好的裂解液(三氟乙酸∶苯甲硫醚∶乙二硫醇∶苯甲醚按体积比90∶5∶3∶2),冰浴、搅拌2h。反应结束后,分离树脂与裂解液,将裂解液倒入准备好的冷冻***中,用离心机分离粗肽,冷冻***洗3遍,得到普兰林肽粗肽。粗肽经过纯化,得到普兰林肽精肽。纯度>97%,总收率20%。
综上所述,本发明采用Fmoc固相策略合成普兰林肽,利用二肽片段代替常用的氨基酸逐个偶联和固相氧化的方法,反应操作简单、后处理容易、收率高、成本低适于规模化生产等特点,具有可观的经济实用价值和广泛的应用前景。
Claims (8)
1.一种合成普兰林肽的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)用固相合成方法由Fmoc-Tyr(tBu)-OH和取代度为0.3—1.5mmol/g的氨基树脂,得到Fmoc-Tyr(tBu)-氨基树脂;
2)将Fmoc-Tyr(tBu)-氨基树脂依肽序逐步偶联剩余的保护氨基酸;
3)使两个半胱氨酸巯基侧链保护基脱除,利用碘进行固相氧化;
4)裂解普兰林肽-树脂得到普兰林肽粗肽;
5)经过纯化得到普兰林肽;
其中,所述的步骤1)中氨基树脂为Rink Amide MBHA树脂,Sieber树脂,Rink Amide AM树脂,Rink Amide树脂或Rink Amide BHA树脂;所述步骤2)合成N端第一位氨基酸的偶联采用Boc–Lys(Boc)-OH,C端第四位氨基酸、C端第五位氨基酸的偶联采用Fmoc-Gly-Ser(ΨMe,Me pro)-OH;“保护氨基酸”是指N端采用Fmoc保护的氨基酸,其中Cys侧链采用Trt 保护,Asn侧链采用Trt 保护,Thr侧链采用tBu保护,Gln侧链采用Trt 保护,Arg侧链采用Pbf保护,His侧链采用Trt保护,Ser侧链采用tBu保护,Tyr侧链采用tBu保护;所述的步骤2)中采用氨基酸偶联体系进行逐步偶联,偶联体系为:DIC或DIEA中的一个或两个,与HOBT、HOAT、Cl-HOBT、HBTU、HATU、PyBOP或PyAOP 中的任意一个或一个以上,组成偶联体系。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步骤1)中氨基树脂的取代度为0.3—0.5mmol/g。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的偶联体系为:HOBT、HOAT、Cl- HOBT中的任意一个或一个以上与DIC;或DIEA与HOBT、HOAT或Cl-HOBT中的任意一个或一个以上与HBTU、HATU、PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上组成偶联体系。
4.如权利要求1、2或3任意一项所述的方法,其特征在于,所述步骤3)碘用量为普兰林肽摩尔比的5—20倍,氧化时间为4至16小时。
5.如权利要求1、2或3任意一项所述的方法,其特征在于,所述步骤4)裂解普兰林肽-树脂采用的裂解试剂是:TFA/苯甲硫醚/乙二硫醇/苯甲醚体积比为90/5/3/2。
6.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述步骤4)裂解普兰林肽-树脂采用的裂解试剂是:TFA/苯甲硫醚/乙二硫醇/苯甲醚,体积比为90/5/3/2。
7.如权利要求1、2或3任意一项所述的方法,其特征在于,所述步骤4)中的裂解液用量是肽树脂重量的10-12倍,沉降***用量是裂解液体积的10-12倍。
8.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述步骤4)中的裂解液用量是肽树脂重量的10-12倍,沉降***用量是裂解液体积的10-12倍。
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