CN105273077B - 一种制备普兰林肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备普兰林肽的方法。本发明的具体步骤为：A）通过液相合成二肽片段Fmoc‑Pro‑Pro‑OH；B）采用固相合成法，以氨基树脂为起始树脂，按照普兰林肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中28、29氨基酸偶联采用片段Fmoc‑Pro‑Pro‑OH偶联；C）使用碘作氧化剂固相环化，然后肽树脂裂解、在酸性条件下重结晶后纯化、脱盐、冻干后可以得到普兰林肽，其多肽杂质des‑Pro29‑普兰林肽含量小于0.1%。本发明提供了一种纯度高、成本低，适合规模化生产的普兰林肽的制备工艺，此工艺既能有效控制杂质des‑Pro29‑普兰林肽的含量又不影响普兰林肽的收率。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽类药物的制备方法，具体涉及一种普兰林肽的合成方法。
背景技术
普兰林肽，英名为：Pramlintide，是含有37肽的环肽，化学分子式如下：
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY-NH2(二硫键：2-7位)。
2005年3月16日，美国食品与药物管理局(FDA)批准了Amylin公司产品普兰林肽上市，普兰林肽是人工合成的多肽的类似物，结构特征为25位的丙氨酸、28位和29位的丝氨酸用脯氨酸代替，普兰林肽作用与胰淀素类似，通过减慢餐后胃排空速度而控制餐后血糖，作用持续约3小时，但是并不改变碳水化合物和其他营养物质的吸收。同时，其抑制餐后胰高血糖素的分泌和引起饱腹感也可起到控制血糖的作用。其用于1型和2型成人糖尿病患者控制血糖，也是今为止继胰岛素之后第二个获准用于治疗1型糖尿病的药物。
WO199310146A1和US5424394报告了一种采用固相合成法制备普兰林肽的方法，在氨基不溶性树脂上，按照按照普兰林肽主链肽序依次偶联具有N端Boc保护且侧链保护的氨基酸，接着使肽链的2位和7位两个半胱氨酸发生分子内环合，得到二硫基桥键，然后使用氢氟酸裂解得到普兰林肽，由于整个工艺采用Boc固相合成，操作繁琐，使用剧毒氢氟酸，不适合工业化生产。
CN200910079134.6、CN200980137895.0、CN201010594565.9和CN201210171394.8报道了选择设计组成普兰林肽的几个组成合理的氨基酸残基片段，然后通过收敛合成以共价键的形式将几个片段合理的偶联起来，制备得到普兰林肽。很明显，包括37个氨基酸的普兰林肽有很多可能的合成片段和偶联顺序，而目前的专利技术中没有做详细的研究报道，其中采用的片段，偶联顺序均较随意，整个设计不太合理，合成分离困难，操作复杂，收率较低，而且成本较高，不合适工业化。
CN201010145391.8报告了一种采用Fmoc固相合成法制备普兰林肽的方法，在氨基不溶性树脂上，按照按照普兰林肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，接着使肽链的2位和7位两个半胱氨酸在碘下发生分子内环合，得到二硫基桥键，然后裂解得到普兰林肽，整个工艺操作相对简单，但是由于28和29位两个偶联的氨基酸都是脯氨酸，同为仲氨，因此导致脯氨酸偶联不完全，生成缺失肽杂质：des-Pro29-普兰林肽。有关杂质des-Pro29-普兰林肽的氨基酸序列分别如下：
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPTNVGSNTY-NH2(二硫键：2-7位)。
这个杂质为毒性较大的杂质之一，且与主峰分离十分困难，该杂质的存在严重影响普兰林肽含量以及使用安全。因此需要找到有效的方法将其去除并使其达到优质标准级别0.1％以下。本发明人研究发现，该杂质用现有技术的手段很难除去，有些方法虽可以去除部分，但去除效果不理想，难以达到优质标准级别同时容易造成普兰林肽本身收率降低。
综上所述，现有普兰林肽的固相合成过程中，由于合成收率低，杂质多，特别是都不能很好控制杂质des-Pro29-普兰林肽，不适用于工业化生产。因此，研发一种收率高、反应简单可控、适用于工业化生产的普兰林肽新的合成方法具有重要的意义。
发明内容
本发明人用现有的合成方法，制备普兰林肽，发现现有技术存在的技术问题是：合成收率低，杂质多，特别是都不能很好控制杂质des-Pro29-普兰林肽，不适于工业化规模生产。为此，本发明人对普兰林肽的合成方法进行了研究，从而得到了本发明的技术方案。
本发明的目的是提供一种制备普兰林肽的方法。本发明的合成路线如图1所示：通过液相合成二肽片段Fmoc-Pro-Pro-OH；采用固相合成法，以氨基树脂为起始树脂，按照普兰林肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中28、29氨基酸偶联采用片段Fmoc-Pro-Pro-OH偶联；使用碘作氧化剂固相环化，然后肽树脂裂解、在酸性条件下重结晶后纯化、脱盐、冻干后可以得到普兰林肽。
本发明中一些常用的缩写具有以下含义；
Fmoc ：芴甲氧羰基
Fmoc-AA ：芴甲氧羰基保护的氨基酸
DIC ：N,N′-二异丙基碳化二亚胺
EDCI.HCl ：1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
PyBOP ：六氟磷酸苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基磷
HATU ：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
HOBt ：1-羟基苯骈***
Tyr ：酪氨酸
Ile ：异亮氨酸
Gln ：谷氨酰胺
Asn ：天冬酰胺
Cys ：半胱氨酸
Pro ：脯氨酸
Leu ：亮氨酸
Gly ：甘氨酸
Arg ：精氨酸
Val ：缬氨酸
Ala ：丙氨酸
Phe ： 苯丙氨酸
Lys ： 赖氨酸
Ser ：丝氨酸
Thr ：苏氨酸
His ：组氨酸
Asn ：天冬酰胺
DMF ：N,N′-二甲基甲酰胺
MeOH ：甲醇
DCM ：二氯甲烷
NMP ：N-甲基吡咯烷酮
DMSO ：二甲基亚砜
TFA ：三氟醋酸
EDT ：乙二硫醇
Piperidine ：六氢吡啶
为此本发明提供一种普兰林肽的合成方法，其步骤如下：
步骤1，通过液相合成二肽片段Fmoc-Pro-Pro-OH；
步骤2，采用固相合成法，以氨基树脂为起始树脂，按照普兰林肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中28、29氨基酸偶联采用片段Fmoc-Pro-Pro-OH偶联；
步骤3，使用碘作氧化剂固相环化，然后肽树脂裂解、然后在酸性条件下重结晶，纯化、脱盐、冻干后可以得到普兰林肽。
其中，步骤1所述的二肽片段Ⅰ：Fmoc-Pro-Pro-OH的合成方法包括如下步骤：1）Fmoc-Pro-OH、HOSu和DCC偶联得到Fmoc-Pro-OSu，然后Fmoc-Pro-OSu和H-Pro-OH反应得到二肽片段Fmoc-Pro-Pro-OH。
其中，步骤2所述的固相合成方法，所述方法包括以下步骤：1）采用0.10~0.40mmol/g 的Rink Amide MBHA Resin氨基树脂为起始树脂；2）采用由体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液脱除氨基树脂上的Fmoc保护基；3）在偶联剂***的存在下，RinkAmide MBHA Resin氨基树脂和Fmoc-Tyr(tBu)-OH偶联得到Fmoc-Tyr(tBu)- Rink AmideMBHA Resin氨基树脂；4）重复步骤2）、3），按照普兰林肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，偶联氨基酸顺序为：Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Pro-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Boc-Lys(Boc)-OH;所述偶联剂***包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂选自DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/DIEA或HATU/HOBt/DIEA；所述反应溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO或他们之间的组合。
优选地，步骤2）中，二肽Fmoc-Pro-Pro-OH偶联过程中，H-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Val-Gly-Ser(tBu)-Asn(Tt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)- Rink Amide MBHA Resin氨基树脂、Fmoc-Pro-Pro-OH、DIC和HOBt的摩尔比优选为：1:3:3:3 ~1:5:5:5，反应温度为25~35℃，反应时间为2~3小时；更优选，H-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Val-Gly-Ser(tBu)-Asn(Tt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)- Rink Amide MBHA Resin氨基树脂、Fmoc-Pro-Pro-OH、DIC和HOBt的摩尔比优选为：1:3:3:3，反应温度为25℃，反应时间为2小时。
本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：
1）摩尔比的选择：H-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Val-Gly-Ser(tBu)-Asn(Tt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)- Rink Amide MBHA Resin氨基树脂、Fmoc-Pro-Pro-OH、DIC和HOBt的摩尔比优选为：1:3:3:3 ~1:5:5:5；
2）反应温度的选择：
25℃和35℃；
3）反应时间的选择：
2小时和3小时。
为此提出了8种实验条件：
实验条件1：取53.22g H-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Val-Gly-Ser(tBu)-Asn(Tt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)- Rink Amide MBHA Resin氨基树脂(10.0mmol)加入到反应柱中，将13.03g Fmoc-Pro-Pro-OH (30.0 mmol) 和4.05g HOBt (30.0 mmol)加入20ml DMF中搅拌溶解，冷却到0℃，将3.79g DIC (30.0 mmol)加入上述溶液中，在25℃反应2小时，然后依次偶联剩下的氨基酸，偶联氨基酸顺序为：Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Boc-Lys(Boc)-OH；偶联完毕得到全保护肽树脂，取6.35g碘(5.0mmol)溶解在50mL的DMF中，在25℃反应3小时；环化完毕，采用按体积比为2.5∶5∶5∶87.5的EDT、PhSMe、H2O和TFA的配置裂解液1150ml，将裂解液加入上述树脂中，室温反应2小时，浓缩，将浓缩后的液体加入到冰***中沉淀1小时，离心，无水***离心洗涤6次，真空干燥，得到30.82g普兰林肽粗肽，将30.82g普兰林肽粗肽加入3L磷酸盐缓冲水溶液（pH=2.0）中（甲液:取磷酸166ml，加水至10000ml，摇匀。乙液：取磷酸氢二钠716.30g，加水使溶解成10000ml。取上述甲液2175ml与乙液825ml混合，摇匀，即得。），搅拌5小时，有白色固体析出，过滤，减压条件下抽干得到白色固体，将上述白色固体加水溶解，用乙酸将pH值调至5.5-6.5，通过C18或C8柱2次纯化、转盐、冷冻干燥后得到目标产物。纯化条件：流动相为：A相： 0.1%TFA；B相：乙腈，检测波长220nm，收集目的峰馏分。转盐条件：流 动相：A相：20mM乙酸铵-水溶液；B相：乙腈；检测波长220nm。收集目的峰馏分，旋蒸浓缩，冻干得到冻干得到普兰林肽精肽17.88g，HPLC纯度99.62 %，总收率44%。
实验条件2-8，实验操作如实验条件1所示，不同的实验条件及其实验结果如下面的表1所示：
表1对比实验结果
| 实验条件 | 摩尔比 | 温度 | 时间 | des-Pro<sup>29</sup>-普兰林肽含量 | 总收率 | 纯度 |
| 实验条件1 | 1:1:3 | 25℃ | 2小时 | 0.06% | 44% | 99.62 % |
| 实验条件2 | 1:1:3 | 25℃ | 3小时 | 0.06% | 44% | 99.61% |
| 实验条件3 | 1:1:3 | 35℃ | 2小时 | 0.07% | 43% | 99.60% |
| 实验条件4 | 1:1:3 | 35℃ | 3小时 | 0.07% | 43% | 99.60% |
| 实验条件5 | 1:1:5 | 25℃ | 2小时 | 0.06% | 44% | 99.59 % |
| 实验条件6 | 1:1:5 | 25℃ | 3小时 | 0.06% | 44% | 99.62 % |
| 实验条件7 | 1:1:5 | 35℃ | 2小时 | 0.07% | 43% | 99.60 % |
| 实验条件8 | 1:1:5 | 35℃ | 3小时 | 0.07% | 43% | 99.62 % |
以上结果表明，实验条件1-8的结果差别不大，但是实验条件1合成成本相对较低、反应时间较短，效率最高，所以实验条件1的综合结果最优。
本发明的方法和现有技术相比具有明显的优势，有关对比实验如下表2所示：
表2 对比实验结果
| 专利 | des-Pro<sup>29</sup>-普兰林肽含量 | 总收率 | 纯度 |
| 本发明技术 | 0.06% | 44% | 99.62% |
| CN200910079134.6 | 1.29% | 21% | 97.30% |
| CN201010594565.9 | 1.25% | 18% | 98.50% |
本发明的有益效果是：采用二肽片段Fmoc-Pro-Pro-OH偶联得到普兰林肽线性肽，然后使用碘作氧化剂固相环化，裂解后在磷酸化条件下沉淀，提高了纯化效率，在提高产品质量的同时降低了高效液相制备纯化的成本，最后纯化、脱盐、冻干后可以得到普兰林肽。本发明提供了一种纯度高、成本低，适合规模化生产的普兰林肽的制备工艺，此工艺既能有效控制杂质des-Pro29-普兰林肽的含量又不影响普兰林肽的收率。
附图说明
图1本发明普兰林肽的合成路线；
图2二肽片段Fmoc-Pro-Pro-OH的HPLC谱图；
图3二肽片段Fmoc-Pro-Pro-OH的质谱谱图；
图4普兰林肽粗肽的HPLC谱图；
图5普兰林肽精肽的HPLC谱图；
图6普兰林肽精肽质谱谱图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。
具体地，关于下面实施例中涉及的各商购氨基酸以及氨基酸片段，以及各商购树脂，其生产厂家和商品型号如下：
Fmoc保护基氨基酸原料、和王树脂均为常规的市售试剂（厂家：吉尔生化（上海）有限公司；化学纯）；二肽片段Fmoc-Pro-Pro-OH是本专利描述合成的。
有机溶剂和其它原料来源均为市售品（厂家：国药集团化学试剂有限公司；化学纯）。
另外，下面实施例中提到的“旋蒸浓缩”以及“冻干”以及测定HPLC和质谱的条件和所用设备型号及生产厂家说明如下：
旋蒸浓缩设备：旋转蒸发仪R-200/205（瑞士Buchi(布奇)公司）；
旋蒸浓缩条件：30℃下，真空（-0.1Mpa）条件下旋蒸浓缩，浓缩后体积在旋蒸前总体积75%以下。
HPLC：Dionex高效液相色谱仪；用十八烷基硅烷键合硅胶（5μm，250×4.6mm）为填充剂；以0.1%TFA溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0mL；检测波长为220nm；柱温30℃。取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
质谱： MALDI-TOF-MS 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱；仪器型号为AUTOFLEX SPEED TOF-TOF。
实施例一：Fmoc-Pro-OSu活化酯的合成
称取337.37g Fmoc-Pro-OH（1.0mol），138.10g HOSu（1.2mol）加入2000ml THF中，冰水浴下加入247.59g DCC（1.2mol），反应1小时，升温到室温反应3小时，反应液过滤，母液旋干，加DCM溶解，过滤，饱和碳酸氢钠洗3遍，纯水2遍，反萃2遍，合并有机相，无水碳酸钠干燥，旋干，乙酸乙酯和石油醚重结晶3次，过滤，固体油泵拉干得到386.66g Fmoc-Pro-OSu活化酯，收率89%。
实施例二：二肽片段Fmoc-Pro-Pro-OH的合成
称取57.57g H-Pro-OH（0.5mol）、217.23gFmoc-Pro-OSu（0.5mol）和79.50g Na2CO3（0.75mol）加入到500ml水和500ml THF的混合溶液中溶解，室温下反应过夜，用10%稀盐酸调节PH到7，旋蒸除去THF，之后调节PH到3。得到大量白色沉淀，过滤。将得到的白色沉淀用乙酸乙酯和石油醚重结晶，得到二肽片段Fmoc-Pro-Pro-OH 236.55g，其HPLC谱图如图2所示，HPLC纯度92.827%，收率89%（收率计算：0.5 mol为265.79g，236.55/265.79=89%）。其质谱如图3所示，[M+Na]+：458.205、[M+K]+：473.255，化合物二肽片段Fmoc-Pro-Pro-OH的理论精确分子量为：434.18，样品质谱结果与理论分子量相符，结构正确。
实施例三：普兰林肽全保护线性肽-Rink Amide AM Resin 树脂的合成
称取取代度为0.10mmol/g的Rink Amide AM Resin树脂100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀树脂30分钟后，取13.79g Fmoc-Tyr(tBu)-OH(30mmol)、4.05gHOBt(30mmol)用DMF溶解，冰水浴下加入3.88g DIC(30mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时后，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照普兰林肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，偶联氨基酸顺序为：Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Pro-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Boc-Lys(Boc)-OH;偶联完毕，用DMF洗涤6次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到170.06 g 普兰林肽全保护线性肽-Rink Amide AM Resin树脂。
其中Fmoc-Arg(Pbf)-OH偶联时溶剂换为：选用体积比为1:4的DMSO和DMF混合溶液；Fmoc-His(Trt)-OH偶联时偶联试剂换为：PyBOP/HOBt/DIEA；Fmoc-Ile-OH偶联时偶联试剂换为：HATU/HOBt/DIEA；Fmoc-Pro-Pro-OH偶联时，Fmoc-Pro-Pro-OH、DIC和HOBt的摩尔比优选为：1:3:3:3，反应温度为25℃，反应时间为2小时。
实施例四：普兰林肽全保护线性肽-Rink Amide AM Resin 树脂的合成
称取取代度为0.40mmol/g的Rink Amide AM Resin树脂25g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀树脂30分钟后，取13.79g Fmoc-Tyr(tBu)-OH(30mmol)、4.05gHOBt(30mmol)用DMF溶解，冰水浴下加入3.88g DIC(30mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时后，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照普兰林肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，偶联氨基酸顺序为：Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Pro-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Boc-Lys(Boc)-OH;偶联完毕，用DMF洗涤6次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到95.06g 普兰林肽全保护线性肽-Rink Amide AM Resin树脂。
其中Fmoc-Arg(Pbf)-OH偶联时溶剂换为：选用体积比为1:4的DMSO和DMF混合溶液；Fmoc-His(Trt)-OH偶联时偶联试剂换为：PyBOP/HOBt/DIEA；Fmoc-Ile-OH偶联时偶联试剂换为：HATU/HOBt/DIEA；Fmoc-Pro-Pro-OH偶联时，Fmoc-Pro-Pro-OH、DIC和HOBt的摩尔比优选为：1:3:3:3，反应温度为25℃，反应时间为2小时。
实施例五：普兰林肽全保护线性肽-Rink Amide MBHA Resin 树脂的合成
称取取代度为0.10mmol/g的Rink Amide MBHA Resin树脂100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀树脂30分钟后，取14.06g Fmoc- Tyr(tBu)-OH(30mmol)、4.05g HOBt(30mmol)用DMF溶解，冰水浴下加入3.88g DIC(30mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时后，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照普兰林肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，偶联氨基酸顺序为：Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Pro-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Boc-Lys(Boc)-OH;偶联完毕，用DMF洗涤6次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到171.05g 普兰林肽全保护线性肽-Rink Amide AM Resin树脂。
其中Fmoc-Arg(Pbf)-OH偶联时溶剂换为：选用体积比为1:4的DMSO和DMF混合溶液；Fmoc-His(Trt)-OH偶联时偶联试剂换为：PyBOP/HOBt/DIEA；Fmoc-Ile-OH偶联时偶联试剂换为：HATU/HOBt/DIEA；Fmoc-Pro-Pro-OH偶联时，Fmoc-Pro-Pro-OH、DIC和HOBt的摩尔比优选为：1:3:3:3，反应温度为25℃，反应时间为2小时。
实施例六：普兰林肽全保护线性肽-Rink Amide MBHA Resin 树脂的合成
称取取代度为0.40mmol/g的Rink Amide MBHA Resin树脂25g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀树脂30分钟后，取14.06g Fmoc- Tyr(tBu)-OH(30mmol)、4.05g HOBt(30mmol)用DMF溶解，冰水浴下加入3.88g DIC(30mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时后，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照普兰林肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，偶联氨基酸顺序为：Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Pro-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Boc-Lys(Boc)-OH;偶联完毕，用DMF洗涤6次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到96.05g 普兰林肽全保护线性肽-Rink Amide AM Resin树脂。
其中Fmoc-Arg(Pbf)-OH偶联时溶剂换为：选用体积比为1:4的DMSO和DMF混合溶液；Fmoc-His(Trt)-OH偶联时偶联试剂换为：PyBOP/HOBt/DIEA；Fmoc-Ile-OH偶联时偶联试剂换为：HATU/HOBt/DIEA；Fmoc-Pro-Pro-OH偶联时，Fmoc-Pro-Pro-OH、DIC和HOBt的摩尔比优选为：1:3:3:3，反应温度为25℃，反应时间为2小时。
实施例七：普兰林肽全保护线性肽-Rink Amide MBHA Resin 树脂的合成
称取取代度为0.20mmol/g的Rink Amide MBHA Resin树脂50g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀树脂30分钟后，取14.06g Fmoc- Tyr(tBu)-OH(30mmol)、4.05g HOBt(30mmol)用DMF溶解，冰水浴下加入3.88g DIC(30mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时后，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照普兰林肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，偶联氨基酸顺序为：Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Pro-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Boc-Lys(Boc)-OH;偶联完毕，用DMF洗涤6次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到120.01 g 普兰林肽全保护线性肽-Rink Amide AM Resin树脂，普兰林全保护肽线性肽树脂收率：99%{普兰林全保护肽线性肽树脂收率=实际重量/[树脂重量+（普兰林肽全保护线性肽分子量-Fmoc分子量）]×0.01mol=120.35/[50+（7325.77-222）×0.01]}。
其中Fmoc-Arg(Pbf)-OH偶联时溶剂换为：选用体积比为1:4的DMSO和DMF混合溶液；Fmoc-His(Trt)-OH偶联时偶联试剂换为：PyBOP/HOBt/DIEA；Fmoc-Ile-OH偶联时偶联试剂换为：HATU/HOBt/DIEA；Fmoc-Pro-Pro-OH偶联时，Fmoc-Pro-Pro-OH、DIC和HOBt的摩尔比优选为：1:3:3:3，反应温度为25℃，反应时间为2小时。
实施例八：普兰林肽全保护环肽-Rink Amide MBHA Resin 树脂的合成
称取实施例六120.01 g的普兰林肽全保护环肽-Rink Amide MBHA Resin 树脂加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀树脂30分钟后，取6.35g 碘(50mmol)用600mLDMF溶解，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应3小时后，然后用DMF洗涤6次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到115.00g 普兰林肽全保护环肽-Rink AmideMBHA Resin树脂，普兰林肽全保护环肽树脂：99%{普兰林肽全保护环肽树脂收率=实际重量/[树脂重量+（普兰林肽全保护环肽分子量-Fmoc分子量）]×0.01mol=115.00/[50+（6841.77-222）×0.01]}。
实施例九：普兰林肽粗肽的制备
称取115.00g 全保护的普兰林肽粗肽树脂，加入到3000mL的三口圆底烧瓶中，采用按体积比为2.5∶5∶5∶87.5的EDT、PhSMe、H2O和TFA的配置裂解液1150ml，将裂解液加入上述树脂中，室温反应2小时，浓缩，将浓缩后的液体加入到冰***中沉淀1小时，离心，无水***离心洗涤6次，真空干燥，得到30.82g普兰林肽粗肽，其HPLC谱图如图4所示，HPLC纯度84.13%，粗肽收率78%[普兰林肽粗肽收率=实际重量/（普兰林肽分子量×0.01mol）=30.82/（3949.39×0.01）]。
实施例十：普兰林肽精肽醋酸盐的制备
将实施例八中的30.82g普兰林肽粗肽加入3L磷酸盐缓冲水溶液（pH=2.0）中（甲液:取磷酸166ml，加水至10000ml，摇匀。乙液：取磷酸氢二钠716.30g，加水使溶解成10000ml。取上述甲液2175ml与乙液825ml混合，摇匀，即得。），搅拌5小时，有白色固体析出，过滤，减压条件下抽干得到的白色固体，将上述白色固体加水溶解，用乙酸将pH值调至5.5-6.5，通过C18或C8柱2次纯化、转盐、冷冻干燥后得到目标产物。纯化条件：流动相为：A相：0.1%TFA；B相：乙腈，检测波长220nm，收集目的峰馏分。转盐条件：流 动 相：A相：20mM乙酸铵-水溶液；B相：乙腈；检测波长220nm。收集目的峰馏分，旋蒸浓缩，冻干得到普兰林肽精肽17.88g，其HPLC谱图如图5所示，HPLC纯度99.62%（面积归一化法），des-Pro29-普兰林肽的含量测定：0.06%，纯化总收率58%（普兰林肽精肽/普兰林肽粗肽=17.88/30.82），总收率44%（总收率=合成收率×纯化总收率=99%×99%×78%×58%）。其质谱如图4所示， [M]+：3949.7266，普兰林肽的理论精确分子量为：3949.93，样品质谱结果与理论分子量相符。
实施例十一：杂质des-Pro29-普兰林肽的含量测定
杂质des-Pro29-普兰林肽的含量测定方法：高效液相色谱法； des-Pro29-普兰林肽的含量测定：0.06%（面积归一化法）。
以上内容是结合具体的修选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (12)
1.一种制备普兰林肽的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1，通过液相合成二肽片段Fmoc-Pro-Pro-OH；
步骤2，采用固相合成法，以氨基树脂为起始树脂，按照普兰林肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中28、29氨基酸偶联采用片段Fmoc-Pro-Pro-OH偶联；
步骤3，使用碘作氧化剂固相环化，然后肽树脂裂解、然后在酸性条件下重结晶，纯化、脱盐、冻干后得到普兰林肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：
其中，步骤1所述的二肽片段Fmoc-Pro-Pro-OH的合成方法包括如下步骤：Fmoc-Pro-OH和HOSu在DCC的作用下偶联得到Fmoc-Pro-OSu，然后Fmoc-Pro-OSu和H-Pro-OH反应得到二肽片段Fmoc-Pro-Pro-OH。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：
其中，步骤2所述的固相合成方法，所述方法包括以下步骤：1)采用0.1-0.4mmol/g的氨基树脂为起始树脂；2)采用由体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液脱除氨基树脂上的Fmoc保护基；3)在偶联剂***的存在下，氨基树脂和Fmoc-Tyr(tBu)-OH偶联得到Fmoc-Tyr(tBu)-氨基树脂；4)重复步骤2)、3)，按照普兰林肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中28、29氨基酸偶联采用片段Fmoc-Pro-Pro-OH偶联。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是：
其中，步骤3采用碘作为氧化剂固相环化，碘与肽树脂的摩尔比为(10-1)：1，反应温度为15℃-35℃，反应时间为2-5小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是：
其中，步骤3在酸性条件下重结晶，酸性条件选自：pH＝2.0的磷酸盐缓冲溶液、pH＝2.5的磷酸盐缓冲溶液，pH＝5.0的磷酸盐缓冲溶液，pH＝5.8的磷酸盐缓冲溶液，pH＝3.6的醋酸-醋酸钠缓冲液，pH＝3.7的醋酸-醋酸钠缓冲液，pH＝3.8醋酸-醋酸钠缓冲液，pH＝4.5醋酸-醋酸钠缓冲液的一种。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征是：
所述二肽Fmoc-Pro-Pro-OH偶联过程中，H-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Val-Gly-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-氨基树脂、Fmoc-Pro-Pro-OH、DIC和HOBt的摩尔比为：1:3:3:3-1:5:5:5，反应温度为25-35℃，反应时间为2-3小时。
7.根据权利要求3所述的方法，所述氨基树脂选自Rink Amide AM Resin、Rink AmideMBHA Resin树脂；其中所述氨基树脂的替代度为0.10-0.40mmol/g。
8.根据权利要求7所述的方法，所述的氨基树脂优选Rink Amide MBHA Resin树脂；所述氨基树脂的替代度优选为0.15-0.35mmol/g。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征是：所述偶联剂***包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂选自DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/DIEA或HATU/HOBt/DIEA；所述反应溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO或它 们之间的组合。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征是：所述二肽Fmoc-Pro-Pro-OH偶联过程中，H-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Val-Gly-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-氨基树脂、Fmoc-Pro-Pro-OH、DIC和HOBt的摩尔比为：1:3:3:3，反应温度为25℃，反应时间为2小时。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征是：其中，步骤3采用碘作为氧化剂固相环化，碘与肽树脂的摩尔比为5：1；反应温度为25℃；反应时间为3小时。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征是：其中，步骤3在酸性条件下重结晶，pH＝2.0的酸性条件为磷酸盐缓冲溶液。
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