CN107880111A - 一种制备利拉鲁肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种固相法制备利拉鲁肽的方法，包括通过Glu侧链羧基进行固相支载，合成氨基酸树脂Fmoc‑Glu(Resin)‑OAll；以Fmoc‑Glu(Resin)‑OAll为起始树脂合成肽树脂中间；偶联片段，制得利拉鲁肽肽树脂；利拉鲁肽肽树脂经酸性条件裂解、HPLC纯化、冷冻干燥后制得高纯度利拉鲁肽。本发明所采用的支载方法由于Glu侧链相对较长，从而起到了肽链和树脂间连接桥(Linker)的作用，增加了肽链与树脂之间的柔性。使肽链更容易变形而降低反应位阻，从而提高合成反应效率。

Description

一种制备利拉鲁肽的方法
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种利拉鲁肽的制备方法。。
背景技术
糖尿病是一种全球性疾病，据报道2014年全球共有糖尿病患者 4.22亿人，约占全球人口的8.5％，其中II型糖尿病占约90％。利拉鲁肽是一种用于治疗II型糖尿病的人胰高血糖素样-1(GLP-1)的修饰物，具有GLP-1受体激动作用，在分子结构、生物活性、作用靶点及免疫原性等方面与GLP-1相似。利拉鲁肽属于新一代肠促胰岛素降血糖药物，作用时间长，并可能对多种心血管危险因素具有正面作用。利拉鲁肽的上市为患者增加了一种更人性化的降糖治疗选择。利拉鲁肽英名为Liraglutide，其结构式为：
利拉鲁肽分子结构与GLP-1(7-37)具有97％同源性。不同处在于以 Arg替代Lys34；Lys26侧链氨基经过Nα-棕榈酰经过γ-谷氨酰化。长链脂肪酸侧链可以使利拉鲁肽在血液中与白蛋白可逆性地结合，从而降低了被DPP-IV水解的速率和肾清除率，从而延长生物半衰期到 11～15h，每天只需皮下注射一次，提高了患者的顺应性。
利拉鲁肽由诺和诺德公司通过基因重组技术和化学修饰生产并上市，专利CN1271086A、CN1951965A、CN100569798A。
专利CN102286092A、CN103145828A、CN103980358A、 CN103304660A等记载了通过固相氨基酸偶联法合成利拉鲁肽,此类方法操作简单，但面临肽树脂增长过程中，困难序列形成导致合成效率低下的缺点，所得粗品纯度低、纯化操作步骤多且杂质不易控制等问题，且合成周期相对较长。
专利CN102875665A、CN104045705A、CN103304659A、 CN103864918A、CN104004083A、WO2016/067271A1等公开了通过片段法结合固相法合成利拉鲁肽，该固相法合成利拉鲁肽都是通过主链碳端氨基酸Gly支载于固相树脂。此类方法合成的利拉鲁肽粗品相对容易纯化，且合成周期有所缩短。但由于其固相树脂支载位置，处于肽链碳端位置，使得整条肽链更易扭曲、空间位阻增大而造成后续偶联效率下降。
专利CN103864918A、WO2014/199397A2等则通过固相法合成片段，然后在液相中，进行片段组合连接合成利拉鲁肽。此类方法合成利拉鲁肽粗品容易纯化，生产周期较短，但前期片段合成和纯化工作量巨大。
发明内容：
本发明的目的是结合现有化学合成技术各项优点，提供一种首次将固相树脂支载于利拉鲁肽21位Glu侧链羧基上进行利拉鲁肽肽树脂的固相法合成，使固相树脂载体处于肽链接近中部位置，示意图如图3所示。
如背景技术所述，现有固相合成利拉鲁肽的技术，都是将树脂支载于肽链碳端进行接肽反应合成利拉鲁肽肽树脂，示意图如图4所示。
本发明所采用的支载方法由于Glu侧链相对较长，从而起到了肽链和树脂间连接桥(Linker)的作用，增加了肽链与树脂之间的柔性。使肽链更容易变形而降低反应位阻，从而提高合成反应效率。
为实现发明目的，本发明采取如下的技术方案：
一种利拉鲁肽的制备方法，包括通过Fmoc固相法将Glu侧链羧基支载到羟基类型树脂上得到Fmoc-Glu(Resin)-OAll氨基酸树脂I；再通过多步骤固相偶联反应合成利拉鲁肽肽树脂： Boc-His(Pg2)-Ala-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(tBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala- Lys(Nα-Pal-γ-Glu-OtBu)-Glu(Resin)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg( pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-Otbu最后在酸性条件下裂解、色谱纯化、冷冻干燥制备得到高纯度利拉鲁肽；
其中Pg2为Trt或Boc；其中羟基类型树脂为Wang树脂或对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯(HMP)树脂；CTC树脂优选为2-Cl-Trityl-Cl树脂、 4-Methyl-Trityl-Cl树脂、4-Methoxy-Trityl-Cl树脂。
作为优选，所述的利拉鲁肽肽树脂由
Boc-His(Pg2)-(2-19)-Lys(Nα-Pal-γ-Glu-OtBu)-Glu(Resin)-OAll(肽树脂 IV)和
H-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-Otbu(片段IV)合成。
作为优选，所述肽树脂IV通过
Boc-His(Pg2)-(2-19)-Lys(Pg1)-Glu(Resin)-OAll(肽树脂III)合成得到；其中所述Pg1为Dde或iVDde。
作为优选，所述肽树脂III通过肽树脂 Fmoc-Lys(Pg1)-Glu(Resin)-OAll(肽树脂Ⅱ)合成得到；所述肽树脂Ⅱ通过Fmoc-Glu(Resin)-OAll(氨基酸树脂I)合成得到。
具体的，本发明关于一种利拉鲁肽的制备方法包括如下步骤：步骤1通过Fmoc-Glu-OAll与树脂(Resin)反应合成 Fmoc-Glu(Resin)-OAll(氨基酸树脂I)；
步骤2通过Trityl-Cl树脂合成Fmoc-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val- Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-OH(片段II)，碳端叔丁酯化、去Fmoc后得H-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-OtBu(片段IV)；
步骤3Fmoc-Glu(Resin)-OAll(氨基酸树脂I)在去保护液作用下脱去保护基Fmoc后，在活化剂***存在下与Fmoc-Lys(Pg1)-OH偶联得 Fmoc-Lys(Pg1)-Glu(Resin)-OAll(肽树脂Ⅱ)；
步骤4Fmoc-Lys(Pg1)-Glu(Resin)-OAll肽树脂Ⅱ脱除Fomc后，在活化剂***存在下与Fmoc-Ala-OH偶联得 Fmoc-Ala-Lys(Pg1)-Glu(Resin)-OALL，继续重复脱Fmoc和偶联操作，依次偶联Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、 Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Pg2)OH得 Boc-His(Pg2)-Ala-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tB u)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(tBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-L ys(Pg1)-Glu(Resin)-OAll(肽树脂Ⅲ)；
步骤5肽树脂Ⅲ在碱性条件下脱除保护基Pg1后，在活化剂***存在下与Fmoc-Glu-OtBu偶联后；所得肽树脂脱除保护基Fmoc后，在活化剂***存在下与Pal-OH偶联得
Boc-His(Pg2)-Ala-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(tBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-L ys(Nα-Pal-γ-Glu-OtBu)-Glu(Resin)-OAll(肽树脂Ⅳ)；
步骤6肽树脂Ⅳ在钯催化体系下脱除保护基OAll后，在活化剂***存
在下与片段IV偶联得
Boc-His(Pg2)-Ala-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(tBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-L ys(Nα-Pal-γ-Glu-OtBu)-Glu(Resin)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(p bf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-OtBu(利拉鲁肽肽树脂)；
步骤7在20℃以下，将利拉鲁肽肽树脂加入到十倍量的三氟乙酸体系的裂解液中，可控制温度20-30℃搅拌反应1-3小时；将所得反应体系过滤，滤液经减压浓缩后，再缓慢加入到0℃以下的醚类溶剂中，边搅拌边滴加；所得白色沉淀物经离心分离和多次洗涤再离心分离，减压干燥后即得利拉鲁肽粗品。
作为优选，所述步骤1是在活化剂存在下进行偶联反应，所述的树脂为固相载体树脂。
作为优选，所述步骤2是在有机碱作用下，由Trityl-Cl树脂与 N端Fmoc保护甘氨酸Fmoc-Gly-OH偶联得Fmoc-Gly-CTC Resin；脱去保护基Fmoc后、在活化剂***存在下与Fmoc-Arg(pbf)-OH偶联得到Fmoc-Arg-Gly-CTC Resin；继续重复脱Fmoc和偶联操作，依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Phe-OH后得肽树脂Ⅴ；然后在酸性***下裂解、分离得片段 II；再在混合溶剂中与TBTA反应碳端叔丁酯化得片段III；经过脱 Fmoc、分离得片段IV。
作为优选，所有形成肽键的偶联反应所用缩合试剂为以下组合之一：DIC/HOBt、DIC/6-Cl-HOBt、DIC/Oxyma、HATU/DIPEA、 HATU/DIPEA/HOBt、HBTU/DIPEA、HBTU/DIPEA/HOBt、 PyBOP/DIPEA、PyBOP/DIPEA/HOBt；
作为优选，所述步骤6)保护基OAll脱除方法所用试剂组合，为以下组合之一：Pd(Ph3)4/Morpholine、Pd(Ph3)4/Ph3/Morpholine、 Pd(Ph3)4/Piperidine、Pd(Ph3)4/Ph3/Piperidine、Pd(Ph3)4/Pyrrolidine、Pd(Ph3)4/Ph3/Pyrrolidine；保护基Pg1脱除方法中所用试剂组合为以下组合之一1.5％N2H2·H2O/DMF、2％N2H2·H2O/DMF、 3％N2H2·H2O/DMF
作为优选，步骤7得到的利拉鲁肽粗品用乙腈/DMSO/水溶液溶解、过滤，滤液高压液相色谱***进行纯化。包括以下步骤：
第一次纯化：填料采用C8烷基键合硅胶为固定相；波长214nm；柱温40℃；流动相A：低浓度TFA/水/甲醇体系；流动相B：低浓度TFA/ 乙腈体系。
第二次纯化：填料采用C18烷基键合硅胶为固定相；波长214nm；柱温40℃；流动相A：铵盐水溶液；流动相B：乙腈。
第三次纯化：填料采用C18烷基键合硅胶为固定相；波长214nm；柱温40℃；流动相A：低浓度醋酸水溶液；流动相B：乙腈。
得高纯度利拉鲁肽。
本发明涉及的固相树脂支载策略具有以下可预见并得到实证优点：
(1)降低了合成中肽链增长产生的偶联反应难度。特别是从 Lys20到His1的偶联效率得到很大提高，以往方法该部分氨基酸偶联接肽反应常常需要进行二次或三次投料才能彻底。而在本方法中这部分氨基酸偶联反应都是一次反应彻底完成，大幅降低了物料使用量及反应不完全形成的杂质。有利于提高产品产率和质量水平。
(2)从Gly31到Phe22之间的氨基酸偶联采用了片段法一次偶联，相比逐个偶联法进行肽键合成，片段法具有缩短产品生产周期的优点。同时片段应用，使后续合成中产生杂质结构和色谱行为发生了巨大变化，有利于色谱纯化效率提高，为进一步提高产品质量提供了保证。
(3)由于整个肽树脂结构的改变，肽树脂缩聚现象得到很大程度的抑制。肽树脂缩聚现象产生会造成偶联反应效率低下，并最终形成所谓的困难序列。本策略所采用的固相支载方法，在一定程度上破坏了困难序列的形成，从而提高了反应效率。
相比较于现有发明中所述固相合成利拉鲁肽工艺，本发明所述工艺具有以下特点：合成路线具有独创性、工业化生产可行性以及产品高质量水平。
附图说明
图1是本发明利拉鲁肽的工艺路线图；
图2是本发明利拉鲁肽中片段Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的合成工艺路线图；
图3是固相树脂载体处于肽链接近中部位置的示意图；
图4是固相树脂支载于肽链碳端的示意图。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明。
本发明中一些常用的缩写具有以下含义；
实施例一 Fmoc-Glu(Wang Resin)-OAll(氨基酸树脂I)的合成
称取王树脂(取代度0.65mmol/g，25.0g，16mmol)，加入到固相玻璃反应器中。加入DMF溶胀后抽滤除去溶剂。称取 Fmoc-Glu-OAll(13.25g，32mmol)，HOBt(3.28g，24mmol)加入专用烧杯。再加入DMF到溶完全解，冷却下加入DIC(3.8ml，24mmol)，搅拌预活化。然后将预活化液加入反应器中，约10分钟后加入DMAP (0.32g，2.5mmol)。控制反应器温度20-25℃反应5小时后，抽滤除去液体。用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。加入醋酸酐/吡啶/DMF 溶液(体积比10/8/82，250ml)封端30min后抽滤除去液体。然后用 DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，再用甲醇收缩树脂，干燥后得氨基酸树脂I(28.50g)，采用Fmoc吸光度法检测得取代度为0.28mmol/g。
实施例二 Fmoc-Gly-CTC Resin的合成
称取CTC树脂(0.95mmol/g，20g，19mmol)加入到固相玻璃反应器中。加入DCM溶胀后抽滤除去溶剂。称取Fmoc-Gly-OH(5.64g， 19mmol)加入烧杯，加入DCM/DMF溶解后再加入DIEA(3.2ml， 19mmol)，室温下搅拌15分钟后加入反应器中。反应3小时后，抽滤除去液体并用DMF和DCM洗涤后，再加入DCM/MeOH/DIEA(体积比85/10/5，200ml)封端30分钟。然后用DMF洗涤3次，DCM 洗涤3次，再用甲醇收缩树脂，干燥后得Fmoc-Gly-CTC Resin(24.23g) 采用Fmoc吸光度法检测得取代度为0.67mmol/g。
实施例三
Fmoc-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-CTC Resin(肽树脂Ⅴ)的合成
称取0.67mmol/g的Fmoc-Gly-CTC Resin(10g，6.7mmol)加入反应器中，用DMF溶胀后抽滤除去液体。加入适量去保护液(体积比20％哌啶/DMF)，20-30℃下反应25-30min，脱去保护基Fmoc。用适量DMF洗涤6遍。另外称取Fmoc-Arg(pbf)-OH(13.05g，20mmol) 和HOBt(2.72g，20mmol)加入专用烧杯，再加入DMF适量，溶解后，加入DIC(3.1ml，20mmol)，10-20℃搅拌5min后，将此与活化液加入反应器。反应约2小时后，用茚三酮做氨基的定性检测来跟踪反应终点。当检测所得树脂显示无色透明时，说明反应完全。抽滤除去液体。用DMF洗涤三遍后完成Arg的偶联。重复上述脱除Fmoc、预活化、偶联及DMF洗涤操作，按利拉鲁肽主链从碳端到氮端次序，依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Phe-OH后，用适量DMF洗涤3遍。再依次用DCM和甲醇洗涤，收缩树脂得肽树脂Ⅴ(24.10g)。
实施例四
Fmoc-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-OH(片段II)的合成
称取肽树脂Ⅴ(10g，2.8mmol)加入到预先配制有TFA/DCM (体积比1％，200ml)的裂解液中，20-30℃搅拌1小时。过滤收集滤液。再重复用2次TFA/DCM(体积比1％，200ml)对过滤所得树脂进行裂解并过滤。合并3次裂解所得滤液，用DIEA调节到溶液接近中性。减压浓缩后，加入适量水。过滤，收集滤饼冻干后得片段II (14.5g，HPLC纯度92.56％)。
实施例五
Fmoc-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-OtBu (片段III)的合成
称取片段II(5.20g，2.6mmol)加入250ml圆底烧瓶，再加入CHCl3/TFE/TBTA(体积比70/20/10，100ml)，于30-35℃下搅拌反应 2小时，将反应物用甲基叔丁基醚沉降、过滤冻干得片段III(5.25g)。
实施例六
H-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-OtBu(片段IV)的合成
称取片段III(5.01g，2.4mmol)加入250ml圆底烧瓶，再加入去保护液(50ml)，于20-30℃下反应30min。加入水(100ml)，充分搅拌，过滤收集沉淀，水洗。冻干得片段IV(4.85g)。
实施例七
Boc-His(Trt)-Ala-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(tBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-L ys(Dde)-Glu(Resin)-OAll(肽树脂Ⅲ)的合成
称取0.28mmol/g的Fmoc-Glu(Wang Resin)-OAll(7.14g，2mmol) 加入反应器中，用DMF溶胀后抽滤除去液体。加入适量去保护液， 20-30℃下反应25-30min，脱去保护基Fmoc。用适量DMF洗涤6遍。另外称取Fmoc-Lys(Dde)-OH(3.19g，6.0mmol)和HOBt(0.82g，6.0mmol)加入专用烧杯，再加入DMF适量，溶解后，加入DIC(0.94ml， 6.0mmol)，10-20℃搅拌5min后，将此与活化液加入反应器。反应约 2小时后，用茚三酮做氨基的定性检测来跟踪反应终点。当检测所得树脂显示无色透明时，说明反应完全。抽滤除去液体。用DMF洗涤三遍后完成Fmoc-Lys(Dde)-OH偶联。重复上述脱除Fmoc、预活化、偶联及DMF洗涤操作，按利拉鲁肽主链从碳端到氮端次序，依次偶联Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)OH后，用适量DMF 洗涤3遍。再依次用DCM和甲醇洗涤，收缩树脂得肽树脂IV(14.48g)。
实施例八
Boc-His(Trt)-Ala-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(tBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-L ys(Nα-Pal-γ-Glu-OtBu)-Glu(Resin)-OAll(肽树脂Ⅳ)的合成
称取肽树脂Ⅲ(7.25g，1mmol)加入固相反应器，加入适量DMF 溶胀、抽滤后，加入适量NH2NH2·H2O/DMF(体积比2/98)，反应 10分钟后，抽滤除去液体，再加入适量NH2NH2·H2O/DMF(体积比2/98)，反应10分钟后，抽滤除去液体，再加入适量 NH2NH2·H2O/DMF(体积比2/98)，反应10分钟后，抽滤除去液体，再加入适量NH2NH2·H2O/DMF(体积比2/98)，反应10分钟后，抽滤除去液体。加入适量DMF洗涤6遍后抽滤除去液体。称取 Fmoc-Glu-OtBu(2.55g，6.0mmol)，HOBt(0.81g，6mmol)加入烧杯，加入适量DMF溶解后，再加入和DIC(1.0ml，6mmol)，于10-20℃搅拌反应5分钟，再将此混合溶液加入反应器中，控制反应温度25-30℃，反应2小时后，用茚三酮做氨基的定性检测来跟踪反应终点。用DMF洗涤三遍后，加入适量去保护液，20-30℃下反应 25-30min，脱去保护基Fmoc。用适量DMF洗涤6遍。称取Pal-OH (1.52g，6mmol)，HOBt(0.81g，6mmol)加入烧杯，加入适量DMF 溶解后，再加入和DIC(1.0ml，6mmol)，于10-20℃搅拌反应5分钟，再将此混合溶液加入反应器中，控制反应温度25-30℃，反应2 小时后，用茚三酮做氨基的定性检测来跟踪反应终点。加入适量DMF 洗涤三遍后，再依次用DCM和甲醇洗涤，收缩树脂得肽树脂Ⅳ (7.64g)。
实施例九 利拉鲁肽肽树脂的合成
称取肽树脂Ⅳ(7.64g，1mmol)，加入固相反应器，加入适量DMF 溶胀、抽滤后，再加入DCM(40ml)和Pd(Ph3)4(0.12g，0.11mmol) 和吗啉(0.13ml)，0-5℃反应1小时后，抽滤除去液体，并用适量DMF 洗涤6遍。往反应器中加入DMF适量，再加入HATU(1.16g，3.0mmol) 和DIEA(0.6ml，0.36mmol)，再加入片段IV(2.81g，1.5mmol)，于20-30℃反应过夜。抽滤除去液体，并用适量DMF洗涤3遍，再依次用DCM和甲醇洗涤，收缩树脂得利拉鲁肽肽树脂(9.45g)。
实施例十 利拉鲁肽的合成
称取利拉鲁肽肽树脂(9.45g，1mmol)，加入到TFA/EDT/TIS/H2O (体积比87.5/5/5/2.5，95ml)中，控制反应温度25-30℃，搅拌反应 3小时。过滤，滤饼用少量TFA洗涤后合并滤液。将滤液转移到减压蒸馏***，在30-35℃下浓缩除去大部分的TFA。将浓缩液加入到-5℃的甲基叔丁基醚中(500ml)中，搅拌沉降1小时。过滤，取出滤饼用甲基叔丁基醚中(500ml)打浆、过滤。再用相同体积的甲基叔丁基醚重复打浆、过滤4遍。最后所得滤饼干燥后的得利拉鲁肽粗品 (3.58g，HPLC纯度)。
实施例十一 利拉鲁肽的纯化、冻干
称取利拉鲁肽粗品(3.58g，1mmol)用乙腈/DMSO/水溶液溶解、调节pH值。通过反相制备型HPLC***，波长215nm，色谱柱为 C8或C18填料进行多次纯化、转盐、冷冻干燥后得利拉鲁肽成品 (0.72g，总收率：25％；HPLC纯度：99.72％，最大单杂0.18％， MS：[M+3H]3+：1251.2，Calculated：3750.6)。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域普通技术人员来说，在不脱离本发明构思前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保户范围。

Claims (10)

1.一种利拉鲁肽的制备方法，其特征在于包括通过Fmoc固相法将Glu侧链羧基支载到羟基类型树脂上得到Fmoc-Glu(Resin)-OAll氨基酸树脂I；再通过多步骤固相偶联反应合成利拉鲁肽肽树脂：Boc-His(Pg2)-Ala-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(tBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Nα-Pal-γ-Glu-OtBu)-Glu(Resin)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-Otbu最后在酸性条件下裂解、色谱纯化、冷冻干燥制备得到高纯度利拉鲁肽；
其中Pg2为Trt或Boc；其中羟基类型树脂为Wang树脂或对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯(HMP)树脂；Trityl-Cl类型树脂优选为2-Cl-Trityl-Cl树脂、4-Methyl-Trityl-Cl树脂、4-Methoxy-Trityl-Cl树脂。
2.根据权利要求1所述的一种利拉鲁肽的制备方法，其特征在于所述的利拉鲁肽肽树脂由
Boc-His(Pg2)-(2-19)-Lys(Nα-Pal-γ-Glu-OtBu)-Glu(Resin)-OAll(肽树脂IV)和
H-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-Otbu(片段IV)合成。
3.根据权利要求2所述的一种利拉鲁肽的制备方法，其特征在于所述肽树脂IV通过Boc-His(Pg2)-(2-19)-Lys(Pg1)-Glu(Resin)-OAll(肽树脂III)合成得到；其中所述Pg1为Dde或iVDde。
4.根据权利要求3所述的一种利拉鲁肽的制备方法，其特征在于所述肽树脂III通过肽树脂Fmoc-Lys(Pg1)-Glu(Resin)-OAll(肽树脂Ⅱ)合成得到；所述肽树脂Ⅱ通过Fmoc-Glu(Resin)-OAll(氨基酸树脂I)合成得到。
5.一种利拉鲁肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1通过Fmoc-Glu-OAll与树脂(Resin)反应合成Fmoc-Glu(Resin)-OAll(氨基酸树脂I)；
步骤2通过Trityl-Cl树脂合成Fmoc-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-OH(片段II)，经过碳端叔丁酯化、去Fmoc后H-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-OtBu(片段IV)；
步骤3Fmoc-Glu(Resin)-OAll(氨基酸树脂I)在去保护液作用下脱去保护基Fmoc后，在活化剂***存在下与Fmoc-Lys(Pg1)-OH偶联得Fmoc-Lys(Pg1)-Glu(Resin)-OAll(肽树脂Ⅱ)；
步骤4Fmoc-Lys(Pg1)-Glu(Resin)-OAll肽树脂Ⅱ脱除Fomc后，在活化剂***存在下与Fmoc-Ala-OH偶联得Fmoc-Ala-Lys(Pg1)-Glu(Resin)-OALL，继续重复脱Fmoc和偶联操作，依次偶联Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Pg2)OH得Boc-His(Pg2)-Ala-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tB u)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(tBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pg1)-Glu(Resin)-OAll(肽树脂Ⅲ)；
步骤5肽树脂Ⅲ在碱性条件下脱除保护基Pg1后，在活化剂***存在下与Fmoc-Glu-OtBu偶联后；所得肽树脂脱除保护基Fmoc后，在活化剂***存在下与Pal-OH偶联得
Boc-His(Pg2)-Ala-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(tBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Nα-Pal-γ-Glu-OtBu)-Glu(Resin)-OAll(肽树脂Ⅳ)；
步骤6肽树脂Ⅳ在钯催化体系下脱除保护基All后，在活化剂***存在下与片段IV偶联得
Boc-His(Pg2)-Ala-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(tBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Nα-Pal-γ-Glu-OtBu)-Glu(Resin)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-OtBu(利拉鲁肽肽树脂)；
步骤7在20℃以下，将利拉鲁肽肽树脂加入到十倍量的三氟乙酸体系的裂解液中，控制温度20-30℃搅拌反应1-3小时；将所得反应体系过滤，滤液经减压浓缩后，再缓慢加入到0℃以下的醚类溶剂中，边搅拌边滴加；所得白色沉淀物经离心分离和多次洗涤再离心分离，减压干燥后即得利拉鲁肽粗品。
6.根据权利要求5所述的一种利拉鲁肽的制备方法，其特征在于所述步骤1是在活化剂存在下进行偶联反应，所述的树脂为固相载体树脂。
7.根据权利要求5所述的一种利拉鲁肽的制备方法，其特征在于所述步骤2是在有机碱作用下，由Trityl-Cl树脂与N端Fmoc保护甘氨酸Fmoc-Gly-OH偶联得Fmoc-Gly-CTC Resin；脱去保护基Fmoc后、在活化剂***存在下与Fmoc-Arg(pbf)-OH偶联得到Fmoc-Arg-Gly-CTCResin；继续重复脱Fmoc和偶联操作，依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH后得肽树脂Ⅴ；然后在酸性***下裂解、分离得片段II；再在混合溶剂中与TBTA反应碳端叔丁酯化得片段III；经过脱Fmoc、分离得片段IV。
8.根据权利要求5所述的一种利拉鲁肽的制备方法，其特征在于所有形成肽键的偶联反应所用缩合试剂为以下组合之一：DIC/HOBt、DIC/6-Cl-HOBt、DIC/Oxyma、HATU/DIPEA、HATU/DIPEA/HOBt、HBTU/DIPEA、HBTU/DIPEA/HOBt、PyBOP/DIPEA、PyBOP/DIPEA/HOBt。
9.根据权利要求5所述的一种利拉鲁肽的制备方法，其特征为步骤6)中保护基OAll脱除方法所用试剂组合，为以下组合之一：Pd(Ph3)4/Morpholine、Pd(Ph3)4/Ph3/Morpholine、Pd(Ph3)4/Piperidine、Pd(Ph3)4/Ph3/Piperidine、Pd(Ph3)4/Pyrrolidine、Pd(Ph3)4/Ph3/Pyrrolidine；保护基Pg1脱除方法中所用试剂组合为以下组合之一1.5％N2H2·H2O/DMF、2％N2H2·H2O/DMF、3％N2H2·H2O/DMF。
10.根据权利要求5所述的一种利拉鲁肽的制备方法，其特征在于步骤7得到的利拉鲁肽粗品用乙腈/DMSO/水溶液溶解、过滤，滤液高压液相色谱***进行纯化。包括以下步骤：
第一次纯化：填料采用C8烷基键合硅胶为固定相；波长214nm；柱温40℃；流动相A：低浓度TFA/水/甲醇体系；流动相B：低浓度TFA/乙腈体系；
第二次纯化：填料采用C18烷基键合硅胶为固定相；波长214nm；柱温40℃；流动相A：铵盐水溶液；流动相B：乙腈；
第三次纯化：填料采用C18烷基键合硅胶为固定相；波长214nm；柱温40℃；流动相A：低浓度醋酸水溶液；流动相B：乙腈；
得高纯度利拉鲁肽。
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