CN101743469A - 试样分析用试剂盒以及试样分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供包含第1试剂和第2试剂的试样分析用试剂盒、以及使用该试剂盒的试样分析方法。其中，第1试剂含有阳离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和芳香族羧酸；第2试剂含有能够将核酸染色的荧光色素。
Description
【技术领域】
本发明涉及用于分析从生物体采集的试样中的血球的试样分析用试剂盒以及试样分析方法。
【背景技术】
在临床检查领域中，试样中的血球成分的分析，在诊断被检测者的循环器官等的各种疾病方面是非常有用的。根据不同疾病，会使特定的血球数增加或减少，或者使通常不存在的血液细胞出现在末梢血中。
近年来，市场上出售应用流式细胞仪原理的各种自动血球计数装置。如果使用这些自动血球计数装置，就可以自动进行试样中的血球的分类和计数。
白血球通常分为淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞以及嗜碱性粒细胞这5类。其中，嗜碱性粒细胞通常在血液试样中含有的数目很少。因此，与采用一次测定将白血球分成5类的方法来测定嗜碱性粒细胞的方法相比，通过对血液试样进行嗜碱性粒细胞测定专用的处理后再测定嗜碱性粒细胞的方法可以更正确地进行分类。与其他白血球相比，嗜碱性粒细胞在酸性条件下具有难以被破坏的特性。专利文献1和专利文献2记载了通过利用其特性进行嗜碱性粒细胞测定专用的处理，将嗜碱性粒细胞与其他白血球区分开。
予以说明，在白血球的测定过程中，常常成为问题的是有核红细胞的出现。有核红细胞具有核。因此，在白血球的测定过程中，即使对红细胞进行溶解处理，也会残留有核红细胞的核，它显示出与白血球相近似的信号，因此在测定白血球数时它会引起正的误差。为了排除该影响，就要对血液试样进行有核红细胞测定专用的处理，然后进行有核红细胞数的测定，并采用其他的方法测定该血液试样的白血球数，从获得的白血球数中扣除有核红细胞数，由此可以得出正确的白血球数。专利文献3记载了通过对血液试样进行有核红细胞测定专用的处理，将有核红细胞与白血球区分开。
然而，为了进行嗜碱性粒细胞和有核红细胞的分类，必须象专利文献1～3记载的那样进行各种血球专用的处理，这样一来，就会使操作变得麻烦，而且还很可能使装置复杂化或者大型化。另外，由于多次使用各种血球测定专用试剂，因此使血液检查整体的成本提高。从这种观点考虑，优选血球专用的处理尽可能少的方法。
但是，嗜碱性粒细胞和有核红细胞都可以通过在酸性条件下处理血液试样来进行测定。因此，只要在酸性条件下处理血液试样，就可以通过一次测定来测定嗜碱性粒细胞和有核红细胞这二者。作为这种尝试之一，专利文献4记载了通过将含有能使白血球和异常细胞变成适合染色的状态的红细胞溶解剂和表面活性剂的水溶液与试样混合，向其中加入含有荧光色素的染色液进行染色，用流式细胞仪进行测定，测定荧光强度和散射光强度，由此可以测定嗜碱性粒细胞和成红细胞(有核红细胞)。
【专利文献1】特开昭61-88896号公报
【专利文献2】特开平7-294518号公报
【专利文献3】特开平10-339729号公报
【专利文献4】特开2002-148261号公报
【发明内容】
【发明所要解决的课题】
但是，按照上述专利文献4记载的方法，对于采血后经过一段时间的试样等，往往会使嗜碱性粒细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球的分离不好。
本发明的目的在于，提供：能将试样中的有核红细胞和嗜碱性粒细胞与其他白血球更明确地区分开，并能对其计数的试样测定用试剂盒以及试样测定方法。
【用于解决课题的手段】
本发明是用于测定试样中的嗜碱性粒细胞和/或有核红细胞的试样分析用试剂盒，该试样分析用试剂盒包含第1试剂和第2试剂，其中，第1试剂含有用于使红细胞溶血并对白血球的细胞膜造成能让荧光色素透过程度的损伤的阳离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和芳香族羧酸；第2试剂含有能够将核酸染色的荧光色素。
另外，本发明是试样分析方法，该方法包含：利用上述第1试剂，使试样中的红细胞溶血，并对血球的细胞膜造成可让荧光色素透过程度的损伤，利用上述第2试剂，将受到损伤的血球染色的工序；向上述被染色的血球照射光，取得散射光信息和荧光信息的工序；以及基于上述散射光信息和上述荧光信息，将上述试样中的嗜碱性粒细胞和/或有核红细胞分类并进行计数的工序。
【发明的效果】
根据本发明，即使是采血后经过一段时间的试样，也可以将有核红细胞和嗜碱性粒细胞与其他血球更明确地区分开，使计数成为可能，也使疾病的检查和诊断能够更正确地进行。本发明中，只需通过一次测定就能对有核红细胞和嗜碱性粒细胞进行计数，根据检查目的的不同，有时只要测定有核红细胞和嗜碱性粒细胞中的任一个即可。在这种情况下，可以只测定其中的任一个。
【附图说明】
图1示出在使用本发明的试样分析用试剂分析试样时的散布图的示意图。
图2示出在使用本发明的试样分析用试剂分析试样时的散布图的示意图。
图3示出在使用实施例1的试样分析用试剂分析试样时的散布图。
图4示出在使用实施例1的试样分析用试剂分析试样时的散布图。
图5示出在使用实施例2的试样分析用试剂分析试样时的散布图。
图6示出在使用实施例2的试样分析用试剂分析试样时的散布图。
图7示出在使用实施例3的试样分析用试剂分析试样时的散布图。
图8示出在使用实施例3的试样分析用试剂分析试样时的散布图。
图9示出在使用实施例3的试样分析用试剂分析试样时的散布图。
图10示出在使用实施例3的试样分析用试剂分析试样时的散布图。
图11示出在使用实施例4的试样分析用试剂分析试样时的散布图。
图12示出在使用实施例4的试样分析用试剂分析试样时的散布图。
图13示出在使用实施例4的试样分析用试剂分析试样时的散布图。
图14示出在使用实施例4的试样分析用试剂分析试样时的散布图。
图15示出在使用实施例5的试样分析用试剂分析试样时的散布图。
图16示出在使用实施例5的试样分析用试剂分析试样时的散布图。
图17示出在使用实施例5的试样分析用试剂分析试样时的散布图。
图18示出在使用实施例6的试样分析用试剂分析试样时的散布图。
图19示出在使用实施例6的试样分析用试剂分析试样时的散布图。
图20示出在使用实施例6的试样分析用试剂分析试样时的散布图。
图21示出在使用实施例7的试样分析用试剂分析试样时的散布图。
图22示出在使用实施例7的试样分析用试剂分析试样时的散布图。
图23示出在使用实施例8的试样分析用试剂分析试样时的散布图。
图24为示出本发明的试剂盒的一例的图。第1试剂为B，第2试剂为A。
图25示出在使用实施例9的试样分析用试剂分析试样时的散布图的一例。
图26示出在使用实施例9的试样分析用试剂分析试样时的散布图的一例。
图27为示出使用实施例9的试样分析用试剂分析试样的结果与采用以往的试样分析方法分析试样的结果之间的关系的曲线图。(A)总白血球数的关系；(B)嗜碱性粒细胞比率的关系；(C)有核红细胞比率的关系。
【具体实施方式】
嗜碱性粒细胞是具有可被碱性色素染色的大型酸性颗粒的白血球中的一种。另外，有核红细胞一般被称为成红细胞，包括前成红细胞、嗜碱性成红细胞、多染性成红细胞和正染性成红细胞。
本说明书中，“试样”是指从哺乳动物、优选从人身上采集的血液、骨髓液、尿、通过析离术(apheresis)等采集的试样等体液试样。
本发明人等反复进行了精心的研究，结果发现，通过使用含有阳离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和芳香族羧酸的第1试剂以及含有可将核酸染色的荧光色素的第2试剂，可以将有核红细胞和嗜碱性粒细胞与其他白血球更明确地区分开。
作为本发明一个实施方案的试样分析用试剂盒，是一种包含含有阳离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和芳香族羧酸的第1试剂、以及含有能够将核酸染色的荧光色素的第2试剂的试剂盒。通过用含有阳离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和芳香族羧酸的第1试剂处理试样，可以使试样中的红细胞溶血并对白血球和有核红细胞的细胞膜造成允许荧光色素通过程度的损伤。由此，嗜碱性粒细胞以外的白血球和有核红细胞的细胞膜受到损伤，发生收缩或者裸核化。另一方面，虽然嗜碱性粒细胞的细胞膜也受到损伤，但与嗜碱性粒细胞以外的白血球和有核红细胞相比，其损伤程度较轻。因此可以认为，与嗜碱性粒细胞以外的白血球和有核红细胞相比，嗜碱性粒细胞收缩的程度小。所以，根据细胞大小和形态的差别，就可以将嗜碱性粒细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球和有核红细胞区分开。进而，通过用含有能够将核酸染色的荧光色素的第2试剂处理试样，可以根据荧光色素的染色性的差别，将有核红细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球和嗜碱性粒细胞区分开。
阳离子型表面活性剂可以使红细胞溶血并对白血球和有核红细胞的细胞膜造成损伤。作为阳离子型表面活性剂，优选季铵盐或者吡啶鎓盐型的阳离子型表面活性剂。作为季铵盐型的阳离子型表面活性剂，更优选由下述通式(III)表示的季铵盐。
上述式(III)中的R13、R14和R15可以相同或不同，为氢原子、碳数1～8的烷基或者碳数6～8的芳烷基。R16为碳数8～18的烷基、碳数8～18的烯基或者碳数6～18的芳烷基。X-为阴离子。
作为R13、R14和R15的碳数1～8的烷基，可举出甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基等。作为R13、R14和R15的碳数6～8的芳烷基，可举出苄基、苯乙基等。优选R13、R14和R15为甲基、乙基等碳数1～8的烷基。
作为R16的碳数8～18的烷基，可举出辛基、癸基、十二烷基、十四烷基等。作为R16的碳数8～18的烯基，可举出辛烯基、癸烯基、油基等。作为R16的碳数6～18的芳烷基，可举出苄基、苯乙基等。优选R16为癸基、十二烷基、十四烷基等碳数10～18的直链烷基。
作为阴离子X-，可举出F-、Cl-、Br-和I-等卤离子以及CF3SO3 -、BF4 -、ClO4 -等。
作为吡啶鎓盐型的阳离子型表面活性剂，更优选由下述式(IV)表示的吡啶鎓盐。
上述式(IV)中的R17为碳数8～18的烷基。X-为阴离子。
予以说明，作为碳数8～18的烷基，可举出癸基、十二烷基、十四烷基等碳数10～18的直链烷基。作为阴离子X-，可举出F-、Cl-、Br-和I-等卤离子以及CF3SO3 -、BF4 -、ClO4 -等。
作为上述阳离子型表面活性剂的具体例，可举出癸基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、辛基三甲基溴化铵、辛基三甲基氯化铵、月桂基三甲基溴化铵、月桂基三甲基氯化铵、肉豆蔻基三甲基溴化铵、肉豆蔻基三甲基氯化铵、月桂基氯化吡啶鎓等。
阳离子型表面活性剂按照足以使红细胞溶血并对白血球和有核红细胞的细胞膜造成损伤的浓度来使用。该浓度通过例如用通常的光学显微镜观察细胞膜等的状态来简单地确定适当的浓度。作为阳离子型表面活性剂的浓度，具体地讲，优选为300～9000mg/L，更优选为400～8000mg/L，最优选为500～7000mg/L，可以根据所使用的阳离子型表面活性剂的种类来适宜调整。
予以说明，如果阳离子型表面活性剂的浓度过低，则往往不能将嗜碱性粒细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球正确地区分开。可以认为，这是因为，如果阳离子型表面活性剂的浓度过低，则不能对白血球造成充分的损伤，其结果，嗜碱性粒细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球之间的大小和形态的差别就会变小。另一方面，如果阳离子型表面活性剂的浓度过高，则往往不能将有核红细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球正确地区分开。可以认为，这是因为，如果阳离子型表面活性剂的浓度过高，则对特别是嗜碱性粒细胞以外的白血球和有核红细胞的细胞膜造成过度的损伤，其结果，不能正确地区分有核红细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球。因此，只要是处于上述范围内的浓度，就不会对白血球和有核红细胞的细胞膜造成过度的损伤，可以有效地使红细胞溶血。另外，阳离子型表面活性剂的溶血力依赖于其主链的长度。主链长的阳离子型表面活性剂，其溶血力强，因此，与主链短的阳离子型表面活性剂相比，只需较少的量就可以获得效果。
对于采血后经过一段时间的试样，白血球等血球由于形态变化等而容易受到损伤。另外，如果使用阳离子型表面活性剂，则会对特别是嗜碱性粒细胞以外的白血球和有核红细胞的细胞膜造成过度的损伤，往往不能将有核红细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球正确地区分开。但是，在这种情况下，如果将阳离子型表面活性剂与非离子型表面活性剂一起使用，则能够抑制对白血球等的过度损伤，可以将有核红细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球更正确地区分开。作为非离子型表面活性剂，优选聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯固化蓖麻油、聚氧乙烯甾醇、或者聚氧乙烯氢化甾醇。
作为聚氧乙烯烷基醚型的非离子型表面活性剂，优选由以下式(V)表示的非离子型表面活性剂。
R18-O-(CH2CH2O)n-H (V)
上述式中的R18为碳数12～22的烷基或者碳数12～22的烯基。n为10～30。
作为聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚型的非离子型表面活性剂，优选由以下式(VI)表示的非离子型表面活性剂。
上述式中的R19为碳数10～30的烷基或者碳数为～的烯基。m为1～10。n为10～30。
作为聚氧乙烯蓖麻油型的非离子型表面活性剂，优选由以下式(VII)表示的非离子型表面活性剂。
上述式中的k、n、m、x、y和z的合计为10～60。
作为聚氧乙烯固化蓖麻油型的非离子型表面活性剂，优选由以下式(VIII)表示的非离子型表面活性剂。
上述式中的k、n、m、x、y和z的合计为10～60。
作为聚氧乙烯甾醇型的非离子型表面活性剂，优选由以下式(IX)表示的非离子型表面活性剂。
上述式中的n为10～30。
作为聚氧乙烯氢化甾醇型的非离子型表面活性剂，优选由以下式(X)或者式(XI)表示的非离子型表面活性剂。
上述式中的n为20～30。
上述式中的n为20～30。
予以说明，作为碳数12～22的烷基，可举出十二烷基、十六烷基等。作为碳数12～22的烯基，可举出油基等。另外，如果上述式(V)、式(VI)、式(IX)～式(XI)中的n过小，则会对血球的细胞膜造成过度的损伤，而如果n过大，则往往不能对血球的细胞膜造成足够的损伤。同样地，如果上述式(VII)和式(VIII)中的k、n、m、x、y和z的合计值过小，则会对血球的细胞膜造成过度的损伤，；而如果合计值过大，则往往不能对血球的细胞膜造成足够的损伤。
作为非离子型表面活性剂，具体地可举出聚氧乙烯(16)油基醚、聚氧乙烯(20)鲸蜡基醚、聚氧乙烯(20)聚氧丙烯(8)鲸蜡基醚、聚氧乙烯(30)聚氧丙烯(6)癸基十四烷基醚、聚氧乙烯(20)蓖麻油、聚氧乙烯(20)固化蓖麻油、聚氧乙烯(50)固化蓖麻油、聚氧乙烯(25)植物甾醇(Phytosterol)等。其中，特别优选聚氧乙烯(16)油基醚、聚氧乙烯(20)聚氧丙烯(8)鲸蜡基醚。
作为非离子型表面活性剂的浓度，优选500～7000mg/L，更优选800～6000mg/L，最优选1000～5000mg/L，可以根据所使用的非离子型表面活性剂的种类来适宜调整。
予以说明，如果非离子型表面活性剂的浓度过低，则例如在使用采血后经过一段时间的试样的情况下，往往不能抑制由阳离子型表面活性剂对白血球和有核红细胞的细胞膜造成的过度损伤，从而不能将特别是有核红细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球正确地区分开。另一方面，如果非离子型表面活性剂的浓度过高，则往往会抑制由阳离子型表面活性剂对白血球和有核红细胞的细胞膜造成的损伤，从而不能将特别是嗜碱性粒细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球正确地区分开。因此，只要是处于上述范围内的浓度，即使是使用采血后经过一段时间的试样的情况下，也可以将有核红细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球正确地区分开。
第1试剂优选含有在分子内具有至少一个芳香环的羧酸(以下称为“芳香族羧酸”)或者其盐中的至少1种。通过使用芳香族羧酸，可以更有效地在短时间内使红细胞溶血。
予以说明，在将不含芳香族羧酸的第1试剂用于测定的情况下，往往会由于血液试样而造成嗜碱性粒细胞的值显示出伪高值。虽然出现伪高值的理由目前尚不清楚，但可以认为，这是由于血液试样中所含的嗜碱性粒细胞以外的血球或者其他成分显示出与嗜碱性粒细胞相似的大小、形态或者荧光强度的缘故。但是，通过使用含有芳香族羧酸的第1试剂来测定上述的血液试样，可以抑制显示出伪高值的现象。
作为所使用的芳香族羧酸，只要是在分子内具有至少1种芳香环的有机酸或其盐，就没有特殊限定。作为优选的芳香族羧酸，可举出水杨酸、苯二甲酸、苯甲酸、羟基苯甲酸、氨基苯甲酸、以及它们的盐等。
第1试剂中的上述芳香族羧酸或其盐的浓度，只要是能使第1试剂的pH值处于以下所示的范围的浓度，就没有特殊限定，优选为0.1～100mM，更优选为0.5～50mM。
予以说明，如果芳香族羧酸的浓度过低，则不能充分获得上述那样的效果，从而往往不能将嗜碱性粒细胞正确地区分开。另一方面，如果芳香族羧酸的浓度过高，则往往不能将有核红细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球正确地区分开。因此，只要是处于上述范围的浓度，就可以将有核红细胞和嗜碱性粒细胞与其他的血球正确地区分开。
当用第1试剂处理试样时，优选在不妨碍有核红细胞和嗜碱性粒细胞的测定的条件下使红细胞溶血。红细胞通常在约150mOsm/kg以下的渗透压下在细胞膜上产生细孔，红细胞内部的血红蛋白溶出，从而成为光学透明(溶血)。成为光学透明的红细胞实际上不会妨碍使用流式细胞仪进行的测定。红细胞的溶血操作，优选低渗透压条件以及低pH值条件。满足这两个条件的渗透压为20mOsm/kg～150mOsm/kg。通过将上述第1试剂的渗透压设定在该范围内，可以在不妨碍有核红细胞和嗜碱性粒细胞的测定的条件下有效地使红细胞溶血。
嗜碱性粒细胞具有在酸性条件下比其他白血球更难以被破坏的特性。因此，第1试剂的pH值优选为2.0～4.5，更优选为2.0～3.5。如果pH处于该范围内，则嗜碱性粒细胞的颗粒稳定。另外，如果pH处于该范围内，则可以在不过度影响白血球、有核红细胞等的条件下有效地使红细胞溶血。由此，无核的红细胞的散射光和荧光变得极小，因此，红细胞实际上不会对有核红细胞和白血球的测定产生不良影响。
第1试剂的pH值也可以使用缓冲剂来调整。优选的缓冲剂为在所希望的pH±2.0附近具有pKa的缓冲剂，可举出例如，苹果酸、酒石酸、丙二酸、琥珀酸、柠檬酸、二甘醇酸等。第1试剂中的上述缓冲剂的浓度，只要能够将pH值保持在上述范围内，就没有特殊限定。
予以说明，如果将上述芳香族羧酸与上述缓冲剂组合，则有核红细胞的区分性能提高，因此是优选的。作为缓冲剂与芳香族羧酸的组合，可举出例如，苹果酸与水杨酸或者水杨酸盐、苹果酸与苯二甲酸或者苯二甲酸盐、柠檬酸与水杨酸或者水杨酸盐、柠檬酸与苯二甲酸或者苯二甲酸盐、苹果酸与苯甲酸或者苯甲酸盐、苹果酸、以及苯二甲酸或者苯二甲酸盐与苯甲酸或者苯甲酸盐、等的组合。
为了使第1试剂中的渗透压处在适于红细胞溶血的范围内，可以使用例如NaCl、KCl等电解质、糖类等。另外，还可以根据上述缓冲剂的浓度来调整渗透压。
第1试剂可以通过将上述的表面活性剂和芳香族羧酸或其盐与根据希望的上述缓冲剂按照上述的浓度溶解于适当的溶剂中，并根据希望使用NaOH、HCl等调整pH值来获得。作为上述适当的溶剂，只要是能够使上述成分溶解的，就没有特殊限定，可举出例如，水、有机溶剂、它们的混合液等。作为有机溶剂，可举出乙醇、乙二醇、二甲亚砜(以下称为“DMSO”)等。
第2试剂含有能够将核酸染色的荧光色素。当用能够将核酸染色的荧光色素将经过上述第1试剂处理的试样中的血球染色时，白血球被明显地染色，发出较强的荧光。另一方面，有核红细胞被轻微地染色，发出较弱的荧光。根据荧光色素的染色性的差别，就可以将有核红细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球和嗜碱性粒细胞区分开。虽然这种白血球与有核红细胞的荧光强度的差异所产生的作用机理尚不明确，但或许可以认为是由于有核红细胞的核(DNA)发生凝缩，从而妨碍了色素进入细胞核中的缘故。
作为荧光色素，只要是能够将核酸染色的，就没有特殊限定，只要是通常用于该领域的，就可以使用。作为第2试剂中含有的荧光色素，可举出以下式(I)的荧光色素和式(II)的荧光色素。
上述式中的R1和R2为烷基。予以说明，R1和R2相互相同或不同。进而，
R3、R4、R5和R6为氢原子或者烷基。予以说明，R3、R4、R5和R6相互相同或不同。X-为阴离子。
上述式中的R7和R8为可以具有酸性基团的烷基。予以说明，R7和R8相互相同或不同。进而，
为
或
另外，
为
或
R9、R10、R11和R12为氢原子或者酸性基团。R9、R10、R11和R12可以相同或不同。但是，R7～R12中的任1个中均存在酸性基团。能够在R7～R12中存在的酸性基团也可以形成盐。但是，能够在R7～R12中存在的酸性基团中的任1个均为释放出质子的基团。
本说明书中，上述式(I)和式(II)中的“烷基”可以是直链状或者支链状的任一种。烷基的碳数通常为1～20，优选为1～10，从荧光色素的水溶性的观点考虑，碳数更优选为1～6。作为烷基的优选例，可举出甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基等。
作为式(I)中的阴离子X-，可举出F-、Cl-、Br-和I-等卤离子以及CF3SO3 -、BF4 -、ClO4 -等。
本说明书中，能够在式(II)中存在的“酸性基团”包含能够释放出质子的基团以及能够释放出质子的基团释放出质子后的基团这二者。作为能够释放出质子的基团，可举出羧基、磺酸基、磷酸基等，优选磺酸基。
上述的酸性基团也可以形成盐。作为所述盐，可举出钠盐、钾盐等碱金属盐等。更优选为钠盐。
上述式(I)和式(II)的荧光色素可以使用1种或2种以上。上述的荧光色素可以从株式会社林原生物化学研究所购买。
本发明的试样分析用试剂中的色素的浓度，可以根据色素的种类来适宜选择，一般为0.01～100mg/L，优选为0.1～10mg/L，更优选为0.2～6.0mg/L。
予以说明，第2试剂中含有的上述式(I)和式(II)的荧光色素，由于对白血球的亲和性强于对有核红细胞的亲和性，因此，可以将白血球明显地染色。因此，根据被这些荧光色素染色的细胞发出的荧光的差异，可以将有核红细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球和嗜碱性粒细胞更正确地区分开。
第2试剂可以通过将上述的荧光色素按照上述的浓度溶解于适当的溶剂中来获得。另外，作为适当的溶剂，只要是能够使上述的荧光色素溶解的，就没有特殊限定，可举出水、有机溶剂、它们的混合液等。作为有机溶剂，可举出乙醇、乙二醇、DMSO等。予以说明，荧光色素往往在水溶液中的长期保存稳定性差，该情况下，优选使其溶解在上述的有机溶剂中。
试样分析用试剂盒优选按照第1试剂：第2试剂：试样的体积比成为10～500∶1～10∶1、更优选20～100∶2～5∶1的量将其与试样混合。通过按照该比例将第1试剂、第2试剂和试样混合制成测定用试样，可以使红细胞的溶解快速地进行，从而可以良好地进行血球成分的染色。另外，试样的量只要为数μl～100μl左右，就可以良好地进行测定。
本发明一个实施方案的试样分析方法包含下述工序：利用上述第1试剂，使试样中的红细胞溶血，并对血球的细胞膜造成可让荧光色素透过那样程度的损伤，并利用上述第2试剂，将受到损伤的血球染色的工序；向被染色的血球照射光以取得散射光信息和荧光信息的工序；以及基于获得的散射光信息和获得的荧光信息，将试样中的嗜碱性粒细胞和/或有核红细胞分类进行计数的工序。
在染色工序中，将第1试剂、第2试剂与试样混合。在该工序中，第1试剂所含的阳离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和芳香族羧酸使试样中的红细胞溶血，并对血球的细胞膜造成可让荧光色素透过那样程度的损伤。因此，通过将第1试剂、第2试剂与试样混合，可以有效地将测定对象的血球荧光染色。
在染色工序中，作为将第1试剂、第2试剂与试样混合的顺序，没有特殊限定。可以先将第1试剂与第2试剂混合，然后将该混合液与试样混合。另外，也可以先将第1试剂与试样混合，然后将该混合液与第2试剂混合。不管按照哪一种顺序混合，都可以得到同等的测定结果。
在染色工序中，将第1试剂、第2试剂与试样混合后，优选在15～50℃、更优选在30～45℃的温度下使其反应5～120秒钟、优选5～30秒钟。
在染色工序中被染色的血球可以使用流式细胞仪进行分析。以下说明使用流式细胞仪进行血球分析。当被染色的血球通过流式细胞仪的流动池时，通过向血球照射光，可以获得散射光信息和荧光信息。作为散射光信息，只要是能够用通常市售的流式细胞仪测定的散射光，就没有特殊限定，可举出前方散射光(例如，入射光角度0～20度附近)、侧方散射光(入射光角度90度附近)等散射光的脉冲幅度、散射光强度等。一般来说，已知侧方散射光反映出细胞的核和颗粒等内部信息，前方散射光反映出细胞的大小等信息。在本实施方案的方法中，优选使用前方散射光强度和侧方散射光强度作为散射光信息。
荧光信息是指通过向测定用试样照射适当波长的光并测定被激发的荧光而获得的信息。根据所使用的荧光色素，可以选择适当的接受光波长。荧光是从被上述荧光色素染色的细胞内的核酸和颗粒等发出的。
所使用的流式细胞仪的光源没有特殊限定，可以选择适于激发荧光色素的波长的光源。例如，可以使用红半导体激光、蓝半导体激光、氩激光、He-Ne激光等。特别地，与气体激光相比，半导体激光非常便宜，因此是优选的。
基于上述那样测定的散射光和荧光，可以将有核红细胞和嗜碱性粒细胞与其他成分区分开并进行计数。该工序优选包含：例如，(1)绘制以荧光信息和前方散射光信息作为二轴的散布图；(2)绘制以前方散射光信息和侧方散射光信息作为二轴的散布图；(3)将得到的各散布图用适当的解析软件解析。
当以荧光强度为X轴、以前方散射光强度为Y轴绘制散布图时，例如，如图1所示，有核红细胞、嗜碱性粒细胞和嗜碱性粒细胞以外的白血球形成各自的集团(簇)进行分布。予以说明，图中，表示为NRBC的是有核红细胞的集团；表示为BASO的是嗜碱性粒细胞的集团；表示为WBC-BASO的是嗜碱性粒细胞以外的白血球的集团；表示为WBC的是白血球的集团。在所述散布图中，与白血球相比，有核红细胞出现在荧光强度较小的区域。由此可以将白血球与有核红细胞明确地区分开。另外，嗜碱性粒细胞的尺寸比嗜碱性粒细胞以外的白血球要大，出现在荧光强度较大的区域。由此，可以与嗜碱性粒细胞以外的白血球区分开。但是，在测定白血球数多的试样或采血后经过一段时间的试样时，在利用荧光强度和前方散射光强度的散布图中，往往不能将嗜碱性粒细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球正确地区分开。该情况下，可以利用前方散射光信息和侧方散射光信息。当以侧方散射光强度为X轴、以前方散射光强度为Y轴绘制散布图时，例如，如图2所示，嗜碱性粒细胞和嗜碱性粒细胞以外的白血球形成各自的集团(簇)进行分布。予以说明，图中，表示为BASO的是嗜碱性粒细胞的集团；表示为WBC-BASO的是嗜碱性粒细胞以外的白血球的集团。在所述散布图中，与其他白血球相比，嗜碱性粒细胞出现在侧方散射光强度和前方散射光强度较大的区域。由此可以将嗜碱性粒细胞与其他的白血球区分开。进而，如上所述，根据图1可以将有核红细胞与其他的白血球区分开。因此，通过将图1和图2任一个区域中所包含的细胞作为嗜碱性粒细胞计算出来，可以求出精度更高的嗜碱性粒细胞。
予以说明，散布图上的各集团究竟是与哪一种血球相对应，可以将只含有各血球的试样用本实施方案的试剂盒处理后进行测定，然后通过确认出现位置来确定。
通过将散布图上的集团用适当的解析软件来解析，可以计算出有核红细胞和嗜碱性粒细胞的数目和比例。具体来说，在散布图中，当在认为是某些特定的细胞会出现的位置观察到细胞集团时，首先确定该集团的中心。在从该中心到其他细胞集团出现的区域之间，可以将直到规定的细胞集团的细胞可能出现的部位作为该细胞集团的边界。可以将在所设定的区域内出现的细胞作为规定的细胞进行计数。另外，通过同时将嗜碱性粒细胞以外的白血球计数，可以计算出嗜碱性粒细胞相对于总白血球的比率(嗜碱性粒细胞/总白血球：以下称为“嗜碱性粒细胞比率”)、以及有核红细胞相对于总白血球的比率(有核红细胞/总白血球：以下称为“有核红细胞比率”)。予以说明，有核红细胞比率通常以每100个白血球中出现的有核红细胞的百分率来表示，单位以“个/100WBC”表示。
使用本实施方案的试样分析用试剂盒和试样分析方法，可以将由有核红细胞形成的集团以及由嗜碱性粒细胞形成的集团与其他的血球细胞形成的集团明确地分离开，因此，可以更正确地进行计数。
用以下的实施例更详细地说明本发明，但本发明可以进行各种变更、修饰，因此本发明的范围不受以下实施例的限定。
【实施例】
在以下的实施例中使用的阳离子型表面活性剂，为癸基三甲基溴化铵(以下记做DTAB)、十二烷基三甲基氯化铵(LTAC)。
在以下的实施例中使用的非离子型表面活性剂如下。
聚氧乙烯(16)油基醚(制品名：NIKKOL BO-16)、
聚氧乙烯(20)鲸蜡基醚(制品名：NIKKOL BC-20TX)、
聚氧乙烯(20)聚氧丙烯(8)鲸蜡基醚(制品名：NIKKOL PBC-44)、
聚氧乙烯(30)聚氧丙烯(6)癸基十四烷基醚(制品名：NIKKOL PEN-4630)、
聚氧乙烯(20)蓖麻油(制品名：NIKKOL CO-20TX)、
聚氧乙烯(20)固化蓖麻油(制品名：NIKKOL HCO-20)、
聚氧乙烯(50)固化蓖麻油(制品名：NIKKOL HCO-50)、
聚氧乙烯(25)植物甾醇(制品名：NIKKOL BPSH-25)。
以上均可从日光化学品株式会社购买。
在以下的实施例中使用的芳香族羧酸，为水杨酸、苯二甲酸、苯甲酸、羟基苯甲酸和氨基苯甲酸。
在以下的实施例中使用的荧光色素，为NK-529、NK-2670、NK-3750、NK-3383、NK-1840、NK-9001、NK-9003、NK-2929、NK-3375、NK-5056、NK-3266、NK-3620。以上均可从株式会社林原生物化学研究所购买。这些色素的化学式示于表1。
【表1】
比较例1
本例中，利用以往的方法，测定采血后经过约8小时的血液试样。
使用自动血球计数装置XE-2100(シスメツクス制：装载红半导体激光(633nm))，测定分别从3名被检测者身上采集的血液试样，对总白血球数和嗜碱性粒细胞进行计数。基于该计数结果，计算出嗜碱性粒细胞比率。予以说明，作为试剂，使用ストマトライザ-FBII(シスメツクス制)。另外，测定中，使用采血后经过约8小时的血液试样。
根据测定结果可以认为，这些试样的嗜碱性粒细胞的含量在正常值以上(以下将该试样记做BASO试样1、BASO试样2和BASO试样3)。BASO试样1的嗜碱性粒细胞比率为0.8％，BASO试样2的嗜碱性粒细胞比率为3.4％，BASO试样3的嗜碱性粒细胞比率为1.6％。将这些结果作为实施例1或2的对照。
其次，与上述同样地使用自动血球计数装置XE-2100，测定分别从其他3名被检测者身上采集的血液试样中所含的有核红细胞，对总白血球数和有核红细胞数进行计数。基于该计数结果，计算出有核红细胞比率。予以说明，作为试剂，使用ストマトライザ-NR(シスメツクス制)。另外，测定中，使用采血后经过约8小时的血液试样。
根据测定结果可以认为，这些试样中出现有核红细胞(以下将该试样记做NRBC试样1、NRBC试样2和NRBC试样3)。NRBC试样1的有核红细胞比率为4.4个/100WBC，NRBC试样2的有核红细胞比率为1.9个/100WBC，NRBC试样3的有核红细胞比率为1.3个/100WBC。将这些结果作为实施例1或2的对照。
实施例1
本实施例中，配制下述组成的第1试剂和第2试剂，使用各试剂，测定采血后经过约8小时的血液试样。
予以说明，第1试剂的pH值为3.0。
第1试剂A
为含有水杨酸钠0.5mM、DL-苹果酸10mM、LTAC 2000ppm、BO-16 1000ppm的水溶液。
第1试剂B
为含有水杨酸钠0.5mM、DL-苹果酸10mM、LTAC 1500ppm、PBC-44 1000ppm的水溶液。
第1试剂C
为含有水杨酸钠10mM、LTAC 2000ppm、BO-16 1000ppm的水溶液。
第1试剂D
为含有水杨酸钠10mM、LTAC 1500ppm、PBC-44 1000ppm的水溶液。
第1试剂E
为含有苯二甲酸氢钾0.5mM、DL-苹果酸10mM、LTAC2000ppm、BO-16 1000ppm的水溶液。
第1试剂F
为含有苯二甲酸氢钾2mM、DL-苹果酸10mM、LTAC 1500ppm、PBC-44 1000ppm的水溶液。
第2试剂
为由NK-338315mg溶解于乙二醇100mL中而形成的溶液。
将上述的第1试剂1mL、第2试剂20μL和血液试样(BASO试样1、2或3、或者NRBC试样1、2或3)20μL充分混合，将该混合液在40℃下使其反应10秒钟，配制测定用试样。将测定用试样导入到具有633nm激发光源的流式细胞仪的检测部，向测定用试样中的细胞照射激发光。并且，检测从该细胞发出的散射光信号和荧光信号，解析得到的信号，由此测定在测定用试样中的嗜碱性粒细胞、有核红细胞和总白血球。该测定使用自动血球计数装置XE-2100来进行。
予以说明，测定中，使用采血后经过约8小时的BASO试样1和2以及NRBC试样1和2。
对于测定用试样，绘制以前方散射光强度和荧光强度作为二轴的第1散布图、以及以前方散射光强度和侧方散射光作为二轴的第2散布图。将通过使用采血后经过约8小时的BASO试样1和2进行测定而获得的第2散布图示于图3，将通过使用采血后经过约8小时的NRBC试样1和2进行测定而获得的第1散布图示于图4。
进而，基于这些散布图，对总白血球、嗜碱性粒细胞和有核红细胞进行计数，计算出嗜碱性粒细胞比率和有核红细胞比率。表2示出在比较例1和本实施例中算出的、采血后经过8小时的BASO试样1或2的嗜碱性粒细胞比率。表3示出在比较例1和本实施例中算出的、采血后经过8小时的NRBC试样1或2的有核红细胞比率。
【表2】
【表3】
如图3所示，可以看出，当使用本实施例的试样分析用试剂时，可以将嗜碱性粒细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球明确地区分开。如图4所示，可以看出，当使用本实施例的试样分析用试剂时，可以将有核红细胞与嗜碱性粒细胞或嗜碱性粒细胞以外的白血球明确地区分开。这样，由于可以分别将嗜碱性粒细胞和有核红细胞明确地区分开，因此，如图3和4所示，将散布图中在规定区域内出现的细胞作为嗜碱性粒细胞和有核红细胞，可以正确地求出它们的个数和相对于总白血球数的比率。
另外，从表2和3看出，实施例1中算出的比率与比较例1中算出的比率为近似的值。因此，可以确认，当使用本实施例的试样分析用试剂进行测定时，可以达到与分别使用各自的试剂测定有核红细胞和嗜碱性粒细胞时同等程度的精度。
实施例2
本实施例中，使用实施例1的第1试剂和第2试剂，测定采血后经过约50小时的血液试样。关于测定方法，除了血液试样以外，均与实施例1相同。在本例的测定中，使用采血后经过约50小时的BASO试样2或3以及NRBC试样2或3。
予以说明，实施例1的第1试剂A～F中，在BASO试样2和NRBC试样2的测定中使用第1试剂A、B、E和F；在BASO试样3和NRBC试样3的测定中使用第1试剂C和D。
与实施例1同样，对于测定用试样，绘制以前方散射光强度和荧光强度作为二轴的第1散布图、以及以前方散射光强度和侧方散射光强度作为二轴的第2散布图。将通过使用采血后经过约50小时的BASO试样2进行测定而获得的第1散布图和第2散布图、以及通过使用采血后经过约50小时的NRBC试样2进行测定而获得的第1散布图示于图5。另外，将通过使用采血后经过约50小时的BASO试样3进行测定而获得的第1散布图和第2散布图、以及通过使用采血后经过约50小时的NRBC试样3进行测定而获得的第1散布图示于图6。
进而，基于这些散布图，对总白血球、嗜碱性粒细胞和有核红细胞进行计数，计算出嗜碱性粒细胞比率和有核红细胞比率。表4示出在本实施例中算出的、采血后经过50小时的BASO试样2或3的嗜碱性粒细胞比率。予以说明，表4示出基于第1散布图(前方散射光强度和荧光强度)和第2散布图(前方散射光强度和侧方散射光强度)算出的各自的嗜碱性粒细胞比率。表5示出在本实施例中算出的、采血后经过50小时的NRBC试样2或3的有核红细胞比率。
【表4】
【表5】
如图5和图6所示，可以看出，当使用本实施例的试样分析用试剂时，可以将采血后经过约50小时的试样中的嗜碱性粒细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球明确地区分开。另外，可以看出，当使用本实施例的试样分析用试剂时，可以将采血后经过约50小时的试样中的有核红细胞与嗜碱性粒细胞或嗜碱性粒细胞以外的白血球明确地区分开。这样，即使是在采血后经过一段时间的试样，也可以将嗜碱性粒细胞和有核红细胞各自明确地区分开，因此，如图5和6所示，将散布图中在规定区域内出现的细胞作为嗜碱性粒细胞和有核红细胞，可以正确地求出它们的个数和相对于总白血球数的比率。
在采用比较例1的方法测定时，采血后经过约8小时的BASO试样2的嗜碱性粒细胞比率为3.4％，采血后经过约8小时的BASO试样3的嗜碱性粒细胞比率为1.6％。进而，采血后经过约8小时的NRBC试样2的有核红细胞比率为1.9个/100WBC，采血后经过约8小时的NRBC试样3的有核红细胞比率为1.3个/100WBC。从这些比较例1的结果以及表4和表5的结果看出，实施例2中算出的比率与比较例1中算出的比率为近似的值。因此，可以确认，当使用本实施例的试样分析用试剂进行测定时，即使是对于采血后经过一段时间的试样，也能够达到与分别使用各自的试剂测定有核红细胞和嗜碱性粒细胞时同等程度的精度。
另外，从表2和表4的BASO试样2的结果看出，对于采血后经过约50小时的试样算出的嗜碱性粒细胞比率与对于采血后经过约8小时的试样算出的嗜碱性粒细胞比率为近似的值。从表3和表5的NRBC试样2的结果看出，对于采血后经过约50小时的试样算出的有核红细胞比率与对于采血后经过约8小时的试样算出的有核红细胞比率为近似的值。
从以上可以确认，当使用本实施例的试样分析用试剂进行测定时，即使是对于采血后经过一段时间的试样，也能够达到高的精度。
实施例3
本实施例中，对于作为阳离子型表面活性剂的DTAB与各种非离子型表面活性剂的组合进行研究。此处，配制下述组成的第1试剂和第2试剂。予以说明，第1试剂的pH值为3.0。
第1试剂A
为含有水杨酸钠10mM、BO-16 3000ppm和DTAB 3000ppm的水溶液。
第1试剂B
为含有水杨酸钠10mM、BO-16 7000ppm和DTAB 7000ppm的水溶液。
第1试剂C
为含有水杨酸钠10mM、PBC-44 3000ppm和DTAB 5000ppm的水溶液。
第1试剂D
为含有水杨酸钠10mM、PBC-44 7000ppm和DTAB 7000ppm的水溶液。
第1试剂E
为含有水杨酸钠10mM、BC-20TX 2000ppm和DTAB 3000ppm的水溶液。
第1试剂F
为含有水杨酸钠10mM、BC-20TX 2000ppm和DTAB 5000ppm的水溶液。
第1试剂G
为含有水杨酸钠10mM、BPSH-25 3000ppm和DTAB 7000ppm的水溶液。
第1试剂H
为含有水杨酸钠10mM、BPSH-25 7000ppm和DTAB 7000ppm的水溶液。
第1试剂I
为含有水杨酸钠10mM、HCO-50 5000ppm和DTAB 5000ppm的水溶液。
第1试剂J
为含有水杨酸钠10mM、HCO-50 7000ppm和DTAB 7000ppm的水溶液。
第1试剂K
为含有水杨酸钠10mM、HCO-20 3000ppm和DTAB 5000ppm的水溶液。
第1试剂L
为含有水杨酸钠10mM、HCO-20 7000ppm和DTAB 7000ppm的水溶液。
第1试剂M
为含有水杨酸钠10mM、CO-20TX 3000ppm和DTAB 5000ppm的水溶液。
第1试剂N
为含有水杨酸钠10mM、CO-20TX 7000ppm和DTAB 7000ppm的水溶液。
第1试剂O
为含有水杨酸钠10mM、PEN-4630 3000ppm和DTAB 5000ppm的水溶液。
第1试剂P
为含有水杨酸钠10mM、PEN-4630 5000ppm和DTAB 7000ppm的水溶液。
第2试剂
为含有NK-3383 300ppm的乙二醇。
将上述的第1试剂1mL、第2试剂20μL以及确认含有BASO或NRBC的血液试样(BASO试样4或NRBC试样4)20μL充分混合，使该混合液在41℃下反应10秒钟，配制测定用试样。与实施例1同样地使用自动血球计数装置XE-2100，测定在测定用试样中的嗜碱性粒细胞、有核红细胞和总白血球。予以说明，测定中，使用采血后经过约8小时的血液试样。
对于由BASO试样4配制的测定用试样，绘制以前方散射光强度和荧光强度作为二轴的第1散布图、以及以前方散射光强度和侧方散射光强度作为二轴的第2散布图。对于由NRBC试样4配制的测定用试样，绘制以前方散射光强度和荧光强度作为二轴的散布图。各散布图示于图7、8、9和10。
如图7～10所示，可以看出，当使用DTAB与非离子型表面活性剂组合而成的试样分析用试剂时，可以将嗜碱性粒细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球成分明确地区分开。进而可以看出，当使用DTAB与非离子型表面活性剂组合而成的试样分析用试剂时，可以将有核红细胞与嗜碱性粒细胞或嗜碱性粒细胞以外的白血球明确地区分开。
另外，从以前方散射光强度和侧方散射光强度作为二轴的第2散布图、以及以前方散射光强度和荧光强度作为二轴的第1散布图任一图中可以看出，可以将本实施例中使用的BASO试样4中所含的嗜碱性粒细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球成分明确地区分开。
这样，由于可以将嗜碱性粒细胞和有核红细胞各自明确地区分开，因此，如图7～10所示，将散布图中规定的区域内出现的细胞作为嗜碱性粒细胞和有核红细胞，可以正确地求出它们的个数和相对于总白血球数的比率。
实施例4
本实施例中，对于作为阳离子型表面活性剂的LTAC与各种非离子型表面活性剂的组合进行研究。此处，配制下述组成的第1试剂和第2试剂。予以说明，第1试剂的pH值为3.0。
第1试剂A
为含有水杨酸钠10mM、BO-16 1000ppm和LTAC 1000ppm的水溶液。
第1试剂B
为含有水杨酸钠10mM、BO-16 5000ppm和LTAC 2000ppm的水溶液。
第1试剂C
为含有水杨酸钠10mM、PBC-44 1000ppm和LTAC 1000ppm的水溶液。
第1试剂D
为含有水杨酸钠10mM、PBC-44 5000ppm和LTAC 2000ppm的水溶液。
第1试剂E
为含有水杨酸钠10mM、BC-20TX 1000ppm和LTAC 1000ppm的水溶液。
第1试剂F
为含有水杨酸钠10mM、BC-20TX 5000ppm和LTAC 2000ppm的水溶液。
第1试剂G
为含有水杨酸钠10mM、BPSH-25 1000ppm和LTAC 1500ppm的水溶液。
第1试剂H
为含有水杨酸钠10mM、BPSH-25 5000ppm和LTAC 2000ppm的水溶液。
第1试剂I
为含有水杨酸钠10mM、HCO-50 1000ppm和LTAC 1000ppm的水溶液。
第1试剂J
为含有水杨酸钠10mM、HCO-50 7000ppm和LTAC 2000ppm的水溶液。
第1试剂K
为含有水杨酸钠10mM、HCO-20 1000ppm和LTAC 1000ppm的水溶液。
第1试剂L
为含有水杨酸钠10mM、HCO-20 7000ppm和LTAC 2000ppm的水溶液。
第1试剂M
为含有水杨酸钠10mM、PEN-4630 1000ppm和LTAC 1000ppm的水溶液。
第1试剂N
为含有水杨酸钠10mM、PEN-4630 5000ppm和LTAC 1800ppm的水溶液。
第2试剂
为含有NK-3383 300ppm的乙二醇。
将上述的第1试剂1mL、第2试剂20μL以及确认含有BASO或NRBC的血液试样(BASO试样5或NRBC试样5)20μL充分混合，使该混合液在41℃下反应10秒钟，配制测定用试样。与实施例1同样地使用自动血球计数装置XE-2100，测定在测定用试样中的嗜碱性粒细胞、有核红细胞和总白血球。予以说明，测定中，使用采血后经过约8小时的血液试样。
对于由BASO试样5配制的测定用试样，绘制以前方散射光强度和荧光强度作为二轴的第1散布图、以及以前方散射光强度和侧方散射光强度作为二轴的第2散布图。对于由NRBC试样5配制的测定用试样，绘制以前方散射光强度和荧光强度作为二轴的散布图。各散布图示于图11、12、13和14。
如图11～14所示，可以看出，当使用LTAC与非离子型表面活性剂组合而成的试样分析用试剂时，可以将嗜碱性粒细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球成分明确地区分开。进而可以看出，当使用LTAC与非离子型表面活性剂组合而成的试样分析用试剂时，可以将有核红细胞与嗜碱性粒细胞或嗜碱性粒细胞以外的白血球明确地区分开。
另外，从以前方散射光强度和侧方散射光强度作为二轴的第2散布图、以及以前方散射光强度和荧光强度作为二轴的第1散布图任一图中可以看出，可以将本实施例中使用的BASO试样5中所含的嗜碱性粒细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球成分明确地区分开。
这样，由于可以将嗜碱性粒细胞和有核红细胞各自明确地区分开，因此，如图11～14所示，将散布图中规定的区域内出现的细胞作为嗜碱性粒细胞和有核红细胞，可以正确地求出它们的个数和相对于总白血球数的比率。
从实施例3和实施例4示出，通过使用阳离子型表面活性剂与非离子型表面活性剂组合而成的试样分析用试剂，可以将血液试样中的有核红细胞和嗜碱性粒细胞与其他的白血球明确地区分开，并进行计数。
实施例5
本实施例中，对于芳香族羧酸与缓冲剂的组合进行研究。此处，配制下述组成的第1试剂和第2试剂。予以说明，第1试剂的pH值为3.0。
第1试剂A
为含有苯二甲酸氢钾10mM、DL-苹果酸0mM、BO-16 1000ppm和LTAC 2000ppm的水溶液。
第1试剂B
为含有苯二甲酸氢钾5mM、DL-苹果酸5mM、BO-16 1000ppm和LTAC 2000ppm的水溶液。
第1试剂C
为含有苯二甲酸氢钾1mM、DL-苹果酸9mM、BO-16 1000ppm和LTAC 2000ppm的水溶液。
第1试剂D
为含有苯二甲酸氢钾0.3mM、DL-苹果酸9.7mM、BO-161000ppm和LTAC 2000ppm的水溶液。
第1试剂E
为含有水杨酸钠5mM、DL-苹果酸5mM、PBC-44 1000ppm和LTAC 1500ppm的水溶液。
第1试剂F
为含有水杨酸钠1mM、DL-苹果酸9mM、PBC-44 1000ppm和LTAC 1500ppm的水溶液。
第1试剂G
为含有水杨酸钠0.22mM、DL-苹果酸10mM、PBC-44 1000ppm和LTAC 1500ppm的水溶液。
第1试剂H
为含有水杨酸钠5mM、DL-苹果酸5mM、BO-16 1000ppm和LTAC 2000ppm的水溶液。
第1试剂I
为含有水杨酸钠1mM、DL-苹果酸9mM、BO-16 1000ppm和LTAC 2000ppm的水溶液。
第1试剂J
为含有水杨酸钠0.24mM、DL-苹果酸10mM、BO-16 1000ppm和LTAC 2000ppm的水溶液。
第2试剂
为含有NK-3383 300ppm的乙二醇。
将上述的第1试剂1mL、第2试剂20μL以及确认含有BASO或NRBC的血液试样(BASO试样6或NRBC试样6)20μL充分混合，使该混合液在41℃下反应10秒钟，配制测定用试样。与实施例1同样地使用自动血球计数装置XE-2100，测定在测定用试样中的嗜碱性粒细胞、有核红细胞和总白血球。予以说明，测定中，使用采血后经过约8小时的血液试样。
对于由BASO试样6配制的测定用试样，绘制以前方散射光强度和荧光强度作为二轴的第1散布图、以及以前方散射光强度和侧方散射光强度作为二轴的第2散布图。对于由NRBC试样6配制的测定用试样，绘制以前方散射光强度和荧光强度作为二轴的散布图。各散布图示于图15、16和17。
如图15～17所示，可以看出，当使用芳香族羧酸与缓冲剂组合而成的试样分析用试剂时，可以将嗜碱性粒细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球成分明确地区分开。进而可以看出，当使用芳香族羧酸与缓冲剂组合而成的试样分析用试剂时，可以将有核红细胞与嗜碱性粒细胞或嗜碱性粒细胞以外的白血球明确地区分开。
另外，以前方散射光强度和侧方散射光强度作为二轴的第2散布图、以前方散射光强度和荧光强度作为二轴的第1散布图任一图中可以看出，可以将本实施例中使用的BASO试样6中所含的嗜碱性粒细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球成分明确地区分开。
这样，由于可以将嗜碱性粒细胞和有核红细胞各自明确地区分开，因此，如图15～17所示，将散布图中规定的区域内出现的细胞作为嗜碱性粒细胞和有核红细胞，可以正确地求出它们的个数和相对于总白血球数的比率。
另外，图15中，首先确定有核红细胞集团的重心、嗜碱性粒细胞集团的重心以及嗜碱性粒细胞以外的白血球集团的重心，求出与各重心相对应的荧光强度的值，对各值进行比较(未示出数据)。予以说明，作为求出各集团重心的方法，利用公知的方法(特开平5-149863号公报)。由此可以看出，与只含有苯二甲酸的试样分析用试剂(第1试剂A)相比，使用同时含有苯二甲酸和苹果酸二者的试样分析用试剂(第1试剂B～D)的一方可以使有核红细胞的荧光强度与嗜碱性粒细胞或嗜碱性粒细胞以外的白血球的荧光强度之差变大。进而可以看出，在含有苯二甲酸和苹果酸二者的试样分析用试剂(第1试剂B～D)中，苹果酸浓度高的一方(第1试剂C和D)可以使有核红细胞的荧光强度与嗜碱性粒细胞或嗜碱性粒细胞以外的白血球的荧光强度之差变大。
这对于图16和图17的含有水杨酸和苹果酸的试样分析用试剂(第1试剂E～J)也观察到同样的倾向。从以上可以看出，通过将芳香族羧酸与缓冲剂组合，特别是可使对有核红细胞的区分性能提高。
实施例6
本实施例中，使用各种荧光色素作为第2试剂的荧光色素。此处，配制下述组成的第1试剂和第2试剂。予以说明，第1试剂的pH值为3.0。
第1试剂
为含有0.5mM苯二甲酸氢钾、10mM DL-苹果酸、1000ppm BO-16和2000ppm LTAC的水溶液。
第2试剂A
为含有NK-529 150ppm的乙二醇。
第2试剂B
为含有NK-2670 150ppm的乙二醇。
第2试剂C
为含有NK-3750 150ppm的乙二醇。
第2试剂D
为含有NK-3383 150ppm的乙二醇。
第2试剂E
为含有NK-1840 150ppm的乙二醇。
第2试剂F
为含有NK-9001 150ppm的乙二醇。
第2试剂G
为含有NK-9003 300ppm的乙二醇。
第2试剂H
为含有NK-2929 150ppm的乙二醇。
第2试剂I
为含有NK-3375 150ppm的乙二醇。
第2试剂J
为含有NK-5056 300ppm的乙二醇。
第2试剂K
为含有NK-3266 150ppm的乙二醇。
第2试剂L
为含有NK-3620 150ppm的乙二醇。
将上述的第1试剂1mL、第2试剂20μL以及确认含有BASO或NRBC的血液试样(BASO试样7或NRBC试样7)20μL充分混合，使该混合液在41℃下反应10秒钟，配制测定用试样。与实施例1同样地使用自动血球计数装置XE-2100，测定在测定用试样中的嗜碱性粒细胞、有核红细胞和总白血球。
予以说明，测定中使用采血后经过约8小时的血液试样。
对于由BASO试样7配制的测定用试样，绘制以前方散射光强度和荧光强度作为二轴的第1散布图、以及以前方散射光强度和侧方散射光强度作为二轴的第2散布图。对于由NRBC试样7配制的测定用试样，绘制以前方散射光强度和荧光强度作为二轴的散布图。各散布图示于图18、19和20。
如图18～20所示，可以看出，当使用含有任一种荧光色素的试样分析用试剂时，均可以将嗜碱性粒细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球成分明确地区分开。进而可以看出，当使用含有任一种荧光色素的试样分析用试剂时，均可以将有核红细胞与嗜碱性粒细胞或嗜碱性粒细胞以外的白血球明确地区分开。
另外，从以前方散射光强度和侧方散射光强度作为二轴的第2散布图、以及以前方散射光强度和荧光强度作为二轴的第1散布图任一图中可以看出，可以将本实施例中使用的BASO试样7中所含的嗜碱性粒细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球成分明确地区分开。
这样，由于可以将嗜碱性粒细胞和有核红细胞各自明确地区分开，因此，如图18～20所示，将散布图中规定的区域内出现的细胞作为嗜碱性粒细胞和有核红细胞，可以正确地求出它们的个数和相对于总白血球数的比率。
实施例7
苯甲酸类的研究
本实施例中，使用苯甲酸钾、4-羟基苯甲酸钠、3-羟基苯甲酸钠、4-氨基苯甲酸钾作为芳香族羧酸。此处，配制下述组成的第1试剂和第2试剂。予以说明，第1试剂的pH值为3.0。
第1试剂A
为含有2mM苯甲酸钾、8mM DL-苹果酸、1000ppm PBC-44和2500ppm LTAC的水溶液。
第1试剂B
为含有3mM苯甲酸钾、7mM DL-苹果酸、1000ppm PBC-44和2500ppm LTAC的水溶液。
第1试剂C
为含有4mM苯甲酸钾、6mM DL-苹果酸、1000ppm PBC-44和2500ppm LTAC的水溶液。
第1试剂D
为含有7mM 4-羟基苯甲酸钠、3mM DL-苹果酸、1000ppm PBC-44和2500ppm LTAC的水溶液。
第1试剂E
为含有8mM 4-羟基苯甲酸钠、2mM DL-苹果酸、1000ppm PBC-44和2500ppm LTAC的水溶液。
第1试剂F
为含有4mM 3-羟基苯甲酸钠、6mM DL-苹果酸、1000ppm PBC-44和2500ppm LTAC的水溶液。
第1试剂G
为含有5mM 3-羟基苯甲酸钠、5mM DL-苹果酸、1000ppm PBC-44和2500ppm LTAC的水溶液。
第1试剂H
为含有1mM苯甲酸钾、9mM DL-苹果酸、2000ppm BO-16和2800ppm LTAC的水溶液。
第1试剂I
为含有2mM 4-氨基苯甲酸钾、8mM DL-苹果酸、2000ppm BO-16和2800ppm LTAC的水溶液。
予以说明，第1试剂A～G以含有2mM苯二甲酸氢钾、10mM DL-苹果酸、1000ppm PBC-44和2500ppm LTAC的水溶液作为对照；第1试剂H和I以含有0.5mM苯二甲酸氢钾、10mM DL-苹果酸、2000ppm BO-16和2800ppm LTAC的水溶液作为对照。
第2试剂
为含有NK-3383 150ppm的乙二醇。
将上述的第1试剂1mL、第2试剂20μL以及确认含有BASO或NRBC的血液试样(BASO试样8和9或NRBC试样8和9)20μL充分混合，使该混合液在41℃下反应7秒钟，配制测定用试样。与实施例1同样地使用自动血球计数装置XE-2100，测定在测定用试样中的嗜碱性粒细胞、有核红细胞和总白血球。予以说明，测定中，使用采血后经过约8小时的血液试样。
对于由BASO试样8和9配制的测定用试样，绘制以前方散射光强度和荧光强度作为二轴的第1散布图、以及以前方散射光强度和侧方散射光强度作为二轴的第2散布图。对于由NRBC试样8和9配制的测定用试样，绘制以前方散射光强度和荧光强度作为二轴的散布图。各散布图示于图21和22。
如图21和22所示，可以看出，在任一种情况下，均可以将嗜碱性粒细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球成分明确地区分开。进而可以看出，在任一种情况下，均可以将有核红细胞与嗜碱性粒细胞或嗜碱性粒细胞以外的白血球明确地区分开。
另外，从以前方散射光强度和侧方散射光强度作为二轴的第2散布图、以及以前方散射光强度和荧光强度作为二轴的第1散布图任一图中可以看出，可以将本实施例中使用的BASO试样8和9中所含的嗜碱性粒细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球成分明确地区分开。
这样，由于可以将嗜碱性粒细胞和有核红细胞各自明确地区分开，因此，如图21和22所示，将散布图中规定的区域内出现的细胞作为嗜碱性粒细胞和有核红细胞，可以正确地求出它们的个数和相对于总白血球数的比率。
实施例8
苯二甲酸氢钾与苯甲酸钾的组合
在本实施例中，研究以苯二甲酸氢钾与苯甲酸钾的组合作为芳香族羧酸的情况。此处，配制下述组成的第1试剂和第2试剂。予以说明，第1试剂的pH值为3.0。
第1试剂A
为含有2mM苯二甲酸氢钾、10mM DL-苹果酸、1000ppm PBC-44和2500ppm LTAC的水溶液。
第1试剂B
为含有1.5mM苯二甲酸氢钾、0.5mM苯甲酸钾、10mM DL-苹果酸、1000ppm PBC-44和2500ppm LTAC的水溶液。
第1试剂C
为含有1.33mM苯二甲酸氢钾、0.66mM苯甲酸钾、10mM DL-苹果酸、1000ppm PBC-44和2500ppm LTAC的水溶液。
第1试剂D
为含有1mM苯二甲酸氢钾、1mM苯甲酸钾、10mM DL-苹果酸、1000ppm PBC-44和2500ppm LTAC的水溶液。
第1试剂E
为含有0.66mM苯二甲酸氢钾、1.33mM苯甲酸钾、10mM DL-苹果酸、1000ppm PBC-44和2500ppm LTAC的水溶液。
第1试剂F
为含有0.5mM苯二甲酸氢钾、1.5mM苯甲酸钾、10mM DL-苹果酸、1000ppm PBC-44和2500ppm LTAC的水溶液。
第1试剂G
为含有2mM苯甲酸钾、10mM DL-苹果酸、1000ppm PBC-44和2500ppm LTAC的水溶液。
第2试剂
为含有NK-3383 150ppm的乙二醇。
将上述的第1试剂1mL、第2试剂20μL以及确认含有BASO或NRBC的血液试样(BASO试样10或NRBC试样10)20μL充分混合，使该混合液在41℃下反应7秒钟，配制测定用试样。与实施例1同样地使用自动血球计数装置XE-2100，测定在测定用试样中的嗜碱性粒细胞、有核红细胞以及总白血球。予以说明，测定中，使用采血后经过约8小时的血液试样。
对于由BASO试样10配制的测定用试样，绘制以前方散射光强度和荧光强度作为二轴的第1散布图、以及以前方散射光强度和侧方散射光强度作为二轴的第2散布图。对于由NRBC试样10配制的测定用试样，绘制以前方散射光强度和荧光强度作为二轴的散布图。各散布图示于图23。
如图23所示，可以看出，在任一种情况下，均可以将嗜碱性粒细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球成分明确地区分开。进而可以看出，在任一种情况下，均可以将有核红细胞与嗜碱性粒细胞或嗜碱性粒细胞以外的白血球明确地区分开。
另外，从以前方散射光强度和侧方散射光强度作为二轴的第2散布图、以及以前方散射光强度和荧光强度作为二轴的第1散布图任一图中可以看出，可以将本实施例中使用的BASO试样10中所含的嗜碱性粒细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球成分明确地区分开。
当使用苯二甲酸氢钾时，具有空胞量减少的优点，当使用苯甲酸钾时，具有可使WBC分级和NRBC分级由于被明确地区分开而变得良好的优点。通过将它们混合使用，可以将嗜碱性粒细胞和有核红细胞各自更明确地区分开。
这样，由于可以将嗜碱性粒细胞和有核红细胞各自明确地区分开，因此，如图23所示，将散布图中规定的区域内出现的细胞作为嗜碱性粒细胞和有核红细胞，可以正确地求出它们的个数和相对于总白血球数的比率。
实施例9
对于采血后未经过一段时间的血液试样进行的测定
在本实施例中，使用以荧光强度作为X轴、以前方散射光强度作为Y轴的散布图，用本发明的试剂，测定采血后未经过一段时间的血液试样的NRBC和BASO二者。此处，配制下述组成的第1试剂和第2试剂。
第1试剂(溶血剂)：
为含有2mM苯二甲酸氢钾、10mM DL-苹果酸、1000ppm PBC-44和2000ppm LTAC的水溶液。予以说明，第1试剂的pH值为3.0。
第2试剂(染色液)：
为含有NK-338350ppm的乙二醇。
予以说明，作为血液试样，使用：
确认含有BASO的血液试样(BASO试样)…12检测物
确认含有NRBC的血液试样(NRBC试样)…12检测物。任一种血液试样均在采血后经过约2～7小时。
将第1试剂1mL、第2试剂20μL以及血液试样(BASO试样或NRBC试样)20μL充分混合，使该混合液在41℃下反应7秒钟，配制测定用试样。与实施例1同样地使用自动血球计数装置XE-2100，测定在测定用试样中的嗜碱性粒细胞、有核红细胞和总白血球。
对于由BASO试样或NRBC试样配制的测定用试样，绘制以前方散射光强度和荧光强度作为二轴的散布图。由BASO试样的测定结果获得的散布图之一示于图25。另外，由NRBC试样的测定结果获得的散布图之一示于图26。
从图25和图26可以看出，本发明的试剂对于采血后未经过一段时间的血液试样也同样能够区分NRBC和BASO。
在上述的散布图中，将规定区域内出现的细胞作为总白血球、嗜碱性粒细胞、有核红细胞，求出它们的数目。另外，从获得的各细胞的数目求出嗜碱性粒细胞或者有核红细胞相对于总白血球数的比率。
进而，对于相同的血液试样，通过与比较例1同样地进行操作，求出总白血球、嗜碱性粒细胞以及有核红细胞的数目、以及嗜碱性粒细胞或者有核红细胞相对于总白血球数的比率作为对照。
然后，通过使用上述试剂(第1试剂、第2试剂)进行测定而获得的结果与经过确认的上述对照的、总白血球数、嗜碱性粒细胞比率、有核红细胞比率相关的结果示于图27。予以说明，图27中，实施例9和对照的总白血球数为测定BASO试样时的结果。
从图27可以看出，使用本发明的试剂测定的结果以及对照，对于总白血球数、嗜碱性粒细胞比率和有核红细胞比率中的任一个，相关系数(r)达到0.9以上，具有很好的相关关系。由此可以看出，本发明的试剂对于采血后未经过一段时间的血液试样也同样能够测定NRBC和BASO。
本申请与2007年9月27日申请的日本国专利申请特愿2007-252666号、以及2008年3月24日申请的日本国专利申请特愿2008-76606号有关，这些专利的权利要求、说明书、附图和摘要全部作为参照引入本说明书中。
Claims (19)
1.试样分析用试剂盒，用于测定试样中的嗜碱性粒细胞和/或有核红细胞，
其中包含第1试剂和第2试剂，其中，
第1试剂含有用于使红细胞溶血并对白血球的细胞膜造成能让荧光色素透过程度的损伤的阳离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和芳香族羧酸；
第2试剂含有能够将核酸染色的荧光色素。
2.权利要求1所述的试样分析用试剂盒，其中，上述荧光色素选自通式(I)的荧光色素、以及通式(I I)的荧光色素中的至少1种：
式中，R1和R2为相互相同或不同的烷基；
R3、R4、R5和R6相互相同或不同，为氢原子或者烷基；
X-为阴离子；
式中，R7和R8相互相同或不同，为可以具有酸性基团的烷基；
R9、R10、R11和R12相互相同或不同，为氢原子或者酸性基团，
其中，R7～R12中有1个存在酸性基团；
能够在R7～R12中存在的酸性基团也可以形成盐，其中，能够在R7～R12中存在的酸性基团中必须有1个为给质子的基团。
3.权利要求2所述的试样分析用试剂盒，其中，能够存在于上述通式(II)的R7～R12中的酸性基团为磺酸基。
4.权利要求2或3所述的试样分析用试剂盒，其中，能够存在于上述通式(II)的R7～R12中的形成盐的酸性基团为碱金属盐的基团。
5.权利要求1所述的试样分析用试剂盒，其中，上述阳离子型表面活性剂为季铵盐型或者吡啶鎓盐型。
6.权利要求1所述的试样分析用试剂盒，其中，上述非离子型表面活性剂为选自聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯固化蓖麻油、聚氧乙烯甾醇、聚氧乙烯氢化甾醇中的至少1种。
7.权利要求1所述的试样分析用试剂盒，其中，上述芳香族羧酸为选自水杨酸、苯二甲酸、苯甲酸、羟基苯甲酸、氨基苯甲酸、以及它们的盐中的至少1种。
8.权利要求1所述的试样分析用试剂盒，其中，上述第1试剂的pH为酸性。
9.权利要求1所述的试样分析用试剂盒，其中，上述第1试剂含有在pH为2.0～4.5的范围内具有pKa的缓冲剂。
10.权利要求9所述的试样分析用试剂盒，其中，上述缓冲剂为选自苹果酸、柠檬酸、酒石酸、二甘醇酸、丙二酸、琥珀酸中的至少1种。
11.试样分析方法，其中包含：利用权利要求1的第1试剂，使试样中的红细胞溶血，并对血球的细胞膜造成能让荧光色素透过程度的损伤，利用权利要求1的第2试剂，将受到损伤的血球染色的工序；
向上述被染色的血球照射光，取得散射光信息和荧光信息的工序；以及
基于上述散射光信息和上述荧光信息，将上述试样中的嗜碱性粒细胞和/或有核红细胞分类并进行计数的工序。
12.权利要求11所述的方法，其中，
上述散射光信息为前方散射光信息，
上述计数工序基于上述前方散射光信息和上述荧光信息，将上述试样中的有核红细胞计数。
13.权利要求11或12所述的方法，其中，上述散射光信息为前方散射光信息，
上述计数工序基于上述前方散射光信息和上述荧光信息，将上述试样中的嗜碱性粒细胞计数。
14.权利要求11所述的方法，其中，上述散射光信息为前方散射光信息和侧方散射光信息，
上述计数工序基于上述前方散射光信息和上述侧方散射光信息，将上述试样中的嗜碱性粒细胞计数。
15.权利要求11所述的方法，其中，上述计数工序基于上述散射光信息和上述荧光信息，进而将上述试样中的白血球分类并计数。
16.权利要求15所述的方法，其中，上述散射光信息为前方散射光信息，
上述计数工序基于上述前方散射光信息和上述荧光信息，将上述试样中的白血球分类并计数。
17.试样分析用试剂盒，用于测定试样中的白血球和有核红细胞，其中包含：
含有用于使红细胞溶血的、阳离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和芳香族羧酸的第1试剂、以及
含有能够将核酸染色的荧光色素的第2试剂；
基于从被第1试剂和第2试剂处理的试样中取得的荧光信息，能够将白血球与有核红细胞区分开。
18.试样分析用试剂盒，用于测定试样中的嗜碱性粒细胞和嗜碱性粒细胞以外的白血球，其中包含：
含有用于使红细胞溶血的、阳离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和芳香族羧酸的第1试剂、以及
含有能够将核酸染色的荧光色素的第2试剂；
基于从被第1试剂和第2试剂处理的试样中取得的散射光信息，能够将嗜碱性粒细胞与嗜碱性粒细胞以外的白血球区分开。
19.试样分析用试剂盒，用于测定试样中的嗜碱性粒细胞、嗜碱性粒细胞以外的白血球、有核红细胞、以及白血球，其中包含：
含有用于使红细胞溶血的、阳离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和芳香族羧酸的第1试剂、以及
含有能够将核酸染色的荧光色素的第2试剂；
基于从被第1试剂和第2试剂处理的试样中取得的荧光信息和散射光信息，能够将嗜碱性粒细胞、嗜碱性粒细胞以外的白血球、有核红细胞、以及白血球区分开。
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