CN101709315A - 一种提高s-腺苷甲硫氨酸产量的发酵工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高S-腺苷甲硫氨酸产量的发酵工艺方法,即提高S-腺苷甲硫氨酸生产菌株酿酒酵母的S-腺苷甲硫氨酸发酵产量的方法。该方法包括:对酿酒酵母的Genome shuffling改造方法;适合S-腺苷甲硫氨酸产生的蔗糖、玉米蛋白粉等的选定以及3)发酵过程中甲硫氨酸脉冲添加等步骤,从而使得S-腺苷甲硫氨酸的微生物发酵生产产量达到27g/L的水平。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,特别涉及一种提高S-腺苷甲硫氨酸产量的发酵工艺。
背景技术
S-腺苷甲硫氨酸,英文名为S-adenosyl-L-methionine(缩写为SAM、SAMe或AdoMet),是广泛存在于细胞内参与许多关键生化反应的重要生理活性物质,参与40多种生化反应,主要作为三种代谢途径(转甲基、转硫基、转氨丙基)的前体参与体内激素、神经递质、核酸、蛋白质和磷脂的生物合成和代谢以及抗氧化剂谷胱甘肽的形成,与体内各种解毒过程关系密切,是维护细胞膜正常功能、人体正常代谢和健康不可缺少的重要生命物质。
临床研究表明,S-腺苷甲硫氨酸(SAM)对人体各组织器官乃至整体健康的发展均有重要作用:(1)保护肝脏:SAM可在体内促进抗氧化剂——胶氨基硫的产生,胶氨基硫可与有毒物质直接结合形成水溶性混合物,从而使之顺利排出人体,从而有助于减轻药品、酒精、化学毒物对肝脏的损害,改善肝硬化,并有助于抑制引发肝癌的因子;(2)改善关节炎:有助于促进软骨组织的形成和修复,减轻关节疼痛、肿胀、僵硬;(3)改善情绪:有助于促进脑部多巴胺及血清素神经递质的新陈代谢,从而提升积极情绪,改善抑郁、沮丧。(4)改善睡眠:SAM对调节睡眠的褪黑激素的合成也非常重要。(5)保健功能:SAM能帮助降低人体高半胱氨酸水平,血液中的高半胱氨酸含量过高,与心脏病、癌症、忧郁症、关节炎和其他疾病密切相关。现在SAM在临床上已被作为治疗胆汁郁积性肝病,抗忧郁和关节炎的处方药广泛应用。
腺苷蛋氨酸的应用价值已不容质疑,现生产技术的落后成为其应用的主要瓶颈,提高生产效率,降低生产成本成为SAM进一步开发的重要研究方向。
发明内容
本发明提供一种提高S-腺苷甲硫氨酸产量的发酵工艺,它可以有效地克服现有生产工艺的缺陷,具有生产菌株生长量大,转化率高,培养条件简单和价格低廉等特点,为在工业生产中应用提供了基础。
本发明的技术方案是这样实现的:
(1)发酵菌株的选择:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ATCC44857,ATCC60593,ATCC66103和ATCC76625菌株之一;
(2)发酵菌株的Genome shuffling改造:将上述菌株分别接种到固体斜面培养基上,pH 6.2-6.8;30-35℃,培养18-24小时后,接种液体培养基,pH6.2-6.8;30-35℃,120-180rpm摇床培养18-24小时,获得4个菌株的液体培养物;
以上4个菌株的液体培养物各取5ml离心收集菌体细胞,分别装在4个50ml无菌离心管中,然后向每个离心管中都加入10ml ST溶液,pH7.4,震荡5分钟,离心弃上清;然后加入蜗牛酶混合液,pH7.4,恒温震荡水浴37℃60-100rpm,震荡20-30分钟,离心弃上清,获得原生质体;
原生质体用10ml ST溶液洗涤三次;然后合并4个离心管的原生质体到一个离心管中,加入30ml PTC溶液,pH7.5,恒温震荡水浴35-37℃ 60-80rpm震荡30-40分钟,进行原生质体融合,融合结束后,离心弃上清得沉淀为融合原生质体,用ST溶液洗涤三次;最后在离心管中加入40ml ST溶液制成轻微震荡制成悬液,菌悬液涂布固体再生培养基,pH5.5-6.2;30℃,培养48小时,用无菌小铲刮取固体再生培养基上的所有菌体混合在一起制备原生质体,再进行原生质体融合,融合原生质体涂布再生平板;如此重复3-5轮;最后一轮获得的再生菌株分别进行液体发酵后利用步骤5的方法评估其液体发酵SAM的产量;SAM产量为10-12g/L的改造菌株;
(3)发酵培养条件的优化:将获得改造菌株接种固体斜面培养基,培养基成分同上,30℃,培养24小时后,接种液体发酵培养基,发酵容器为300ml三角瓶,内装100ml培养基,培养温度为30℃,摇床转速为120rpm,培养24小时;获得液体发酵液;
(4)综合消除底物对菌株发酵生产能力的影响:将上述菌株接种固体斜面培养基,培养基成分同上,30℃,培养2天后,接种液体发酵培养基,30℃,120rpm摇床培养24小时;发酵过程中,脉冲补加DL-甲硫氨酸,发酵容器为300ml三角瓶,内装100ml培养基,培养温度为30℃,摇床转速为120rpm,脉冲补加方式为发酵培养1-12小时每隔30分钟补加一次,每次补加0.05-0.2g甲硫氨酸,12-24小时每隔10分钟补加一次,每次补加0.1-0.4g甲硫氨酸;培养结束后获得液体发酵液。
(5)SAM的定量分析:将步骤3或4获得液体发酵液每个都取3ml,置于5ml离心管中,4000rpm,离心10min,去上清液,收集菌体,加入浓度为20%的高氯酸4.5mL,振荡30min后,12000rpm,离心10min,取上清液,用0.45μm微孔滤膜过滤作为HPLC分析的样品,利用高效液相色谱仪获得HPLC谱图,在HPLC谱图上SAM保留时间处具有较大的峰面积代表SAM产量较高的改造菌株,HPLC分析条件为:色谱柱为AT LiCHROMC18反相柱;检测波长为260nm;流动相的制备方法为取4.7g甲酸铵,用750mL纯净水溶解后,与250mL甲醇混匀,加入1g辛烷磺酸钠,然后用乙酸调pH为4;流速为1ml/min;进样量为10μL;SAM的保留时间为12.3min;
(6)SAM的提取纯化:将100ml发酵液3000-4000rpm,离心10-15min收集细胞;然后用20-30ml乙酸乙酯处理15min,再用25-35mL 0.35M硫酸处理15-20min;3000-4000rpm,离心10min;取上清液的下层水相慢慢滴入50-80ml无水甲醇溶液中,置于冰箱内4℃下放置18-24h;取出冷藏的溶液过滤,滤渣冷冻干燥即得纯化的SAM。
所述的固体培养基的成分为:酵母膏3-5g/L,蛋白胨8-10g/L,葡萄糖15-20g/L,琼脂15-20g/L。
所述的液体培养基成分为:酵母膏3-5g/L,蛋白胨8-10g/L,葡萄糖15-20g/L。
所述的ST溶液的成分为1mol/L山梨醇,0.01mol/L Tris-HCl。
所述的蜗牛酶混合液的成分是1mol/L山梨醇,0.01mol/L Tris-HCl,0.01mol/L EDTA,蜗牛酶20g/L。
所述的PTC溶液的成分是1mol/L山梨醇,0.01mol/L Tris-HCl,0.01mol/L CaCl2,350g/L PEG6000。
所述的固体再生培养基的成分为葡萄糖15-20g/L,酵母膏8-10g/L,盐酸腺嘌呤0.2-0.4g/L,蛋白胨15-20g/L,山梨醇150-180g/L,琼脂15-20g/L。
所述的液体发酵培养基的成分为:碳源为糊精、土豆淀粉、玉米淀粉、葡聚糖、甘露糖、蔗糖,含量均为50g/L;氮源为大豆蛋白胨、水解乳蛋白、玉米蛋白粉、酵母粉、蛋白胨、KNO3、NH4SO4,含量均为3g/L,磷酸二氢钠2g/L,磷酸氢二钠2g/L,MgSO4·7H2O 0.1 g/L,FeSO4·7H2O 0.1g/L,CaCl2 0.1g/L,MnCl2 0.1g/L,DL-甲硫氨酸10g/L。
所述的液体发酵培养基的成分为:蔗糖50g/L,玉米蛋白粉5g/L,磷酸二氢钠2g/L,磷酸氢二钠2g/L,MgSO4·7H2O 0.1g/L,FeSO4·7H2O 0.1g/L,CaCl2 0.1g/L,MnCl2 0.1g/L,甲硫氨酸10g/L。
所述的固体培养基成分为:酵母膏5g/L,蛋白胨10g/L,葡萄糖20g/L,琼脂20g/L。
液体培养基成分为:酵母膏5g/L,蛋白胨10g/L,葡萄糖20g/L。
所述的液体发酵培养基的碳源为蔗糖。
所述的液体培养基的氮源为玉米蛋白粉。
所述的在发酵培养1-24小时期间甲硫氨酸的每次添加量为0.1g。
所述的在发酵培养24-48小时期间甲硫氨酸的每次添加量为0.2g。
表1的结果显示生产菌株改造前后的SAM的产量。本项技术的创造性在于:利用工业微生物菌株分子改造技术改良SAM发酵生产菌株。本项技术获得的结果是使酿酒酵母的SAM产量提高了5倍。
表1
表2是不同碳源对改造菌株的SAM产量的影响。其中糊精、葡聚糖、甘露糖、蔗糖对SAM的产生有明显的促进作用。
表2
表3是不同氮源对改造菌株的SAM产量的影响。其中玉米蛋白粉、大豆蛋白胨、水解乳蛋白、酵母粉对SAM的产生有明显的促进作用。
表3
表2和表3的结果获得的蔗糖和玉米蛋白粉使酿酒酵母发酵产生SAM的产量提高50%-60%。本项技术的创造性在于:获得的培养基使酿酒酵母发酵产生SAM的产量提高,同时培养基的来源更为便宜易得,为工业化发酵奠定了基础。
表4为不同脉冲补料策略对SAM产量的影响。结果显示发酵不同时间段补加甲硫氨酸将有效提高SAM产量。其中发酵培养1-24小时每隔30分钟补加一次,每次补加0.1g甲硫氨酸,24-48小时每隔10分钟补加一次,每次补加0.2g甲硫氨酸效果最好。
表4
表4的结果显示脉冲补加甲硫氨酸能提高菌株产生SAM的能力,其中最优添加量能提高产量达50%,效果显著。本技术的创造性在于使用的脉冲补料法不同于常规的一次性补料和连续补料,这种补料法显著消除了底物对菌株发酵生产产物的反馈抑制作用,提高了酿酒酵母生产SAM的产量。
附图说明
图1提纯获得的S-腺苷甲硫氨酸的HPLC分析谱图;
图2液体发酵液的S-腺苷甲硫氨酸的HPLC分析谱图;
下面结合附图对本发明的内容作进一步详细说明。
具体实施方式
参照图1所示,说明该方法能够获得纯化的SAM。
参照图2所示,说明能够通过该方法确定发酵液中的SAM含量。横坐标为保留时间,纵坐标为光吸收值。
实施例1:
(1)发酵菌株选择酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ATCC44857。
(2)发酵菌株的Genome shuffling改造:将上述菌株接种到固体斜面培养基上,固体培养基的成分为:酵母膏5g/L,蛋白胨10g/L,葡萄糖20g/L,琼脂20g/L,pH 6.2;30℃,培养24小时后,接种液体培养基,液体培养基的成分为:酵母膏5g/L,蛋白胨10g/L,葡萄糖20g/L,pH 6.2;30℃,120rpm摇床培养24小时,以上4个菌株的液体培养物各取5ml离心收集菌体细胞,分别装在4个50ml无菌离心管中。然后向每个离心管中都加入10mlST溶液,ST溶液的成分为1mol/L山梨醇,0.01mol/L Tris-HCl,pH7.4,震荡5分钟,离心弃上清;然后加入蜗牛酶混合液,蜗牛酶混合液的成分是1mol/L山梨醇,0.01mol/L Tris-HCl,0.01mol/L EDTA,蜗牛酶20g/L,pH7.4,恒温震荡水浴37℃ 60rpm震荡30分钟,离心弃上清,获得原生质体;原生质体用10ml ST溶液洗涤三次;然后合并4个离心管的原生质体到一个离心管中,加入30ml PTC溶液,PTC溶液的成分是1mol/L山梨醇,0.01mol/LTris-HCl,0.01mol/L CaCl2,350g/L PEG6000,pH7.5,恒温震荡水浴37℃60rpm震荡40分钟,进行原生质体融合,融合结束后,离心弃上清得沉淀为融合原生质体,用ST溶液洗涤三次;最后在离心管中加入40ml ST溶液制成轻微震荡制成悬液。菌悬液涂布固体再生培养基,固体再生培养基的成分为葡萄糖20g/L,酵母膏10g/L,盐酸腺嘌呤0.4g/L,蛋白胨20g/L,山梨醇180g/L,琼脂20g/L,pH5.5;30℃,培养48小时,用无菌小铲刮取固体再生培养基上的所有菌体混合在一起制备原生质体,再进行原生质体融合,融合原生质体涂布再生平板;如此重复3轮;最后一轮获得的再生菌株分别进行液体发酵后利用步骤5的方法评估其液体发酵SAM的产量。
(3)发酵培养条件的优化:将步骤2获得改造菌株接种固体斜面培养基,培养基成分同上,30℃,培养24小时后,接种液体发酵培养基,液体发酵培养基的成分为:蔗糖50g/L,玉米蛋白粉3g/L,磷酸二氢钠2g/L,磷酸氢二钠2g/L,MgSO4·7H2O 0.1g/L,FeSO4·7H2O 0.1g/L,CaCl2 0.1g/L,MnCl2 0.1g/L,DL-甲硫氨酸10g/L;发酵容器为300ml三角瓶,内装100ml培养基,培养温度为30℃,摇床转速为120rpm,培养24小时。
(4)综合消除底物对菌株发酵生产能力的影响:将上述菌株接种固体斜面培养基,培养基成分同上,30℃,培养2天后,接种液体发酵培养基,液体发酵培养基的成分为:蔗糖50g/L,玉米蛋白粉5g/L,磷酸二氢钠2g/L,磷酸氢二钠2g/L,MgSO4·7H2O 0.1g/L,FeSO4·7H2O 0.1g/L,CaCl2 0.1g/L,MnCl2 0.1g/L,甲硫氨酸10g/L;30℃,120rpm摇床培养24小时;发酵过程中,脉冲补加DL-甲硫氨酸。发酵容器为300ml三角瓶,内装100ml培养基,培养温度为30℃,摇床转速为120rpm。脉冲补加方式为发酵培养1-12小时每隔30分钟补加一次,每次补加0.05g甲硫氨酸,12-24小时每隔10分钟补加一次,每次补加0.1g甲硫氨酸。
(5)SAM的定量分析:液体发酵结束后,取发酵液3ml,置于5ml离心管中,4000rpm,离心10min,去上清液,收集菌体,加入浓度为20%的高氯酸4.5mL,振荡30min后,12000rpm,离心10min,取上清液,用0.45μm微孔滤膜过滤作为HPLC分析的样品。HPLC分析条件为:色谱柱为AT LiCHROM C18反相柱;检测波长为260nm;流动相的制备方法为取4.7g甲酸铵,用750mL纯净水溶解后,与250mL甲醇混匀,加入1g辛烷磺酸钠,然后用乙酸调pH为4;流速为1ml/min;进样量为10μL;SAM的保留时间为12.3min。获得SAM的最高产量为21g/L。
实施例2:
(1)发酵菌株选择酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ATCC44857。
(2)发酵菌株的Genome shuffling改造:将上述菌株接种到固体斜面培养基上,固体培养基的成分为:酵母膏5g/L,蛋白胨10g/L,葡萄糖20g/L,琼脂20g/L,pH 6.2;30℃,培养24小时后,接种液体培养基,液体培养基的成分为:酵母膏5g/L,蛋白胨10g/L,葡萄糖20g/L,pH 6.2;30℃,120rpm摇床培养24小时,以上4个菌株的液体培养物各取5ml离心收集菌体细胞,分别装在4个50ml无菌离心管中。然后向每个离心管中都加入10mlST溶液,ST溶液的成分为1mol/L山梨醇,0.01mol/L Tris-HCl,pH7.4,震荡5分钟,离心弃上清;然后加入蜗牛酶混合液,蜗牛酶混合液的成分是1mol/L山梨醇,0.01mol/L Tris-HCl,0.01mol/L EDTA,蜗牛酶20g/L,pH7.4,恒温震荡水浴37℃60rpm震荡30分钟,离心弃上清,获得原生质体;原生质体用10ml ST溶液洗涤三次;然后合并4个离心管的原生质体到一个离心管中,加入30ml PTC溶液,PTC溶液的成分是1mol/L山梨醇,0.01mol/LTris-HCl,0.01mol/L CaCl2,350g/L PEG6000,pH7.5,恒温震荡水浴37℃60rpm震荡40分钟,进行原生质体融合,融合结束后,离心弃上清得沉淀为融合原生质体,用ST溶液洗涤三次;最后在离心管中加入40ml ST溶液制成轻微震荡制成悬液。菌悬液涂布固体再生培养基,固体再生培养基的成分为葡萄糖20g/L,酵母膏10g/L,盐酸腺嘌呤0.4g/L,蛋白胨20g/L,山梨醇180g/L,琼脂20g/L,pH5.5;30℃,培养48小时,用无菌小铲刮取固体再生培养基上的所有菌体混合在一起制备原生质体,再进行原生质体融合,融合原生质体涂布再生平板;如此重复4轮;最后一轮获得的再生菌株分别进行液体发酵后利用步骤5的方法评估其液体发酵SAM的产量。
(3)发酵培养条件的优化:将步骤2获得改造菌株接种固体斜面培养基,培养基成分同上,30℃,培养24小时后,接种液体发酵培养基,液体发酵培养基的成分为:蔗糖50g/L,玉米蛋白粉3g/L,磷酸二氢钠2g/L,磷酸氢二钠2g/L,MgSO4·7H2O 0.1g/L,FeSO4·7H2O 0.1g/L,CaCl2 0.1g/L,MnCl2 0.1g/L,DL-甲硫氨酸10g/L;发酵容器为300ml三角瓶,内装100ml培养基,培养温度为30℃,摇床转速为120rpm,培养24小时。
(4)综合消除底物对菌株发酵生产能力的影响:将上述菌株接种固体斜面培养基,培养基成分同上,30℃,培养2天后,接种液体发酵培养基,液体发酵培养基的成分为:蔗糖50g/L,玉米蛋白粉5g/L,磷酸二氢钠2g/L,磷酸氢二钠2g/L,MgSO4·7H2O 0.1g/L,FeSO4·7H2O 0.1g/L,CaCl2 0.1g/L,MnCl2 0.1g/L,甲硫氨酸10g/L;30℃,120rpm摇床培养24小时;发酵过程中,脉冲补加DL-甲硫氨酸。发酵容器为300ml三角瓶,内装100ml培养基,培养温度为30℃,摇床转速为120rpm。脉冲补加方式为发酵培养1-12小时每隔30分钟补加一次,每次补加0.1g甲硫氨酸,12-24小时每隔10分钟补加一次,每次补加0.2g甲硫氨酸。
(5)SAM的定量分析:液体发酵结束后,取发酵液3ml,置于5ml离心管中,4000rpm,离心10min,去上清液,收集菌体,加入浓度为20%的高氯酸4.5mL,振荡30min后,12000rpm,离心10min,取上清液,用0.45μm微孔滤膜过滤作为HPLC分析的样品。HPLC分析条件为:色谱柱为AT LiCHROM C18反相柱;检测波长为260nm;流动相的制备方法为取4.7g甲酸铵,用750mL纯净水溶解后,与250mL甲醇混匀,加入1g辛烷磺酸钠,然后用乙酸调pH为4;流速为1ml/min;进样量为10μL;SAM的保留时间为12.3min。获得SAM的最高产量为24g/L。
实施例3:
(1)发酵菌株选择酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ATCC44857。
(2)发酵菌株的Genome shuffling改造:将上述菌株接种到固体斜面培养基上,固体培养基的成分为:酵母膏5g/L,蛋白胨10g/L,葡萄糖20g/L,琼脂20g/L,pH 6.2;30℃,培养24小时后,接种液体培养基,液体培养基的成分为:酵母膏5g/L,蛋白胨10g/L,葡萄糖20g/L,pH 6.2;30℃,120rpm摇床培养24小时,以上4个菌株的液体培养物各取5ml离心收集菌体细胞,分别装在4个50ml无菌离心管中。然后向每个离心管中都加入10mlST溶液,ST溶液的成分为1mol/L山梨醇,0.01mol/L Tris-HCl,pH7.4,震荡5分钟,离心弃上清;然后加入蜗牛酶混合液,蜗牛酶混合液的成分是1mol/L山梨醇,0.01mol/L Tris-HCl,0.01mol/L EDTA,蜗牛酶20g/L,pH7.4,恒温震荡水浴37℃60rpm震荡30分钟,离心弃上清,获得原生质体;原生质体用10ml ST溶液洗涤三次;然后合并4个离心管的原生质体到一个离心管中,加入30ml PTC溶液,PTC溶液的成分是1mol/L山梨醇,0.01mol/LTris-HCl,0.01mol/L CaCl2,350g/L PEG6000,pH7.5,恒温震荡水浴37℃60rpm震荡40分钟,进行原生质体融合,融合结束后,离心弃上清得沉淀为融合原生质体,用ST溶液洗涤三次;最后在离心管中加入40ml ST溶液制成轻微震荡制成悬液。菌悬液涂布固体再生培养基,固体再生培养基的成分为葡萄糖20g/L,酵母膏10g/L,盐酸腺嘌呤0.4g/L,蛋白胨20g/L,山梨醇180g/L,琼脂20g/L,pH5.5;30℃,培养48小时,用无菌小铲刮取固体再生培养基上的所有菌体混合在一起制备原生质体,再进行原生质体融合,融合原生质体涂布再生平板;如此重复5轮;最后一轮获得的再生菌株分别进行液体发酵后利用步骤5的方法评估其液体发酵SAM的产量。
(3)发酵培养条件的优化:将步骤2获得改造菌株接种固体斜面培养基,培养基成分同上,30℃,培养24小时后,接种液体发酵培养基,液体发酵培养基的成分为:蔗糖50g/L,玉米蛋白粉3g/L,磷酸二氢钠2g/L,磷酸氢二钠2g/L,MgSO4·7H2O 0.1g/L,FeSO4·7H2O 0.1g/L,CaCl2 0.1g/L,MnCl2 0.1g/L,DL-甲硫氨酸10g/L;发酵容器为300ml三角瓶,内装100ml培养基,培养温度为30℃,摇床转速为120rpm,培养24小时。
(4)综合消除底物对菌株发酵生产能力的影响:将上述菌株接种固体斜面培养基,培养基成分同上,30℃,培养2天后,接种液体发酵培养基,液体发酵培养基的成分为:蔗糖50g/L,玉米蛋白粉5g/L,磷酸二氢钠2g/L,磷酸氢二钠2g/L,MgSO4·7H2O 0.1g/L,FeSO4·7H2O 0.1g/L,CaCl2 0.1g/L,MnCl2 0.1g/L,甲硫氨酸10g/L;30℃,120rpm摇床培养24小时;发酵过程中,脉冲补加DL-甲硫氨酸。发酵容器为300ml三角瓶,内装100ml培养基,培养温度为30℃,摇床转速为120rpm。脉冲补加方式为发酵培养1-12小时每隔30分钟补加一次,每次补加0.1g甲硫氨酸,12-24小时每隔10分钟补加一次,每次补加0.2g甲硫氨酸。
(5)SAM的定量分析:液体发酵结束后,取发酵液3ml,置于5ml离心管中,4000rpm,离心10min,去上清液,收集菌体,加入浓度为20%的高氯酸4.5mL,振荡30min后,12000rpm,离心10min,取上清液,用0.45μm微孔滤膜过滤作为HPLC分析的样品。HPLC分析条件为:色谱柱为AT LiCHROM C18反相柱;检测波长为260nm;流动相的制备方法为取4.7g甲酸铵,用750mL纯净水溶解后,与250mL甲醇混匀,加入1g辛烷磺酸钠,然后用乙酸调pH为4;流速为1ml/min;进样量为10μL;SAM的保留时间为12.3min。获得SAM的最高产量为27g/L。
Claims (9)
1.一种提高S-腺苷甲硫氨酸产量的发酵工艺,其特征在于,包括以下步骤:
(1)发酵菌株的选择:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ATCC44857,ATCC60593,ATCC66103和ATCC76625菌株之一;
(2)发酵菌株的Genome shuffling改造:将上述菌株分别接种到固体斜面培养基上,pH 6.2-6.8;30-35℃,培养18-24小时后,接种液体培养基,pH6.2-6.8;30-35℃,120-180rpm摇床培养18-24小时,获得4个菌株的液体培养物;
以上4个菌株的液体培养物各取5ml离心收集菌体细胞,分别装在4个50ml无菌离心管中,然后向每个离心管中都加入10ml ST溶液,pH7.4,震荡5分钟,离心弃上清;然后加入蜗牛酶混合液,pH7.4,恒温震荡水浴37℃60-100rpm,震荡20-30分钟,离心弃上清,获得原生质体;
原生质体用10ml ST溶液洗涤三次;然后合并4个离心管的原生质体到一个离心管中,加入30ml PTC溶液,pH7.5,恒温震荡水浴35-37℃ 60-80rpm震荡30-40分钟,进行原生质体融合,融合结束后,离心弃上清得沉淀为融合原生质体,用ST溶液洗涤三次;最后在离心管中加入40ml ST溶液制成菌悬液,菌悬液涂布固体再生培养基,pH5.5-6.2;30℃,培养48小时,用无菌小铲刮取固体再生培养基上的所有菌体混合在一起制备原生质体,再进行原生质体融合,融合原生质体涂布再生平板;以上重复3-5轮;最后一轮获得的再生菌株分别进行液体发酵后利用步骤5的方法评估其液体发酵SAM的产量;SAM产量为10-12g/L的改造菌株;
(3)发酵培养条件的优化:将获得改造菌株接种固体斜面培养基,培养基成分同上,30℃,培养24小时后,接种液体发酵培养基,发酵容器为300ml三角瓶,内装100ml培养基,培养温度为30℃,摇床转速为120rpm,培养24小时;获得液体发酵液;
(4)综合消除底物对菌株发酵生产能力的影响:将上述菌株接种固体斜面培养基,培养基成分同上,30℃,培养2天后,接种液体发酵培养基,30℃,120rpm摇床培养24小时;发酵过程中,脉冲补加DL-甲硫氨酸,发酵容器为300ml三角瓶,内装100ml培养基,培养温度为30℃,摇床转速为120rpm,脉冲补加方式为发酵培养1-12小时每隔30分钟补加一次,每次补加0.05-0.2g甲硫氨酸,12-24小时每隔10分钟补加一次,每次补加0.1-0.4g甲硫氨酸;培养结束后获得液体发酵液。
(5)SAM的定量分析:将步骤3或4获得液体发酵液每个都取3ml,置于5ml离心管中,4000rpm,离心10min,去上清液,收集菌体,加入浓度为20%的高氯酸4.5mL,振荡30min后,12000rpm,离心10min,取上清液,用0.45μm微孔滤膜过滤作为HPLC分析的样品,利用高效液相色谱仪获得HPLC谱图,在HPLC谱图上SAM保留时间处具有较大的峰面积代表SAM产量较高的改造菌株,HPLC分析条件为:色谱柱为AT LiCHROMC18反相柱;检测波长为260nm;流动相的制备方法为取4.7g甲酸铵,用750mL纯净水溶解后,与250mL甲醇混匀,加入1g辛烷磺酸钠,然后用乙酸调pH为4;流速为1ml/min;进样量为10μL;SAM的保留时间为12.3min;
(6)SAM的提取纯化:将100ml发酵液3000-4000rpm,离心10-15min收集细胞;然后用20-30ml乙酸乙酯处理15min,再用25-35mL 0.35M硫酸处理15-20min;3000-4000rpm,离心10min;取上清液的下层水相慢慢滴入50-80ml无水甲醇溶液中,置于冰箱内4℃下放置18-24h;取出冷藏的溶液过滤,滤渣冷冻干燥即得纯化的SAM。
2.根据权利要求1所述的一种提高S-腺苷甲硫氨酸产量的发酵工艺,其特征在于,所述的固体培养基的成分为:酵母膏3-5g/L,蛋白胨8-10g/L,葡萄糖15-20g/L,琼脂15-20g/L。
3.根据权利要求1所述的一种提高S-腺苷甲硫氨酸产量的发酵工艺,其特征在于,所述的液体培养基成分为:酵母膏3-5g/L,蛋白胨8-10g/L,葡萄糖15-20g/L。
4.根据权利要求1所述的一种提高S-腺苷甲硫氨酸产量的发酵工艺,其特征在于,所述的ST溶液的成分为1mol/L山梨醇,0.01mol/L Tris-HCl。
5.根据权利要求1所述的一种提高S-腺苷甲硫氨酸产量的发酵工艺方法,其特征在于,所述的蜗牛酶混合液的成分是1mol/L山梨醇,0.01mol/LTris-HCl,0.01mol/L EDTA,蜗牛酶20g/L。
6.根据权利要求1所述的一种提高S-腺苷甲硫氨酸产量的发酵工艺,其特征在于,所述的PTC溶液的成分是1mol/L山梨醇,0.01mol/L Tris-HCl,0.01mol/L CaCl2,350g/L PEG6000。
7.根据权利要求1所述的一种提高S-腺苷甲硫氨酸产量的发酵工艺,其特征在于,所述的固体再生培养基的成分为葡萄糖15-20g/L,酵母膏8-10g/L,盐酸腺嘌呤0.2-0.4g/L,蛋白胨15-20g/L,山梨醇150-180g/L,琼脂15-20g/L。
8.根据权利要求1所述的一种提高S-腺苷甲硫氨酸产量的发酵工艺,其特征在于,所述的液体发酵培养基的成分为:碳源为糊精、土豆淀粉、玉米淀粉、葡聚糖、甘露糖、蔗糖,含量均为50g/L;氮源为大豆蛋白胨、水解乳蛋白、玉米蛋白粉、酵母粉、蛋白胨、KNO3、NH4SO4,含量均为3g/L,磷酸二氢钠2g/L,磷酸氢二钠2g/L,MgSO4·7H2O 0.1g/L,FeSO4·7H2O 0.1g/L,CaCl2 0.1g/L,MnCl2 0.1g/L,DL-甲硫氨酸10g/L。
9.根据权利要求1所述的一种提高S-腺苷甲硫氨酸产量的发酵工艺,其特征在于,所述的液体发酵培养基的成分为:蔗糖50g/L,玉米蛋白粉5g/L,磷酸二氢钠2g/L,磷酸氢二钠2g/L,MgSO4·7H2O 0.1g/L,FeSO4·7H2O0.1g/L,CaCl2 0.1g/L,MnCl2 0.1g/L,甲硫氨酸10g/L。
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