CN103882080A

CN103882080A - 一种制备阿维菌素的有效方法

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Publication number: CN103882080A
Application number: CN201410098148.3A
Authority: CN
Inventors: 钟娟; 谭红; 周金燕; 舒丹; 罗笛; 杨杰; 肖亮
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2014-03-17
Filing date: 2014-03-17
Publication date: 2014-06-25

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种阿维菌素（Avermectin）的制备方法。本发明将能够产生阿维菌素的阿维链霉菌菌株及其遗传改良菌，在第一级液体培养基中培养,然后作为种子液接种到第二级液体培养基中；第二级液体培养基接种种子液后进行发酵培养及流加丙酸钠前体的补料培养。发酵结束后，从发酵培养液中收集阿维菌素B1a。本发明具有生产效率高的特点。

Description

一种制备阿维菌素的有效方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种制备阿维菌素的有效方法。

背景技术

阿维菌素（Avermectin）是阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）次级代谢合成的一组结构相似的十六元大环内酯类抗生素，具有广谱、高效的杀虫、杀螨活性，由8个组分组成，即阿维菌素A1a，A2a，，B2a，A1b，A2b，B1b，B2b，其中，阿维菌素B1a的活性最高。

由于阿维菌素具有活性高、杀虫谱广、无持久性残留、对环境安全、化学结构独特易于改造等优点，已成为生物农药开发研制的热点。1985年，阿维菌素作为农用杀虫剂正式推向市场，在世界范围内广泛应用于蔬菜、果树、大田作物、园林等植物害虫、害螨的防治，取得了令人瞩目的成效。1999年，阿维菌素已成为了世界第21大畅销农药，第4大畅销杀虫剂，是目前最主要的新型生物杀虫、杀螨剂，与苏云金杆菌Bt号称世界两大生物农药，已经成为农业部推荐使用的高效低毒的农兽药产品。近年来的研究表明，阿维菌素不仅能杀死结核杆菌，包括耐药结核杆菌，而且具有抗肿瘤的功效，对肿瘤细胞的抗药性也有一定的抑制作用，这预示着阿维菌素或可用于研发新的抗肺结核和抗肿瘤药物，所以阿维菌素在农、畜、医三个方面均具有较高的应用价值和广阔的市场前景。

到目前为止，阿维菌素被普遍认为是继青霉素以来对人类具有重大贡献的新型抗生素，市场需求量大，自1995年以来，阿维菌素原药每年以50％左右的速度递增，产能逐年放大。在我国，阿维菌素的开发、研制及工业化生产一直被列为国家重点科技攻关项目，已有好几家制药公司在进行阿维菌素的生产，但是我国的阿维菌素生产企业，生产菌种的产率较低，并且发酵工艺技术落后。因此，亟需提高菌种产量水平，优化发酵生产工艺，提高发酵单位，进一步降低生产成本。

本发明人在对一株阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）进行遗传改良后发现，突变株Streptomyces avermitilis AW-H1具有高产阿维菌素的特性。

随后，本发明人对利用阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）发酵制备阿维菌素的工艺参数和技术方法进行了研究，获得了一种通过补充丙酸钠前体提高阿维菌素产量的技术方法，因此完成了本发明。

发明内容

本发明的目的：

本发明的目的之一，是提供一种用于生产阿维菌素的新菌株；

本发明的目的之二，是提供一种通过流加丙酸钠作为菌株合成阿维菌素的前体物质，发酵生产阿维菌素；

本发明的目的之三，是提供用于生产阿维菌素的培养基。

更具体地说，本发明提供一种制备阿维菌素的有效方法，包含以下步骤：

将能够产生阿维菌素的放线菌在一级液体培养基(例如,下文所述的培养基A)中培养，作为种子液；所述的放线菌主要是阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)及其遗传改良菌株。

将在第一级液体培养基中培养好的种子液接种到第二级液体培养基（例如，下文所述的培养基B）中培养；第二级液体培养基接种第一级种子液后培养一段合适的时间，开始流加一定浓度的丙酸钠作为菌株合成阿维菌素的前体物质，提高阿维菌素的产量。

发酵结束后，从上述发酵培养液中收集阿维菌素。

本发明的具体实施方案是，采用产生阿维菌素的阿维链霉菌菌种及其遗传改良菌在液体培养基中进行二级发酵培养，在每级发酵阶段选用不同的培养基。在第二级发酵中，以适合于第二级发酵的液体培养基，例如下文所述的培养基B，作为发酵培养基。接种第一级种子液后，在适合的温度下培养一段时间，例如，在25℃—35℃发酵培养5-30小时后，流加丙酸钠。

丙酸钠的流加方式可以采用连续（匀速或非匀速）流加和/或间歇式流加方式，连续（匀速或非匀速）流加方式是优选的。

所述的连续（匀速或非匀速）流加方式，是以一定的流加速率（匀速或非匀速）将一定浓度的丙酸钠，连续流加入第二级发酵罐中，至发酵第120小时停止流加。

所述的间歇式流加方式，是以间隔一段时间加一次料的方式，间歇式将一定浓度的丙酸钠，流加入第二级发酵罐中。间歇时间优选为每隔5-20小时补料1-5次，更优选为大约间隔10小时补料1-2次。本领域技术人员也可以根据需要，采用其他的适合时间间隔补料。

发酵条件：温度25℃—35℃，PH：4-7

发酵时间：11-13天

发酵结束后，将发酵液过滤后保留的菌丝体用有机溶剂萃取法、硅胶柱层析法、浓缩结晶法等提取后，即得阿维菌素产品。

采用高效液相色谱法检测阿维菌素，所用条件：色谱柱HC-C184.6×250mm；流动相为甲醇：水=88：12（0.5%冰乙酸）；流速1mL/min；检测波长245nm。

采用本发明工艺，在第二级发酵时，流加一定浓度的丙酸钠，可以补充阿维菌素合成的丙酸钠前体，从而提高阿维菌素的产量。

在优选的具体实施方案中，本发明还采用例如新菌株等技术方案来进一步提高阿维菌素的产量。

在优选的本发明方法中，本发明特别提供一株用于生产阿维菌素的阿维链霉菌的遗传改良菌株Streptomyces avermitilis AW-H1；其已于2013年3月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No.7319，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明二级发酵所采用的培养基A、B，其具体组成如下：

培养基A（g/mL）：玉米淀粉0.3%-5.0%，α-淀粉酶1u/100mL-10u/100mL，豆粕粉0.1%-1.5%，酵母膏0.05%-1.5%，花生饼粉0.3%-2.0%，氯化钴0.05%-0.5%。

培养基B（g/mL）：

成分	一般范围	优选范围
			玉米粉	0.01%-15.0%	0.02%-10.0%
可溶性淀粉	0.001%-10.0%	0.005%-5.0%
			玉米淀粉	5.0%-25.0%	10.0%-20.0%
黄豆粉	0.001%-3.0%	0.005%-1.0%
			豆粕粉	0.05%-10.0%	0.5-5.0%
花生饼粉	0.001%-2.0%	0.005%-1.5%
			酵母膏	0.001%-2.0%	0.005%-1.0%
酵母粉	0.05%-5.0%	0.1%-3.0%
			硫酸锰	0.001%-0.05%	0.002%-0.03%
硫酸铵	0.001%-2.0%	0.005%-0.5%
			磷酸氢二钾	0.0001%-1.0%	0.0005%-0.01%
氯化钴	0.0005%-0.01%	0.001%-0.006%
			氯化钠	0.0001%-1.0%	0.0002%-0.05%
钼酸钠	0.001%-0.01%	0.0015%-0.005%
			α-淀粉酶	10u/100mL-100u/100mL	20u/100mL-50u/100mL
碳酸钙	0.005%-3.0%	0.01%-1.5%

本发明优选实施方案的发酵工艺全过程为:

将活化后的阿维链霉菌菌种接种于培养基A中,固体培养或装于三角瓶内25℃—35℃摇瓶培养24—40小时后，以5%--20%的接种量接种于已加有灭菌培养基B的发酵罐中进行发酵生产。菌种接种于第二级发酵罐后于25℃—35℃，优选27℃—32℃发酵培养5—30小时后，开始流加一定浓度的丙酸钠。

丙酸钠的流加补料方式有两种，一种是连续（匀速或非匀速）流加，一种是间歇式流加，连续流加方式是优选的。

采用连续流加方式时，以0.001—10.0L/h的速度连续（匀速或非匀速）流加丙酸钠（1mmol/L-100mmol/L），于发酵培养第120小时停止流加。

采用间歇式流加丙酸钠（1mmol/L-100mmol/L）时，间歇时间可为每隔5-20小时补料1-5次，优选为大约间隔10小时补料1-2次，每次补料量为发酵液总体积的0.001%—0.6%，优选0.01%—0.2%。

发酵条件：温度25℃—35℃，PH：4-7

发酵时间：11-13天本发明的全工艺流程见附图1。

采用本发明工艺，菌株以较高的底物转化率和产物合成速率生产阿维菌素，阿维菌素有效组分B1a的产量可达8200ug/mL以上。

在优选的本发明方法中，特别提供一株用于生产阿维菌素的阿维链霉菌的遗传改良菌株Streptomyces avermitilis AW-H1；其已于2013年3月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No.7319。

本发明具有的优点：

一、本发明提供的一株阿维链霉菌的遗传改良菌株Streptomyces avermitilis AW-H1生产阿维菌素的能力强，用该菌株制备阿维菌素，可以提高生产阿维菌素的效率。

二、流加一定浓度的丙酸钠进行补料发酵，可以补充阿维菌素合成所需的丙酸钠前体，大幅提高阿维菌素的产量。

附图说明

附图为阿维菌素发酵生产的流程图。

具体实施方式

实施例1

用500mL三角瓶10个，每瓶装150mL培养基A（玉米淀粉3.0%，α-淀粉酶6u/100mL，豆粕粉0.8%，酵母膏0.4%，花生饼粉1.0%，氯化钴0.3%），于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)AW-H1菌液，置于28℃温度下，摇瓶培养32小时。将培养好的菌种液按5％－10％的接种量接种于内装20L灭菌培养基B的50L发酵罐中，（培养基B:玉米粉0.04%，可溶性淀粉0.01%，玉米淀粉14.0%，黄豆粉0.008%，豆粕粉2.8%，花生饼粉0.006%，酵母膏0.008%，酵母粉1.0%，硫酸锰0.0072%，硫酸铵0.025%，磷酸氢二钾0.0008%，氯化钴0.002%，氯化钠0.0003%，钼酸钠0.023%，α-淀粉酶28u/100mL，碳酸钙0.08%），在27℃—32℃温度下，通气搅拌发酵8—20小时后，以0.01—1.0L/h的速度连续流加丙酸钠（5mmol/L），于发酵培养第120小时停止流加。发酵PH4-7，发酵周期12天。

经检测，经过12天发酵，阿维菌素产量可达到8400ug/mL发酵液，产品回收率达85％以上。

实施例2

用500mL三角瓶12个，每瓶装150mL培养基A（玉米淀粉4.0%，α-淀粉酶8u/100mL，豆粕粉1.0%，酵母膏0.4%，花生饼粉0.8%，氯化钴0.2%），于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)AW-H1菌液，置于28℃温度下，摇瓶培养32小时。将培养好的菌种液按5％－10％的接种量接种于内装20L灭菌培养基B的50L发酵罐中，（培养基B:玉米粉0.08%，可溶性淀粉0.02%，玉米淀粉12.0%，黄豆粉0.02%，豆粕粉3.0%，花生饼粉0.01%，酵母膏0.01%，酵母粉1.5%，硫酸锰0.0024%，硫酸铵0.02%，磷酸氢二钾0.001%，氯化钴0.0025%，氯化钠0.001%，钼酸钠0.025%，α-淀粉酶30u/100mL，碳酸钙0.08%），在27℃—32℃温度下，通气搅拌发酵8—20小时后，间歇式流加丙酸钠 (10mmol/L)，间歇时间为大约间隔10小时补料1次，每次补料量为发酵液总体积的0.01%-0.1%，于发酵培养第120小时停止流加。发酵PH4-7，发酵周期12天。

经检测，经过12天发酵，阿维菌素产量可达到8200ug/mL发酵液，产品回收率达85％以上。

实施例3

用500mL三角瓶10个，每瓶装150mL培养基A（玉米淀粉4.0%，α-淀粉酶8u/100mL，豆粕粉1.0%，酵母膏0.5%，花生饼粉1.0%，氯化钴0.2%），于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)AW-12（本实验室保存）菌液，置于28℃温度下，摇瓶培养32小时。将培养好的菌种液按5％－10％的接种量接种于内装20L灭菌培养基B的50L发酵罐中（培养基B:玉米粉0.06%，可溶性淀粉0.008%，玉米淀粉16.0%，黄豆粉0.01%，豆粕粉3.0%，花生饼粉0.02%，酵母膏0.02%，酵母粉1.5%，硫酸锰0.003%，硫酸铵0.025%，磷酸氢二钾0.002%，氯化钴0.002%，氯化钠0.0008%，钼酸钠0.023%，α-淀粉酶40u/100mL，碳酸钙0.1%），在27℃—32℃温度下，通气搅拌发酵8—20小时后，以0.01—1.0L/h的速度连续流加丙酸钠(10mmol/L)，直至发酵培养第120小时停止流加。发酵PH4-7，发酵周期12天。

经检测，经过12天发酵，阿维菌素产量可达到5000ug/mL发酵液，产品回收率达80％以上。

Claims

1.一种制备阿维菌素的有效方法，包含如下步骤：

将能够产生阿维菌素的放线菌在第一级液体培养基中培养，所述的放线菌是阿维链霉菌的遗传改良菌株Streptomyces avermitilis AW-H1；

将在第一级液体培养基中培养好的第一级种子液接种到第二级液体培养基上进行发酵培养，在适合的条件下培养一段时间后，流加一定浓度的丙酸钠，进行流加补料发酵培养。发酵结束后，从上述发酵培养液中收集阿维菌素B1a。第一级为种子液培养，所用培养基为液体培养基A,第二级为发酵培养，所用培养基为液体培养基B。

2.权利要求1所述制备阿维菌素的方法，其特征是：所述菌种为阿维链霉菌的遗传改良菌株Streptomyces avermitilis AW-H1，CGMCC No.7319。

3.根据权利要求1所述制备阿维菌素的方法，其特征是：培养基的具体组成如下：

培养基A：

玉米淀粉0.3%-5.0%，α-淀粉酶1u/100mL-10u/100mL，豆粕粉0.1%-1.5%，酵母膏0.05%-1.5%，花生饼粉0.3%-2.0%，氯化钴0.05%-0.5%。

培养基B：

玉米粉0.02%-10.0%，可溶性淀粉0.005%-5.0%，玉米淀粉10.0%-20.0%，黄豆粉0.005%-1.0%，豆粕粉0.5%-5.0%，花生饼粉0.005%-1.5%，酵母膏0.005%-1.0%，酵母粉0.1%-3.0%，硫酸锰0.002%-0.03%，硫酸铵0.005%-0.5%，磷酸氢二钾0.0005%-0.01%，氯化钴0.001%-0.006%，氯化钠0.0002%-0.05%，钼酸钠0.0015%-0.005%，α-淀粉酶20u/100mL-50u/100mL，碳酸钙0.01%-1.5%。

4.根据权利要求1所述制备阿维菌素的方法，其特征是：流加丙酸钠的方式为连续流加方式和/或间歇式流加方式。

5.根据权利要求4所述制备阿维菌素的方法，其特征是：连续流加方式为匀速或非匀速连续流加方式，以0.001—10.0L/h的速度连续流加丙酸钠（1mmol/L-100mmol/L），至发酵第120小时停止流加。

6.根据权利要求4所述制备阿维菌素的方法，其特征是：间歇式流加丙酸钠（（1mmol/L-100mmol/L）的间歇时间可为每隔5-20小时补料1-5次，优选为大约间隔10小时补料1-2次，每次补料量为发酵液总体积的0.001%—0.6%，优选0.01%—0.2%。