CN102329826A - 利用CO2培养微藻生产富含必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸油脂的方法 - Google Patents
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Abstract
利用CO2培养微藻生产亚油酸和α-亚麻酸油脂的方法，包括以下步骤：(1)采用特定筛选培养***、特定培养基，高效、耐高CO2浓度、耐高温条件下进行抗污染藻种的筛选和驯化；(2)利用CO2培养驯化后的微藻；(3)以微藻细胞为原料提取富含亚油酸和α-亚麻酸的油脂。本发明将电厂废气排放的CO2转化为可供微藻生长吸收的物质，获得高生物量的藻细胞并生产高价值的必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸油脂。不仅降低CO2的排放，缓解温室效应，能够将其转化为高附加值的亚油酸和α-亚麻酸油脂，并且可以获得较高的油脂产率并且维持亚油酸和α-亚麻酸的含量在60％以上的水平，不仅保证必需脂肪酸油脂的品质还降低生产其的成本。
Description
技术领域
本发明属于可再生生物资源领域，涉及利用CO2培养微藻生产富含必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸油脂的方法。
背景技术
温室气体过量排放导致的全球气候变暖已成为各国政府、学术界以及企业界关注的焦点之一。据***气候变化署的数据统计，目前温室气体主要是CO2，占76.7％。国际上对气候变化的关注导致了***气候变化框架公约(UNFCCC)的问世，并于2005年实施的《京都议定书》对各国承担温室气体特别是CO2减排的义务进行了明确规定。目前，欧美等国家已经开始征收CO2排放税，并通过清洁发展机制(Clean Development Mechanism，CDM)项目向发展中国家提供资金和技术进行CO2排放权交易。实施CO2减排项目至少可以获得两方面的效益：一是可通过CDM项目获得不菲经济效益；二是减少CO2排放量可以改善当地气候条件，具有相当重要的环境效益和社会效益。因此，在满足社会发展的能源需求的基础上，有效控制CO2排放，已成为各国所要解决的重大项目之一。
光合微生物能够利用无机碳用于生长因此能吸收CO2转化为生物量。CO2生物固定方法也是目前地球上最重要和最有效的碳固定方法。因为微藻大多数是专性光合自养生物，利用无机碳通过光合作用转化为生物质，其光合作用强度大大超过同等质量的植物的代谢总量。因此，通过微藻光合作用固定CO2被认为是一种可行的和环境友好的技术。另外微藻具有生长周期短、生长速度快、CO2固碳率高、必需脂肪酸含量高、环境耐受性强、培养不占用耕地等特点被认为是必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸油脂生产最有潜力的原料之一。
亚油酸和α-亚麻酸是人和动物健康必需却又普遍缺乏，急需补充的一种必需营养素。其中亚油酸具有降低血脂、软化血管、降低血压、促进微循环的作用，可预防或减少心血管病的发病率，特别是对高血压、高血脂、心绞痛、冠心病、动脉粥样硬化、老年性肥胖症等的防治极为有利，能起到防止人体血清胆固醇在血管壁的沉积，有“血管清道夫”的美誉，具有防治动脉粥样硬化及心血管疾病的保健效果。α-亚麻酸是构成细胞膜和生物酶的基础物质，对人体健康起决定性作用。在动物体内通过脱饱和、增加双键和延长碳链转变成高等动物细胞的必需成分并具有防止心血管等疾病重要生理功能的二十碳五烯酸(EPA)和二十碳六烯酸(DHA)而发挥其重要的生理功能。α-亚麻酸有调节血脂、预防心肌梗塞和脑梗塞、降低血粘度、增加血液携氧量、对胰岛素抵抗和糖尿病、降血压、减肥、抑制过敏反应、抗炎、保护视力、增强智力等作用。美国FDA研究证明：缺乏α-亚麻酸将导致儿童大脑及视网膜发育迟缓，注意力不能集中，营养不均衡，不能有效吸收，直接导致：智力发育迟缓，动作不协调，视力弱，多动症，肥胖，厌食，发育缓慢，免疫力低下等30多种症状和疾病。
目前关于必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸生产的专利主要是集中在利用各种陆地植物作为原料生产亚油酸和α-亚麻酸。但是由于这些方法的基础原料都是粮食和油料作物，这些陆生植物生长周期长，生长慢，对土地要求比较高，长期效益不高。另外会产生与人争地、粮食危机等一系列问题，不利于人类的可持续发展。利用藻类生产γ-亚麻酸目前只有一个专利号为03113398.3、发明名称为“从藻类提取、制备、纯化γ-亚麻酸甲酯的工艺”的中国专利，其主要着重于利用有机溶剂和超临界CO2萃取的方法从藻细胞中提取出γ-亚麻酸。关于利用CO2培养微藻生产必需脂肪酸油脂方面的专利还是一片空白。
发明内容
综合考虑以上各方面，我们设计了一种利用微藻吸收废气中的CO2作为碳源生产富含亚油酸和α-亚麻酸油脂的方法。微藻进行光合作用吸收CO2后，经过自身的代谢作用，可以在细胞内转化为脂类物质(如脂肪酸)，然后将成熟的微藻细胞通过有机萃取法提取出富含亚油酸和α-亚麻酸的油脂。这不仅大大降低了碳排放，对环境起到了很好的改善作用，而且可以有效降低微藻的培养成本，同时也填补了利用微藻来生产富含必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸油脂的技术空缺，为生物质的全面开发和综合利用提供了一个新的途径。因此我们可以利用吸收CO2作为碳源进行生长，获得的藻细胞生产富含亚油酸和α-亚麻酸油脂，使得这项研究同时具有减少碳排放和生产高价值和高附加值有用物质的潜力。
因此，本发明的目的在于利用CO2培养微藻生产必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸的方法，具体来说，本发明的具体过程包括为高效、耐高CO2浓度、耐高温及抗污染藻种的筛选和驯化，然后再将驯化后的微藻放入特定的培养基和特定培养***中通入不同浓度CO2进行培养，利用培养获得的微藻细胞通过有机萃取法提取获得富含必需脂肪酸的亚油酸和α-亚麻酸油脂，最后利用响应面复合中心分析优化获得最佳培养条件。
本发明的利用CO2培养微藻生产富含亚油酸和α-亚麻酸油脂的方法，包括以下步骤：
(1)采用特定筛选培养装置、特定培养基，高效、耐高CO2浓度、耐高温条件下进行抗污染藻种的筛选和驯化；
(2)利用CO2培养驯化后的微藻；
(3)以微藻细胞为原料提取富含亚油酸和α-亚麻酸的油脂。
所述(1)中的特定筛选培养***包括光生物反应器和配气***，所述光生物反应器是通气瓶，所述光生物反应器的数量为1-12个，所述通气瓶连接所述配气***，所述配气***是提供不同CO2浓度的装置，其利用调节空气和CO2的流量比来提供不同CO2浓度。
所述通气瓶的容积为500mL-1L。
所述配气***同时向所述光生物反应器分别提供从0.03％-50％的不同CO2浓度来筛选微藻，提供的筛选CO2浓度因藻种不同而不同。
在所述步骤(1)中特定的培养基主要是改良后去除碳源Na2CO3的改良BG11培养基。改良BG11培养基的配方(每升)如下：1mg Na2EDTA、36mg CaCl2·2H2O、75mgMgSO4·7H2O、40mg K2HPO4·3H2O、2.86mg H3BO3、1.81mg MnCl2·4H2O、0.222mgZnSO4·7H2O、0.079mg CuSO4·5H2O、0.05mg CoCl2·6H2O、0.391mg NaMoO4·2H2O和1500mgNaNO3。
在所述步骤(1)中的筛选和驯化方法为利用高浓度CO2筛选和驯化微藻，提高微藻的高浓度CO2耐受度和高温耐受度。CO2浓度范围为0.03％-50％，优选10％；驯化温度范围为20-40℃，优选30℃；光照强度范围为4000lux-10000lux，优选8000lux；通气流量范围为0.1-1vvm，优选0.5vvm；培养基pH范围为6.0-7.5，优选7.0。具体优选参数因藻种不同而不同。
所述抗污染藻种选自蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、月芽藻(Selenastrumcapricornutum)、沙角衣藻(Chlamydomonas sajao)、斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)、链丝藻(Hormidium sp.)、水华束丝藻(Aphanizo menon flos-aquae)和集球藻(Palmellococcus chodat)中的一种。
在所述步骤(2)中在特定BG11培养基中通入不同浓度的CO2进行培养微藻。接种密度范围为0.02-0.1g/L，优选0.05g/L；光照强度范围为7000lux-9000lux，优选8000lux；CO2浓度范围为0.03％-50％，优选10％；通气流量范围为0.25-1vvm，优选0.5vvm；培养温度范围为20-30℃，优选25℃；培养基pH范围为6.0-7.5，优选7.0。具体优选参数因藻种不同而不同。
在所述步骤(3)中采用有机萃取法以微藻细胞为原料通过多次萃取得富含亚油酸和α-亚麻酸的油脂，其中有机提取溶剂为氯仿∶甲醇(2∶1)或正己烷，用量为每1g藻细胞20-80mL氯仿∶甲醇(2∶1)有机提取剂，优选60mL氯仿∶甲醇(2∶1)有机提取剂；正己烷用量为每1g藻细胞20-100mL正己烷，优选80mL正己烷；反应温度20-40℃，优选25℃；反应时间5-60分钟，优选30分钟；萃取次数为1-6次，优选3次。然后浓缩(即进行旋蒸回收有机提取剂)得到油脂，所述油脂进一步利用GC-MS进行分析，主要含3种脂肪酸：亚油酸、α-亚麻酸和棕榈酸，其中两种必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸的含量分别为13-20.7％和40-48.4％。
所述方法还进一步包括利用响应面分析优化培养条件。响应面分析实验主要使用Minitab15软件，采用中心复合设计法进行实验设计，独立变量是二氧化碳浓度和光照强度，响应变量是生物量。接种密度范围为0.02-0.1g/L，优选0.05g/L；光照强度范围为2000lux-10000lux，优选7500lux；CO2浓度范围为0.03％-40％，优选10％；通气流量范围为0.25-1vvm，优选0.5vvm；培养温度范围为20-30℃，优选25℃；培养基pH范围为6.0-7.5，优选7.0。
采用本发明方法，不仅可以利用电厂废气排放的CO2作为微藻培养的碳源，达到了节能减排，缓解温室效应的效果，而且又可以降低生物柴油生产的成本，另外产生高附加值的必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸。另一方面，通过有机萃取的方法，可以获得较高的油脂产率并且维持亚油酸和α-亚麻酸的含量在60％以上的水平，不仅这保证必需脂肪酸油脂的品质还降低了生产必需脂肪酸油脂的成本。电厂废气CO2的浓度一般为10％，通过本案的实施，在此条件下，微藻的总油脂含量为19.3％，其中亚油酸和α-亚麻酸的含量分别为19％和41.54％，因此利用电厂废气CO2培养微藻生产亚油酸和α-亚麻酸的收率可达3.66％和8％。这对于电厂废气CO2的综合利用和高价值必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸的生产都是具有积极意义的。
附图说明
图1表示通入不同浓度的CO2进行培养，斜生栅藻的生物量随培养时间的变化。
其中，横坐标为时间，纵坐标为斜生栅藻的生物量，□表示CO2浓度为0.03％、■表示CO2浓度为5％、○表示CO2浓度为10％、●表示CO2浓度为20％、△表示CO2浓度为30％、▲表示CO2浓度为50％。数据为3次平行取样的平均值。
图2表示在不同浓度CO2下，斜生栅藻的固碳速率随培养时间的变化。
其中，横坐标为时间，纵坐标为斜生栅藻的固碳速率，□表示CO2浓度为0.03％、■表示CO2浓度为5％、○表示CO2浓度为10％、●表示CO2浓度为20％、△表示CO2浓度为30％、▲表示CO2浓度为50％。数据为3次平行取样的平均值。
图3表示不同CO2浓度对斜生栅藻油脂含量的影响。
其中，横坐标为CO2浓度，纵坐标为斜生栅藻的油脂含量，数据为3次平行取样的平均值。
图4表示不同CO2浓度对斜生栅藻各种脂肪酸含量的影响。
其中，横坐标为CO2浓度，纵坐标为斜生栅藻的各种脂肪酸含量，数据为3次平行取样的平均值。
图5表示二氧化碳和光强交互影响斜生栅藻生物量的响应面图。
其中，纵坐标为斜生栅藻的生物量，水平的2个坐标分别为CO2浓度和光强度。
图6表示二氧化碳和光强交互影响斜生栅藻生物量的等值线图。
其中，横坐标为CO2浓度，纵坐标为光强度。
具体实施方式
以下描述只是以实例的方式对优选实施方案的说明，而非意图对本发明进行限制。
实施例1
(1)特定筛选培养***的构建：从市场上购买250L光照培养箱、6个空气流量计、6个CO2流量计、CO2气体测量仪、空气泵、CO2钢瓶、通气管、过滤膜、特制配气支架、特制通气培养瓶，组装构成一套能够同时提供6种不同CO2浓度的藻种筛选培养和驯化装置。
(2)特定培养基的制备：由于主要是CO2作物碳源，为了驯化微藻对CO2的偏好性，我们配置的特定培养基主要是去除碳源Na2CO3的BG11培养基。并按每升1mg Na2MGEDTA、36mg CaCl2·2H2O、75mg MgSO4·7H2O、40mg K2HPO4·3H2O、2.86mg H3BO3、1.81mg MnCl2·4H2O、0.222mg ZnSO4·7H2O、0.079mg CuSO4·5H2O、0.05mg CoCl2·6H2O、0.391mgNaMoO4·2H2O和1500mg NaNO3.的用量配置特定培养基，调节pH值至7。培养基分装于1L通气培养瓶中，每瓶800mL，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。
(3)高效、耐高CO2浓度、耐高温及抗污染藻种的筛选和驯化：分别将蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、月芽藻(Selenastrum capricornutum)、沙角衣藻(Chlamydomonassajao)、斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)、链丝藻(Hormidium sp.)、水华束丝藻(Aphanizo menonflos-aquae)和集球藻(Palmellococcus chodat)分别接种于已灭菌的特定培养基中，然后置于前面提到的筛选和驯化装置中进行筛选和培养，通入6种不同的CO2浓度：0.03％、5％、10％、20％、30％、50％，经过筛选培养，选出斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)能够在高CO2浓度和较高培养温度下快速生长，生物量最大，然后再对斜生栅藻进行一段时间的驯化。经过3-5代的驯化，斜生栅藻已经适应了在无碳源培养基中利用通入的高浓度CO2快速稳定生长。
(4)利用CO2培养驯化后的微藻：将驯化后的斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)进行培养，将小球藻接种于新的特制无碳源BG11培养基中，保持初始的接种密度在0.5g/L左右；由于电厂废气CO2浓度范围为5％-15％，所以我们选择10％CO2；培养温度为30±1℃；光照强度为8000lux左右；通气流量为0.25vvm左右；培养基pH值为7.0左右。每隔1天平行取样3次同时用分光光度计测定和干重法测定斜生栅藻的生物量。培养14天后当生物量达到1.84g/L，然后将培养液在8000rpm下离心5分钟，收集藻细胞冷冻干燥后，置于研钵内轻轻压碎，得到干燥的藻粉。
(5)以微藻细胞为原料提取富含亚油酸和α-亚麻酸的油脂：采用有机提取溶剂为氯仿：甲醇(2∶1)或正己烷，氯仿∶甲醇(2∶1)有机提取剂得用量为每1g藻细胞60mL；正己烷用量为每1g藻细胞80mL正己烷；反应温度为25℃；反应时间为30分钟；萃取数次，然后进行旋蒸回收有机提取剂，得到的油脂再利用GC-MS进行分析，主要含3种脂肪酸：亚油酸、α-亚麻酸和棕榈酸。其中两种必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸的含量分别达19％和41.54％。
实施例2-6
以与实例1相似的方法进行试验，除了在培养驯化后的斜生栅藻的通入CO2浓度分别为0.03％、5％、10％、20％、30％、50％，其他参数不变。
图1表明在5％和10％浓度的CO2下斜生栅藻的生物量最大。图2表明在5％和10％浓度的CO2下斜生栅藻的对CO2的固碳速率最大。图3表明在50％浓度的CO2下斜生栅藻的油脂含量最高。图4表明在0.03％、5％、10％、20％、30％、50％CO2浓度下，亚油酸的含量分别是13％、20.65％、19％、19.14％、13.43％、13.34％；而和α-亚麻酸的含量分别是43.35％、40％、41.54％、40.67％、48.44％、48.23％，因此在5％以上浓度的CO2斜生栅藻的必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸的总含量较高，都大于60％。
实施例7
采用响应面分析优化培养条件，响应面分析实验主要使用Minitab 15软件，采用中心复合设计法(是Minitab软件中的分析方法)进行实验设计，表1是指响应面实验的因素和水平编码值，独立变量是二氧化碳浓度和光照强度，响应变量是生物量。中心复合试验设计及结果如表2所示。接种密度为0.05g/L；独立变量光照强度范围为2000lux-10000lux；独立变量二氧化碳浓度范围为0.03％-40％；通气流量为0.5vvm；培养温度为30±1℃；培养基pH为7.0±0.1。图5和图6分别是利用响应面二氧化碳和光强交互影响斜生栅藻生物量的响应面图及等值线图，表明斜生栅藻的生物量在电厂废气二氧化碳浓度6％-25％区间，光强区间7.3-9.8klux内达到最高，其中最佳条件是在10％二氧化碳和7500lux光强。
表1
表2
综上所述，微藻吸收CO2作为碳源生产富含必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸油脂的方法，不仅可以利用电厂废气排放的CO2作为微藻培养的碳源，达到了节能减排，缓解温室效应的效果，而且又可以降低生物柴油生产的成本，另外产生含量高于60％的高附加值的必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸。也填补了利用CO2培养微藻来生产富含必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸油脂的技术空缺，为生物质的全面开发和综合利用提供了一个新的途径这对于电厂废气CO2的综合利用和高价值必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸油脂的生产都是具有积极意义的。
此处所涉及及参考的专利和公开通过参考全部并入此处，包括所有的图和表。
Claims (10)
1.利用CO2培养微藻生产富含必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸油脂的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)采用特定筛选培养***、特定培养基，高效、耐高CO2浓度、耐高温条件下进行抗污染藻种的筛选和驯化；
(2)利用CO2培养驯化后的微藻；
(3)以微藻细胞为原料提取富含亚油酸和α-亚麻酸的油脂。
2.权利要求1所述的利用CO2培养微藻生产富含必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸油脂的方法，其特征在于所述(1)中的特定筛选培养***包括光生物反应器和配气***，所述光生物反应器是通气瓶，所述光生物反应器的数量为1-12个，所述通气瓶连接所述配气***，所述配气***是提供不同CO2浓度的装置，其利用调节空气和CO2的流量比来提供不同CO2浓度。
3.根据权利要求2所述的利用CO2培养微藻生产富含必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸油脂的方法，其特征在于，所述CO2浓度的范围是0.03％-50％，当所述光生物反应器的数量大于1个，所述配气***同时向所述光生物反应器分别提供不同CO2浓度来筛选微藻，提供的筛选CO2浓度因藻种不同而不同。
4.根据权利要求1所述的利用CO2培养微藻生产富含必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸油脂的方法，其特征在于所述(1)中特定培养基为去除Na2CO3碳源的改良BG11培养基。
5.权利要求1所述的利用CO2培养微藻生产富含必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸油脂的方法，其特征在于所述(1)中高浓度CO2、高温筛选和驯化微藻的筛选和驯化CO2浓度范围为0.03％-50％；驯化温度范围为20-40℃；光照强度范围为4000lux-10000lux；通气流量范围为0.1-1vvm；培养基pH范围为6.0-7.5。
6.权利要求5所述的利用CO2培养微藻生产富含必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸油脂的方法，其特征在于所述CO2浓度范围为10％，所述驯化温度范围为30℃，所述光照强度范围为8000lux，所述通气流量范围为0.5vvm，所述培养基pH范围为7.0。
7.权利要求1所述的利用CO2培养微藻生产富含必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸油脂的方法，其特征在于所述抗污染藻种选自蛋白核小球藻、月芽藻、沙角衣藻、斜生栅藻、链丝藻、水华束丝藻和集球藻中的一种。
8.权利要求1所述的利用CO2培养微藻生产富含必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸油脂的方法，其特征在于所述(2)中培养的微藻为斜生栅藻，初始的接种密度为0.5g/L，CO2浓度为10％，培养温度为30±1℃，光照强度为8000lux，通气流量为0.25vvm，培养基pH值为6.9-7.2，每隔1天平行取样3次同时测定斜生栅藻的生物量，培养14天后当生物量达到1.84g/L，然后将培养液在8000rpm下离心5分钟，收集藻细胞冷冻干燥后，置于研钵内压碎，得到干燥的藻粉。
9.权利要求1所述的利用CO2培养微藻生产富含必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸油脂的方法，其特征在于所述(3)中采用有机提取溶剂进行提取，所述有机提取溶剂为氯仿：甲醇或正己烷，氯仿∶甲醇的体积比为2∶1，该混合有机提取剂的用量为每1g干燥藻粉60mL有机提取剂；正己烷用量为每1g藻细胞80mL正己烷；萃取，然后浓缩得到油脂，所述油脂进一步利用GC-MS进行分析，其中两种必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸的含量分别为13-20.7％和40-48.4％。
10.权利要求1所述的利用CO2培养微藻生产富含必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸油脂的方法，其特征在于所述方法还进一步包括利用响应面中心复合分析优化培养条件，所述培养条件优化利用二氧化碳浓度和光照强度作为独立变量，生物量作为响应变量进行响应面中心复合实验设计，其中接种密度为0.05g/L；光照强度范围为2000lux-10000lux；CO2浓度范围为0.03％-40％；通气流量为0.5vvm；培养温度为30℃；培养基pH为7.0。
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