CN101397540B

CN101397540B - 一种生产星形孢菌素的培养基及其方法

Info

Publication number: CN101397540B
Application number: CN2007100463696A
Authority: CN
Inventors: 张海红; ***; 张琴
Original assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Current assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Priority date: 2007-09-25
Filing date: 2007-09-25
Publication date: 2011-03-30
Anticipated expiration: 2027-09-25
Also published as: CN101397540A

Abstract

本发明公开了一种适用于培养星形孢菌素产生菌以生产星形孢菌素的培养基，pH为7.0，包含碳源、有机氮源和无机盐，其中无机盐包括钙盐，所述的选自以下A、B、C三组成分中的两种或以上碳源，其中至少两种成分选自不同组，A组：葡萄糖，B组：可溶性淀粉、玉米淀粉和土豆淀粉，C组：燕麦和麦芽糊精；和/或，所述的有机氮源选自豆粕粉、酵母提取物、酵母膏和棉籽饼粉；和/或，所述的无机盐中还添加镁盐。本发明还公开一种采用所述培养基从星形孢菌素产生菌中生产星形孢菌素的方法。采用本发明的发酵培养基生产星形孢菌素，星形孢菌素产生菌菌体生长快，菌丝不易结团，发酵产物产率高，相对效价是优化以前的培养基的230％。

Description

一种生产星形孢菌素的培养基及其方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于培养星形孢菌素产生菌以生产星形孢菌素的培养基及其方法。

背景技术

星形孢菌素(staurosporine，以下简称STS)是日本学者S.QMURA等在1977年从Saccharothrix staurosporeus AM-2282发酵产物中分离得到的(Omura S，Iwai Y，Hirano A，et al.A new alkaloid AM-2282 of Streptomycesorigin：taxonomy，fermentation，isolation and preliminary characterization.J.Antibiot，1977，30(4)：275-282)，以后陆续在放线菌(Actinomycetes)科的Streptomyces属Streptomyces hygroscopicus、Streptomyces actuosus；Saccharothrix属、Actinomadura属、Nocarda属等菌的发酵产物中也得到了STS。STS的化学结构式如下所示。

STS是一种广谱非特异性蛋白激酶C抑制剂，可强有力地抑制蛋白激酶C和其他大部分激酶(包括酪氨酸蛋白激酶)。它通过阻断磷酸二酯键从DNA转移到活化的酪氨酸位点而直接抑制拓普异构酶II的活性。可用于抵抗酵母和真菌引起的许多感染性疾病，抑制细胞增殖，诱导细胞程序性死亡，废除细胞周期检查点，抑制血管增生等。还具有极强的抗肿瘤活性，在临床上对12种人肿瘤细胞平均IC50为0.016μg/ml。它的抗菌谱为各种霉菌和酵母菌等，对细菌作用不明显(U.S.Patent 4735039)。

化学家用有机合成法合成了大量STS的结构类似物，其活性也越来越强，目前已有几种作为抗癌药物在美国和日本进入临床研究阶段。如何高效地生产星形孢菌素正受到越来越多的关注。

U.S.4107297公布了利用星孢链霉菌发酵生产STS的过程：从斜面培养基上取一环星形孢菌素产生菌Saccharothrix staurosporeus AM-2282(或Streptomyces actuosus；Streptomyces diastaticus等)接种于含种子培养基(葡萄糖2％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.5％，酵母粉0.3％，CaCO₃0.4％，pH7.0，121℃灭菌20min，上述百分比均为重量百分比)的Sakaguchi烧瓶中，27℃振荡培养48小时后接种于含发酵培养基(葡萄糖3％、黄豆饼粉1.5％、碳酸钙0.4％，pH7.0，上述百分比均为重量百分比)的发酵罐中，通风条件下，27℃振荡培养68小时；发酵完成后所得发酵液用乙酸乙酯等有机溶剂萃取、浓缩、干燥、纯化、结晶即得纯度大于99％的STS。该发明公开了一种星孢链霉菌产生的新化合物STS及其制备方法，但是使用该方法生产STS，菌体生长缓慢，菌丝易结团，发酵培养产物产率低下。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用于培养星形孢菌素产生菌以生产星形孢菌素的培养基，采用该培养基培养星形孢菌素产生菌，发酵产物星形孢菌素的产率高。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种采用所述的培养基培养星形孢菌素产生菌生产星形孢菌素的方法。

本发明人通过诸多试验，经长期而广泛的研究发现，在STS产生菌的发酵过程中，培养基的成分是影响发酵产物星形孢菌素的产率的关键因素。特别是不同碳源的组合，有机氮源选用豆粕粉、酵母提取物、酵母膏和棉籽饼粉等，和/或，无机盐中添加镁盐可大大提高星形孢菌素的产率。

因此，本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案是：一种用于培养STS产生菌以生产星形孢菌素的培养基，pH为7.0，包含碳源、有机氮源和无机盐，其中无机盐包括钙盐，所述的碳源选自以下A、B、C三组成分中的两种或以上，其中至少两种成分选自不同组，A组：葡萄糖，B组：可溶性淀粉、玉米淀粉和土豆淀粉等淀粉类物质，C组：燕麦和麦芽糊精；和/或，所述的有机氮源选自豆粕粉、酵母提取物、酵母膏和棉籽饼粉；和/或，所述的无机盐中还添加镁盐。

也就是说，上述培养基的成份可选自以下7种组合。

1)上述培养基可以是在常规的用于培养星形孢菌素产生菌生产星形孢菌素的培养基的基础上，培养基的碳源选自以下A、B、C三组成分中的两种或以上，其中至少两种成分选自不同组，A组：葡萄糖，B组：可溶性淀粉、玉米淀粉和土豆淀粉，C组：燕麦和麦芽糊精；而培养基的其它方面，如各大类物质的含量、有机氮源和无机盐的具体成分、pH值及配制方法等同常规。

2)上述培养基也可以是在常规的用于培养星形孢菌素产生菌生产星形孢菌素的培养基的基础上，培养基的有机氮源选自豆粕粉、酵母提取物、酵母膏和棉籽饼粉；而培养基的其它方面，如各大类物质的含量、碳源和无机盐的具体成分、pH值及配制方法等同常规。

3)上述培养基也可以是在常规的用于培养星形孢菌素产生菌生产星形孢菌素的培养基的基础上，在培养基中添加镁盐；而培养基的其它方面，如各大类物质的含量、碳源和有机氮源的具体成分、pH值及配制方法等同常规。

4)上述培养基可以是在常规的用于培养STS产生菌生产星形孢菌素的培养基的基础上，将培养基的碳源和有机氮源作上述优化；而培养基的其它方面，如各大类物质的含量、无机盐的具体成分、pH值及配制等同常规。

5)上述培养基可以是在常规的用于培养STS产生菌生产星形孢菌素的培养基的基础上，将培养基的碳源作上述优化并在无机盐中添加镁盐；而培养基的其它方面，如各大类物质的含量、有机氮源的具体成分、pH值及配制方法等同常规。

6)上述培养基可以是在常规的用于培养STS产生菌生产星形孢菌素的培养基的基础上，将培养基的有机氮源选自豆粕粉、酵母提取物、酵母膏和棉籽饼粉；将培养基的无机盐中添加镁盐；而培养基的其它方面，如各大类物质的含量、碳源的具体成分、pH值及配制方法等同常规。

7)上述培养基可以是在常规的用于培养STS产生菌生产星形孢菌素的培养基的基础上，将培养基的碳源、有机氮源作上述优化；并在培养基的无机盐中添加镁盐；而培养基的其它方面，如各大类物质的含量、pH值及方法等同常规。

根据本发明，所说的碳源是指能提供微生物生长所需的碳元素的营养源；氮源是指能提供微生物生长所需的氮元素的营养源；无机盐提供微生物生长所需的微量元素、离子、电解质等营养，可构成菌体成份或维持酶活性，调节渗透压、pH等。常规的碳源是指任何已知的可以作为培养基碳源的成份，如糊精、麦芽糊精、土豆淀粉、可溶性淀粉、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、甘油等，这些成份的用量在本领域也可以是常规的。常规的氮源是指任何已知的可以作为培养基氮源的成份，如玉米浆、花生饼粉、黄豆饼粉(又称大豆饼粉)、棉籽饼粉、豆粕粉、蛋白胨、酵母提取物、大豆粉、牛肉膏和酵母膏等，这些成份的用量在本领域也可以是常规的。

优选的，所述的培养基中：A组成分的含量可为0.5～10％，B组成分的含量可为0.5～8％，C组成分的含量可为0.5～10％。更优选的，A组成分的含量可为1.0～3.0％，B组成分的含量可为3.0～5.0％，C组成分的含量可为1.0～5.0％；上述百分比均为重量百分比。

较佳地，所述的培养基的碳源含量可为0.5～10.0％，有机氮源的含量可为0.5～5％，钙盐以钙离子计含量可为0.1～0.6％，镁盐以镁离子计的含量可为0.05～0.5％。更佳的，碳源含量可为1.0～8.0％，有机氮源的含量可为1.0～3.0％，钙盐以钙离子计含量可为0.3～0.5％，镁盐以镁离子计的含量可为0.2～0.3％；上述百分比均为重量百分比。

根据本发明，所说的星形孢菌素产生菌是指现有技术中适用于发酵生产星形孢菌素的任何放线菌科的菌株，如上述美国专利文献所公开的。本发明以可购买得到的Saccharothrix aerocolonigenes subsp.staurosporea CGMCC4.1708菌株为例来说明，但并不限于该菌株，该菌株与上述Saccharothrixstaurosporeus AM-2282菌株同种。

在本发明一较佳实施例中，所述的培养基可以包含以下重量百分比的组分：葡萄糖1.0％、可溶性淀粉3.0％、豆粕粉1.5％、MgSO₄·7H₂O(以镁离子计)0.2％和CaCO₃(以钙离子计)0.4％，其pH为7.0。

本发明所述的培养基中还可以加入各种维生素、氨基酸或其他的金属离子。

本发明所述的培养基为液体培养基时适于STS产生菌液体发酵生产星形孢菌素，若在配制时加入促凝固的成份如琼脂糖等制备成固体培养基，STS产生菌也能生长。

本发明解决上述第二个技术问题所采用的技术方案是一种采用所述的培养基培养STS产生菌生产星形孢菌素的方法，换言之，该方法同现有技术一样，也是采用发酵培养STS产生菌来生产STS，通常包括斜面培养(ISP₄ 培养基)、种子培养及发酵培养，本发明方法与现有技术的区别主要在于发酵培养基由本发明的培养基所替代；其可以包括以下步骤：

1)在适合STS产生菌生长的条件下，在所述的本发明培养基中培养STS产生菌，获得培养物；

2)从培养物中分离获得星形孢菌素。

采用本发明的发酵培养基生产星形孢菌素，STS产生菌及其突变株菌体生长快，菌丝不易结团，产量最高可达初始培养基发酵产量的2.3倍。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件或按照药品或以其制造厂商所建议的条件。

1)发酵培养方法及标准效价的制定：

将Saccharothrix aerocolonigenes subsp.staurosporea CGMCC 4.1708(购于中国普通微生物菌种保藏中心)种子取出活化后接种斜面培养基(ISP₄培养基：可溶性淀粉1.0％、K₂HPO₄ 0.1％、MgSO₄·7H₂O 0.1％、NaCl 0.1％、(NH₄)₂SO₄ 0.2％、CaCO₃ 0.4％，余量为水，pH7.2，121℃灭菌20min)，将接种菌种的斜面置于28℃恒温培养箱中，培养10天，得到成熟的孢子，然后成熟的孢子接种于装有30ml种子培养基(葡萄糖2.0％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.5％，酵母粉0.3％，CaCO₃ 0.4％，余量为水，pH7.0，121℃灭菌20min)的250ml摇瓶中，在28℃、220rpm摇床上培养3天，得到成熟的种子，得到的种子以2％的接种量接入装有100ml发酵培养基(葡萄糖3.0％，大豆饼粉1.5％，碳酸钙0.4％，余量为水，pH7.0)的750ml摇瓶中，置于28℃、220rpm摇床继续培养60小时，放瓶，取发酵液2ml加入8ml乙酸乙酯浸泡过夜。离心取上清用HPLC进行星形孢菌素含量的测定。HPLC采用的色谱仪是Waters510型高效液相色谱仪，色谱柱是C18柱，检测器是Waters 996Photodiode Array Detector，流动相是甲醇∶水＝60∶40，流速是0.6ml/min，进样量是5μl，柱温是20℃-25℃。

因为以上步骤是用现有技术(参照背景技术中所提及的文献公开的方法)生产星形孢菌素。故本发明把上述的HPLC检测的产物峰面积定为100％，作为计算优化培养基发酵生产所得的星形孢菌素相对效价的标准。该相对效价计算公式为：相对效价＝(HPLC测定的改良培养基产物峰面积÷上述的标准的产物的峰面积)×100％。

实施例1～30

发酵方法同上述，除其中的发酵培养基分别用下表中的培养基代替以外，其它条件相同。其中培养基的pH7.0，碳酸钙0.4％。

相对效价结果：HPLC测定的实施例1～30培养基产物峰面积÷上述的标准的产物峰面积)×100％，如表1所示。

培养基的配制方法是将所述成分混合溶解在水中即可。

表1培养基的配方及相对效价

上述实施例中的百分比均为重量百分比，所述MgSO₄·7H₂O和碳酸钙的百分比均以镁离子和钙离子计算。

以上实施例中所用的药品和试剂为：

可溶性淀粉、MgSO₄·7H₂O：国药集团化学试剂有限公司；

酵母膏：国药集团化学试剂有限公司；

酵母提取物：湖北安琪酵母股份有限公司；

豆粕粉、黄豆饼粉(冷榨)：山东枣庄市豆制品研究中心；

玉米淀粉、燕麦(片或粉)、土豆淀粉：上海诺泰化工有限公司；

葡萄糖、麦芽糊精：上海聚豪精细化工有限公司；

棉籽饼粉：北京华康希望生物科技有限公司。

培养基中用到的组分及试剂均为化学纯。

Claims

1.一种用于培养星形孢菌素产生菌以生产星形孢菌素的培养基，pH为7.0，包含碳源、有机氮源和无机盐，其中无机盐包括钙盐，其特征是：所述的碳源选自以下A、B、C三组成分中的两种或以上，其中至少两种成分选自不同组，A组：葡萄糖，B组：可溶性淀粉、玉米淀粉和土豆淀粉，C组：燕麦和麦芽糊精；所述的有机氮源选自豆粕粉、酵母提取物、酵母膏和棉籽饼粉；所述的无机盐中还添加镁盐；所述的培养基中：A组成分的含量为0.5～10.0％，B组成分的含量为0.5～8.0％，C组成分的含量为0.5～10.0％；所述的碳源含量为0.5～12.0％，有机氮源的含量为0.5～5.0％，钙盐以钙离子计含量为0.1～0.6％，镁盐以镁离子计的含量为0.05～0.5％；上述百分比均为重量百分比。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征是所述的培养基中：A组成分的含量为1.0～3.0％，B组成分的含量为3.0～5.0％，C组成分的含量为1.0～5.0％；上述百分比均为重量百分比。

3.根据权利要求1所述的培养基，其特征是所述的碳源含量为1.0～8.0％，有机氮源的含量为1.0～3.0％，钙盐以钙离子计含量为0.3～0.5％，镁盐以镁离子计的含量为0.2～0.3％；上述百分比均为重量百分比。

4.根据权利要求1所述的培养基，其特征是所述的星形孢菌素产生菌为Saccharothrix aerocolonigenes subsp.staurosporeus CGMCC 4.1708菌株。

5.根据权利要求1所述的培养基，其特征是所述的培养基包含以下组分：葡萄糖1.0％、可溶性淀粉3.0％、豆粕粉1.5％、MgSO₄·7H₂O以镁离子计0.2％和CaCO₃以钙离子计0.4％；上述百分比均为重量百分比。

6.一种培养星形孢菌素产生菌生产星形孢菌素的方法，其特征是所述的方法包括：

1)在适合星形孢菌素产生菌生长的条件下，在权利要求1～5任一项所述的培养基中培养星形孢菌素产生菌，获得培养物；

2)从培养物中分离获得星形孢菌素。