CN101704877A - 一种大豆缩氨酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种大豆缩氨酸产品及其制备方法,具体涉及一种以大豆分离蛋白为原料,采用碱性蛋白酶和风味蛋白酶复合协同水解技术制备目标大豆缩氨酸的方法,解决了大豆分离蛋白的酶法修饰中存在的产物具有苦味及分子量1000以内的低分子量大豆缩氨酸的富集问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种大豆缩氨酸的制备方法,具体涉及一种通过复合酶水解法制备低分子量的大豆缩氨酸的方法,属于食品加工领域。
背景技术
缩氨酸是2到50个氨基酸连接的构造物,它表现出不同于蛋白质的活性和机能。一般可定义为“蛋白质的一种”或“蛋白质的短片”,更确切的说是多种氨基酸中给人体特定活力和技能的部分成分来组合的无毒合成物。主要应用作为医药品(如治疗剂,临床诊断等)和生活用品(如机能性食品及化妆品),目前生活用品方面的市场正在日益扩大。
目前,大豆缩氨酸是国内外大豆加工、食品、营养学和医学界十分关注和研究的重点、热点。美国、日本等发达国家研究较早,国外目前已经形成广泛的缩氨酸产品市场,市场潜力很大,产品主要有两类:一类是缩氨酸药品和试剂,世界上已经有100多种缩氨酸药物上市,这类产品纯度非常高,价格也非常昂贵;另一类是以缩氨酸为功能因子的低抗原保健食品和含缩氨酸的普通食品。目前国外缩氨酸食品已经形成产业,许多著名的公司进行了缩氨酸系列产品开发,例如缩氨酸食品添加剂以及添加缩氨酸的配餐等,有饮料、儿童午餐、老年人套餐、运动食品、促钙吸收食品和降压食品等。
我国对缩氨酸的研究起步较晚,但前景十分看好,由于大豆缩氨酸所具有的保健功能和生理活性,在功能食品中的应用领域越来越广。目前市场处于准入期,市场上还没有充足的产品,竞争格局也不明显,尤其是1000Da以下的缩氨酸产品极少。
目前对大豆缩氨酸的提取生产、研究较多。其中大部分所采用的原料是以脱脂豆粉、大豆分离蛋白或低温脱脂豆粕为主,其中脱脂豆粉和低温豆粕粗蛋白含量不高,蛋白纯度较低,但大豆分离蛋白含量大于90%,并且蛋白质质量较好。采用技术为酶水解或微生物发酵,但是微生物发酵所应用的菌种需要的卫生条件较高,并且菌种产生蛋白酶活力较低,因此应用商业酶进行酶解较为便捷。酶解后离心渗透反渗透、喷雾干燥而成。成品多为复合肽,可作为加工食品添加的中间产品使用。其中酶水解法可采用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、枯草芽孢杆菌蛋白酶及碱性蛋白酶水解。然而目前的方法存在着酶种类繁多反应条件苛刻,只注重水解度的高低,分子量1000以内的大豆肽的提取率偏低,并且酶解大豆蛋白时,其内部的疏水基团被暴露在外面,产物具有苦味等缺陷。
发明内容
为了解决大豆分离蛋白的酶法修饰中存在的产物的苦味去除和分子量1000以内大豆缩氨酸的富集问题,本发明的目的在于提供一种新的复合酶制备方法来提高大豆缩氨酸的提取率和含量。
为了达到上述目的,本方法采用如下的技术方案:
本发明提供一种大豆缩氨酸及其制备方法,是以大豆分离蛋白为原料,采用碱性蛋白酶和风味蛋白酶复合协同水解技术将大豆蛋白进行水解产生目标大豆缩氨酸。
本发明所述的大豆缩氨酸,其含有分子量小于1000Da的大豆多肽。
所述的大豆缩氨酸是采用如下方法制备得到的:
1)采用加热的方法对大豆分离蛋白进行一定程度的预处理;
2)加入碱性蛋白酶进行水解;
3)将碱性蛋白酶水解底物灭酶后,采用风味蛋白酶继续水解;
4)得到的水解液经离心后,依次通过截留分子量分别为3000Da和1000Da的聚醚砜膜进行超滤,即先流过3000Da膜,后流过1000Da膜,最终得到分子量小于1000Da的多肽溶液。
其中,所述预处理是取大豆分离蛋白加入10-20倍水,配成5%-10%溶液,75℃-90℃加热10-20分钟。通过预热温度和水解度关系实验得到,在85℃时水解度优于其他温度的处理,由于蛋白的二硫键不断的打开,使得酶作用位点暴露,使得水解度增高。在85℃预热15分钟可以提高水解度。在90℃以上时由于温度过高,使得部分蛋白质变性,酶作用位点反而被破坏。
所述碱性蛋白酶水解的水解条件为pH8.5-9.5,加入酶的重量为底物重量的3-7%,酶解温度50-65℃,酶解时间3-6h;优选为pH9.0,加入酶的重量为底物重量的5%,酶解温度55℃,酶解时间4h。
所述风味蛋白酶的水解条件为pH5.0-8.0,加入酶的重量为底物重量的3-7%,酶解温度45℃-55℃,酶解时间3-12h;优选为pH6.5,加入酶的重量为底物重量的5%,酶解温度50℃,酶解时间6h。
所述灭酶条件是90-95℃下灭酶20-25min。
所述超滤条件是在中性pH下,压力0.1-0.3MPa,温度35-45℃;优选为压力0.2MPa,温度40℃。
优选的,还可以对所得多肽溶液进行干燥。例如采用喷雾干燥,其条件为入口温度160-180℃,出口温度80-90℃,真空度值70-80Mpa,进样量值20-30Mpa,使物料组分混合均匀,粒度均匀,成品分散性高达80%以上。优选的,所述条件为进口温度175℃,出口温度82℃,真空度值75Mpa,进样量值25Mpa。
本发明还提供所述大豆缩氨酸在制备缩氨酸类药品和试剂中的应用,还提供所述大豆缩氨酸作为食品添加剂的应用,优选作为功能因子在低抗原保健食品和含缩氨酸的普通食品中的应用。
本发明大豆缩氨酸的产品为乳白色粉末状。通过本发明方法首先采用碱性蛋白酶进行水解,得到的可溶性氮含量最高,使大豆蛋白水解度达到24.2%;并且通过本方法处理可以达到初步水解,不需中间环节对水解过程进行监控;之后采用风味蛋白酶继续水解,在提高水解度的同时有效地减少了苦味,使水解度提高到25.3%,苦味值达到0.2-0.5;并且超滤后产品的得率达到20.3-24.3%。
本发明大豆缩氨酸产品的体外抗氧化效果的研究表明,其抗氧化值较高,为9.78-10.4mg/g,是维生素C的约1.5倍;大豆缩氨酸清除自由基(·OH)的IC50值为6.220mg/ml。
附图说明
图1为本发明的大豆缩氨酸的制备方法工艺流程图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明,应该理解的是,这些实施例仅用于例证的目的,决不限制本发明的保护范围。
本发明碱性蛋白酶酶解大豆蛋白可溶性蛋白含量及水解度的正交实验中,采用四因素三水平,结果如表1所示。
表1
由正交实验得到所述碱性蛋白酶水解的水解条件为pH8.5-9.5,加入酶的重量为底物重量的3-7%,酶解温度50-65℃,酶解时间3-6h;优选为pH9.0,加入酶的重量为底物重量的5%,酶解温度55℃,酶解时间4h。
进一步在风味酶酶解大豆蛋白可溶性蛋白含量及水解度的正交实验中,采用四因素三水平,结果如表2所示。
表2
由正交实验得到所述风味蛋白酶的水解条件为pH5.0-8.0,加入酶的重量为底物重量的3-7%,酶解温度45℃-55℃,酶解时间3-12h;优选为pH6.5,加入酶的重量为底物重量的5%,酶解温度50℃,酶解时间6h。
实施例1
1、取大豆分离蛋白加入10倍水,配成10%溶液,加热至75℃,保温10分钟;
2、将预热好的大豆蛋白溶液冷却到50℃,调节pH值至8.5,加入占大豆蛋白溶液中蛋白基(即蛋白干物质含量的百分比)重量3%的碱性蛋白酶(NOVO,2.4LMG),保温水解3小时;
3、将水解后大豆蛋白溶液在90-95℃,灭酶20-30分钟;
4、将灭酶后大豆蛋白溶液冷却至45℃,加入风味蛋白酶(NOVO,500MG),水解条件为:pH5.0,水解3小时,风味蛋白酶用量占底物中蛋白基重量的3%;
5、离心:转数3000转/分;
6、超滤:中和上述溶液(例如采用0.1mol/L的NaOH溶液)至中性,调节温度35℃,采用超滤膜分别为3000Da和1000Da的聚醚砜膜,在0.1MPa压力下,先流过3000Da膜,后流过1000Da膜,收集透出液;
进行水解度的测定:甲醛滴定法测定水解度
取灭酶后的8.0mL水解液,置于150mL的烧瓶中,加60mL去CO2水,调节pH值为7.0。向烧瓶中加入10.0mL中性甲醛溶液,混匀。开动磁力搅拌器,用浓度为0.05mol/L的NaOH标准溶液滴定至为9.20,记录下此时滴定管中的NaOH溶液的体积消耗数V1(mL)。
同时,取相同浓度未水解蛋白溶液8.0mL,按上述方法作空自试验,记录此时滴定管中的NaOH标准溶液的体积消耗数V2(mL)。则蛋白的水解度的计算公式为
DH%=M(V1-V2)(1000/CwoV)(1/htot)×100
式中:M为NaOH标准溶液的浓度(mol/L);V1为滴定样品稀释液消耗的0.05mol/L的NaOH标准溶液的体积(mL);V2为空白实验所消0.05mol/L的NaOH标准溶液的体积(mL);Cwo为所用WPC溶液的蛋白质量浓(g/L);V为用于甲醛滴定的水解液的体积数(mL);htot为每克原料蛋白质中肽键的毫摩尔数,对大豆分离蛋白,该值取7.8。
7、灭菌:90-95℃,20-30分钟(水浴加热);
8、喷雾干燥:采用Buchi公司Mini Spray DryerB-290,进口温度160℃,出口温度80℃,真空度值70,进样量值20。
所得产品为乳白色粉末状,苦味值为0.35。超滤后产品的得率为24.3%,经水解度监控,水解度达到25.3%。
体外抗氧化效果的研究表明,其抗氧化值(AOV)较高,为10.4mg/g,是维生素C的1.5倍;清除自由基(·OH)的IC50值为6.220mg/ml。
实施例2
1、取大豆分离蛋白加入20倍水,配成5%溶液,加热至85℃,保温15分钟;
2、将预热好的大豆蛋白溶液冷却到55℃,调节pH值至9.0,加入占大豆蛋白溶液(蛋白基)重量5%的碱性蛋白酶,保温水解4小时;
3、将水解后大豆蛋白溶液在90-95℃,灭酶20-30分钟;
4、将灭酶后大豆蛋白溶液冷却至50℃,加入风味蛋白酶,水解条件为:pH6.5,水解6小时,风味蛋白酶用量占底物(蛋白基)重量的5%;
5、离心:转数3000转/分;
6、超滤:中和溶液至中性,调节温度40℃,采用超滤膜分别为3000Da和1000Da的聚醚砜膜,在0.2MPa压力下,先流过3000Da膜,后流过1000Da膜,收集透出液;
水解度的测定同实施例1;
7、灭菌:90-95℃,20-30分钟;(水浴)
8、喷雾干燥:采用Buchi公司Mini Spray DryerB-290,进口温度175℃,出口温度82℃,真空度值75,进样量值25。
所得产品为乳白色粉末状,苦味值0.28。超滤后产品的得率为20.3%,经水解度监控,水解度达到25.3%。
体外抗氧化效果的研究表明,其抗氧化值(AOV)较高,为9.20mg/g,是维生素C的1.5倍;清除自由基(·OH)的IC50值为6.220mg/ml。
实施例3
1、取大豆分离蛋白加入10倍水,配成10%溶液,加热至90℃,保温20分钟;
2、将预热好的大豆蛋白溶液冷却到65℃,调节pH值至9.5,加入占大豆蛋白溶液(蛋白基)重量7%的碱性蛋白酶,保温水解6小时;
3、将水解后大豆蛋白溶液在90-95℃,灭酶20-30分钟;
4、将灭酶后大豆蛋白溶液冷却至55℃,加入风味蛋白酶,水解条件为:pH8.0,水解12小时,风味蛋白酶用量占底物(蛋白基)重量的4%;
5、离心:转数3000转/分;
6、超滤:中和溶液至中性,调节温度45℃,采用超滤膜分别为3000Da和1000Da的聚醚砜膜,在0.3MPa压力下,先流过3000Da膜,后流过1000Da膜,收集透出液;
水解度的测定同实施例1;
7、灭菌:90-95℃,20-30分钟;(水浴)
8、喷雾干燥:采用Buchi公司Mini Spray DryerB-290,进口温度180℃,出口温度90℃,真空度值80,进样量值30。
所得产品为乳白色粉末状,苦味值0.42。超滤后产品的得率为22.5%,经水解度监控,水解度达到25.3%。
体外抗氧化效果的研究表明,其抗氧化值(AOV)较高,为9.78mg/g,是维生素C的1.5倍;清除自由基(·OH)的IC50值为6.220mg/ml。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,对本发明而言仅仅是说明性的,而非限制性的。本专业技术人员理解,在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变,修改,甚至等效,但都将落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种大豆缩氨酸,其特征在于含有分子量小于1000Da的大豆多肽。
2.根据权利要求1所述的大豆缩氨酸,其特征在于其苦味值在0.5以下,优选0.2-0.5。
3.一种制备权利要求1所述大豆缩氨酸的方法,其特征在于包括如下步骤:
1)采用加热的方法对大豆分离蛋白进行预处理;
2)采用碱性蛋白酶进行水解;
3)将碱性蛋白酶水解底物灭酶后,采用风味蛋白酶继续水解;
4)得到的水解液经离心后,依次通过截留分子量分别为3000Da和1000Da的聚醚砜膜,即先流过3000Da膜,后流过1000Da膜,最终得到小于1000Da的多肽溶液。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于所述预处理是取大豆分离蛋白加入10-20倍水,配成5%-10%溶液,75-90℃加热10-20分钟;优选85℃加热15分钟。
5.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于所述碱性蛋白酶水解的水解条件为pH8.5-9.5,加入酶的重量为底物重量的3-7%,酶解温度50-65℃,酶解时间3-6h;优选为pH9.0,加入酶的重量为底物重量的5%,酶解温度55℃,酶解时间4h。为pH9.0,酶活,酶解温度55℃,酶解时间4h。
6.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于所述风味蛋白酶的水解条件为pH5.0-8.0,加入酶的重量为底物重量的3-7%,酶解温度45℃-55℃,酶解时间3-12h;优选为pH6.5,加入酶的重量为底物重量的5%,酶解温度50℃,酶解时间6h。
7.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于所述超滤条件在中性pH下,压力0.1-0.3MPa,温度35-45℃;优选为压力0.2MPa,温度40℃,pH为7.0。
8.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于进一步将所得多肽溶液进行干燥。
9.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于所述喷雾干燥的条件为入口温度160-180℃,出口温度80-90℃,真空度值70-80Mpa,进样量值20-30Mpa;优选的,所述条件为进口温度175℃,出口温度82℃,真空度值75Mpa,进样量值25Mpa。
10.权利要求1所述的大豆缩氨酸在制备缩氨酸类药品和试剂中的应用,或作为食品添加剂的应用;优选作为功能因子在低抗原保健食品和含缩氨酸的普通食品中的应用。
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GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120627 Termination date: 20151130 |
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EXPY | Termination of patent right or utility model |