CN108611390A - 一种制备低苦味水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备低苦味水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉的方法，该方法包括：取新鲜水牛乳，经脱脂、沉淀和纯化处理后，得到水牛乳酪蛋白；制备水牛乳酪蛋白水溶液，煮沸变性，再向缓冲溶液中加入动物水解蛋白酶进行一次酶解后，再加入Prote AX蛋白酶进行二次酶解，酶解结束后煮沸灭酶，得到水牛乳酪蛋白酶解液；所述动物水解蛋白酶购自广西南宁庞博有限公司；所述水牛乳酪蛋白酶解液依次经离心和超滤处理后，冷冻干燥，得到水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉。本发明从鲜水牛乳中分离、纯化得到水牛乳酪蛋白，并采用动物水解蛋白酶和Prote AX蛋白酶对水牛乳酪蛋白进行两级酶解，得到氮回收率高、分子量小、抗氧化活性强且苦味低的水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉。

Description

一种制备低苦味水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉的方法
技术领域
本发明涉及乳制品技术领域，尤其涉及一种制备低苦味水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉的方法。
背景技术
乳是人类膳食中历史最悠久的食物之一，乳及乳制品不仅给人类身体提供丰富的营养，而且是生物活性肽的重要来源。酪蛋白是乳蛋白中含量最丰富的混合蛋白质，其含量占乳总蛋白的80％左右。水牛是分布在我国南方的一种重要经济畜牧品种，随着生产资料的不断进步，新世纪水牛已逐渐转变成“乳用为主、肉役为辅”的发展趋势，水牛乳业已成为一项新兴产业。水牛乳中蛋白含量高达4.3％，其中必需氨基酸含量大于30％，为制备优质乳源活性肽提供了原料保障。
近年来，关于牛乳酪蛋白中蕴含的具有生理活性的肽段越来越受到人们关注。小分子肽在肠道内的转运、吸收和利用率都优于单体氨基酸，而且由其不同的氨基酸排列方式，可具有不同的生理活性，例如在体内参与免疫调节、清除自由基、调节血压平衡、抗血栓和强化骨骼健康等。其中抗氧化活性肽是被研究的较广泛的一个方向，现已在多种乳及乳制品中鉴定出不同的抗氧化片段，水牛乳酪蛋白中含有丰富的疏水性氨基酸和碱性氨基酸，是制备抗氧化肽的优质原料。
酶解所产生的苦味一直是活性肽产品中亟待解决的生产难题。单体疏水性氨基酸本身不具有苦味，但短肽中疏水性氨基酸比例增加会明显使苦味增加，降低消费者的接受度。工业中常使用添加吸附剂或包埋剂的方式脱除或结合疏水性氨基酸使苦味降低，但这些方式会带来必须氨基酸损失，降低牛乳本身的营养价值，提高产品成品等问题。
公告号为CN1546682的发明专利申请公开了一种酶解与膜滤集成连续制取酪蛋白生物活性多肽的工艺，该工艺以酪蛋白为原料，在由酶解罐与不同截留分子量的超滤、纳滤膜组合而成的多级酶膜反应器中，经至少一种蛋白酶作用，制得具有多种功能的生物活性多肽；其中，蛋白酶为胰酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、羧肽酶中的一种或复配。
采用内肽酶和端肽酶(氨肽酶和羧肽酶)协同水解的方式对降低多肽产品苦味有着明显效果。先利用水解能力强的内切蛋白酶释放小分子肽，接着利用端肽酶切断苦味肽C端的疏水性氨基酸或N端的碱性氨基酸，释放单体氨基酸，从而达到降低苦味的效果。在双酶协同水解过程中由于不同蛋白酶所适合的条件不同，需要不断调节酸碱和温度，在实际生产中还需增加脱盐工序，不符合节能环保的工业趋势。
因此，寻找水解能力强和水解环境匹配的脱苦蛋白酶对于活性肽产业是至关重要的。
发明内容
本发明提供了一种制备低苦味水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉的方法，采用该方法制备获得的酪蛋白短肽不仅氮回收率高，分子量低，抗氧化活性强，对铁原子还原率和ABTS自由基的清除率较高，而且能够显著降低产品的苦味，利于产品的推广。
具体技术方案如下：
一种制备低苦味水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉的方法，包括：
(1)取新鲜水牛乳，经脱脂、沉淀和纯化处理后，得到水牛乳酪蛋白；
(2)配制水牛乳酪蛋白水溶液，煮沸变性，再向缓冲溶液中加入动物水解蛋白酶进行一次酶解后，再加入Prote AX蛋白酶进行二次酶解，酶解结束后煮沸灭酶，得到水牛乳酪蛋白酶解液(3)所述水牛乳酪蛋白酶解液依次经离心和超滤处理后，冷冻干燥，得到水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉。
本发明所用的动物水解蛋白酶购自广西南宁庞博有限公司，主要由碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、外切酶和风味酶复配而成，适用条件广泛，酶切位点多且针对性不强，使用中无需调节pH值，因而减少了后续脱盐的步骤，节能且环保。
本发明所用的Prote AX蛋白酶购自日本天野酶公司，是一种源于米曲霉(Aspergillus oryzae)发酵提炼而成的氨肽酶，适合偏中性条件使用，外肽酶活力为1400U/g。
适宜的离心条件可以高效脱除脂肪，提高所得水牛乳酪蛋白的纯度。作为优选，步骤(1)中，所述脱脂的温度为3～6℃，转速为3500～5000r/min，时间为10～15min。
适宜的蛋白浓度可提高酶解效率，增加氮回收率，蛋白浓度太低会升高制备成本，蛋白浓度太高不利于蛋白酶高效酶解。作为优选，步骤(2)中，所述的水牛乳酪蛋白水溶液中，水牛乳酪蛋白的质量分数为2～5％。
作为优选，步骤(2)中，所述煮沸变性的温度为90～100℃，时间为10～15min。高温可以破坏蛋白质的立体结构，暴露出肽链，利于蛋白酶酶切，明显提高酶切效率。
动物水解蛋白酶的添加量对氮回收率、乳清蛋白抗氧化肽的分子量大小和抗氧化性能均有影响。作为优选，步骤(2)中，以1g酪蛋白计，缓冲溶液中所述动物水解蛋白酶的添加量为0.01～0.03g。
不同动物蛋白酶酶解条件会获得不同终态pH的酶解液，适宜的蛋白酶添加量和酶解条件可获得最适宜后续Prote AX蛋白酶脱苦工序的酶解液。作为优选，步骤(2)中，所述一次酶解的温度为50～60℃，时间为2～4h。该酶解条件可以高效发挥蛋白酶酶活，提高多肽得率。
Prote AX蛋白酶的添加量会对乳清蛋白抗氧化肽的苦味有明显影响，同时，ProteAX具有一定的内肽酶活性，可进一步切割蛋白质和多肽，影响氮回收率、肽分子量和抗氧化能力。作为优选，步骤(2)中，以1g酪蛋白计，缓冲溶液中所述Prote AX蛋白酶的添加量为0.005～0.02g。
作为优选，步骤(2)中，所述二次酶解的温度为40～60℃，时间为2～4h。该酶解条件可以高效发挥蛋白酶酶活，提高多肽得率，降低肽粉苦味。
作为优选，步骤(3)中，所述离心的转速为6000～8000r/min，时间为10～20min；可以尽可能分离多肽和不溶性蛋白，提高多肽得率。
作为优选，步骤(3)中，所述超滤的截留量为6000～10000Da，压力为0.4～0.6MPa。超滤可以除去少数残留脂质和大分子蛋白和多肽，可以有效除去杂质，获得清澈纯净肽液，提高产品的抗氧化性能。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明从鲜水牛乳中分离、纯化得到水牛乳酪蛋白，并采用动物水解蛋白酶和Prote AX蛋白酶对水牛乳酪蛋白进行两级酶解，得到氮回收率高、分子量小、抗氧化活性强且苦味低的水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉。
(2)本发明方法无需调节pH及反复调节温度，只需一步灭酶即可，不仅绿色节能，而且减少后续脱盐步骤，易于工业连续化规模生产。
(3)本发明方法脱苦效果优异，肽粉产品感官良好、品质稳定、可直接作为多肽添加剂应用于其他产品中。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
下列实施例中涉及的铁原子还原率、ABTS自由基清除率、氮回收率和分子量分布的测定方法如下：
(1)铁离子还原能力测定：
①FRAP试剂配制：将0.1mol/L pH 3.6的醋酸缓冲溶液、10mmol/L TPTZ溶液、20mmoL/L的三氯化铁溶液按10:1:1的配制。
②在5mL离心管中分别加入0.1mL待测多肽液(1mg/mL)和1.9mL FRAP试剂，摇匀反应10min后用紫外分光光度计检测其593nm下的吸光值Aj；
③在5mL离心管中分别加入0.1mL纯水和1.9mL FRAP试剂，摇匀反应10min后用紫外分光光度计检测其593nm下的吸光值Ai；
④铁离子还原能力用以下公式计算结果：
(2)ABTS自由基清除率测定：
①ABTS自由基制备：将440μL浓度为140mmoL/L的过硫酸钾溶液加入到25mL浓度为7mmoL/L的ABTS溶液中，混匀避光反应12h后定容至100mL。
②在5mL离心管中分别加入0.1mL纯水和1.9mL ABTS反应溶液，混合摇匀反应10min后用紫外分光光度计检测其734nm下的吸光值A0；
③在5mL离心管中分别加入0.1mL待测多肽液(1mg/mL)和1.9mL ABTS反应溶液，混匀反应10min后用紫外分光光度计检测其734nm下的吸光值A1；
④用以下公式计算结果：
(3)氮回收率测定：通过凯氏定氮法分别测定水牛乳酪蛋白和肽粉中的氮百分含量分别为N1和N2。
氮回收率通过下式计算：
(4)小分子量肽含量测定：利用GE AKTApure蛋白纯化仪，配备Superdex Peptide10/300GL色谱柱，流动相为含0.1％(V/V)TFA的30％(V/V)乙腈溶液，流速0.5mL/min，检测波长为215nm。配制2mg/mL的多肽溶液，过0.22μm水系滤膜后进样100μL。分子量标准品选用抑肽酶(6511Da)、杆菌肽(1422Da)、还原型谷胱甘肽(614Da)和酪氨酸(181Da)。肽粉的分子量分布在200～1500Da范围内为小分子肽，利用不同分子量标准品确定小分子量肽的比例。
(5)感官评定：采用肽粉和10mg/mL的肽液进行感官评定。选用8名具有感官评定基础的评定员(4男4女，年龄22～25岁)，对肽粉和肽液的苦味、色泽和溶解度按照评分表进行评判，其中苦味值以不同浓度的单宁溶液为评定标准，50mmol/L单宁溶液为微弱苦味，100mmol/L单宁溶液为明显苦味，200mmol/L单宁溶液为强烈苦味。汇总8份评分，各项分别去掉最高分和最低分后取平均值即为产品得分。
表1感官评定表
实施例1
一种制备低苦味水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉的方法，具体内容如下：
(1)水牛乳酪蛋白的制备：取100g鲜水牛乳于4℃低温下5000r/min离心10min可分离上层脂肪，得到脱脂水牛乳；用1mol/L稀盐酸调节水牛乳pH至4.6沉淀酪蛋白，4000r/min离心10min后除去上清液，得到粗品酪蛋白；继续用纯水洗涤酪蛋白三遍，每次洗涤后4000r/min离心10min收集沉淀物，冷冻干燥后得纯净水牛乳酪蛋白。
(2)蛋白酶酶解：用纯水配制质量分数百分比为3％的水牛乳酪蛋白溶液，95℃煮沸预处理10min后，冷却至55℃，再置于磁力恒温水浴装置中，按每1g酪蛋白添加0.02g蛋白酶的比例添加动物水解蛋白酶，恒温酶解3h，一次酶解结束后不灭酶，继续按每1g酪蛋白添加0.015g蛋白酶的比例添加Prote AX蛋白酶，保持55℃恒温酶解3h，两次酶解结束后，煮沸灭酶，得水牛乳酪蛋白酶解液。
(3)肽粉的制备：酶解液7000r/min离心15min收集上清液为粗肽液，将粗肽液先过截留量为10kDa的超滤膜，压力为0.6MPa，脱去脂质和大分子蛋白和多肽，再采用冷冻干燥法，得水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉。
实施例2
一种制备低苦味水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉的方法，具体内容如下：
(1)水牛乳酪蛋白的制备：取100g鲜水牛乳于4℃低温下5000r/min离心10min可分离上层脂肪，得到脱脂水牛乳；用1mol/L稀盐酸调节水牛乳pH至4.6沉淀酪蛋白，4000r/min离心10min后除去上清液，得到粗品酪蛋白；继续用纯水洗涤酪蛋白三遍，每次洗涤后4000r/min离心10min收集沉淀物，冷冻干燥后得纯净水牛乳酪蛋白。
(2)蛋白酶酶解：用纯水配制质量分数百分比为2％的水牛乳酪蛋白溶液，95℃煮沸预处理10min后，冷却至50℃，再置于磁力恒温水浴装置中，按每1g酪蛋白添加0.01g蛋白酶的比例添加动物水解蛋白酶，恒温酶解2.5h，一次酶解结束后不灭酶，继续按每1g酪蛋白添加0.01g蛋白酶的比例添加Prote AX蛋白酶，保持50℃恒温酶解2.5h，两次酶解结束后，煮沸灭酶，得水牛乳酪蛋白酶解液。
(3)肽粉的制备：酶解液7000r/min离心15min收集上清液为粗肽液，将粗肽液先过截留量为10kDa的超滤膜，压力为0.5MPa，脱去脂质和大分子蛋白和多肽，再采用冷冻干燥法，得水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉。
实施例3
一种制备低苦味水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉的方法，具体内容如下：
(1)水牛乳酪蛋白的制备：取100g鲜水牛乳于4℃低温下5000r/min离心10min可分离上层脂肪，得到脱脂水牛乳；用1mol/L稀盐酸调节水牛乳pH至4.6沉淀酪蛋白，4000r/min离心10min后除去上清液，得到粗品酪蛋白；继续用纯水洗涤酪蛋白三遍，每次洗涤后4000r/min离心10min收集沉淀物，冷冻干燥后得纯净水牛乳酪蛋白。
(2)蛋白酶酶解：用纯水配制质量分数百分比为5％的水牛乳酪蛋白溶液，95℃煮沸预处理10min后，冷却至55℃，再置于磁力恒温水浴装置中，按每1g酪蛋白添加0.02g蛋白酶的比例添加动物水解蛋白酶，恒温酶解3.5h，一次酶解结束后不灭酶，继续按每1g酪蛋白添加0.01g蛋白酶的比例添加Prote AX蛋白酶，保持55℃恒温酶解3.5h，两次酶解结束后，煮沸灭酶，得水牛乳酪蛋白酶解液。
(3)肽粉的制备：酶解液7000r/min离心15min收集上清液为粗肽液，将粗肽液先过截留量为10kDa的超滤膜，压力为0.5MPa，脱去脂质和大分子蛋白和多肽，再采用冷冻干燥法，得水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉。
实施例4
一种制备低苦味水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉的方法，具体内容如下：
(1)水牛乳酪蛋白的制备：取100g鲜水牛乳于4℃低温下5000r/min离心10min可分离上层脂肪，得到脱脂水牛乳；用1mol/L稀盐酸调节水牛乳pH至4.6沉淀酪蛋白，4000r/min离心10min后除去上清液，得到粗品酪蛋白；继续用纯水洗涤酪蛋白三遍，每次洗涤后4000r/min离心10min收集沉淀物，冷冻干燥后得纯净水牛乳酪蛋白。
(2)蛋白酶酶解：用纯水配制质量分数百分比为3％的水牛乳酪蛋白溶液，95℃煮沸预处理10min后，冷却至40℃，再置于磁力恒温水浴装置中，按每1g酪蛋白添加0.015g蛋白酶的比例添加动物水解蛋白酶，恒温酶解4h，一次酶解结束后不灭酶，继续按每1g酪蛋白添加0.01g蛋白酶的比例添加Prote AX蛋白酶，保持40℃恒温酶解4h，两次酶解结束后，煮沸灭酶，得水牛乳酪蛋白酶解液。
(3)肽粉的制备：酶解液7000r/min离心15min收集上清液为粗肽液，将粗肽液先过截留量为10kDa的超滤膜，压力为0.5MPa，脱去脂质和大分子蛋白和多肽，再采用冷冻干燥法，得水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉。
实施例5
一种制备低苦味水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉的方法，具体内容如下：
(1)水牛乳酪蛋白的制备：取100g鲜水牛乳于4℃低温下5000r/min离心10min可分离上层脂肪，得到脱脂水牛乳；用1mol/L稀盐酸调节水牛乳pH至4.6沉淀酪蛋白，4000r/min离心10min后除去上清液，得到粗品酪蛋白；继续用纯水洗涤酪蛋白三遍，每次洗涤后4000r/min离心10min收集沉淀物，冷冻干燥后得纯净水牛乳酪蛋白。
(2)蛋白酶酶解：用纯水配制质量分数百分比为5％的水牛乳酪蛋白溶液，95℃煮沸预处理10min后，冷却至60℃，再置于磁力恒温水浴装置中，按每1g酪蛋白添加0.01g蛋白酶的比例添加动物水解蛋白酶，恒温酶解2h，一次酶解结束后不灭酶，继续按每1g酪蛋白添加0.01g蛋白酶的比例添加Prote AX蛋白酶，保持60℃恒温酶解2h，两次酶解结束后，煮沸灭酶，得水牛乳酪蛋白酶解液。
(3)肽粉的制备：酶解液7000r/min离心15min收集上清液为粗肽液，将粗肽液先过截留量为10kDa的超滤膜，压力为0.5MPa，脱去脂质和大分子蛋白和多肽，再采用冷冻干燥法，得水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉。
对比例1
一种制备低苦味水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉的方法，具体内容如下：
(1)水牛乳酪蛋白的制备：取100g鲜水牛乳于4℃低温下5000r/min离心10min可分离上层脂肪，得到脱脂水牛乳；用1mol/L稀盐酸调节水牛乳pH至4.6沉淀酪蛋白，4000r/min离心10min后除去上清液，得到粗品酪蛋白；继续用纯水洗涤酪蛋白三遍，每次洗涤后4000r/min离心10min收集沉淀物，冷冻干燥后得纯净水牛乳酪蛋白。
(2)蛋白酶酶解：用纯水配制质量分数百分比为3％的水牛乳酪蛋白溶液，95℃煮沸预处理10min后，冷却至50℃，再置于磁力恒温水浴装置中，按每1g酪蛋白添加0.02g蛋白酶的比例添加动物水解蛋白酶，恒温酶解3h，酶解结束后，煮沸灭酶，得水牛乳酪蛋白酶解液。
(3)肽粉的制备：酶解液7000r/min离心15min收集上清液为粗肽液，将粗肽液先过截留量为10kDa的超滤膜，压力为0.5MPa，脱去脂质和大分子蛋白和多肽，再采用冷冻干燥法，得水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉。
对比例2
一种制备低苦味水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉的方法，具体内容如下：
(1)水牛乳酪蛋白的制备：同对比例1制备方法。
(2)蛋白酶酶解：用纯水配制质量分数百分比为3％的水牛乳酪蛋白溶液，95℃煮沸预处理10min后，冷却至50℃，再置于磁力恒温水浴装置中，按每1g酪蛋白添加0.02g蛋白酶的比例添加Prote AX蛋白酶，保持50℃恒温酶解3h，两次酶解结束后，煮沸灭酶，得水牛乳酪蛋白酶解液。
(3)肽粉的制备：酶解液7000r/min离心15min收集上清液为粗肽液，将粗肽液先过截留量为10kDa的超滤膜，压力为0.5MPa，脱去脂质和大分子蛋白和多肽，再采用冷冻干燥法，得水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉。
对比例3
一种制备低苦味水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉的方法，具体内容如下：
(1)水牛乳酪蛋白的制备：同对比例1制备方法。
(2)蛋白酶酶解：用纯水配制质量分数百分比为3％的水牛乳酪蛋白溶液，95℃煮沸预处理10min后，冷却至50℃，再置于磁力恒温水浴装置中，按每1g酪蛋白添加0.015g蛋白酶的比例添加动物水解蛋白酶，恒温酶解3h，一次酶解结束后不灭酶，继续按每1g酪蛋白添加0.010g蛋白酶的比例添加风味蛋白酶，保持50℃恒温酶解3h，两次酶解结束后，煮沸灭酶，得水牛乳酪蛋白酶解液。所用的风味蛋白酶购自广西南宁庞博生物工程有限公司，来源于米曲霉发酵，包含了内切蛋白酶与外切肽酶两种活性。
(3)肽粉的制备：酶解液7000r/min离心15min收集上清液为粗肽液，将粗肽液先过截留量为10kDa的超滤膜，压力为0.5MPa，脱去脂质和大分子蛋白和多肽，再采用冷冻干燥法，得水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉。
对比例4
一种制备低苦味水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉的方法，具体内容如下：
(1)水牛乳酪蛋白的制备：同对比例1制备方法。
(2)蛋白酶酶解：用纯水配制质量分数百分比为4％的水牛乳酪蛋白溶液，95℃煮沸预处理10min后，冷却至50℃，再置于磁力恒温水浴装置中，按每1g酪蛋白添加0.015g蛋白酶的比例添加动物水解蛋白酶，恒温酶解3h，一次酶解结束后不灭酶，降温至40℃，按每1g酪蛋白添加0.015g蛋白酶的比例添加Peptidase R蛋白酶，保持40℃恒温酶解3h，两次酶解结束后，煮沸灭酶，得水牛乳酪蛋白酶解液。所用Peptidase R蛋白酶购自日本天野酶制剂公司，是一种源于米根霉(Rhizopus oryzae)发酵提炼而成的氨肽酶，外肽酶活力为420U/g。
(3)肽粉的制备：酶解液7000r/min离心15min收集上清液为粗肽液，将粗肽液先过截留量为10kDa的超滤膜，压力为0.5MPa，脱去脂质和大分子蛋白和多肽，再采用冷冻干燥法，得水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉。
对比例5
一种制备低苦味水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉的方法，具体内容如下：
(1)水牛乳酪蛋白的制备：同对比例1制备方法。
(2)蛋白酶酶解：用纯水配制质量分数百分比为3％的水牛乳酪蛋白溶液，95℃煮沸预处理10min后，冷却至37℃，再置于磁力恒温水浴装置中，按每1g酪蛋白添加0.015g蛋白酶的比例添加胰蛋白酶，恒温酶解3h，一次酶解结束后不灭酶，继续按每1g酪蛋白添加0.010g蛋白酶的比例添加Prote AX蛋白酶，保持37℃恒温酶解3h，两次酶解结束后，煮沸灭酶，得水牛乳酪蛋白酶解液。所用的胰蛋白酶购自广西南宁庞博生物工程有限公司，从猪胰中提取纯化而得。
(3)肽粉的制备：酶解液7000r/min离心15min收集上清液为粗肽液，将粗肽液先过截留量为10kDa的超滤膜，压力为0.5MPa，脱去脂质和大分子蛋白和多肽，再采用冷冻干燥法，得水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉。
对比例6
一种制备低苦味水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉的方法，具体内容如下：
(1)水牛乳酪蛋白的制备：同对比例1制备方法。
(2)蛋白酶酶解：用纯水配制质量分数百分比为3％的水牛乳酪蛋白溶液，95℃煮沸预处理10min后，冷却至50℃，再置于磁力恒温水浴装置中，按每1g酪蛋白添加0.010g蛋白酶的比例添加中性蛋白酶，恒温酶解3h，一次酶解结束后不灭酶，继续按每1g酪蛋白添加0.010g蛋白酶的比例添加Prote AX蛋白酶，保持50℃恒温酶解3h，两次酶解结束后，煮沸灭酶，得水牛乳酪蛋白酶解液。本发明所用的中性蛋白酶购自广西南宁庞博生物工程有限公司，从枯草芽孢杆菌发酵而得。
(3)肽粉的制备：酶解液7000r/min离心15min收集上清液为粗肽液，将粗肽液先过截留量为10kDa的超滤膜，压力为0.5MPa，脱去脂质和大分子蛋白和多肽，再采用冷冻干燥法，得水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉。
对上述实施例1～5和对比例1～6制备获得的肽粉产品进行氮回收率、小分子肽含量、铁原子还原率和ABTS自由基清除率的测定，以及苦味、色泽和溶解性的评定，结果如表2所示。
表2不同实施例1～5与对照例1～6的结果对比

Claims (10)

1.一种制备低苦味水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉的方法，其特征在于，包括：
(1)取新鲜水牛乳，经脱脂、沉淀和纯化处理后，得到水牛乳酪蛋白；
(2)配制水牛乳酪蛋白水溶液，煮沸变性，再向缓冲溶液中加入动物水解蛋白酶进行一次酶解后，再加入Prote AX蛋白酶进行二次酶解，酶解结束后煮沸灭酶，得到水牛乳酪蛋白酶解液；所述动物水解蛋白酶购自广西南宁庞博有限公司；
(3)所述水牛乳酪蛋白酶解液依次经离心和超滤处理后，冷冻干燥，得到水牛乳酪蛋白抗氧化肽粉。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述脱脂的温度为3～6℃，转速为3500～5000r/min，时间为10～15min。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的水牛乳酪蛋白水溶液中，水牛乳酪蛋白的质量分数为2～5％。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述煮沸变性的温度为90～100℃，时间为10～15min。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，以1g酪蛋白计，缓冲溶液中所述动物水解蛋白酶的添加量为0.01～0.03g。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述一次酶解的温度为50～60℃，时间为2～4h。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，以1g酪蛋白计，缓冲溶液中所述Prote AX蛋白酶的添加量为0.005～0.02g。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述二次酶解的温度为40～60℃，时间为2～4h。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述离心的转速为6000～8000r/min，时间为10～20min。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述超滤的截留量为6000～10000Da，压力为0.4～0.7MPa。
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