CN108410938A - 一种制备低苦味乳清蛋白抗氧化肽粉的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备低苦味乳清蛋白抗氧化肽粉的方法，该方法包括：配制乳清蛋白水溶液，高温变性后，加入中性蛋白酶进行一次酶解，再加入ProteAX蛋白酶进行二次酶解，酶解结束后，高温灭酶，得到乳清蛋白酶解液；将乳清蛋白酶解液依次经离心和超滤处理后，冷冻干燥，得到乳清蛋白抗氧化肽粉。本发明采用中性蛋白酶和ProteAX蛋白酶对乳清蛋白进行两级酶解，得到氮回收率高、分子量小、抗氧化活性强且苦味低的乳清蛋白抗氧化肽粉。
Description
技术领域
本发明涉及乳制品技术领域，尤其涉及一种制备低苦味乳清蛋白抗氧化肽粉的方法。
背景技术
乳及乳制品是人类膳食历史中最悠久的食物之一，它们所含有的丰富蛋白质不仅可以提供丰富的营养，而且是生物活性肽的重要来源。乳清蛋白是牛乳沉淀酪蛋白后分离出的多种蛋白质组分的总称，曾作为工业化生产干酪及干酪素的副产品，占乳总蛋白含量的20％左右。
近年来，关于乳及乳制品中蕴含的具有生理活性的肽段越来越受到人们关注。小分子肽在肠道内的转运、吸收和利用率都优于单体氨基酸，而且由其不同的氨基酸排列方式，可具有不同的生理活性，例如在体内参与免疫调节、清除自由基、调节血压平衡、抗血栓和强化骨骼健康等。其中抗氧化活性肽是被研究的较广泛的一个方向，现已在多种乳及乳制品中鉴定出不同的抗氧化片段，乳清蛋白中含有丰富的疏水性氨基酸和碱性氨基酸，是制备抗氧化肽的优质原料。
近年来，关于牛乳乳清蛋白中蕴含的具有生理活性的肽段越来越受到人们关注。小分子肽在肠道内的转运、吸收和利用率都优于单体氨基酸，而且由其不同的氨基酸排列方式，可具有不同的生理活性，例如在体内参与免疫调节、清除自由基、调节血压平衡、抗血栓和强化骨骼健康等。其中抗氧化活性肽是被研究的较广泛的一个方向，现已在多种乳及乳制品中鉴定出不同的抗氧化片段，乳清蛋白中含有丰富的疏水性氨基酸和碱性氨基酸，是制备抗氧化肽的优质原料。
酶解法是目前工业制备活性肽的最常用方法，该方法条件温和、可控性强、产品稳定。但在酶解过程中，疏水性氨基酸从蛋白质断裂成多肽时暴露，往往使C端具有疏水性氨基酸的多肽带有苦味，造成肽产品的感官品质降低。工业中常使用添加吸附剂或包埋剂的方式脱除或结合疏水性氨基酸使苦味降低，但这些方式会带来必须氨基酸损失，降低牛乳本身的营养价值，提高产品成品等问题。采用内肽酶和端肽酶(氨肽酶和羧肽酶)协同水解的方式对降低多肽产品苦味有着明显效果。先利用酶切位点为疏水性氨基酸的内切蛋白酶切割蛋白质，释放端位带有疏水性氨基酸的小分子肽，接着利用氨肽酶切断苦味肽C端的疏水性氨基酸或利用羧肽酶切断苦味肽N端的疏水性氨基酸，达到降低苦味的效果。但在内外肽酶协同水解过程中，不同蛋白酶所适合的条件不同，需要不断调节酸碱和温度，在实际生产中还需增加脱盐工序。
因此，寻找水解能力强和水解环境匹配的脱苦蛋白酶对于活性肽产业是至关重要的。
发明内容
本发明提供了一种制备低苦味乳清蛋白抗氧化肽粉的方法，采用该方法制备获得的乳清蛋白短肽不仅氮回收率高，分子量低，抗氧化活性强，对DPPH自由基和ABTS自由基的清除率较高，而且能够显著降低产品的苦味，利于产品的推广。
具体技术方案如下：
一种制备低苦味乳清蛋白抗氧化肽粉的方法，包括：
(1)配制乳清蛋白水溶液，高温变性后，加入中性蛋白酶进行一次酶解，再加入ProteAX蛋白酶进行二次酶解，酶解结束后，高温灭酶，得到乳清蛋白酶解液；
(2)将乳清蛋白酶解液依次经离心和超滤处理后，冷冻干燥，得到乳清蛋白抗氧化肽粉。
本发明所用的中性蛋白酶购自广西南宁庞博生物工程有限公司，来源于枯草芽孢杆菌，中性蛋白酶活力为200,000U/g；所用ProteAX蛋白酶购自日本天野酶制剂公司，是一种源于米曲霉(Aspergillus oryzae)发酵提炼而成的氨肽酶，外肽酶活力为1400U/g。
本发明所用乳清蛋白为浓缩型乳清蛋白粉(WPC)，乳清蛋白含量大于80％，购自新西兰恒天然公司；在具体操作中也可使用WPC90，WPC75或WPC35。
适宜的蛋白浓度可提高酶解效率，增加氮回收率，蛋白浓度太低会升高制备成本，蛋白浓度太高不利于蛋白酶高效酶解。作为优选，所述的乳清蛋白水溶液中，乳清蛋白的质量分数为2～8％。
为保证乳清蛋白充分溶解在水中，需将乳清蛋白置于90℃～100℃的水中搅拌10～20min，该溶解过程同时也是变性过程。作为优选，步骤(1)中，所述高温变性的温度为90～100℃，时间为10～20min。高温可以破坏蛋白质的立体结构，暴露出肽链，利于蛋白酶酶切，明显提高酶切效率。
中性蛋白酶适宜乳清蛋白溶液的天然pH值，无需用酸碱调节溶液pH。蛋白酶的添加量对氮回收率、乳清蛋白抗氧化肽的分子量大小和抗氧化性能均有影响。作为优选，步骤(1)中，所述中性蛋白酶与乳清蛋白的质量比为1～3:100。
不同酶解条件会获得不同终态pH的酶解液，影响后续ProteAX蛋白酶效力发挥，因此适宜酶解条件可获得最适宜后续Prote AX蛋白酶脱苦工序的酶解液。作为优选，步骤(1)中，所述一次酶解的温度为40～60℃，时间为2～5h。该酶解条件可以高效发挥蛋白酶酶活，提高多肽得率。
ProteAX蛋白酶的添加量会对乳清蛋白抗氧化肽的苦味有影响，同时，Prote AX具有一定的内肽酶活性，可进一步切割蛋白质和多肽，影响氮回收率、肽分子量和抗氧化能力。作为优选，步骤(1)中，所述ProteAX蛋白酶与乳清蛋白的质量比为1～3:100。
作为优选，步骤(1)中，所述二次酶解的温度为40～60℃，时间为2～5h。该酶解条件可以高效发挥蛋白酶酶活，提高多肽得率，降低多肽的苦味。
作为优选，步骤(2)中，所述离心的转速为6000～8000r/min，时间为10～20min；可以尽可能分离多肽和不溶性蛋白，提高多肽得率。
作为优选，步骤(2)中，所述超滤的截留量为6000～10000Da，压力为0.4～0.6MPa。超滤可以除去少数残留脂质和大分子蛋白和多肽，可以有效除去杂质，获得清澈纯净肽液，提高产品的抗氧化性能。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明采用中性蛋白酶和ProteAX蛋白酶对乳清蛋白进行两级酶解，得到氮回收率高、分子量小、抗氧化活性强且苦味低的乳清蛋白抗氧化肽粉。
(2)本发明方法无需反复调节pH和温度，只需一步灭酶即可，不仅绿色节能，而且减少后续脱盐步骤，易于工业连续化规模生产。
(3)本发明方法采用的酶水解能力强，氮回收率高，肽粉分子量小，抗氧化能力强，感官良好，可单独作为功能性食品或作为添加剂应用于其他食品中。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
下列实施例中涉及的DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、氮回收率和分子量分布的测定方法如下：
(1)DPPH自由基清除率的测定：
①在5mL离心管中分别加入0.1mL纯水和1.9mL DPPH无水乙醇溶液(1mmoL/L)，摇匀后于暗处反应30min后，用紫外分光光度计检测其515nm下的吸光值Ac；
②在5mL离心管中分别加入0.1mL待测多肽液(2mg/mL)和1.9mL DPPH无水乙醇溶液(1mmoL/L)，摇匀后于暗处反应30min后，用紫外分光光度计检测其515nm下的吸光值Ai；
③DPPH清除率用以下公式计算结果：
(2)ABTS自由基清除率的测定：
①ABTS自由基制备：将440μL浓度为140mmoL/L的过硫酸钾溶液加入到25mL浓度为7mmoL/L的ABTS溶液中，混匀避光反应12h后定容至100mL得ABTS自由基反应液。
②在5mL离心管中分别加入0.1mL纯水和1.9mL ABTS反应溶液(2mmoL/L)，混合摇匀反应10min后用紫外分光光度计检测其734nm下的吸光值A0；
③在5mL离心管中分别加入0.1mL待测多肽液(2mg/mL)和1.9mL ABTS反应溶液，混合摇匀反应10min后用紫外分光光度计检测其734nm下的吸光值A1；
④ABTS清除率用以下公式计算结果：
(3)氮回收率测定：通过凯氏定氮法分别测定乳清蛋白和肽粉中的氮百分含量分别为N1和N2。
氮回收率通过下式计算：
(4)小分子量肽含量测定：利用GE AKTA pure蛋白纯化仪，配备Superdex Peptide10/300GL色谱柱，流动相为含0.1％(V/V)TFA的30％(V/V)乙腈溶液，流速0.5mL/min，检测波长为215nm。配制2mg/mL的多肽溶液，过0.22μm水系滤膜后进样100μL。分子量标准品选用抑肽酶(6511Da)、杆菌肽(1422Da)、还原型谷胱甘肽(614Da)和酪氨酸(181Da)。肽粉的分子量分布在200～1500Da范围内为小分子肽，利用不同分子量标准品确定小分子量肽的比例。
(5)感官评定：采用肽粉和10mg/mL的肽液进行感官评定。选用8名具有感官评定基础的评定员(4男4女，年龄22～25岁)，对肽粉和肽液的苦味、色泽和溶解度按照评分表进行评判，其中苦味值以不同浓度的单宁溶液为评定标准，50mmol/L单宁溶液为微弱苦味，100mmol/L单宁溶液为明显苦味，200mmol/L单宁溶液为强烈苦味。汇总8份评分，各项分别去掉最高分和最低分后取平均值即为产品得分。
表1感官评定表
实施例1
一种制备低苦味乳清蛋白抗氧化肽粉的方法，具体内容如下：
(1)蛋白酶酶解：取质量分数为5％的乳清蛋白水溶液，90℃下搅拌10min溶解乳清蛋白，降温至50℃时，置于磁力恒温酶反应器中，加入中性蛋白酶，中性蛋白酶与乳清蛋白的质量比为2:100，恒温酶解3.5h，一次酶解结束后不灭酶，继续添加ProteAX蛋白酶，ProteAX蛋白酶与乳清蛋白的质量比为1.5:100，恒温酶解3.5h，两次酶解结束后95℃煮沸灭酶10min，得乳清蛋白酶解液。
(2)肽粉的制备：酶解液7000r/min离心15min后，收集上清液为粗肽液，将粗肽液过截留量为10kDa的超滤膜，压力为0.5MPa，脱去脂质、大分子蛋白和多肽，再经冷冻干燥，得乳清蛋白肽粉。
实施例2
一种制备低苦味乳清蛋白抗氧化肽粉的方法，具体内容如下：
(1)蛋白酶酶解：取质量分数为2％的乳清蛋白水溶液，90℃下搅拌10min溶解乳清蛋白，降温至55℃时，置于磁力恒温酶反应器中，加入中性蛋白酶，中性蛋白酶与乳清蛋白的质量比为0.5:100，恒温酶解3h，一次酶解结束后不灭酶，继续添加ProteAX蛋白酶，ProteAX蛋白酶与乳清蛋白的质量比为0.5:100，恒温酶解3h，两次酶解结束后95℃煮沸灭酶10min，得乳清蛋白酶解液。
(2)肽粉的制备：酶解液7000r/min离心15min后，收集上清液为粗肽液，将粗肽液过截留量为10kDa的超滤膜，压力为0.5MPa，脱去脂质、大分子蛋白和多肽，再经冷冻干燥，得乳清蛋白肽粉。
实施例3
一种制备低苦味乳清蛋白抗氧化肽粉的方法，具体内容如下：
(1)蛋白酶酶解：取质量分数为5％的乳清蛋白水溶液，90℃下搅拌10min溶解乳清蛋白，降温至45℃时，置于磁力恒温酶反应器中，加入中性蛋白酶，中性蛋白酶与乳清蛋白的质量比为1.5:100，恒温酶解4h，一次酶解结束后不灭酶，继续添加ProteAX蛋白酶，ProteAX蛋白酶与乳清蛋白的质量比为1:100，恒温酶解3h，两次酶解结束后95℃煮沸灭酶10min，得乳清蛋白酶解液。
(2)肽粉的制备：酶解液7000r/min离心15min后，收集上清液为粗肽液，将粗肽液过截留量为10kDa的超滤膜，压力为0.5MPa，脱去脂质、大分子蛋白和多肽，再经冷冻干燥，得乳清蛋白肽粉。
实施例4
一种制备低苦味乳清蛋白抗氧化肽粉的方法，具体内容如下：
(1)蛋白酶酶解：取质量分数为8％的乳清蛋白水溶液，90℃下搅拌15min溶解乳清蛋白，降温至60℃时，置于磁力恒温酶反应器中，加入中性蛋白酶，中性蛋白酶与乳清蛋白的质量比为2.5:100，恒温酶解2.5h，一次酶解结束后不灭酶，继续添加ProteAX蛋白酶，ProteAX蛋白酶与乳清蛋白的质量比为1.5:100，恒温酶解2.5h，两次酶解结束后95℃煮沸灭酶10min，得乳清蛋白酶解液。
(2)肽粉的制备：酶解液7000r/min离心15min后，收集上清液为粗肽液，将粗肽液过截留量为10kDa的超滤膜，压力为0.5MPa，脱去脂质、大分子蛋白和多肽，再经冷冻干燥，得乳清蛋白肽粉。
对比例1
一种制备低苦味乳清蛋白抗氧化肽粉的方法，具体内容如下：
(1)蛋白酶酶解：取质量分数为5％的乳清蛋白水溶液，90℃下搅拌10min溶解乳清蛋白，降温至50℃时，置于磁力恒温酶反应器中，加入中性蛋白酶，中性蛋白酶与乳清蛋白的质量比为2:100，恒温酶解3h，酶解结束后95℃煮沸灭酶10min，得乳清蛋白酶解液。
(2)肽粉的制备：酶解液7000r/min离心15min后，收集上清液为粗肽液，将粗肽液过截留量为10kDa的超滤膜，压力为0.5MPa，脱去脂质、大分子蛋白和多肽，再经冷冻干燥，得乳清蛋白肽粉。
对比例2
一种制备低苦味乳清蛋白抗氧化肽粉的方法，具体内容如下：
(1)蛋白酶酶解：取质量分数为5％的乳清蛋白水溶液，90℃下搅拌10min溶解乳清蛋白，降温至50℃时，置于磁力恒温酶反应器中，加入ProteAX蛋白酶，ProteAX蛋白酶与乳清蛋白的质量比为2:100，恒温酶解3h，酶解结束后95℃煮沸灭酶10min，得乳清蛋白酶解液。
(2)肽粉的制备：酶解液7000r/min离心15min后，收集上清液为粗肽液，将粗肽液过截留量为10kDa的超滤膜，压力为0.5MPa，脱去脂质、大分子蛋白和多肽，再经冷冻干燥，得乳清蛋白肽粉。
对比例3
一种制备低苦味乳清蛋白抗氧化肽粉的方法，具体内容如下：
(1)蛋白酶酶解：取质量分数为4％的乳清蛋白水溶液，90℃下搅拌10min溶解乳清蛋白，降温至50℃时，置于磁力恒温酶反应器中，加入中性蛋白酶，中性蛋白酶与乳清蛋白的质量比为1.5:100，恒温酶解3h，一次酶解结束后不灭酶，继续添加风味蛋白酶，风味蛋白酶与乳清蛋白的质量比为1.5:100，恒温酶解3h，两次酶解结束后95℃煮沸灭酶10min，得乳清蛋白酶解液。所用的风味蛋白酶购自广西南宁庞博生物工程有限公司，来源于米曲霉发酵，包含了内切蛋白酶与外切肽酶两种活性。
(2)肽粉的制备：酶解液7000r/min离心15min后，收集上清液为粗肽液，将粗肽液过截留量为10kDa的超滤膜，压力为0.5MPa，脱去脂质、大分子蛋白和多肽，再经冷冻干燥，得乳清蛋白肽粉。
对比例4
一种制备低苦味乳清蛋白抗氧化肽粉的方法，具体内容如下：
(1)蛋白酶酶解：取质量分数为4％的乳清蛋白水溶液，90℃煮沸预处理10min后，冷却至50℃，再置于磁力恒温水浴装置中，按每1g乳清蛋白添加0.015g蛋白酶的比例添加中性蛋白酶，恒温酶解3h，一次酶解结束后不灭酶，降温至40℃，按每1g乳清蛋白添加0.015g蛋白酶的比例添加Peptidase R蛋白酶，保持40℃恒温酶解3h，两次酶解结束后，煮沸灭酶，得乳清蛋白酶解液。所用Peptidase R蛋白酶购自日本天野酶制剂公司，是一种源于米根霉(Rhizopus oryzae)发酵提炼而成的氨肽酶，外肽酶活力为420U/g。
(2)肽粉的制备：酶解液7000r/min离心15min后，收集上清液为粗肽液，将粗肽液过截留量为10kDa的超滤膜，压力为0.5MPa，脱去脂质、大分子蛋白和多肽，再经冷冻干燥，得乳清蛋白肽粉。
对比例5
一种制备低苦味乳清蛋白抗氧化肽粉的方法，具体内容如下：
(1)蛋白酶酶解：取质量分数为4％的乳清蛋白水溶液，90℃下搅拌10min溶解乳清蛋白，冷却至37℃，再置于磁力恒温水浴装置中，按每1g乳清蛋白添加0.015g蛋白酶的比例添加胰蛋白酶，恒温酶解3h，一次酶解结束后不灭酶，继续按每1g乳清蛋白添加0.010g蛋白酶的比例添加ProteAX蛋白酶，保持37℃恒温酶解3h，两次酶解结束后，煮沸灭酶，得乳清蛋白酶解液。所用的胰蛋白酶购自广西南宁庞博生物工程有限公司，从猪胰中提取纯化而得。
(2)肽粉的制备：酶解液7000r/min离心15min后，收集上清液为粗肽液，将粗肽液过截留量为10kDa的超滤膜，压力为0.5MPa，脱去脂质、大分子蛋白和多肽，再经冷冻干燥，得乳清蛋白肽粉。
对比例6
一种制备低苦味乳清蛋白抗氧化肽粉的方法，具体内容如下：
(1)蛋白酶酶解：取质量分数为4％的乳清蛋白水溶液，90℃下搅拌10min溶解乳清蛋白，降温至50℃时，置于磁力恒温酶反应器中，加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶与乳清蛋白的质量比为1.5:100，恒温酶解3h，一次酶解结束后不灭酶，继续添加ProteAX蛋白酶，ProteAX蛋白酶与乳清蛋白的质量比为1.5:100，恒温酶解3h，两次酶解结束后95℃煮沸灭酶10min，得乳清蛋白酶解液。所用的碱性蛋白酶购自广西南宁庞博生物工程有限公司，来源于细菌原生质体诱变选育出的地衣芽孢杆菌2709发酵而得，蛋白酶活力为800,000U/g。
(2)肽粉的制备：酶解液7000r/min离心15min后，收集上清液为粗肽液，将粗肽液过截留量为10kDa的超滤膜，压力为0.5MPa，脱去脂质、大分子蛋白和多肽，再经冷冻干燥，得乳清蛋白肽粉。
对比例7
一种制备低苦味乳清蛋白抗氧化肽粉的方法，具体内容如下：
(1)蛋白酶酶解：取质量分数为5％的乳清蛋白水溶液，90℃下搅拌10min溶解乳清蛋白，降温至50℃时，置于磁力恒温酶反应器中，同时加入中性蛋白酶和ProteAX蛋白酶，中性蛋白酶与乳清蛋白的质量比为1.5:100，ProteAX蛋白酶与乳清蛋白的质量比也为1.5:100，恒温酶解4h，酶解结束后95℃煮沸灭酶10min，得乳清蛋白酶解液。
(2)肽粉的制备：酶解液7000r/min离心15min后，收集上清液为粗肽液，将粗肽液过截留量为10kDa的超滤膜，压力为0.5MPa，脱去脂质、大分子蛋白和多肽，再经冷冻干燥，得乳清蛋白肽粉。
对比例8
一种制备低苦味乳清蛋白抗氧化肽粉的方法，具体内容如下：
(1)蛋白酶酶解：取质量分数为5％的乳清蛋白水溶液，90℃下搅拌10min溶解乳清蛋白，降温至50℃时，置于磁力恒温酶反应器中，加入ProteAX蛋白酶，ProteAX蛋白酶与乳清蛋白的质量比为1.5:100，恒温酶解3h，一次酶解结束后不灭酶，继续添加中性蛋白酶，中性蛋白酶与乳清蛋白的质量比为1.5:100，恒温酶解3h，两次酶解结束后95℃煮沸灭酶10min，得乳清蛋白酶解液。
(2)肽粉的制备：酶解液7000r/min离心15min后，收集上清液为粗肽液，将粗肽液过截留量为10kDa的超滤膜，压力为0.5MPa，脱去脂质、大分子蛋白和多肽，再经冷冻干燥，得乳清蛋白肽粉。
对上述实施例1～4和对比例1～8制备获得的乳清蛋白肽粉产品进行氮回收率、小分子肽含量、DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率的测定，以及苦味、色泽和溶解性的评定，结果如表2所示。
表2不同实施例1～4与对照例1～8的结果对比
Claims (9)
1.一种制备低苦味乳清蛋白抗氧化肽粉的方法，其特征在于，包括：
(1)配制乳清蛋白水溶液，高温变性后，加入中性蛋白酶进行一次酶解，再加入ProteAX蛋白酶进行二次酶解，酶解结束后，高温灭酶，得到乳清蛋白酶解液；
(2)将乳清蛋白酶解液依次经离心和超滤处理后，冷冻干燥，得到乳清蛋白抗氧化肽粉。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的乳清蛋白水溶液中，乳清蛋白的质量分数为2～8％。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述中性蛋白酶与乳清蛋白的质量比为1～3:100。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，高温灭酶的温度为90～100℃，时间为10～15min。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述一次酶解的温度为40～60℃，时间为2～5h。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述ProteAX蛋白酶与乳清蛋白的质量比为1～3:100。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述二次酶解的温度为40～60℃，时间为2～5h。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述离心的转速为6000～8000r/min，时间为10～20min。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述超滤的截留量为6000～10000Da，压力为0.4～0.6MPa。
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