CN101696241A - 从家蝇幼虫中诱导并提取金属硫蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的从家蝇幼虫中诱导并提取金属硫蛋白的方法，利用Cd2+，Zn2+，Cu2+的金属离子生物诱导剂的培养基，在非金属培养器皿中培养3-5日龄家蝇幼虫，将家蝇幼虫漂洗、灭菌、低温高速均浆，膜过滤、色谱分离、洗脱浓缩，真空冷冻干燥，能够获得分子量5300-6500dDa含有20-27％半胱氨酸的Zn\Cu金属硫蛋白及其亚型，分子结构中带有少量芳香族氨基酸。经过生物诱导后的幼虫蛋白中金属硫蛋白得率能到达1mg/g，本发明的生产方法成本低、纯度高、产量高。

Description

从家蝇幼虫中诱导并提取金属硫蛋白的方法
技术领域
本发明涉及一种物质提取方法，尤其是从家蝇幼虫中诱导并提取金属硫蛋白的方法。
背景技术
金属硫蛋白是一种分子量约为6000-8000Da的金属结合蛋白，富含半胱氨酸。金属硫蛋白广布于原核与真核的生物体内，具有参与稀有元素转运、贮存与代谢，以及重金属解毒和清除自由基等作用。该蛋白已被人们用于改善消化道微环境、治疗胃溃疡和配制化妆品等方面。金属硫蛋白的提取以及纯化方法很多，包括层析法、高效液相色谱法、毛细管电泳法等，但是多数只能用于实验室研究，不适于在工业生产中采用。并且目前金属硫蛋白的提取多数是从酵母菌、蜗牛及兔肝内提取硫蛋白，由于供体有限且成本高，不利于长期经济的发展，且现有提取方法的提取量较小、纯度较低。
发明内容
针对现有金属硫蛋白提取方法提取纯度低、提取量小等不足，本发明提供一种诱导并提取金属硫蛋白的方法，从家蝇幼虫中提取，降低了成本。在原有粗品的生产工艺基础上采用进一步离子交换层析和脱盐，研究了精品的生产工艺，同时对诱导次数以及采用生理盐水作为诱导剂进行了研究，提高金属硫蛋白的提取量及提取纯度。
本发明的从家蝇幼虫中诱导并提取金属硫蛋白的方法，其操作步骤如下：
a、以麦麸、水、10％EM复合菌群和含有锌、铜、铬复合离子诱导剂为原料，常温发酵10～50小时制成培养基；
b、取家蝇的卵植入a步骤制得的培养基内，温度控制在30～35摄氏度，二十四小时后在培养基表面均匀喷洒5％浓度的相当于培养基总量10％的Cd2+、Zn2+、Cu2+金属离子诱导剂，培养4～6天，即制得家蝇幼虫蛋白原料；
c、取经b步骤培养的幼虫在4～20摄氏度纯净水中漂洗2次，再放入20～50摄氏度、10％过氧化氢溶液浸泡10～120分钟；
d、将经c步骤处理的幼虫在无菌水中漂洗30分钟，置于离心干燥机中干燥3～20分钟，取出置于-30～-70摄氏度下冷冻保存；
e、取经d步骤处理的家蝇幼虫蛋白原料投入到高速均浆机中，按照投入原料的1∶1添加常温甘氨酸缓冲液制成均浆液，甘氨酸缓冲液的PH值7～9；浓度0.1～2mol/L；
f、再将e步骤得到的混合液进行0.1～0.45靘滤膜过滤，滤液浓度为1～10g/mL，膜过滤蛋白分子量12000～15000Da溶液；
g、将经f步骤制得的溶液进行模拟移动床色谱分离，洗脱泵流量0～1000mL/min，压力0～10Mpa；进样泵流量0～30mL/min，压力0～8Mpa；萃取泵流量0～100mL/min，压力0～10MPa；工作温度20～25摄氏度；模拟移动床色谱参数：解吸段4根柱、精制段4根柱、吸附段4根柱，进样流速Uf＝8～12mL/min，洗脱泵流速Ud＝340～380mL/min，萃取液流速Ue＝230～250mL/min，残余液流速Ur＝118～142mL/min，切换时间ts＝14～18min；
h、将经g步骤处理的残余液蛋白分子量5500～6500Da，注入真空浓缩罐内，经减压浓缩含水1～50％后，再进行真空冻干机冻干20小时，即制成金属硫蛋白产品。
作为本发明的进一步改进，上述色谱柱填料及流动相选择填料为反相硅胶ODS，填料粒度30～40um，洗脱流动相为乙醇与水的混合物，乙醇和水的体积比为5∶5。
本发明从家蝇幼虫中诱导提取金属硫蛋白的方法，简单易行，成本低、提取纯度高、提取量大。
具体实施方式
本发明从家蝇幼虫中诱导并提取金属硫蛋白的方法，其操作步骤如下：
a、以麦麸、水、10％EM复合菌群和含有锌、铜、铬复合离子诱导剂为原料，常温发酵10～50小时制成培养基；
b、取家蝇的卵植入a步骤制得的培养基内，温度控制在30～35摄氏度，二十四小时后在培养基表面均匀喷洒5％浓度的相当于培养基总量10％的Cd2+、Zn2+、Cu2+金属离子诱导剂，培养4～6天，即制得家蝇幼虫蛋白原料；
c、取经b步骤培养的幼虫在4～20摄氏度纯净水中漂洗2次，再放入20～50摄氏度、10％过氧化氢溶液浸泡10～120分钟；
d、将经c步骤处理的幼虫在无菌水中漂洗30分钟，置于离心干燥机中干燥3～20分钟，取出置于-30～-70摄氏度下冷冻保存；
e、取经d步骤处理的家蝇幼虫蛋白原料投入到高速均浆机中，按照投入原料的1∶1添加常温甘氨酸缓冲液制成均浆液，甘氨酸缓冲液的PH值7～9；浓度0.1～2mol/L；
f、再将e步骤得到的混合液进行0.1～0.45靘滤膜过滤，滤液浓度为1～10g/mL，膜过滤蛋白分子量12000～15000Da溶液；
g、将经f步骤制得的溶液进行模拟移动床色谱分离，洗脱泵流量0～1000mL/min，压力0～10Mpa；进样泵流量0～30mL/min，压力0～8Mpa；萃取泵流量0～100mL/min，压力0～10MPa；工作温度20～25摄氏度；色谱柱填料及流动相选择填料为反相硅胶ODS，填料粒度30～40um，洗脱流动相为乙醇与水的混合物，乙醇和水的体积比为5∶5；模拟移动床色谱参数：解吸段4根柱、精制段4根柱、吸附段4根柱，进样流速Uf＝8～12mL/min，洗脱泵流速Ud＝340～380mL/min，萃取液流速Ue＝230～250mL/min，残余液流速Ur＝118～142mL/min，切换时间ts＝14～18min；
h、将经g步骤处理的残余液蛋白分子量5500～6500Da，注入真空浓缩罐内，经压浓缩含水1～50％后，再进行真空冻干机冻干20小时，即制成金属硫蛋白产品。

Claims (2)

1.从家蝇幼虫中诱导并提取金属硫蛋白的方法，其操作步骤如下：
a、以麦麸、水、10％EM复合菌群和含有锌、铜、铬复合离子诱导剂为原料，常温发酵10～50小时制成培养基；
b、取家蝇的卵植入a步骤制得的培养基内，温度控制在30～35摄氏度，二十四小时后在培养基表面均匀喷洒5％浓度的相当于培养基总量10％的Cd2+、Zn2+、Cu2+金属离子诱导剂，培养4～6天，即制得家蝇幼虫蛋白原料；
c、取经b步骤培养的幼虫在4～20摄氏度纯净水中漂洗2次，再放入20～50摄氏度、10％过氧化氢溶液浸泡10～120分钟；
d、将经c步骤处理的幼虫在无菌水中漂洗30分钟，置于离心干燥机中干燥3～20分钟，取出置于-30～-70摄氏度下冷冻保存；
e、取经d步骤处理的家蝇幼虫蛋白原料投入到高速均浆机中，按照投入原料的1∶1添加常温甘氨酸缓冲液制成均浆液，甘氨酸缓冲液的PH值7～9；浓度0.1～2mol/L；
f、再将e步骤得到的混合液进行0.1～0.45靘滤膜过滤，滤液浓度为1～10g/mL，膜过滤蛋白分子量12000～15000Da溶液；
g、将经f步骤制得的溶液进行模拟移动床色谱分离，洗脱泵流量0～1000mL/min，压力0～10Mpa；进样泵流量0～30mL/min，压力0～8Mpa；萃取泵流量0～100mL/min，压力0～10MPa；工作温度20～25摄氏度；模拟移动床色谱参数：解吸段4根柱、精制段4根柱、吸附段4根柱，进样流速Uf＝8～12mL/min，洗脱泵流速Ud＝340～380mL/min，萃取液流速Ue＝230～250mL/min，残余液流速Ur＝118～142mL/min，切换时间ts＝14～18min；
h、将经g步骤处理的残余液蛋白分子量5500～6500Da，注入真空浓缩罐内，经减压浓缩含水1～50％后，再进行真空冻干机冻干20小时，即制成金属硫蛋白产品。
2.如权利要求1所述的从家蝇幼虫中诱导并提取金属硫蛋白的方法，其特征在于色谱柱填料及流动相选择填料为反相硅胶ODS，填料粒度30～40um，洗脱流动相为乙醇与水的混合物，乙醇和水的体积比为5∶5。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN103275215A (zh) * 2013-06-03 2013-09-04 沅江普济生物科技有限公司 一种从河蚌中提取金属硫蛋白的方法

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