CN102816233A - 定向诱导合成金属硫蛋白的工艺 - Google Patents
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Abstract
定向诱导合成金属硫蛋白的工艺，属于生物工程领域。针对现有金属硫蛋白来源的局限性，本发明的定向诱导合成金属硫蛋白的工艺是通过以下技术方案实现的：1、选择合适的原材料配制培养基；2、培养基二次发酵复制；3、大麦虫虫卵培殖；4、大麦虫虫卵植入复制培养基中；5、超声波振荡培育；6、大麦虫成虫处理；7、微滤与超滤；8、超声驻波液相制备色谱分离纯化；9、冷冻干燥至成品。本发明不仅为金属硫蛋白生产提供了一种新的工艺，而且由于分离过程的特殊性，确保了金属硫蛋白的生物活性，具有工业化生产的价值。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，尤其是涉及一种定向诱导合成金属硫蛋白及分离纯化工艺。
背景技术
金属硫蛋白是一种含有大量Cd和Zn的蛋白质，广泛存在于生物体内。金属硫蛋白相对分子质量6000~10000，富含氨基酸和半胱氨酸，并能大量结合金属离子，具有很强的生物活性。
大量研究结果表明，金属硫蛋白有下列功能：1、清除自由基，拮抗电离辐射；2、参与微量元素的贮存、运输和代谢；3、重金属的解毒作用；4、参与激素和发育过程的调节，增强机体对各种应激反应；5、参与细胞DNA的复制和转录，蛋白质的合成与分解，以及能量代谢的调节过程。
201110076199.2公开了一种虫草金属硫蛋白的生产方法。生产步骤为：虫草菌—液体培养—过滤—含金属硫蛋白菌体—研磨—有机物变性—去杂蛋白—加热变性—除变性蛋白—超滤浓缩—层析—冷冻干燥成品。
201110063616.X公开了嗜冷红酵母中金属硫蛋白的制备工艺，工艺过程为菌株筛选—培养—细胞破壁—凝胶过滤—离子层析—冷冻干燥成品。
200910308720.3 公开了从家蝇幼虫中诱导并提取金属硫蛋白的方法。该方法利用富含金属离子生物诱导剂的培养基加入家蝇幼虫培育出成虫，再经漂洗、灭菌、均浆、膜过滤、分离、浓缩、冷冻干燥成品。
01128543.5 公开了液体涂层发酵转基因工程菌生产人或动物金属硫蛋白制品的方法。该方法是将转基因工程菌通过深层发酵、培养工程菌、过滤、洗涤、冷冻干燥成品。
200910309136.X 公开了一种富锌黄粉虫的饲养方法，该方法包括幼虫养殖、富锌养殖，大龄黄粉虫用硫酸锌水溶液饲喂得富锌黄粉虫。
200910309135.5 公开了一种富硒黄粉虫的饲养方法，该方法包括幼虫养殖、富硒养殖，大龄黄粉虫用***钠水饲喂，得富硒黄粉虫。
01131966.6公开了金属硫蛋白的制备方法，该方法选择金属硫蛋白工程菌，接种于培养液，收集菌体，超声破碎，层析分离，梯度洗脱，收集目标蛋白。
金属硫蛋白是一种用途广泛的金属蛋白物，但是由于来源的局限性，科技人员一直在研究开发产生金属硫蛋白的原料，产率和效率是一个长期关注的问题。
发明内容
针对现有金属硫蛋白来源的局限性，本发明提供一种定向诱导合成金属硫蛋白的工艺。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：1、选择合适的原材料配制培养基；2、培养基二次发酵复制；3、大麦虫虫卵培殖；4、大麦虫虫卵植入复制培养基中；5、超声波振荡培育；6、大麦虫成虫处理；7、微滤与超滤；8、超声驻波液相制备色谱分离纯化；9、冷冻干燥至成品；具体步骤如下：
（1）选择合适的原材料配制培养基，所述培养基由1000g麦麸或米糠、50~200g大豆豆粉、0~20g赖氨酸、0~20g甘氨酸、10~80g胱氨酸、10~20gCuSO4、5~20gNaCl、0~20gCdSO4、0~10gCaSO4、0~20gZnSO4混合而成；
（2）上述培养基喷淋去离子水，保持温度25~45℃，时间48~120h，使培养基充分发酵；
（3）将大麦虫雄虫与雌虫按2：3比例混合，保持温度25~30℃，湿度60~85%，雄虫与雌虫交配5~7天产卵，虫卵在8~12天孵化出幼虫，收集幼虫；
（4）将5~8g幼虫置于前述的发酵培养基中，保持温度20~30℃、湿度60~85%培养，待幼虫第一次脱皮后超声波振荡培育；
（5）待幼虫脱皮6次后的第4~6天，收集大麦幼虫，用去离子水清洗，甩干大麦幼虫表面水分；
（6）甩干的大麦幼虫捣碎，加热80~100℃，时间5~10min，离心分离，收集分离液；
（7）分离液进行微滤与超滤处理，收集浓缩液；
（8）100mL浓缩液溶于1000~2000mL溶剂体系中，泵入超声驻波液相制备色谱里连续分离纯化金属硫蛋白；
（9）将分离纯化的金属硫蛋白冷冻干燥至成品。
本发明根据金属硫蛋白化学成份与结构特征，选择并配制合适的培养基；以大麦虫虫卵作为生物合成的载体，随着大麦虫生长过程，采用化学成分，超声波定向催化使得大麦虫机体大量合成金属硫蛋白，该金属硫蛋白为白色或微黄色冻干品，相对分子量6800Da，分子直径50 
，等电点为4，含量为90-99%。本发明不仅为金属硫蛋白生产提供了一种新的工艺，而且由于分离过程的特殊性，确保了金属硫蛋白的生物活性，具有工业化生产的价值。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
实施例1：
（1）取1000g麦麸，100~200g大豆豆粉，10~20g赖氨酸，50~80g胱氨酸，10~15gCuSO4，5~10gNaCl，及10~20gCdSO4，5~10g CaSO4混合均匀成为培养基；
（2）上述培养基喷淋500~1000mL去离子水，保持温度25~45℃，时间48~120h，培养基充分发酵；
（3）选羽化后10~20天的大麦虫，将雄虫与雌虫按2：3比例混合，保持温度25~30℃，湿度60~85%，雄虫与雌虫交配5~7天产卵，虫卵在8~12天孵化出幼虫，收集幼虫；
（4）将5~8g幼虫置前述的发酵培养基中，保持温度20~30℃、湿度60~85%培养，待幼虫第一次脱皮后，用超声波发生器在频率250~500kHz、功率0.1~0.5kw超声处理2~10min，每间隔8~10h重复超声处理一次，幼虫培育周期50~80d；
（5）待幼虫脱皮6次后的第4~6天，收集大麦幼虫，1000g大麦幼虫用2L~10L去离子水清洗3次，甩干大麦幼虫表面水分；
（6）甩干的大麦幼虫放入组织捣碎匀浆机中以10000~15000r/min捣碎，加热80~100℃，时间5~10min，离心机750~1250r/min分离，收集分离液；
（7）分离液用膜孔径0.5~1.0μm微孔膜过滤机过滤，再用膜孔径10~120nm超滤机浓缩，收集浓缩液；
（8）100mL浓缩液溶于由质量比4.5%PEG6000-质量比8.0%葡萄糖T600组成的1000~2000mL溶剂体系中，泵入超声驻波液相制备色谱里，以超声频率500~1000kHz、功率0.1~1.5kw、流速20~100ml/min、紫外检测器波长220nm连续分离纯化金属硫蛋白；
（9）将分离纯化的金属硫蛋白用真空冷冻干燥机在真空度10~50kpa、温度-30~50℃、时间15~24h干燥含水份5~6%为成品，金属硫蛋白含量为95.5%。
实施例2
（1）取1000g米糠，50~100g大豆蛋白粉，10~20g甘氨酸，10~20g胱氨酸，10~20gCuSO4，10~20gNaCl，10~20gZnSO4充分混合成为培养基；
（2）上述培养基喷淋500~1000mL去离子水，保持温度25~45℃，时间48~120h，培养基充分发酵；
（3）选羽化后10~20天的大麦虫，将雄虫与雌虫按2：3比例混合，保持温度25~30℃，湿度60~85%，雄虫与雌虫交配5~7天产卵，虫卵在8~12天孵化出幼虫，收集幼虫；
（4）将5~8g幼虫置前述的发酵培养基中，保持温度20~30℃、湿度60~85%培养，待幼虫第一次脱皮后，用超声波发生器在频率250~500kHz、功率0.1~0.5kw超声处理2~10min，每间隔8~10h重复超声处理一次，幼虫培育周期50~80d；
（5）待幼虫脱皮6次后的第4~6天，收集大麦幼虫，1000g大麦幼虫用2L~10L去离子水清洗3次，甩干大麦幼虫表面水分；
（6）甩干的大麦幼虫放入组织捣碎匀浆机中以10000~15000r/min捣碎，加热80~100℃，时间5~10min，离心机750~1250r/min分离，收集分离液；
（7）分离液用膜孔径0.5~1.0μm微孔膜过滤机过滤，再用膜孔径10~120nm超滤机浓缩，收集浓缩液；
（8）100mL浓缩液溶于1000~2000mL由亚丁醇-***-水按照10：5：12体积比组成的溶剂体系中，注入超声驻波液相制备色谱中，超声频率500~1000kHz，功率0.1~1.5kw，流速20~100ml/min，紫外检测器波长220nm，连续分离纯化金属硫蛋白；
（9）将分离纯化的金属硫蛋白用真空冷冻干燥机在真空度10~50kPa、温度-30~50℃、时间15~24h干燥含水份5~6%为成品，金属硫蛋白含量为96.2%。
Claims (10)
1.定向诱导合成金属硫蛋白的工艺，其特征在于所述工艺如下：
（1）选择合适的原材料配制培养基；
（2）上述培养基喷淋去离子水，保持温度25~45℃，时间48~120h，使培养基充分发酵；
（3）将大麦虫雄虫与雌虫按2：3比例混合，保持温度25~30℃，湿度60~85%，雄虫与雌虫交配5~7天产卵，虫卵在8~12天孵化出幼虫，收集幼虫；
（4）将5~8g幼虫置于前述的发酵培养基中，保持温度20~30℃、湿度60~85%培养，待幼虫第一次脱皮后超声波振荡培育；
（5）待幼虫脱皮6次后的第4~6天，收集大麦幼虫，用去离子水清洗，甩干大麦幼虫表面水分；
（6）甩干的大麦幼虫捣碎，加热80~100℃，时间5~10min，离心分离，收集分离液；
（7）分离液进行微滤与超滤处理，收集浓缩液；
（8）100mL浓缩液溶于1000~2000mL溶剂体系中，泵入超声驻波液相制备色谱里连续分离纯化金属硫蛋白；
（9）将分离纯化的金属硫蛋白冷冻干燥至成品。
2.根据权利要求1所述的定向诱导合成金属硫蛋白的工艺，其特征在于所述步骤（1）中，培养基由1000g麦麸或米糠、50~200g大豆豆粉、0~20g赖氨酸、0~20g甘氨酸、10~80g胱氨酸、10~20gCuSO4、5~20gNaCl、0~20gCdSO4、0~10gCaSO4、0~20gZnSO4混合而成。
3.根据权利要求2所述的定向诱导合成金属硫蛋白的工艺，其特征在于所述培养基由1000g麦麸、100~200g大豆豆粉、10~20g赖氨酸、50~80g胱氨酸、10~15gCuSO4、5~10gNaCl、10~20gCdSO4、5~10g CaSO4混合而成。
4.根据权利要求2所述的定向诱导合成金属硫蛋白的工艺，其特征在于所述培养基由1000g米糠、50~100g大豆蛋白粉、10~20g甘氨酸、10~20g胱氨酸、10~20gCuSO4、10~20gNaCl、10~20gZnSO4混合而成。
5.根据权利要求1所述的定向诱导合成金属硫蛋白的工艺，其特征在于所述步骤（4）中，每间隔8~10h重复超声处理一次，幼虫培育周期50~80d，超声波振荡频率为250~500kHz，功率为0.1~0.5kw，时间为2~10min。
6.根据权利要求1所述的定向诱导合成金属硫蛋白的工艺，其特征在于所述步骤（7）中，分离液用膜孔径0.5~1.0μm微孔膜过滤机过滤，再用膜孔径10~120nm超滤机浓缩。
7.根据权利要求1所述的定向诱导合成金属硫蛋白的工艺，其特征在于所述步骤（8）中，溶剂体系由质量比4.5%PEG6000-质量比8.0%葡萄糖T600组成。
8.根据权利要求1所述的定向诱导合成金属硫蛋白的工艺，其特征在于所述步骤（8）中，溶剂体系由亚丁醇-***-水按照10：5：12体积比组成。
9.根据权利要求1所述的定向诱导合成金属硫蛋白的工艺，其特征在于所述步骤（8）中，超声频率500~1000kHz，功率0.1~1.5kw，流速20~100ml/min，紫外检测器波长220nm。
10.根据权利要求1所述的定向诱导合成金属硫蛋白的工艺，其特征在于所述步骤（9）中，分离纯化的金属硫蛋白用真空冷冻干燥机在真空度10~50kPa、温度-30~50℃、时间15~24h干燥含水份5~6%为成品。
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