CN106834395A - 一种适合工业化生产的重组水蛭素分离纯化的方法 - Google Patents

一种适合工业化生产的重组水蛭素分离纯化的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106834395A
CN106834395A CN201710244487.1A CN201710244487A CN106834395A CN 106834395 A CN106834395 A CN 106834395A CN 201710244487 A CN201710244487 A CN 201710244487A CN 106834395 A CN106834395 A CN 106834395A
Authority
CN
China
Prior art keywords
zymotic fluid
ludon
lepirudin
purified
isolated
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710244487.1A
Other languages
English (en)
Inventor
程度胜
桑建彬
薛霞
韩明娣
龙应国
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Sihuan Biopharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Beijing Sihuan Biopharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Sihuan Biopharmaceutical Co Ltd filed Critical Beijing Sihuan Biopharmaceutical Co Ltd
Priority to CN201710244487.1A priority Critical patent/CN106834395A/zh
Publication of CN106834395A publication Critical patent/CN106834395A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种适合工业化生产的重组水蛭素分离纯化的方法，属于生物技术制药领域。取HV3甘油菌种培养发酵得到发酵液，将发酵液离心，得发酵液上清液，发酵液上清液用12M盐酸调节pH，之后放入发酵罐中加热的处理方式，有效除去杂蛋白，大大降低后续纯化工艺的难度，提高大批量生产工艺的可操作性。所得发酵液从罐中取出保持2‑8℃静置之后采用滤器过滤的方法，去除杂蛋白和脂类物质，提高大批量生产工艺的可操作性，本发明根据水蛭素结构特点设计的分离纯化工艺有效，提高蛋白纯度的同时大大降低色素含量，工艺操作简便、成本较低。

Description

一种适合工业化生产的重组水蛭素分离纯化的方法
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及适合工业化生产的重组水蛭素分离纯化的方法。
背景技术
目前，水蛭素是蛭类动物唾液腺分泌的一种酸性多肽，含有65～66个氨基酸残基，主要有HV1、HV2、HV3这3种异构体，它们之间具有很高的结构同源性。水蛭素是迄今发现的作用最强的凝血酶特异性抑制剂，水蛭素(HV3)蛋白表达工程菌菌种活性取决于抗凝血酶活性强度，它与凝血酶以等摩尔比形成非共价键紧密结合的稳定复合物。药理学及临床研究表明，水蛭素可用于深静脉血栓、Ⅱ型肝素相关的血小板减少症和弥漫性血管内凝血，并在血液透析和体外循环时预防血栓形成等。与肝素、阿司匹林等传统的抗凝药物相比，水蛭素用量小、疗效高、不良反应少而轻、不会引起过敏反应。重组水蛭素已成为一种高效、专一、安全的新型抗凝、防栓药物，具有广阔的临床应用前景。
由于目前水蛭素分离纯化时采用大批量发酵液加热后放入发酵罐中的处理方式，不适于大批量工业化生产，并且在去除杂蛋白和脂类物质时，采取低温离心的方法，大批量生产的可操作性差，且蛋白纯度低、色素含量较高，成本高。分离纯化水蛭素时需提高蛋白纯度的同时大大降低色素含量，使工艺操作简便、成本较低，且适合工业化放大生产有赖于新的技术和方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种适合工业化生产的重组水蛭素分离纯化的方法，利用发酵液上清液通过pH调节和上罐加热的处理方式，提高蛋白纯度的同时大大降低色素含量，使工艺操作简便；采用低温静置后过滤的方法去除杂蛋白和脂类物质，降低成本，且提高工艺的可操作性，适合工业化生产。
为了实现上述目的，本发明技术方案如下：
本发明提供一种适合工业化生产的重组水蛭素分离纯化的方法，步骤如下：
(1)取水蛭素(HV3)蛋白表达工程菌菌种培养发酵得到发酵液，将发酵液离心，得发酵液上清液，备用；
(2)将上述发酵液上清液用盐酸将pH调为3.8-4.2，之后放入发酵罐中加热至78-82℃，备用；
(3)将步骤(2)中所得发酵液从罐中取出保持2-8℃静置，待分层后取发酵液上清液，备用；
(4)将步骤(3)中发酵液上清液用0.45μm过滤器进行过滤；将过滤后的发酵液进行分离纯化得到目的蛋白活性部分。
优选地，适合工业化生产的重组水蛭素分离纯化的方法，步骤(1)中菌种培养发酵的步骤如下：
A、将保存的水蛭素(HV3)蛋白表达工程菌菌种在LBA固体培养基上保持恒温静止培养11-13小时，得到单菌落，备用；
B、选取上述单菌落，接种于LBA液体培养基中保持恒温摇床培养14-16小时，得一级种子液，备用；
C、吸取上述一级种子液，接种于LBA液体培养基中继续培养，保持恒温摇床培养14-16小时，制得二级种子液，备用；
D、监测上述二级种子液的OD600nm值，待OD600nm值达到4.0-4.4时，开始流加补碳培养基，补料过程中将溶氧控制在20％-40％，待OD600连续4.5-5.5小时不再增长时，停止补碳，开始缓慢流加补氮培养基，待水蛭素(HV3)蛋白表达工程菌菌种活性不再增长时，停止补氮，发酵至菌体进入自溶阶段、产物合成能力下降时终止发酵，制得发酵液，备用；
优选地，适合工业化生产的重组水蛭素分离纯化的方法，菌种培养发酵的步骤A-C中，恒温控制在36.5-37.5℃。
优选地，适合工业化生产的重组水蛭素分离纯化的方法，菌种培养发酵的步骤A-C中，恒温控制在37℃。
优选地，适合工业化生产的重组水蛭素分离纯化的方法，步骤(2)中，发酵上清液用12M盐酸将pH调为4.0，将发酵液放入罐中加热至80℃。
更优选地，适合工业化生产的重组水蛭素分离纯化的方法，将发酵液放入罐中加热至80℃保持50-70分钟，有效除去杂蛋白。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明关键在于适合工业化生产的重组水蛭素分离纯化工艺的设计。实验证实，使用所设计的分离纯化工艺，发酵液上清液通过pH调节和上罐加热的处理方式，提高蛋白纯度的同时大大降低色素含量，使工艺操作简便；采用低温静置后过滤的方法去除杂蛋白和脂类物质，降低成本，且提高工艺的可操作性，适合工业化生产。
附图说明
图1为具体实施方式步骤4中所提供的HV3发酵过程菌体浓度OD600值和上清液抗凝血酶活性。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施方式对本发明提供的适合工业化生产的重组水蛭素分离纯化的方法作进一步的详细说明。
水蛭素(HV3)蛋白表达工程菌，见江苏省南京中央路童家巷24号的中国药科大学谭树华、吴梧桐申请的“新型分泌表达载体及其在重组水蛭素表达技术中的应用”，专利申请号：01113526.3，授权公告日：20031119。
步骤1：菌种活化
将水蛭素(HV3)蛋白表达工程菌菌种一支于室温解冻，用接菌环接种，在LBA固体培养基上划线，倒置在恒温培养箱中，保持恒温37℃静止培养12小时，得到形状规则的圆形单菌落；
步骤2：一级种子培养
从LBA固体培养基上，选取形状规则的，圆形,单个菌落，挑取单菌落，接种于LBA液体培养基中保持恒温37℃摇床培养14-16小时，得一级种子液；
步骤3：二级种子培养
吸取5％的一级种子液，接种于LBA液体培养基中继续培养，保持恒温37℃摇床培养14-16小时，制得二级种子液，备用；
步骤4：发酵
监测上述二级种子液的OD600nm值，待OD600nm值达到4.2左右时，开始流加补碳培养基，根据溶氧的变化，补料的速度呈指数或线性增加，补料过程中将溶氧控制在20％～40％，待OD600连续5小时左右不再增长时，停止补碳，开始缓慢流加补氮培养基，待抗凝血酶活性不再增长时，停止补氮，发酵至菌体进入自溶阶段、产物合成能力下降时终止发酵，制得发酵液，发酵时长约20小时左右，如图1所示；
步骤5：发酵液预处理
将上述发酵液进行离心，制得发酵液上清液，发酵液上清液用12M盐酸将pH调为4.0，之后放入发酵罐中加热至80℃，保持60分钟后将发酵液从罐中取出保持2-8℃静置，待分层后取发酵液上清液，用4层纱布过滤，和0.45μm过滤器过滤；
步骤6：发酵液纯化
(1)阳离子交换树脂SP sepharose Fast Flow
装SP sepharose Fast Flow阳离子交换树脂柱，使用去离子水冲洗除去树脂保存液，用50mM柠檬酸-NaOH(pH3.0)缓冲液平衡，将过滤后的发酵液经以5ml/min的速度上样。用50mM柠檬酸-NaOH(pH3.0)缓冲液和50mM柠檬酸-NaOH(pH4.25)缓冲液洗去部分杂蛋白和色素，采用50mM柠檬酸c-NaOH(pH5.5)缓冲液进行洗脱目的蛋白。每步收集穿过液，凝血酶滴定法测比活，记录数据，收集活性部分。
(2)快速蛋白液相色谱Fast protein liquid chromatography(FPLC)
将SP sepharose Fast Flow阳离子交换层析洗脱液经C18反相柱进行分离纯化。甲醇-水作为流动相，A相为0.2％TFA/dd H2O，B相为甲醇，流速20ml/min，检测波长280nm。
甲醇-水梯度洗脱体系：
15％B平衡反相柱30mim至基线平行；依次使用0-30min 30％B；30-40min，65％B；40-50min，60％-100％B。收集活性部分。
表1纯化后水蛭素(HV3)的回收率
步骤5中除去杂蛋白和脂类物质时，以往技术中大批量发酵液罐外加热之后采取低温离心的处理方式不方便操作，本发明采取发酵液上清通过pH调节和上罐加热80℃保持60分钟之后低温静置并且过滤的处理方式，有效除去杂蛋白，大大降低后续纯化工艺的难度，提高工艺的可操作性，成本较低，且适合工业化生产。
以上对本发明所提供的适合工业化生产的重组水蛭素分离纯化的方法进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (6)

1.一种适合工业化生产的重组水蛭素分离纯化的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)取水蛭素(HV3)蛋白表达工程菌菌种培养发酵得到发酵液，将发酵液离心，得发酵液上清液，备用；
(2)将上述发酵液上清液用盐酸将pH调为3.8-4.2，之后放入发酵罐中加热至78-82℃，备用；
(3)将步骤(2)中所得发酵液从罐中取出保持2-8℃静置，待分层后取发酵液上清液，备用；
(4)将步骤(3)中发酵液上清液用0.45μm过滤器进行过滤；将过滤后的发酵液进行分离纯化得到目的蛋白活性部分。
2.根据权利要求1所述的适合工业化生产的重组水蛭素分离纯化的方法，其特征在于，步骤(1)中菌种培养发酵的步骤如下：
A、将保存的水蛭素(HV3)蛋白表达工程菌菌种在LBA固体培养基上保持恒温静止培养11-13小时，得到单菌落，备用；
B、选取上述单菌落，接种于LBA液体培养基中保持恒温摇床培养14-16小时，得一级种子液，备用；
C、吸取上述一级种子液，接种于LBA液体培养基中继续培养，保持恒温摇床培养14-16小时，制得二级种子液，备用；
D、监测上述二级种子液的OD600nm值，待OD600nm值达到4.0-4.4时，开始流加补碳培养基，补料过程中将溶氧控制在20％-40％，待OD600连续4.5-5.5小时不再增长时，停止补碳，开始缓慢流加补氮培养基，待水蛭素(HV3)蛋白表达工程菌菌种活性不再增长时，停止补氮，发酵至菌体进入自溶阶段、产物合成能力下降时终止发酵，制得发酵液，备用。
3.根据权利要求2所述的适合工业化生产的重组水蛭素分离纯化的方法，其特征在于，菌种培养发酵的各步骤中，恒温控制在36.5-37.5℃。
4.根据权利要求3所述的适合工业化生产的重组水蛭素分离纯化的方法，其特征在于，菌种培养发酵的各步骤中，恒温控制在37℃。
5.根据权利要求1所述的适合工业化生产的重组水蛭素分离纯化的方法，其特征在于，步骤(2)中，发酵上清液用12M盐酸将pH调为4.0，将发酵液放入罐中加热至80℃。
6.根据权利要求5所述的适合工业化生产的重组水蛭素分离纯化的方法，其特征在于，将发酵液放入罐中加热至80℃保持50-70分钟，有效除去杂蛋白。
CN201710244487.1A 2017-04-14 2017-04-14 一种适合工业化生产的重组水蛭素分离纯化的方法 Pending CN106834395A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710244487.1A CN106834395A (zh) 2017-04-14 2017-04-14 一种适合工业化生产的重组水蛭素分离纯化的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710244487.1A CN106834395A (zh) 2017-04-14 2017-04-14 一种适合工业化生产的重组水蛭素分离纯化的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106834395A true CN106834395A (zh) 2017-06-13

Family

ID=59146993

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710244487.1A Pending CN106834395A (zh) 2017-04-14 2017-04-14 一种适合工业化生产的重组水蛭素分离纯化的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106834395A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107353338A (zh) * 2017-07-27 2017-11-17 宁波博睿修存生物科技有限公司 一种分离水蛭素发酵液中色素分子的方法
CN107459572A (zh) * 2017-07-27 2017-12-12 宁波博睿修存生物科技有限公司 一种浓缩发酵液中水蛭素的方法
CN109957008A (zh) * 2019-04-16 2019-07-02 广东双骏生物科技有限公司 水蛭素突变体的提取纯化方法及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102373216A (zh) * 2011-10-28 2012-03-14 元昊 一种含有医用水蛭素基因的重组真核汉逊酵母工程菌株的构建及重组水蛭素的生产工艺
CN102965419A (zh) * 2011-08-28 2013-03-13 杭州路富生物科技有限公司 一种重组人生长激素工程菌的发酵优化工艺

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102965419A (zh) * 2011-08-28 2013-03-13 杭州路富生物科技有限公司 一种重组人生长激素工程菌的发酵优化工艺
CN102373216A (zh) * 2011-10-28 2012-03-14 元昊 一种含有医用水蛭素基因的重组真核汉逊酵母工程菌株的构建及重组水蛭素的生产工艺

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
周卫斌等: ""毕赤酵母发酵液的脱色和重组水蛭素的分离"", 《生物工程学报》 *
崔莉等: ""重组水蛭素Ⅲ的工程菌的培养及高密度发酵"", 《药物生物技术》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107353338A (zh) * 2017-07-27 2017-11-17 宁波博睿修存生物科技有限公司 一种分离水蛭素发酵液中色素分子的方法
CN107459572A (zh) * 2017-07-27 2017-12-12 宁波博睿修存生物科技有限公司 一种浓缩发酵液中水蛭素的方法
CN107353338B (zh) * 2017-07-27 2020-11-17 宁波博睿修存生物科技有限公司 一种分离水蛭素发酵液中色素分子的方法
CN109957008A (zh) * 2019-04-16 2019-07-02 广东双骏生物科技有限公司 水蛭素突变体的提取纯化方法及其应用
CN109957008B (zh) * 2019-04-16 2021-12-24 广东双骏生物科技有限公司 水蛭素突变体的提取纯化方法及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11525130B2 (en) Process and system for obtaining botulinum neurotoxin
US10414795B2 (en) Techniques of preparing collagen active peptides
CN106834395A (zh) 一种适合工业化生产的重组水蛭素分离纯化的方法
JP2012532932A5 (zh)
CN102089438A (zh) 使用含有植物源性组分的培养基和挠性密闭容器来制备肉毒梭菌毒素的方法
CN102190722A (zh) 一种纯化重组人血白蛋白的方法
Trexler et al. A cyclical semicontinuous process for production of human α1‐antitrypsin using metabolically induced plant cell suspension cultures
CN103739704B (zh) 龟鳖胶原蛋白及其提取方法
CN100392078C (zh) 一种酸性海藻糖酶及其制备方法
CN108840928B (zh) 一种太子参胰蛋白酶抑制剂及其制备方法
CN105622623A (zh) 一种叶绿素提取工艺
CN103627683A (zh) 一种重组人源超氧化物歧化酶的生产方法
CN101693888A (zh) 一种黄粉虫纤溶酶及其制备方法与应用
CN106148308A (zh) 一种重组枯草杆菌纤溶酶的分离纯化方法
CN110042139A (zh) 一种动物血活性复合肽的制备方法及其应用
CN1286850C (zh) 胸腺肽的制备方法
CN105061575B (zh) 一种金枪鱼肝脏抗菌肽及其制备方法和用途
CN105483201B (zh) 乳清抗氧化肽的发酵制备方法
CN101717430A (zh) 一种重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体的纯化方法
CN102372777A (zh) 天然丝氨酸蛋白酶抑制剂的纯化方法
CN101696241A (zh) 从家蝇幼虫中诱导并提取金属硫蛋白的方法
CN203295493U (zh) 一种液体酶制剂超滤浓缩***
CN113121638B (zh) 一种纯化重组蛋白的方法
CN104327180A (zh) 一种重组人血小板衍生生长因子bb的纯化方法
AU2010273601B2 (en) Process and system for obtaining botulinum neurotoxin

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170613

RJ01 Rejection of invention patent application after publication