CN101680888B - 非特异吸附防止剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种非特异吸附防止剂，其由通过使含有单体A和单体B的单体单元进行聚合而得到的水溶性聚合物而构成，所述单体(A)能够通过均聚聚合而形成在常压的水溶液中、80℃以下具有最低临界溶解温度LCST的聚合物，所述单体(B)能够通过均聚聚合而形成在常压的水溶液中不具有LCST的非离子性水溶性均聚物。

Description

非特异吸附防止剂
技术领域
本发明涉及防止在例如临床诊断药、临床诊断装置、生物芯片等中使用的各种蛋白等的非特异吸附的非特异吸附防止剂。 
背景技术
近年来，为了疾病的早期发现等的目的，而要求检查的高敏感度，提高诊断药的敏感度成为一大课题。在使用聚苯乙烯片、磁性粒子等固相的诊断药中，为了提高敏感度，也在从使用酶显色作为检测方式的方式，向着使用能得到更高的敏感度的荧光、化学发光的方式转变着，但实际上并未得到足够的敏感度。其原因是，在血清等生物分子混合存在下检测特定的物质进行诊断时，共存的生物分子、2次抗体、发光底物等向固相、器具/容器等进行非特异的吸附，其结果是干扰增加而防碍了高敏感化。因此，在免疫诊断测定中，由于特异性结合物质以外的物质非特异地吸附于在免疫反应中使用的固相表面、器具/容器上而导致敏感度降低，为了减轻该种敏感度的降低，通常通过使用白蛋白、酪蛋白、明胶等生物来源物质作为非特异吸附防止剂，来抑制非特异吸附、降低干扰。 
然而，即使用以往的方法添加非特异吸附防止剂，也有非特异性的吸附残留，进而在使用生物来源的非特异吸附防止剂时，由于存在以BSE为代表的生物污染问题等，而希望开发出用化学合成的高性能的非特异吸附防止剂。 
作为基于化学合成的非特异吸附防止剂，在特开平10-153599号公报、特开平11-352127号公报中提出了具有聚氧乙烯的聚合物，以及在专利第3443891号中提出了特定的甲基丙烯酸系共聚物，但它们的非特异吸附的防止效果不充分。 
发明内容
本发明的目的在于，提供如下的非特异吸附防止剂：在广域温度范围不固化，可以防止蛋白等向在化学发光免疫诊断测定等中使用的固相表面、器具/容器等的非特异吸附。 
本发明人等为了解决该课题，发现特定组成的共聚聚合物具有高的非特异吸附防止效果，从而完成了本发明。 
本发明的一种方式的非特异吸附防止剂，由通过使含有单体(A)和单体(B)的单体单元进行聚合而得到的水溶性聚合物构成， 
所述单体(A)能够形成在常压的水溶液中、80℃以下具有最低临界溶解温度(LCST)的聚合物， 
所述单体(B)能够形成在常压的水溶液中不具有LCST的非离子性水溶性均聚物。 
在上述的非特异吸附防止剂中，所述单体(A)能够为N，N-二乙基丙烯酰胺。 
上述的非特异吸附防止剂，由通过使含有上述单体(A)和上述单体(B)的单体单元进行聚合而得到的水溶性聚合物构成，从而在广域温度范围不固化，可以防止蛋白等向在化学发光免疫诊断测定等中使用的固相表面、器具/容器等的非特异吸附。 
以下，对本发明的一个实施方式的非特异吸附防止剂，进行具体说明。 
1.非特异吸附防止剂 
1.1.非特异吸附防止剂的构成及制造 
本实施方式涉及的非特异吸附防止剂，由通过使含有单体(A)和单体(B)的单体单元进行聚合而得到的水溶性聚合物构成，所述单体(A)能够通过均聚聚合而形成在常压的水溶液中、80℃以下具有最低临界溶解温度(lowercritical solution temperature：LCST)的聚合物，所述单体(B)能够通过均聚聚合而形成在常压的水溶液中不具有LCST的非离子性水溶性均聚物。 
首先，对用于制造该水溶性聚合物的单体单元的组成进行说明。 
1.1.1.单体(A) 
如上所述，单体(A)是能够通过均聚聚合而形成在常压的水溶液中、80℃以下具有LCST的聚合物的单体。 
保存中的蛋白质如果发生变性，则分子内构象发生变化，由原本亲水性的状态变化为疏水性的状态，以该疏水性部分为起点进而诱发其它蛋白质变性。认为在常压的水溶液中、80℃以下具有LCST的聚合物，由于其亲水性/疏水性平衡而阻止变性蛋白的凝集、具有保持分散状态的功能。能形成在常压的水溶液中、80℃以下具有LCST的聚合物的单体，是用于实现非特异吸附防止效果的必须成分。 
单体(A)可以使用1种或组合2种以上使用。 
作为单体(A)，例如可以举出N，N-二乙基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-正丙基丙烯酰胺、丙烯酰吗啉、二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯、乙烯基甲基醚等。 
作为单体(A)，从共聚性良好的观点出发，优选含有丙烯酰胺衍生物的丙烯系单体，从非特异吸附防止效果高的观点出发，更优选N，N-二乙基丙烯酰胺。 
1.1.2.单体(B) 
如上所述，单体(B)是能够通过均聚聚合而形成在常压的水溶液中不具有LCST的非离子性水溶性均聚物的单体。单体(B)可以使用1种或组合2种以上而使用。 
作为单体(B)，例如可以举出丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、N-羟乙基丙烯酰胺等取代或非取代的丙烯酰胺类，羟乙基丙烯酸酯、聚乙二醇单(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇单甲基醚(甲基)丙烯酸酯、甘油(甲基)丙烯酸酯等(甲基)丙烯酸酯类，乙酸乙烯酯、(甲基)丙烯酸缩水甘油酯、烯丙基缩水甘油醚等通过聚合后水解而成为水溶性聚合物的单体，N-乙烯基乙酰胺、N-乙烯基吡咯烷酮、烯丙醇等其它单体。 
单体(B)是用于维持或强化非特异吸附防止效果、且在广域温度范围特别是高温区域防止非特异吸附防止剂的析出/固化的必须成分。作为单体(B)，更优选取代或非取代的丙烯酰胺类，进而优选N，N-二甲基丙烯酰胺。 
1.1.3.单体单元的组成和聚合 
作为其它单体(C)，例如可以将如下物质与单体(A)及单体(B)共聚来制造水溶性聚合物，所述物质是丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸、马来酸酐、巴豆酸等的具有羧基的阴离子性单体，苯乙烯磺酸、异戊二烯磺酸、2-丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸等具有磺酸基的阴离子性单体，烯丙基胺、氨基苯乙烯、N，N-二甲基氨基丙基丙烯酰胺、N，N-二甲基氨基丙基丙烯酰胺的氯甲烷季盐等具有伯～季氨基阳离子性单体，(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸月桂酯、(甲基)丙烯酸环己酯、(甲基)丙烯酸异冰片酯、(甲基)丙烯酸苄酯、苯乙烯等疏水性单体。 
另外，作为其它单体(C)，将1～10重量％的阴离子性单体、特别是苯乙烯磺酸、异戊二烯磺酸、2-丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸等，与单体(A)及单体(B)共聚，来制造水溶性聚合物，由此在作为免疫诊断药的稀释液而使用时，有时可以得到非特异检测体的信号抑制效果。 
用于制造作为本实施方式涉及的非特异吸附防止的水溶性聚合物的单体单元的组成，将全部单体设为100重量％、优选单体(A)为30～99重量％、单体(B)为1～70重量％、和其它单体(C)为0～49重量％，更优选单体(A)为40～95重量％、单体(B)为5～60重量％和其它单体(C)为0～20重量％。 
如果单体(A)小于30重量％，则有非特异吸附防止效果不充分的情况，如果单体(B)小于1重量％，则在高温区域有非特异吸附防止剂发生析出/固化的情况。 
用作单体单元的单体，可以是将能作为工业用原料而获得的物质纯化、或者不经纯化而直接用于共聚合。 
单体单元的聚合，例如可以用自由基聚合、阴离子聚合、阳离子聚合等公知的聚合方法来进行，从制造容易的观点出发，优选自由基聚合。 
另外，单体单元的聚合可以通过与公知的溶剂、引发剂、链转移剂等一起搅拌、加热来实施。聚合时间通常为30分钟～24小时，聚合温度为0～120℃左右。 
需要说明的是，通过使用2，2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐(和光纯药工业公司制“V-50”)、2，2’-偶氮双(1-亚氨基-1-吡咯基-2-乙基丙烷)二盐酸盐(和光纯药工业公司制“VA-067”)等阳离子性引发剂作为引发剂，非特异吸附防止剂可以与阴离子性的固相表面库仑结合，可以提高非特异吸附防止效果。这样的引发剂的使用量，相对于单体总量100质量份，优选0.2～5质量份。另外，通过使用2-巯基乙胺(半胱胺)、3-巯基丙胺、2-巯基丙胺等阳离子性分子量调节剂，非特异吸附防止剂可以与上述的阳离子性引发剂同样地与阴离子性的固相表面库仑结合，可以提高非特异吸附防止效果。相对于单体的总量100质量份，这样的分子量调节剂的使用量优选为0.1～10质量份。 
1.2.非特异吸附防止剂的物性和用途 
本发明的非特异吸附防止剂的数均分子量通常为1000～1000000，优选2000～100000，进而优选3000～50000。本实施方式涉及的非特异吸附防止剂(水溶性聚合物)的分子量分布，典型的是重均分子量/数均分子量为1.5～3。 
作为本实施方式涉及的非特异吸附防止剂时的共聚聚合物为水溶性。在本发明中，“为水溶性”是指，在水中添加/混合共聚聚合物以使25℃下成为1％的聚合物固态成分时，用目视为透明溶解的状态。 
本实施方式涉及的非特异吸附防止剂，具有通过例如向容器·器具等涂布的方法、向诊断药的稀释剂、反应溶剂、保存剂添加的方法而有效地防止蛋白等的非特异吸附的效果。 
另外，本实施方式涉及的非特异吸附防止剂，通过用作免疫诊断药的稀释液，可以抑制非特异检测体的信号。 
进而，本实施方式涉及的非特异吸附防止剂，通过作为例如用作临床诊断药的标识抗体、标识抗原、酶、一次抗体、一次抗原的稳定剂，血浆制剂中所含的蛋白稳定剂，用于隐形眼镜的清洗的酶等的稳定剂等而添加到蛋白溶液中，具有长期维持蛋白活性的效果。 
2.实施例 
以下，举出实施例进一步详细说明本发明，但本发明并不受它们的限制。 
2.1.实施例1 
将作为单体(A)的二乙基丙烯酰胺70g、作为单体(B)的二甲基丙烯酰胺30g、和作为链转移剂的半胱胺盐酸盐2g混合于900g水中，装入带有搅拌机的可分离烧瓶。一边向其中吹入氮，一边升温到70℃，添加2，2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐1g作为引发剂后，继续聚合2小时，进而升温到80℃，进行3小时熟化后，冷却到室温。通过透析将得到的共聚物溶液纯化，进而进行冻结干燥，从而得到本实施例的非特异吸附防止剂(N-1)69g。 
非特异吸附防止剂(N-1)的用GPC测定的数均分子量为8000，重均分子量为16000。 
将非特异吸附防止剂(N-1)的0.5％水溶液装满于聚苯乙烯制的96孔板中，在37℃下孵育30分钟后，用交换水洗净5次。接着，将西洋辣根过氧化物酶标记的鼠IgG抗体(Millipore公司制“AP124P”)水溶液装满于上述的处理板中，在室温下孵育30分钟后，用PBS缓冲液洗净3次。用TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)/过氧化氢水/硫酸使其显色，测定450nm的吸光度。得到的吸光度为0.058的低值，确认了可以防止鼠IgG抗体的非特异吸附。需要说明的是，在37℃下的孵育中没有聚合物的析出/固化。 
2.2.实施例2 
除了使用作为单体(A)的二乙基丙烯酰胺85g和作为单体(B)的丙烯酰胺15g，来代替在实施例1中作为单体(A)的二乙基丙烯酰胺70g和作为单体(B)的二甲基丙烯酰胺30g以外，其它用与实施例1同样的方法，得到共聚聚合物(N-2)。
共聚聚合物(N-2)的用GPC测定的数均分子量为7200，重均分子量为15000。 
另外，用与实施例1同样的方法，测定共聚聚合物(N-2)的吸光度，结果该吸光度为0.076，确认了可以防止鼠IgG抗体的非特异吸附。需要说明的是，在37℃下的孵育中没有聚合物的析出/固化。 
2.3.实施例3 
除了使用作为单体(A)的N-异丙基丙烯酰胺70g，来代替在实施例1中作为单体(A)的二乙基丙烯酰胺70g以外，其它用与实施例1同样的方法，得到共聚聚合物(N-3)。 
共聚聚合物(N-3)的用GPC测定的数均分子量为6800，重均分子量为13000。 
另外，用与实施例1同样的方法，测定共聚聚合物(N-3)的吸光度，结果该吸光度为0.18，确认了可以防止鼠IgG抗体的非特异吸附。需要说明的是，在37℃下的孵育中没有聚合物的析出/固化。 
2.4.比较例1 
除了使用作为单体(A)的二乙基丙烯酰胺100g，来代替在实施例1中作为单体(A)的二乙基丙烯酰胺70g、作为单体(B)的二甲基丙烯酰胺30g以外，其它用与实施例1同样的方法，得到聚合物(X-1)。 
聚合物(X-1)的用GPC测定的数均分子量为7800，重均分子量为16000。 
另外，用与实施例1同样的方法，测定聚合物(X-1)的吸光度，结果该吸光度为0.21，得到了比实施例1的非特异吸附防止剂(N-1)的吸光度稍高的值。另外，在37℃下的孵育中聚合物发生析出/固化。 
2.5.比较例2 
除了使用作为单体(A)的二甲基丙烯酰胺100g，来代替在实施例 1中作为单体(A)的二乙基丙烯酰胺70g和作为单体(B)的二甲基丙烯酰胺30g以外，其它用与实施例1同样的方法，得到聚合物(X-2)。 
聚合物(X-2)的用GPC测定的数均分子量为8400，重均分子量为17000。 
另外，用与实施例1同样的方法，测定聚合物(X-2)的吸光度，结果该吸光度为1.8，得到了与实施例1的非特异吸附防止剂(N-1)的吸光度相比为显著高的值。需要说明的是，没有确认在37℃下的孵育中聚合物发生析出/固化。 
2.6.比较例3 
除了使用牛血清白蛋白(BSA)来代替非特异吸附防止剂(N-1)以外，用与实施例同样的方法测定聚合物(X-2)的吸光度，结果该吸光度为0.20，得到了比实施例1的非特异吸附防止剂(N-1)的吸光度稍高的值。需要说明的是，没有确认在37℃下的孵育中BSA发生析出/固化。 

Claims (3)

1.一种防止蛋白非特异性吸附的方法，其特征在于，使用如下的非特异吸附防止剂：
所述非特异吸附防止剂由通过使由单体A和单体B组成的单体单元进行聚合而得到的水溶性聚合物而构成，
所述单体A能够形成在常压的水溶液中、80℃以下具有最低临界溶解温度LCST的聚合物，
所述单体B能够形成在常压的水溶液中不具有LCST的非离子性水溶性均聚物；
所述单体A为从N，N-二乙基丙烯酰胺及N-异丙基丙烯酰胺中选择的至少一种；
所述单体B是从丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、N-羟乙基丙烯酰胺和N-乙烯基乙酰胺中选择的至少一种；
所述单体单元的组成是：将全部单体重量设为100重量％，单体A为30～99重量％，单体B为1～70重量％。
2.如权利要求1所述的方法，是防止蛋白向容器或器具非特异吸附的方法，其中，使用权利要求1所述的非特异吸附防止剂来涂敷容器或器具。
3.如权利要求1所述的方法，是防止蛋白向诊断药非特异吸附的方法，其中，将权利要求1所述的非特异吸附防止剂添加到诊断药的稀释剂、反应溶剂或保存剂中。
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