CN101677989B - 一种防治缺血性脑卒中的药物组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种防治缺血性脑卒中的药物组合物,该药物组合物由瑟丹酸内酯19~72%、蒿本内酯17~67%、天麻素2~29%和溶剂组成。本发明药物组合物药效高,可有效减轻缺血性脑卒中的病理变化和行为障碍;其次药效确切,用量小,作用强;此外本发明纯度高,纯度可达98%以上,可以制成包括注射剂在内的制剂。
Description
技术领域
本发明属于一种中药单体组合物,具体地说涉及一种防治缺血性脑卒中的药物组合物及其制备方法。
背景技术
脑卒中是中、老年人致死和致残的主要原因之一。近80%的缺血性脑卒中病例是由于脑动脉栓塞或粥样硬化血栓形成所致。根据临床症状和持续时间可将脑缺血分为症状在24小时内完全缓解的短暂性脑缺血发作(TIA),症状持续达6周时才缓解的可逆性缺血性神经功能缺失(RIND)以及症状持续性卒中。据WHO公布的资料,在57个国家中有40个国家把脑血管病的死亡率列入了致死原因的前三位,在日本和中国则占首位。但是现有的药物防治效果不好,因此急需开发疗效更好的临床用药。
药用川芎是伞形科多年生草本植物川芎(Ligusticum chuanxiong Hort)的根茎(英文名为Rhizoma chuanxiong)。川芎的主要化学成分为挥发油、生物碱、酚性成分、内酯类、阿魏酸等。其中进入体内并改善脑缺血的川芎有效部位的化学成分为川芎内酯类化合物。其中的内酯为瑟丹酸内酯(4,5二氢-3-丁基苯肽,4,5-dihydro-3-butyl-phthalide)(通式(I)和蒿本内酯(4,5二氢-3-丁叉基苯肽,4,5-dihydro-3-butylidene-phthal ide)(通式(II)。
药用天麻(Gastrodia elata Blume,英文名为Rhizoma Gastrodiae)是多年生兰科高等食菌植物,天麻内含天麻素、香荚兰醛、琥珀酸、β-谷甾醇、维生素A样物质、甙类、生物碱、粘液质和天麻多糖等。其中天麻素和天麻多糖是其主要成分。现已能人工合成天麻素(天麻甙)(周树舜等,中国医药工业杂志,1985年05期)
天麻素(英文名称为Gastrodin),其化学名称为4-羟基苯-β-D吡喃葡萄糖苷。分子式为:C13H1807。天麻具有多方面的药理作用。可恢复大脑皮质兴奋与抑制过程间的平衡失调,具有镇静、安眠和镇痛等中枢抑制作用。天麻素(天麻苷)的急性毒性很小。
我国自古就有用于活血化瘀、息风止痛的川芎和天麻的组方,例如大川芎丸等。除此以外,还有由川芎和天麻组成的其它中药方剂,例如“天芎注射液”,该药属于传统中药制剂,由川芎、天麻两味中药组成。其川芎的监测指标为阿魏酸(黄东萍等.中草药,2004,35(4),409-411)。“天芎头痛宁胶囊”是以天麻为君药,由十几味中药组成的方剂(申玉华等.中药新药与临床药理,1995,6(3),33-35)。“天芎软胶囊”主要成份为天麻和大黄,其中天麻和大黄在处方中的比例为3∶1(郭增军等.中成药2005,27(4),467-468)。这些方剂多以治疗偏头痛为主,且制备过程中不以有效成分为指标。
除上述传统中药制剂外,现代也有一些以川芎和天麻为有效成分的药物。例如专利申请《包含天麻和川芎有效成份的药物组合物及制剂》(申请号:200610020605.2)公开了以天麻和川芎为有效成份组成的药物组合物;专利申请《大川芎干粉制剂及制备方法和应用》(申请号:200610046747.6)公开了由天麻提取物和川芎提取物混合制成的干粉制剂。专利申请《治疗缺血性心脏病的川芎内酯及其制备方法》(申请号:03146029.1)公开了川芎内酯,包括瑟丹酸内酯和蒿本内酯两种内酯成分。专利申请《一种治疗脑血管疾病的药物组合物及其制备方法》(申请号:200510101971.6)公开了蒿本内酯和洋川芎内酯组成的组合物以及《一种川芎内酯提取物及其制备方法和应用》(申请号:200610130680.4)公开了涉及川芎内酯在治疗缺血性心血管病中的应用。专利《一种川芎挥发油软胶囊及其制备方法》(申请号:200410037185.X)公开了一种采用二氧化碳超临界萃取方法制备川芎挥发油的方法。
上述现有技术存在以下缺点:(1)药品成分纯度不高,不能制成化学成分明确的中药制剂,特别是无法制成化学成分明确且纯度很高的注射剂;(2)在现有的以川芎提取物为主的防治脑卒中的中药制剂中均以化学性质不够稳定的蒿本内酯为监测指标,影响检测的准确性。
经检索,没有发现由瑟丹酸内酯、蒿本内酯和天麻素组成的药用组合物。
发明内容
本发明目的之一是提供一种防治缺血性脑卒中的药用组合物。
本发明的第二个目的是提供制备上述药物组合物的方法。
本发明的另一目的是提供上述药物组合物在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
一种防治缺血性脑卒中的药物组合物,其组成成分及其重量百分比为:
瑟丹酸内酯 19~72%
蒿本内酯 17~67%
天麻素 2~29%
溶剂 余量
上述药物组合物中所述的溶剂是指羧甲基纤维素钠,吐温-80或植物油等。
所述的植物油是指橄榄油、花生油、玉米油、大豆油、葵花籽油、麻油、蓖麻油、杏仁油或桃仁油等植物油中的一种或几种。
按照通常的方法,用上述药物组合物制备的剂型可以是一种药学上可接受的剂型,如可以是注射剂、喷雾剂、胶囊、滴丸、片剂、颗粒剂、乳剂、分散剂、缓释剂等。
上述药物组合物在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用。
上述药物组合物中瑟丹酸内酯、蒿本内酯和天麻素均为纯品化合物,纯度都在98%以上,天麻素可从市场上购买。
上述防治缺血性脑卒中的药物组合物的制备方法,按照比例取瑟丹酸内酯、蒿本内酯、天麻素和助溶剂,然后混合均匀即可。
上述瑟丹酸内酯的制备方法,包括如下步骤:
(1)将干燥的川芎根块粉碎至直径1~3mm的颗粒,然后置于萃取釜中;
(2)将萃取釜的温度旋钮设定至42~58℃,加热;当萃取釜温度为42~58℃时,开启CO2进气泵;
(3)萃取及分离,CO2气流经萃取釜后进入分离釜I,再进入分离釜II;到达萃取釜压力为18~32Mpa;其中分离釜I压力为8~14Mpa,温度为45~55℃,萃取时间为60~120min,CO2流量为220~350kg/h;分离釜II压力为4~8Mpa,温度为35~45℃,萃取时间为60~120min;
(4)第一次萃取及分离完成后再次向萃取釜中投料同样粒径的川芎根块颗粒,重复步骤(2)~(3),进行第二次萃取及分离;
(5)第二次萃取及分离后,分别从分离釜I和分离釜II的出料口一次性放出全部内容物;
(6)将上述两种内容物分别置于分液漏斗中直至分层,分层后收集上层液体,分别得到川芎内酯的I级分离产品(出自分离釜I)和II级分离产品(出自分离釜II);
(7)吸取步骤(6)的川芎内酯的I级分离产品或川芎内酯的II级分离产品或者是这两种产品的混合物3~7ml加入石油醚∶乙酸乙酯(95∶5)的混合溶液至8~12ml,摇匀;进样至Biotage 40+M正相液相色谱硅胶柱;其流动相为A石油醚,B乙酸乙酯;流速50ml/min;检测波长280nm;梯度洗脱,0.01~12minA∶B=95∶5,15~30minA∶B=85∶15;在18~25min之间收集洗脱液;
(8)重复步骤(7),依次将I级和/或II级分离产品进样完毕,得洗脱液;
(9)将步骤(8)的洗脱液在30~40℃水浴中旋转蒸发除去溶剂,即得瑟丹酸内酯初级纯化产品;
(10)吸取步骤(9)中的初级纯化产品3~7ml加入甲醇溶解至ShimadzuLC-8A反相制备液相***进样;其中色谱柱为Phenomenex Luna 10μm,250mm×50mm I.D.;流动相为水(A)和甲醇(B),流速为80ml/min,等度洗脱,A∶B=40∶60;检测波长为280nm;在18~26min之间收集洗脱液;
(11)将步骤(10)所得洗脱液在30~40℃水浴中旋转蒸发除去甲醇;将剩余物用乙酸乙酯萃取3~5次,得萃取液;
(12)将上述萃取液在30~40℃水浴中旋转蒸发除去溶剂,得瑟丹酸内酯。
所述的蒿本内酯的制备方法,包括如下步骤:
步骤(1)~(6)同瑟丹酸内酯制备方法步骤(1)~(6);
(7)同瑟丹酸内酯步骤(7),收集6~12min之间的洗脱液;
(8)在30~40℃水浴中旋转蒸发除去溶剂,所得产品即为蒿本内酯。
上述制备方法步骤(1)中所述的超临界二氧化碳萃取釜可以是HA221-40-48或HA421-40-963.13-3.43。
所述的天麻素可直接从市场上购买,如昆明制药集团股份有限公司生产的天麻素或乙酰天麻素。
用本发明方法提取、纯化的有效成分瑟丹酸内酯和蒿本内酯,纯度均在98%以上。市售天麻素(或乙酰天麻素)纯度在98%以上。
本发明优点和有益效果:(1)药效高,可有效减轻缺血性脑卒中的病理变化和行为障碍,药效明显好于现有临床用药;(2)本发明药物组合物药效确切,用量小,作用强;(3)纯度高,本发明药物组合物各组分均为纯品,纯度都在98%以上,可以制成包括注射剂在内的制剂;(4)稳定性好,本发明工艺达到制备标准品水平;(5)本发明指出瑟丹酸内酯的化学性质比蒿本内酯稳定,更适合作为川芎油产品质量的监测指标。
附图说明
图1为从超临界萃取液分离的蒿本内酯和瑟丹酸内酯产品的制备谱图(正向HPLC法)(其中QHNP-1为蒿本内酯;QHNP-2为瑟丹酸内酯)
图2为蒿本内酯的检测谱图(反向HPLC检测)
图3为瑟丹酸内酯初级纯化产品的制备谱图(反向HPLC法)
图4为瑟丹酸内酯最终纯化产品的检测谱图(反向HPLC检测)
图5为瑟丹酸内酯的红外鉴定谱图
图6为蒿本内酯的红外鉴定谱图
图7为瑟丹酸内酯的紫外鉴定谱图
图8为蒿本内酯的紫外鉴定谱图
图9为瑟丹酸内酯的质谱鉴定谱图
图10为蒿本内酯的质谱鉴定谱图
图11为瑟丹酸内酯的核磁共振鉴定谱图(氢谱)
图12为蒿本内酯的核磁共振鉴定谱图(氢谱)
图13为瑟丹酸内酯的核磁共振鉴定谱图(碳谱)
图14为蒿本内酯的核磁共振鉴定谱图(碳谱)
具体实施方式
实施例1
瑟丹酸内酯的制备
(1)称取川芎的干燥根块30kg粉碎至直径2.5mm的颗粒,置于HA221-40-48萃取釜中;
(2)旋转萃取釜温度设定旋钮至50℃,当温度达到50℃时,开启CO2进气泵;
(3)启动设备,进行第一次萃取及分离;CO2气流经萃取釜后进入分离釜I、再进入分离釜II;萃取釜压力25Mpa,分离釜I压力11Mpa,分离釜I温度50℃,萃取时间90min,CO2流量250kg/h,分离釜II压力6Mpa,分离釜II温度40℃;
(4)再投料30kg,按步骤(1)~(3)进行第二次萃取及分离;
(5)分别从分离釜I和分离釜II的出料口一次性放出全部内容物;
(6)将上述两种内容物分别置于分液漏斗中直至分层。分层后收集上层液体,分别得到川芎内酯的I级分离产品(出自分离釜I)和II级分离产品(出自分离釜II)。
(7)吸取步骤(6)中的川芎内酯II级分离产品5ml,加入石油醚和乙酸乙酯的混合溶液(石油醚∶乙酸乙酯为95∶5)至10ml,摇匀;进样至Biotage 40+M正相液相色谱硅胶柱;其流动相为A石油醚,B乙酸乙酯;流速50ml/min;检测波长280nm;梯度洗脱,0.01~12minA∶B=95∶5,15~30minA∶B=85∶15;在19.6~23.2min之间收集洗脱液(见图1QHNP-2);
(8)重复步骤(7),将川芎内酯II级分离产品进样完毕,得洗脱液;
(9)将步骤(8)所收集的洗脱液在35℃水浴中旋转蒸发除去溶剂后即得到瑟丹酸内酯初级纯化产品;
(10)从步骤(9)的产品中吸取5ml加入甲醇溶解至Shimadzu LC-8A反相制备液相***进样;其中色谱柱为Phenomenex Luna 10μm,250mm×50mmI.D.,流动相为A水B甲醇,流速为80ml/min,等度洗脱,A∶B=40∶60,检测波长为280nm;在20.3~24.5min之间收集洗脱液(见图3);
(11)在步骤(10)所得洗脱液在35℃水浴中旋转蒸发除去甲醇,将剩余物用乙酸乙酯萃取3次,得萃取液;
(12)将步骤(11)所得萃取液在35℃水浴中旋转蒸发除去溶剂,得到最终产品347.3g。
(13)按照《中国药典》2005年版一部附录VI D“高效液相色谱法”所述的检测方法对所得到的最终产品进行检测,得到其纯度为99.17%(见图4)。经红外、紫外、质谱以及核磁共振(包括氢谱和碳谱两种方法)四大光谱学认证得知该产品为瑟丹酸内酯(见图5、图7、图9、图11和图13)。
实施例2
瑟丹酸内酯的制备
(1)称取川芎的干燥根块30kg粉碎至直径1mm的颗粒,置于HA221-40-48萃取釜中;
(2)旋转萃取釜温度设定旋钮至58℃,当温度达到58℃时,开启CO2进气泵;
(3)启动设备,进行第一次萃取及分离,CO2气流经萃取釜后进入分离釜I、再进入分离釜II,萃取釜压力32Mpa,分离釜I压力14Mpa,分离釜I温度55℃,萃取时间120min,CO2流量280kg/h;分离釜II压力8Mpa,分离釜II温度45℃;
(4)再投料川芎颗粒30kg于HA221-40-48萃取釜中,重复步骤(2)~(3)进行第二次萃取及分离;
(5)分别从分离釜I和分离釜II的出料口一次性放出全部内容物;
(6)将上述两种内容物分别置于分液漏斗中直至分层;分层后收集上层液体,分别得到川芎内酯的I级分离产品(出自分离釜I)和II级分离产品(出自分离釜II);
(7)将上述两种川芎内酯产品充分混合;
(8)从步骤(7)的产品中吸取5ml加入石油醚和乙酸乙酯的混合溶液(石油醚∶乙酸乙酯为95∶5)至10ml,摇匀;进样至Biotage 40+M正相液相色谱硅胶柱;其流动相为石油醚(A)和乙酸乙酯(B);流速50ml/min;检测波长280nm;梯度洗脱,从0.01~12minA∶B=95∶5,15~30minA∶B=85∶15;在18~25min之间收集洗脱液;
(9)将所收集的洗脱液在30℃水浴中旋转蒸发除去溶剂后即得到瑟丹酸内酯初级纯化产品;
(10)从步骤(9)的产品中吸取5ml加入甲醇溶解至Shimadzu LC-8A反相制备液相***进样;其中色谱柱为Phenomenex Luna 10μm,250mm×50mmI.D.,流动相为A水B甲醇,流速为80ml/min,等度洗脱,A∶B=40∶60,检测波长为280nm;在18~26min之间收集洗脱液;
(11)30℃水浴中旋转蒸发除去甲醇,然后将剩余物用乙酸乙酯萃取5次,得萃取液;
(12)将萃取液在30℃水浴中旋转蒸发除去溶剂,得瑟丹酸内酯309g。
实施例3
蒿本内酯的制备,包括如下步骤:
(1)称取干燥的川芎根块30kg,粉碎至直径3mm的颗粒,置于HA221-40-48萃取釜中;
(2)萃取釜温度42℃,当温度达到设定值时,开启CO2进气泵;
(3)萃取釜压力18Mpa,分离釜I压力8Mpa,分离釜I温度45℃,萃取时间60min,CO2流量220kg/h,分离釜II压力5Mpa,分离釜II温度40℃,进行第一次萃取及分离;
步骤(4)~(7)同实施例2的步骤(4)~(7);
(8)从步骤(7)的产品中吸取5ml进样至Biotage 40+M正相液相色谱硅胶柱;色谱条件同实施例2;在7~10.6min之间收集洗脱液,得到最终产品498.2g(见图1中的QHNP-1)。
(9)按照《中国药典》2005年版一部附录VI D“高效液相色谱法”所述的检测方法对所得到的最终产品进行检测,得到其纯度为98.32%%。经红外、紫外、质谱以及核磁共振(包括氢谱和碳谱两种方法)四大光谱学认证得知该产品为藁本内酯(见图6、图8、图10、图12和图14)。
实施例4
分别取实施例1~3制备的(后同)瑟丹酸内酯(比重0.95,后同)4.2g、藁本内酯1.0g(比重0.95,后同),和天麻素0.6g,加入到20g纯橄榄油中,超声混合均匀,得本发明组合物A 25.8g。
实施例5
分别取瑟丹酸内酯0.6g、藁本内酯1.8g,和天麻素0.75g,加入到20g大豆油中,超声混合均匀,得本发明组合物B 23.15g。
实施例6
分别取瑟丹酸内酯3.6g、藁本内酯3.3g,和天麻素2.9g,加入纯花生油至20ml,超声混合均匀,得本发明组合物C 29.8g。
实施例7
分别称取瑟丹酸内酯2.8g,蒿本内酯1.2g,天麻素0.08g,研匀,加0.5%羧甲基纤维素钠至21.6ml,得本发明组合物D 25.68g。
实施例8
分别取瑟丹酸内酯1.4g、藁本内酯3.0g,和天麻素0.1g,加入到2%羧甲基纤维素钠至20ml,超声混合均匀,得本发明组合物E 25.5g。
实施例9
瑟丹酸内酯稳定性实验
按照高效液相色谱法测定(见中国药典2005年版一部附录VI D)。
色谱条件与***适应性试验:选用岛津LC-2010高效液相色谱柱。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Diamonsil C18,4.6×150mm,5μm);以乙腈-水(42∶58)为流动相;柱温35℃;检测波长280nm,230nm;流速1ml/min。理论板数按瑟丹酸内酯峰计算不低于16000。
标准品溶液的制备:取实施例1所制备的瑟丹酸内酯,精密称定,加甲醇制成每1ml分别含瑟丹酸内酯0.08mg的溶液,即得纯度大于99%的标准品溶液。
供试品溶液的制备:取实施例1得到的瑟丹酸内酯适量,精密称定,用甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中含0.08mg的溶液,作为瑟丹酸内酯供试品溶液。
测定方法:精密吸取瑟丹酸内酯标准品与供试品溶液各10ul,注入液相色谱仪,按照实施例1步骤(13)所述方法测定即可。
表1瑟丹酸内酯稳定性实验结果(归一化纯度测定%,280nm)
储存条件 | 0天(等度) | 5天(等度) | 10天(等度) | 20天(梯度) | 30天(梯度) |
室温避光未充氮 | 99.028 | 98.288 | 98.228 | 98.270 | 98.286 |
室温避光充氮 | 99.028 | 98.947 | 98.909 | 99.050 | 99.124 |
室温光照未充氮 | 99.028 | 98.210 | 98.070 | - | 98.142 |
室温光照充氮 | 99.028 | 98.825 | 98.824 | - | 99.059 |
40℃避光充氮 | 99.028 | 98.856 | 98.966 | - | 99.024 |
60℃避光充氮 | 99.028 | 98.717 | 98.896 | - | 98.965 |
冷藏避光充氮 | 99.028 | 98.983 | 99.038 | 99.022 | 99.110 |
结果(见表1)本发明瑟丹酸内酯的稳定性主要受高温、光照和氧的影响。在30天内充氮避光的储存条件下,无论是室温、冷藏或冷冻,对瑟丹酸内酯的稳定性基本无影响(含量的相对标准偏差<2%)。说明瑟丹酸内酯性质较稳定,只要充氮避光保存,纯度在30天内不会下降,可以作为标准品使用。
实施例10
藁本内酯稳定性实验
按照《中国药典》2005年版一部附录VI D所示的高效液相色谱法测定。
色谱条件与***适应性试验:选用岛津LC-2010高效液相色谱柱。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Diamonsil C18,4.6×150mm,5μm);以乙腈-水(42∶58)为流动相;柱温35℃;检测波长280nm,230nm;流速1ml/min。
标准品溶液的制备:取实施例3所制备的藁本内酯,精密称定,加甲醇制成每1ml含藁本内酯0.4mg的溶液,即得纯度大于99%的标准品溶液。
供试品溶液的制备:取实施例3所得藁本内酯适量,精密称定,用甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中含0.4mg的溶液,作为藁本内酯供试品溶液。
测定方法:吸取标准品与供试品溶液各10ul,注入液相色谱仪按照实施例3步骤(9)所述方法进行测定。
结果(见表2)。本发明藁本内酯稳定性主要受光照、温度和氧化影响;室温条件下放置10天后纯度从98%下降到95%以下。表明藁本内酯标准品必须在充氮、避光、冷藏或冷冻条件下储存。必须新鲜配制。每次制备量不超过5天使用量。
表2藁本内酯稳定性实验结果(归一化纯度测定%,280nm)
储存条件 | 0天(等度) | 5天(等度) | 10天(等度) | 20天(梯度) | 30天(梯度) |
室温避光未充氮 | 98.264 | 95.707 | 97.214 | 95.303 | 94.552 |
室温避光充氮 | 98.264 | 97.892 | 98.345 | 96.546 | 95.908 |
室温光照未充氮 | 98.264 | 95.534 | 94.112 | - | 27.669 |
室温光照充氮 | 98.264 | 96.978 | 95.202 | - | 18.084 |
40℃避光充氮 | 98.264 | 97.999 | 97.971 | - | 90.114 |
60℃避光充氮 | 98.264 | 96.948 | 96.836 | - | 60.214 |
冷藏避光充氮 | 98.264 | 97.304 | 98.170 | 97.442 | 97.150 |
冷冻避光充氮 | 98.264 | 97.657 | 98.290 | 97.662 | 97.403 |
实施例11
本发明药用组合物对线栓法脑缺血模型的影响
(一)、试验方法按照如下方法进行:
(1).分组与给药:选用150只体重在240~250g的健康雄性SPF/VAF级Wistar大鼠进行试验。(北京维通利华实验动物技术有限公司提供,合格证号:SCXK京2002-0003)。随机分为9组,即空白对照组、模型对照组、脉络宁阳性对照组6ml/kg、组合物A、B、C各两个剂量(6mg/kg以及12/kg)组。组合物A、B、C的配制方法见实施例4~6
手术前1小时及再灌注之后2小时腹腔注射一种组合物或生理盐水或阳性药物。阳性药选取临床治疗缺血性脑卒中的常用西药脉络宁注射液(10ml/支,金陵药业股份有限公司南京金陵制药厂生产,批号:200503011)。空白对照组和模型对照组腹腔注射等体积生理盐水。
(2).线栓制备:选用日本产的直径为0.23mm的尼龙丝线塑成直线形并剪成5cm的线段,前端用细砂纸打磨、蘸胶使之平滑,在距离前端1.6cm、1.8cm、2.0cm处作标记备用,临用时将尼龙丝前端蘸取肝素。
(3).模型复制:400mg/kg腹腔注射10%水合氯醛麻醉;颈部正中切开,暴露左侧颈总动脉(简称CCA)、颈外动脉(简称ECA)、颈内动脉(简称ICA);结扎CCA近端、ECA根部;在CCA结扎处远端剪一斜口,***尼龙丝,经CCA分叉处通过ICA入颅至大脑前动脉(ACA),阻断MCA的血流;尼龙丝平均***深度为18.5±0.5mm,结扎ICA。缝合皮肤,暴露尼龙丝末端;于缺血2小时后将尼龙丝拔出,观察再灌注后不同时程的变化;假手术组不插尼龙丝。
(二)、观察指标:
(1).神经行为学评分:采用五级评分法(0-4分)。于再灌注终末期进行动物的行为学观察。提鼠尾离开地面约1尺,观察两前肢状况;将大鼠置于水平地面,推动其双肩,观察两侧抵抗力有无差异;大鼠置于地面,观察其行走情况。分数越高,表明其神经行为损伤越严重。(按最高分计)
a.行为完全正常为0分;
b.提起鼠尾离开地面,手术对侧前肢内旋、内收者,为1分;
c.大鼠至地面,用手挤压两侧检查其抗力,手术对侧抗力下降者,为2分;
d.大鼠至地面,观察其行走,围绕手术对侧转圈者,为3分;
e.损伤极其严重,已无法自主活动者,为4分。
(2).脑梗塞面积测试:24小时后断头取脑,将左侧大脑切为2mm厚共5片、4mm厚共1片。经4%红四氮唑(TTC)37℃避光染色30分钟;其间每隔5分钟翻动一次。经TTC染色后,正常组织深染呈红色,梗死组织呈白色。将每组脑片排列整齐,拍照保存。应用图象分析***软件(SPOT 3.5软件)处理并统计。计算每片的梗塞面积并最终叠加换算成梗塞体积。梗塞体积以所占大脑半球的百分率表示。计算公式如下:
脑梗塞体积(%)=(手术对侧半球的体积-手术侧半球未梗塞部分的体积)/手术对侧半球的体积×100%
(3).脑含水量测定:
再灌注24小时后,即刻断头取脑,去除嗅束、小脑和低位脑干,分开手术侧和正常侧半球,分别称重(湿重)。置于烤箱中95℃烘烤24小时至恒重后,再次称取脑重(干重)。脑含水量按下述公式计算:
脑含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%
实验数据用X±SD表示,经t检验比较组间差异。
表3.本发明药用组合物对线栓法脑缺血模型治疗试验结果
组别(N=10) | 剂量(mg(ml)/kg) | 脑含水百分数(%) | 梗塞面积(%±SD) | 24小时行为评分(0-4分值) |
空白对照组模型对照组脉络宁组合物A组合物A组合物B组合物B组合物C组合物C | 6ml12.06.012.06.012.06.0 | 78.46±0.1979.28±0.30△△79.17±0.4279.02±0.12*79.15±0.2079.75±0.5379.18±0.4379.20±0.3479.29±0.23 | 2.90±1.9834.04±9.65△△13.75±2.49**17.32±13.44**13.03±8.06**11.75±9.91**18.58±8.47**13.31±1.16**13.46±3.10** | 01.90±0.88△△1.80±0.422.30±0.951.69±0.631.70±0.671.50±0.531.80±0.631.60±0.70 |
注:与空白对照组相比较△△P<0.01△△P<0.05;
与模型对照组相比较**P<0.01*P<0.05;
结果(见表3)本发明A、B、C三组药用组合物及阳性药组均可改善大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血梗塞面积。其中以组合物B大剂量(12mg/kg体重)效果最好,药效好于常用临床用药脉络宁注射液。说明本发明药用组合物可用于治疗缺血性脑卒中,减轻脑梗塞面积。
实施例12
本发明药用组合物对线栓法脑缺血模型的影响
(一)、试验按照如下方法进行:
(1)分组与给药:200~220g的健康雄性SD大鼠78只,随机分成6组,分别为正常对照组、模型组、阳性对照药川芎嗪组及本发明实施例4~6的组合物A、B、C组。阳性对照药川芎嗪组选自磷酸川芎嗪片,50mg/片,100片/瓶,北京市燕京制药厂生产,批号:040603。预先灌胃给药7天,每日一次,每次给药剂量50mg/kg。断头取脑前2h再给药一次。正常对照组及模型组灌胃等量生理盐水。
(2)实验方法:4%水合氯醛(350mg/kg,ip)麻醉。将大鼠仰卧位固定,沿颈正中切开,分离右侧颈总动脉并穿2根缝线备用,再分离颈外动脉,近心端结扎。颈外动脉下方分离出颈内动脉及其旁边一根分支(翼突腭动脉),在分支下穿一根缝线,于近心端分叉处结扎。在已分离的颈总动脉近心端用缝线结扎,远心端用动脉夹阻断血流,在此之间,剪一小口,将一端加热成圆珠状(直径<0.3mm)的尼龙线(4-0)***小口,去掉动脉夹,将尼龙线缓缓推入至前脑动脉(约20mm),再往回拉约2mm即至大脑中动脉口,长约17mm(自颈内外动脉分叉处算起),用缝线结扎固定尼龙线棒。缝合肌肉和皮肤。手术过程中,视野温度保持37℃。术后24h进行行为学评分,评分后,处死大鼠,断头取脑。对照组不插线,术后24h进行行为学评分后处死,断头取脑。以下操作及计算方法等同实施例11中有关部分内容。
(二)、观察指标:同实施例11观察指标(2)
结果(见表4)本发明A、B、C三组药用组合物口服剂及阳性药组预防给药7天均可改善大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血梗塞面积;本发明A、B、C三组药用组合物药效明显好于常用临床用药磷酸川芎嗪片。说明本发明药用组合物可以防治缺血性脑卒中,减轻脑梗塞面积。药效明显好于常用临床用药磷酸川芎嗪片(P<0.01)。
表4本发明药用组合物对线栓法脑缺血模型试验结果
组别 | 剂量(mg/kg) | 动物数(只) | 脑梗塞面积%(±SD) |
正常对照组 | / | 10 | 0 |
模型组 | 50 | 10 | 27.67±0.05* |
组合物A | 50 | 10 | 21.73±0.04** |
组合物B | 50 | 10 | 21.48±0.04** |
组合物C | 50 | 10 | 21.36±0.04** |
阳性药组(川芎嗪) | 50 | 10 | 25.20±0.03* |
注:*与模型对照组相比较P<0.05,**与模型对照组相比较P<0.01
实施例13
本发明药用组合物对三氯化铁法脑缺血模型的影响
(一)、实验按如下方法进行:
(1)分组与给药:将110只体重在180~200g的健康雄性SD大鼠按体重随机分为9组。空白对照组、模型对照组、磷酸川芎嗪120mg/ml组(药品来源同实施例12)、各组合物组分为80mg/ml、40mg/ml两个剂量组,每组12只。每天口服给药一次,连续30天,空白组、模型对照组服用等体积食用油。
(2)实验方法:于末次给药1小时后,按350mg/ml腹腔注射12%的水合氯醛溶液将大鼠麻醉,侧卧位固定,在手术显微镜下进行操作。眼眦与外耳道连线中点作一长约1cm的垂直切口,暴露并剥离顳肌,在卵圆孔侧前上方1mm处用牙钻钻一直径约2mm的小孔,用细针刺破脑膜,暴露大脑中动脉(MCA),将蘸有50%三氯化铁溶液的滤纸条敷于大脑中动脉上,30min后取出,此时大脑中动脉变成黑色或白色。缝合切口。24h后断头取脑。以下操作及计算方法等见实施例11中有关部分内容。
神经行为学测试分别在手术6h和24h后进行。评分标准及方法同实施例11观察指标(1)。
(二)、观察指标:同实施例11观察指标(1)、(2)
结果(见表5)各组药用组合物口服剂及阳性药组连续预防给药30天与模型组相比均可明显改善大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血梗塞面积。其中本发明组合物A药效明显好于常用临床用药磷酸川芎嗪片(P<0.05)。由于同等剂量的阳性药组无法体现药效,只好加大剂量。而本发明组合物组剂量的1/3~2/3即可显现类似药效。说明本发明药用组合物口服剂长期给药可以防治缺血性脑卒中,减轻脑梗塞面积。药效好于或不低于常用临床用药磷酸川芎嗪片。
表5.本发明药物组合物预防给药30天对脑缺血模型试验结果
注:与空白对照组相比较△△P<0.01
与模型对照组相比较*P<0.05
实施例14
本发明药物组合物的小鼠急性毒性试验
(一)实验和计算方法:
采用SPF级昆明种小白鼠,一次性口服给药。以预试验结果为试验剂量,剂距为1∶0.90。
药液配制方法如下:准确称取瑟丹酸内酯2.501g、蒿本内酯2.502g,以及天麻素0.7502g,混匀后加适量2%羧甲基纤维素钠助溶,充分研匀后制成浓度为0.0575g/g的溶液;各组剂量分别按表7所示剂量用2%羧甲基纤维素钠的水溶液)稀释,每20g体重口服给药0.8ml;连续观察48小时。
将动物按禁食16小时后的体重随机分为9组,每组20只,雌雄各半;组间剂距1∶0.9;分别将上述不同浓度的受试物按0.8ml/20g灌胃,即刻观察给予受试物后各组动物出现的毒性反应,连续观察48小时。记录动物的毒性反应及死亡情况。用Bilss法计算小鼠口服LD50剂量和95%可信限。
计算公式如下:
回归系数:
半数致死量:
log LD50标准误:
LD50的95%平均可信限:
LD50的99%平均可信限:
结果(见表6)显示本发明药物组合物的小鼠口服LD50值为0.7276g/kg;LD50的95%平均可信限为0.7276±0.0470g/kg(范围:0.6806-0.7746g/kg);LD50的99%平均可信限为0.7276±0.0616g/kg(范围:0.6660-0.7892g/kg)。组间剂距1∶0.9。
本试验为为化学级纯品的急性毒性试验。结果表明本发明药物组合物安全性好,为临床用药剂量提供了有价值的参考数据。
表6小鼠口服LD50剂量和95%可信限实验结果
No. | 剂量g/kg | 对数计量X | n | 死亡动物数 | 死亡率P | 机率单位Y | 权重系数W | R | RY |
1 | 1.000 | 0 | 20 | 20 | 1.00 | 7.620 | 0.116 | 9-1=8 | 60.960 |
2 | 0.900 | -0.0458 | 20 | 19 | 0.95 | 6.645 | 0.224 | 9-3=6 | 39.870 |
3 | 0.810 | -0.0915 | 20 | 18 | 0.90 | 5.282 | 0.342 | 9-5=4 | 25.128 |
4 | 0.729 | -0.1373 | 20 | 15 | 0.75 | 5.674 | 0.538 | 9-7=2 | 11.348 |
5 | 0.656 | -0.1831 | 20 | 12 | 0.60 | 5.253 | 0.621 | 9-9=0 | 0.000 |
6 | 0.590 | -0.2291 | 20 | 7 | 0.35 | 4.603 | 0.603 | 9-11=-2 | -9.206 |
7 | 0.531 | -0.2749 | 20 | 5 | 0.25 | 4.326 | 0.538 | 9-13=-4 | -17.304 |
8 | 0.478 | -0.3206 | 20 | 3 | 0.15 | 3.964 | 0.426 | 9-15=-6 | -23.784 |
9 | 0.430 | -0.3665 | 20 | 0 | 0.00 | 2.380 | 0.116 | 9-17=-8 | -19.04 |
=-0.1832 | =5.1941 | ∑=3.524 | 67.972 |
i=log(1/0.9)=0.0458
b=12.3675
LD50=0.6326g·kg-1
L95=0.6326±0.0274g·kg-1(范围:0.6052-0.6600g·kg-1)
L99=0.6326±0.0359g·kg-1(范围:0.5967-0.6685g·kg-1)
Sx50=0.0096
Claims (10)
1.一种防治缺血性脑卒中的药物组合物,其特征在于,含有:纯度为99.17%、比重为0.95的瑟丹酸内酯4.2g,纯度为98.32%、比重为0.95的蒿苯内酯1.0g和天麻素0.6g。
2.根据权利要求1所述的一种防治缺血性脑卒中的药物组合物提出的制备方法、其特征在于,把纯度为99.17%、比重为0.95的瑟丹酸内酯4.2g,纯度为98.32%、比重为0.95的蒿苯内酯1.0g和天麻素0.6g加入到20g纯橄榄油中,超声混合均匀,得到药物组合物25.8g。
3.一种防治缺血性脑卒中的药物组合物,其特征在于,含有:纯度为99.17%、比重为0.95的瑟丹酸内酯0.6g,纯度为98.32%、比重为0.95的蒿苯内酯1.8g和天麻素0.75g。
4.根据权利要求3所述的一种防治缺血性脑卒中的药物组合物提出的制备方法,其特征在于,把纯度为99.17%、比重为0.95的瑟丹酸内酯0.6g,纯度为98.32%、比重为0.95的蒿苯内酯1.8g和天麻素0.75g,加入到20g大豆油中,超声混合均匀,得到药物组合物23.15g。
5.一种防治缺血性脑卒中的药物组合物,其特征在于,含有:纯度为99.17%、比重为0.95的瑟丹酸内酯3.6g,纯度为98.32%、比重为0.95的蒿苯内酯3.3g和天麻素2.9g。
6.根据权利要求5所述的一种防治缺血性脑卒中的药物组合物提出的制备方法、其特征在于,把纯度为99.17%、比重为0.95的瑟丹酸内酯3.6g,纯度为98.32%、比重为0.95的蒿苯内酯3.3g和天麻素2.9g,加入到20ml纯花生油中,超声混合均匀,得到药物组合物29.8g。
7.一种防治缺血性脑卒中的药物组合物,其特征在于,含有:纯度为99.17%、比重为0.95的瑟丹酸内酯2.8g,纯度为98.32%、比重为0.95的蒿苯内酯1.2g和天麻素0.08g。
8.根据权利要求7所述的一种防治缺血性脑卒中的药物组合物提出的制备方法、其特征在于,把纯度为99.17%、比重为0.95的瑟丹酸内酯2.8g,纯度为98.32%、比重为0.95的蒿苯内酯1.2g和天麻素0.08g,混合均匀,加入浓度为0.5%的羧甲基纤维素钠21.6ml,得到药物组合物25.68g。
9.一种防治缺血性脑卒中的药物组合物,其特征在于,含有:纯度为99.17%、比重为0.95的瑟丹酸内酯1.4g,纯度为98.32%、比重为0.95的蒿苯内酯3.0g和天麻素0.1g。
10.根据权利要求9所述的一种防治缺血性脑卒中的药物组合物提出的制备方法、其特征在于,把纯度为99.17%、比重为0.95的瑟丹酸内酯1.4g,纯度为98.32%、比重为0.95的蒿苯内酯3.0g和天麻素0.1g,混合均匀,加入浓度为2%的羧甲基纤维素钠20ml,得到药物组合物24.5g。
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2008
- 2008-02-14 WO PCT/CN2008/000349 patent/WO2009100587A1/zh active Application Filing
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余昭锐等.天麻素注射液治疗急性缺血性脑卒中的疗效观察.《中国中西医结合杂志》.2007,第27卷(第4期),参见第377页左栏第1段. * |
胡长鹰等.当归中藁本内酯的提取、分离与结构鉴定.《无锡轻工大学学报》.2003,第22卷(第5期),参见全文. * |
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Publication number | Publication date |
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CN101677989A (zh) | 2010-03-24 |
WO2009100587A1 (zh) | 2009-08-20 |
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