JP5847458B2 - 改変rRNAオペロンを有する組換え微生物 - Google Patents
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Description
上記非特許文献1にはまた、10種類のrrnオペロンのうちのいずれか1種を1コピーのみ有する枯草菌株を作製し、それらの成長速度と胞子形成の頻度を調べた結果、各株間で胞子形成能が大きく異なっていたことを報告している。この知見は、複数のrrnオペロンが異種性(heterogeneity)であり、各々が異なる生育局面で異なる機能を担っているという考え方を支持する。
佐藤ら(非特許文献2及び3)は、10コピーのrrnオペロンのうちの1つのアンチSD配列を改変した枯草菌株で、改変したSD配列を有するクロラムフェニコール耐性遺伝子(cat)の翻訳効率を調べた結果、改変株では、翻訳効率の低下したSD配列を有するcat遺伝子を持つにもかかわらず、クロラムフェニコール耐性が向上したことを示した。
さらに、非特許文献4及び5によれば、改変rrnオペロンのコピー数を増やしても翻訳効率は増加しないと考えられており、一方で改変rrnオペロンを増やせば、細菌の通常の蛋白合成能が低下して生命活動に影響を及ぼす可能性があるため、アンチSD配列の改変が必ずしも目的蛋白質の生産性向上につながるかどうかは明らかではなかった。
(1)改変SD配列を有する標的遺伝子と;当該改変SD配列と相補的な改変アンチSD配列を有する複数個のrrnオペロンと;改変されていないアンチSD配列を有するrrnオペロン、とを有する細菌。
(2)前記改変SD配列が、前記改変されていないアンチSD配列と80%以上の配列同一性を有する(1)記載の細菌。
(3)前記改変SD配列が、CCTCCである(1)又は(2)記載の細菌。
(4)前記改変アンチSD配列が、GGAGGである(1)〜(3)のいずれか1に記載の細菌。
(5)バチルス属細菌である(1)〜(4)のいずれか1に記載の細菌。
(6)前記改変アンチSD配列を有する複数のrrnオペロンが、少なくともrrnIオペロン及びrrnOオペロンである(5)に記載の細菌。
(7)前記改変アンチSD配列を有する複数のrrnオペロンが、rrnIオペロン、rrnOオペロン及びrrnEオペロンである(5)に記載の細菌。
(8)前記改変されていないアンチSD配列を有するrrnオペロンがrrnJオペロンである(6)又は(7)に記載の細菌。
(9)(1)〜(8)のいずれか1に記載の細菌を培養する工程を含む目的遺伝子産物の生産方法。
枯草菌(Bacillus subtilis)の場合、ゲノム上に10コピーの異なるrrnが存在し、それぞれrrnA、rrnB、rrnD、rrnE、rrnG、rrnH、rrnI、rrnJ、rrnO、rrnWとして知られている。上記10個のrrnの塩基配列及びゲノム上での位置は公知である(Nanamiya et al. Microbiology (2010) 156:2944-2952、あるいはJAFAN(Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis)により公開されている枯草菌ORFデータベース(BSORF DB)[http://bacillus.genome.ad.jp/])。
上記10個のrrnは、枯草菌等のバチルス属細菌において高度に保存されており、各rrnの配列は、いずれも類似性が高く且つ高度に保存されたアンチSD配列を有する。
SD配列としては、例えば遺伝子配列上の配列としては、開始コドンのおよそ6〜14bp上流に位置する配列GGAGG等が挙げられる。
アンチSD配列としては、rRNA上の配列の場合、例えば、16SrRNAの3’末端付近に位置する配列CCUCC等が知られている(McLaughlin et al. (1981) J. Biol. Chem. 256:11283-91、「遺伝子」第8版、B. Lewin 著、東京化学同人、128−130)。したがって、遺伝子配列の場合のアンチSD配列としては、例えば、16SrRNA遺伝子の3’末端付近に位置する配列CCTCC等が挙げられる。
上記改変SD配列は、好ましくは、上記改変されていないアンチSD配列と60%以上の配列同一性を有し、より好ましくは80%以上の配列同一性を有し、さらに好ましくは100%の配列同一性を有する。
したがって、上記改変アンチSD配列は、好ましくは、上記改変されていないアンチSD配列の相補配列と60%以上の配列同一性を有し、より好ましくは80%以上の配列同一性を有し、さらに好ましくは100%の配列同一性を有する。
当該複数個のrrnオペロンは、好ましくは少なくともrrnIオペロンを含み、より好ましくは少なくともrrnI及びrrnOオペロンを含み、さらに好ましくはrrnI、rrnOオペロン及びrrnEオペロンを含み、なお好ましくはrrnI、rrnOオペロン及びrrnEオペロンからなる。
また例えば、本発明の細菌は、各1コピーの改変アンチSD配列を有するrrnI及びrrnOオペロンと、2コピーの改変されていないアンチSD配列を有するrrnJオペロンとを有し、他のrrnオペロンを有していない細菌であり得る。
また例えば、本発明の細菌は、各1コピーの改変アンチSD配列を有するrrnI、rrnOオペロン及びrrnEオペロンと、2コピーの改変されていないアンチSD配列を有するrrnJオペロンとを有し、他のrrnオペロンを有していない細菌であり得る。
rrnJ+J+株はrrnJ以外の9個のrrnオペロンを欠失した枯草菌168株において、増殖性が回復した変異体として見出された。rrnオペロンの欠失はrrnオペロン以外の遺伝子の変異では補うことができないため、増殖性はrrnJオペロンの多コピー化でのみ回復されるものと推察される。従って、Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156, 2944-2952に記載の方法によりrrnJ以外の9個のrrnオペロンを欠失した枯草菌168株より増殖に優れた株を選抜することにより、rrnJ+J+株を再現良く取得することがでる。
本発明の細菌において、上記標的遺伝子は、当該細菌が生来有する遺伝子であってもよく、外来遺伝子又は異種遺伝子であってもよい。また本発明の細菌において、上記rrnオペロンは、当該細菌が生来有するオペロンであってもよく、天然に生じた突然変異によって新たに構築されたオペロンであってもよく、又は外部から導入したものでもよい。
したがって、上記改変SD配列及び上記改変アンチSD配列は、当該細菌が生来有するSD配列若しくはアンチSD配列を改変して作製されたものであってもよく、天然に生じた改変SD配列若しくはアンチSD配列であってもよく、又は細胞外から導入された改変されたSD配列若しくはアンチSD配列であってもよい。
DNA配列の改変、所望の配列を有するDNA断片の構築、DNA断片のベクターへの組み込み、ベクターの細菌細胞への導入、およびDNA断片の細菌ゲノム内への導入の手順は、当業者に周知である。
1.改変rrnを有する変異細菌株の構築
枯草菌168株の10個のrrnオペロンのうちrrnJを除く9個が欠失し、且つ当該rrnJを2個有する株であるrrnJ+J+(ΔrrnHG1 ΔrrnO1 ΔrrnD1 ΔrrnE1 ΔrrnB2 ΔrrnA1 ΔrrnI2 ΔrrnW2)(Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156, 2944-2952のSupplementary material中に記載されている。下記参考例2も参照のこと)を元株(RIK530株)として以下の変異株を構築した。変異株構築に用いたプライマーを表1に示し、構築手順の概要を図2に示す。
RIK213株(trpB'A'::PrrnOkan196(am) erm hisC101)(Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2944-2952、下記参考例1も参照)のDNAを鋳型としてTRPFプライマーとPROCRプライマー、及びPROCFプライマーとTRPRプライマーをそれぞれ用いてトリプトファン合成遺伝子領域を増幅した。次に、pC194(Horinouchi, S. et al. ( 1982) J. Bacteriol. 150:815-825、Bacillus Genetic Stock Center [http://www.bgsc.org/]より入手可能)を鋳型として、CATFプライマーとCATRプライマーを用いてクロラムフェニコール耐性遺伝子を増幅した。得られた3断片を鋳型としてTRPFプライマーとTRPRプライマーを用いてPrrnOcatpt1 erm DNA断片を作製した。次に、PrrnOcatpt1 erm DNA断片をRIK213株に形質転換し、クロラムフェニコール耐性である形質転換体を選択した。RIK1140株にPrrnOcatpt1 ermが導入されていることをPCRとシークエンシングにより確認した。
RIK1140株のDNAを鋳型としてTRPFプライマーとCATSDRプライマー、及びCATSDFプライマーとTRPRプライマーを用いてトリプトファン合成遺伝子領域を増幅した。得られた2断片を鋳型としてTRPFプライマーとTRPRプライマーを用いてtrpB'A'::PrrnOcatpt1 SD10(CCTCC) erm hisC101断片を作製した。得られたtrpB'A'::PrrnOcatpt1 SD10(CCTCC) erm hisC101断片をRIK530株に形質転換し、エリスロマイシン耐性である形質転換体を選択した。RIK1211株にtrpB'A'::PrrnOcatpt1 SD10(CCTCC) erm hisC101が導入されていることをPCRとシークエンシングにより確認した。
rrnI領域内の野生型アンチSD配列CCTCC(rrnIanti-SD)を改変アンチSD配列GGAGG(rrnIanti-SD10)に改変するため、RIK542株(Nanamiya et al. (2010) Microbiology. 156:2977-2982、下記参考例3も参照)のDNAを鋳型としてRRNIFプライマーとRRNISDRプライマー、及びRRNISDFプライマーとRRNIRプライマーをそれぞれ用いてrrnI領域を増幅した。次に、得られた2断片を鋳型としてRRNIFプライマーとRRNIRプライマーを用いて、rrnIanti-SD10を有するDNA断片を作製した。得られたDNA断片をRIK1211株に形質転換し、クロラムフェニコール耐性である形質転換体を選択した。RIK1196株に改変アンチSD(anti-SD10)配列を有するrrnIが導入されていることをシークエンシングにより確認した。
枯草菌W168株(Nakamura et al. (1999) Int. J. Syst. Bacteriol. 49:1211-1215、Bacillus Genetic Stock Center [http://www.bgsc.org/]より入手可能)のDNAを鋳型としてTRPF2プライマーとTRPR2プライマーを用いてトリプトファン合成遺伝子領域を増幅した。得られたDNA断片をRIK1196株に形質転換し、トリプトファン非要求性、ヒチジン要求性、および、クロラムフェニコール感受性、エリスロマイシン感受性を示す形質転換体を選択した。RIK1229株に野生型のトリプトファン合成遺伝子が導入されたことをPCRとシークエンシングにより確認した。
rrnE領域内の野生型アンチSD配列CCTCC(rrnEanti-SD)を改変アンチSD配列GGAGG(rrnEanti-SD10)に改変するため、RIK545株(Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982、下記参考例5も参照)のDNAを鋳型としてRRNEFプライマーとRRNESDRプライマー、及びRRNESDFプライマーとRRNERプライマーをそれぞれ用いてrrnE領域を増幅した。次に、得られた2断片を鋳型としてRRNEFプライマーとRRNERプライマーを用いて、rrnEanti-SD10を有するDNA断片を作製した。得られたDNA断片をRIK1211株に形質転換し、クロラムフェニコール耐性である形質転換体を選択した。RIK1215株に改変アンチSD(anti-SD10)配列を有するrrnEが導入されていることをシークエンシングにより確認した。
ydhU遺伝子の上流領域にrrnOプロモーターを有するカナマイシン耐性遺伝子(PrrnOkan)を導入するため、RIK211株(Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982、下記参考例1も参照)を鋳型としてPrrnOkan領域をRRNOPFプライマーとKMRプライマーを用いて増幅した。次に、ydhU遺伝子の上流領域を野生株のDNAを鋳型としてYDHUUPFプライマーとYDHUUPRプライマー、及びYDHUDFプライマーとYDHUDRプライマーをそれぞれ用いて増幅した。得られた2種のDNA断片とPrrnOkan遺伝子を鋳型として、YDHUUPFプライマーとYDHUDRプライマーを用いてydhU遺伝子の上流領域にカナマイシン耐性遺伝子が導入されたDNA断片(ydhU+::PrrnO-kan)を作製した。ydhU+::PrrnO-kan DNA断片をRIK1215株に形質転換し、カナマイシン耐性である形質転換体を選択した。RIK1257株にydhU+::PrrnO-kanが導入されていることをPCRとシークエンシングにより確認した。
rrnO領域内の野生型アンチSD配列CCTCC(rrnOanti-SD)を改変アンチSD配列GGAGG(rrnOanti-SD10)に改変するため、RIK543株(Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982、下記参考例4も参照)のDNAを鋳型としてRRNOFプライマーとRRNOSDRプライマー、RRNOSDFプライマーとRRNORプライマーをそれぞれ用いてrrnO領域を増幅した。次に、得られた2断片を鋳型としてRRNOFプライマー、RRNORプライマーを用いて、rrnOanti-SD10を有するDNA断片を作製した。得られたDNA断片をRIK1211株に形質転換し、クロラムフェニコール耐性である形質転換体を選択した。RIK1226株に改変アンチSD(anti-SD10)配列を有するrrnOが導入されていることをシークエンシングにより確認した。
yaaC遺伝子の上流部分をYAAC−F1プライマーとYAAC−R1プライマーを用いて、下流部分をYAAC−F2プライマー、YAAC−R2プライマーを用いて、それぞれ増幅した。次に、プラスミドpDG1727(Guerout-Fleury et al. (1995) Gene. 167:335-336、Bacillus Genetic Stock Center [http://www.bgsc.org/]より入手可能)のスペクチノマイシン耐性遺伝子を鋳型とし、スペクチノマイシン耐性遺伝子をSPC−FプライマーとSPC−Rプライマーを用いて増幅した。得られた3断片を鋳型としてYAAC−F1プライマーとYAAC−R2プライマーを用いて増幅し、yaaC::spc DNA断片を作製した。当該yaaC::spc DNA断片をRIK1226株に形質転換し、スペクチノマイシン耐性である形質転換体を選択した。RIK1224株にyaaC::spc変異が導入されていることをPCRとシークエンシングにより確認した。
RIK1224から抽出した染色体DNAをRIK1229株に形質転換し、スペクチノマイシン耐性である形質転換体を選択した。RIK1246株にrrnO領域が導入されていることをPCRとシークエンシングにより確認した。
RIK1257株から抽出した染色体DNAをRIK1246株に形質転換し、カナマイシン耐性である形質転換体を選択した。RIK1267株にrrnE領域が導入されていることをPCRとシークエンシングにより確認した。
バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM-S237株(FERM BP-7875)由来のアルカリセルラーゼ遺伝子(特開2000−210081号公報)断片(3.1kb)がシャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY-S237のアルカリセルラーゼ遺伝子のSD配列GGAGGを改変SD配列CCTCCに改変したプラスミドpHY237-SD10を、以下のように構築した。プラスミド構築に用いたプライマーを表2に示し、構築手順の概要を図3に示す。
バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM−S237株(FERM BP−7875)由来のアルカリセルラーゼ遺伝子(特開2000−210081号公報)の断片(3.1kb)がシャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドであるpHYS237をEcoRI処理した後、アガロースゲル電気泳動を行い、6.2kbのDNA断片をゲルから切り出した。当該DNA断片をプラスミド精製キットHigh Pure PCR Product Purification Kit (Roche)を用いて精製し、この精製したDNAを、LigationHigh(TOYOBO)を用いてライゲーションし、得られたプラスミドベクターをE. coli HB101株に形質転換した。形質転換体から、プラスミドpHYS237-EIを抽出した(図3(1))。
pHYS237を鋳型にphyUPfとcelSD10fのプライマーセットを用いてPCR断片(A)を調製した。上記DNAを鋳型とし、S237SD10r及びS237DNrのプライマーセットを用いて、断片(B)をPCRにより増幅した。次に、断片(A)と断片(B)を鋳型とし、phyUPf2およびS237DNr2のプライマーセットを用いたPCRにより断片(C)を増幅した(図3(2))。
1)で作製したプラスミドpHYS237-EIと2)で作製したDNA断片(C)とを制限酵素EcoRIを用いて消化し、それぞれ線状化したベクター(6.2kb)及びインサート(1.8kb)として精製した。次に、得られた当該ベクターとインサートをLigation High(TOYOBO)を用いて連結した後、得られたベクターを用いてE. coli HB101の形質転換を行った。得られた形質転換体からプラスミドを抽出し、pHYS237-SD10とした(図3(3))。
3)で得られたプラスミドpHYS237-SD10を、プロトプラスト形質転換法によってRIK530株、RIK1196株、RIK1246株、RIK1267株のそれぞれに導入し、組換え細菌株を作製した。
上記実施例1で得られたRIK530株、RIK1196株、RIK1246株及びRIK1267株由来の組換え菌株を10mLのLB培地で一夜37℃で振盪培養し、更にこの培養液0.05mLを50mLの2×L−マルトース培地(2%トリプトン、1%酵母エキス、1%NaCl、7.5%マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4−5水和物、15ppmテトラサイクリン)に接種し、30℃にて3日間振盪培養を行った。遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。
セルラーゼ活性測定については、1/7.5Mリン酸緩衝液(pH7.4、和光純薬)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに0.4mM p-nitrophenyl-β-D-cellotrioside(生化学工業)を50μL加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp−ニトロフェノール量を420nmにおける吸光度(OD420nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとした。
hisC101は、hisC遺伝子内におけるQ318amber変異を表し、この変異はヒスチジン要求性を示す。またtrpC2変異(トリプトファン要求性)と連鎖しているため、枯草菌の遺伝的マーカーとして使用されている。先ず、trpC2変異とhisC101変異を有し、且つtrpBの+1011位からtrpAの+69位までが欠失した168株のtrpB領域とtrpA領域の間にカナマイシン耐性遺伝子とエリスロマイシン耐性遺伝子をタンデムに導入した。カナマイシン耐性遺伝子はpUB110由来であり、rrnOプロモーターを連結した(PrrnOkan)。エリスロマイシン耐性遺伝子はpMutin由来の遺伝子を用いた。次に、カナマイシン耐性遺伝子にK196amber変異を導入し、カナマイシン感受性であり且つエリスロマイシン耐性を有するRIK213株(trpB'A'::PrrnOkan196(am) erm hisC101)を構築した。また、エリスロマイシン耐性遺伝子内にY190Ocher変異を導入した、カナマイシン耐性、且つエリスロマイシン感受性を示すRIK211(trpB'A'::PrrnOkan erm190(oc) hisC101)株を構築した(Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982)。
1)rrnHGの欠失
枯草菌168株を鋳型にし、rrnHG領域の上流領域、下流領域をそれぞれrrnHGUFプライマーとrrnHGURプライマー、rrnHGDFプライマーとrrnHGDRプライマーを用いてPCRにて増幅した。得られた断片をpBR322プラスミドに挿入したプラスミド(ptRNA)を調製した。さらにクロラムフェニコール耐性遺伝子(cat)を導入したプラスミドを調製し(ptRNA-Cm)、ptRNA-Cmを用いてゲノム上のrrnHG領域と相同組換えを行なった。次に、ptRNAからrrnHGの上流−下流領域を含むDNA断片を切り出し、カナマイシン耐性遺伝子及び温度感受性変異を有するrepU遺伝子とプラスミド上で連結し、これをゲノム内のptRNA-Cm領域と組換えた。LB培地で30℃で培養し、カナマイシン耐性及びクロラムフェニコール感受性を指標に株を選択し、rrnHG欠失株(ΔrrnHG1)を得た(Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982)。
rrnO領域の上流領域、下流領域をそれぞれ、rrnOUFプライマーとrrnXURcatプライマー、rrnXDFcatプライマーとrrnODRプライマーを用いて増幅した。次に、CAT−F2プライマー、CAT−R2プライマーを用いてpC194のcat遺伝子を増幅した。得られた3断片をrrnOUFプライマー、rrnODRプライマーを用いてSOE−PCRを行いrrnO領域の上流領域、cat遺伝子、及び下流領域の順に連結されたrrnO::catpt1DNA断片を構築し、枯草菌ゲノムに導入した(ΔrrnO::catpt1)。次に、rrnOを欠失するため、rrnO領域の上流領域、下流領域をそれぞれ、rrnOUFプライマーとrrnXURプライマー、rrnXDFプライマーとrrnODRプライマーにて増幅後、得られた2断片をrrnOUFプライマー、rrnODRプライマーで連結し、ΔrrnO DNA断片を調製した。また、R211株を鋳型として、trpBAUFプライマー及びtrpBADRプライマーを用いてtrpB'A'::PrrnOkan erm190(oc)DNA断片を調製した。得られた、ΔrrnO DNA断片とtrpB'A'::PrrnOkan erm190(oc)DNA断片をΔrrnHG1ΔrrnO::catpt1 trpB'A'::PrrnOkan196(am) erm 株に対して形質転換を行い、ペニシリン濃縮の手法を用いて、カナマイシン耐性を有し、クロラムフェニコール感受性となった株、すなわちcat遺伝子が除かれたΔrrnO株を得た(Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982)。
rrnOと同様にrrnD、E、及びBを欠失した。はじめに、それぞれのrrnにcatpt1変異を導入するため、各rrnの上流、下流領域を以下のプライマーで増幅した。rrnDの上流、下流領域は、rrnDUFプライマーとrrnXURcatプライマー及びrrnXDFcatプライマーとrrnDDRプライマーを、rrnEの上流、下流領域は、rrnEUFプライマーとrrnXURcatプライマー及びrrnXDFcatプライマーとrrnEDRプライマーを、rrnBの上流、下流領域は、rrnBUFプライマーとrrnXURcatプライマー及びrrnXDFcatプライマーとrrnBDRプライマーを用いた。
次に、ΔrrnD1、ΔrrnE1、及びΔrrnB2をそれぞれ有するDNA断片を構築するため、rrnDの上流、下流領域を、rrnDUFプライマーとrrnXURプライマー及びrrnXDFプライマーとrrnDDRプライマー、rrnEの上流、下流領域を、rrnEUFプライマーとrrnXURプライマー及びrrnXDFプライマーとrrnEDRプライマー、rrnBの上流、下流領域を、rrnBUFプライマーとrrnXURプライマー及びrrnXDFプライマーとrrnBDRプライマーを用いて増幅した。得られたDNA断片を用いて、ΔrrnD1、ΔrrnE1、及びΔrrnB2断片を調製した後、rrnOの欠失方法と同様にcatpt1遺伝子を除き、ΔrrnO、ΔrrnD、ΔrrnB2 株を構築した(Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982)。
rrnAの欠失は、rrnA-16Sの下流に存在するtrnAIleとtrnAAlaを残して構築した。まず、ΔrrnO1::catpt1株と同様にrrnA-16S領域にcatpt1遺伝子を導入した。次に、rrnAプロモーター領域、catpt1遺伝子、tRNA遺伝子を含む領域、及びrrnA−5Sの下流領域を、それぞれrrnAUFプライマーとrrnATRRプライマー、rrnA23SDFプライマーとrrnADRプライマーを用いて増幅した。得られた2種のDNA断片をrrnAUFプライマーとrrnADRプライマーを用いて増幅し、rrnA1::catpt1(trnA-Ile、Ala)DNA断片を構築した。得られたDNA断片をΔrrnHG1、ΔrrnO1、trpB'A'::PrrnOkan196(am) erm hisC101株に形質転換し、クロラムフェニコール耐性である形質転換体を選択した。次に、catpt1遺伝子を除くため、ΔrrnA1::catpt1株のcatpt1遺伝子の上流領域、下流領域、およびrrnA-5Sの下流領域を、それぞれをrrnAUFプライマーとrrnAURプライマー、rrnATRFプライマーとrrnATRRプライマー、rrnA23SDFプライマーとrrnADRプライマーを用いて増幅し、得られた3断片をrrnAUFプライマー、rrnADRプライマーにて連結した。得られたDNA断片をrrnO欠失と同様の手法を用いてcatpt1遺伝子を除いた。ΔrrnA1変異をΔrrnHG1ΔrrnO1ΔrrnD1 ΔrrnE1ΔrrnB2株に導入するため、はじめにΔrrnA1:: catpt1変異を導入し、His+マーカーと同時に形質転換を行なった(Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982)。
ΔrrnHG1株から抽出したDNAを鋳型にrrnIの上流領域、下流領域をそれぞれrrnIUFプライマーとrrnXURcatプライマー、rrnXDFcatプライマー、rrnXURプライマーを用いて増幅した。ΔrrnO1::catpt1株構築時と同様に、ΔrrnI::catpt1変異を、ΔrrnHG1 ΔrrnO1 ΔrrnD1 ΔrrnE1 trp trpB'A'::PrrnOkan196(am)erm hisC101株に導入した。次に、rrnI欠失株を構築するため、ΔrrnHG1株から抽出したDNAを鋳型に、rrnIUFプライマー、rrnIURプライマー、rrnXDFプライマー、rrnIDRプライマーでDNA断片を増幅し、rrnO欠失株の作成方法と同様にrrnIを欠失した。
ΔrrnHG1ΔrrnO1 ΔrrnD1ΔrrnE1ΔrrnB2ΔrrnA1株からrrnIを欠失(ΔrrnI2)させるためには、ΔrrnI::catpt1を導入し、その後、ΔrrnI2とTrp+マーカーを同時に形質転換した(Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982)。
rrnWの上流領域、下流領域をそれぞれrrnWUFプライマーとrrnWURcatプライマー、rrnWDFcatプライマー、rrnWDRプライマーを用いて、また、CAT−F2プライマーとCAT−Rプライマーを用いてcat遺伝子を増幅し、ΔrrnO1::catpt1と同様に、ΔrrnW::catpt1を作製した。次に、rrnWUFプライマー、rrnWURプライマー、rrnWDFプライマー、rrnWDRプライマーを用いて増幅し、rrnO欠失株の作成方法と同様の手法を用いて、rrnWを欠失した(Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982)。
Δrrn9 rrnJ+株構築の過程で自然突然変異によりrrnJが重複した、rrnJ+J+株が得られ、株をRIK530として取得した(Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982)。
rrnIオペロンのみを有する株を構築するため、ΔrrnHG1ΔrrnO1ΔrrnE1ΔrrnD1ΔrrnB2ΔrrnA1ΔrrnW2::catpt1 trpB'A'::PrrnOkan196(am) erm and hisC101 株に対し6)の方法と同様にΔrrnW2::catpt1 のcatpt1遺伝子を除去した。次に、trpB'A'::PrrnOkan erm190(oc) 遺伝子を除去した後、ΔrrnJ1::cat、trpC2変異を導入し、RIK542株(ΔrrnHG1 ΔrrnO1ΔrrnE1ΔrrnD1 ΔrrnB2 ΔrrnA1 ΔrrnW2 ΔrrnJ1::cat trpC2)を構築した。(Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982)。
rrnOオペロンのみを有する株は以下の方法で構築した。はじめに、rrnOプロモーターの下流にcatpt1遺伝子を導入したrrnO2+::catpt1をΔrrnHG1ΔrrnO1ΔrrnD1ΔrrnE1ΔrrnB2ΔrrnA1ΔrrnI2ΔrrnW2 rrnJ+J+ hisC101株へ導入した。rrnO2+::catpt1遺伝子断片は、rrnO−catF1プライマーとrrnO−catR1プライマー、rrnO−catF2プライマーとrrnX−catR2プライマー、CAT−F2プライマーとCAT−Rプライマーを用いて増幅し、得られた3断片をrrnO−catF1プライマーとrrnX−catR2プライマーで連結した。次に、rrnOオペロンを有し、かつtrpC2変異を有する染色体DNAを供与DNAに用い、rrnO2+::catpt1 ΔrrnHG1ΔrrnD1ΔrrnE1ΔrrnB2ΔrrnA1ΔrrnI2ΔrrnW2 rrnJ+J+ hisC101株に形質転換を行い、rrnO2+::catpt1とrrnOオペロンを置換した。次に、rrnJオペロンにcat遺伝子を導入するため、rrnJの上流領域、下流領域をそれぞれrrnJUFプライマーとrrnJURcatプライマー、rrnJDFcatプライマーとrrnJDRプライマーを用いて、及び、cat遺伝子をCAT−F2プライマー、CAT−Rプライマーを用いて増幅した。得られた3断片をrrnJUFプライマー、rrnJDRプライマーを用いて連結後、形質転換を行いRIK543株(ΔrrnHG1ΔrrnD1ΔrrnE1ΔrrnB2ΔrrnA1ΔrrnI2ΔrrnW2ΔrrnJ::cat trpC2)を得た(Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982、Natori et al. (2009) J. Bacteriol. 191:4555-4561)。
rrnEオペロンのみを有する株は、参考例4と同様に行なった。rrnE2+::catpt1は、rrnE−catF1プライマーとrrnE−catR1プライマー、rrnE−catF2プライマーとrrnX−catR2プライマーを用いて増幅し、cat遺伝子と連結することで構築した(Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982、Natori et al. (2009) J. Bacteriol. 191: 4555-4561)。
Claims (6)
- 改変SD配列を有する標的遺伝子と;当該改変SD配列と相補的な改変アンチSD配列を有する複数個のrrnオペロンと;改変されていないアンチSD配列を有するrrnオペロン、とを有するバチルス属細菌であって、
該改変SD配列がCCTCCであり、かつ該改変アンチSD配列がGGAGGである、
バチルス属細菌。 - 前記改変アンチSD配列を有する複数個のrrnオペロンが、少なくともrrnIオペロン及びrrnOオペロンである請求項1に記載のバチルス属細菌。
- 前記改変アンチSD配列を有する複数個のrrnオペロンが、rrnIオペロン、rrnOオペロン及びrrnEオペロンである請求項1に記載のバチルス属細菌。
- 前記改変されていないアンチSD配列を有するrrnオペロンがrrnJオペロンである請求項2又は3に記載のバチルス属細菌。
- 前記rrnJオペロンを2個有する、請求項4に記載のバチルス属細菌。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のバチルス属細菌を培養する工程を含む目的遺伝子産物の生産方法。
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