CN103620016B - 微流控装置及其用途 - Google Patents

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Abstract

提供了微流控装置及其用途，具体而言，提供了微流控装置、确定生物样品是否具有遗传变异的方法和确定生物样品是否具有遗传变异的***。其中，微流控装置具有适于分离单细胞的微流控通道。

Description

微流控装置及其用途
技术领域
本发明涉及微流控装置及其用途，具体而言，涉及微流控装置、确定生物样品是否具有遗传变异的方法和确定生物样品是否具有遗传变异的***。
背景技术
微流控芯片技术起源于分析化学领域，是通过微细加工技术，将生物、医学和化学领域中所涉及到的样品的制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到数平方厘米芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个***，用以取代常规分析实验室的各种功能的技术。微流控技术在细胞分离、核酸提取、纯化、PCR扩增等方面表现出了极强的优越性。
然而，目前的微流控芯片仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种微流控装置。根据本发明的实施例，该微流控装置具有适于分离单细胞的微流控通道。由此，利用根据本发明实施例的微流控装置可以有效地从生物样本中分离单细胞。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种确定生物样品是否具有遗传变异的方法，其特征在于，包括下列步骤：利用前面所述的微流控装置，从生物样品分离细胞样本；对所分离的细胞样本中所包含的遗传物质的至少一部分进行扩增，以便获得扩增产物；对所述扩增产物进行测序，以便获得测序结果；以及基于所述测序结果，确定所述生物样品是否具有遗传变异。通过根据本发明实施例的方法，能够有效地借助根据本发明实施例的微流控装置分离单细胞，从而可以基于对单细胞的遗传物质例如全基因组进行测序，有效地通过对测序结果进行分析而得到单细胞的遗传物质例如全基因组中是否存在异常，从而确定生物样品是否具有遗传变异。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种确定生物样品是否具有遗传变异的***，其特征在于包括：前面所述的微流控装置，所述微流控装置用于从生物样品分离细胞样本；扩增装置，所述扩增装置与所述微流控装置相连，并且适于对所分离的细胞样本中所包含的遗传物质的至少一部分进行扩增，以便获得扩增产物；测序装置，所述测序装置与所述扩增装置相连，并且适于对所述扩增产物进行测序，以便获得测序结果；以及分析装置，所述分析装置与所述测序装置相连，并且适于基于所述测序结果，确定所述生物样品是否具有遗传变异。利用根据本发明实施例的确定生物样品是否具有遗传变异的***，可以有效地实施前面所述的方法，能够有效地借助根据本发明实施例的微流控装置分离单细胞，从而可以基于对单细胞的遗传物质例如全基因组进行测序，有效地通过对测序结果进行分析而得到单细胞的遗传物质例如全基因组中是否存在异常，从而确定生物样品是否具有遗传变异。
由此，根据本发明的实施例，本发明针对低丰度细胞的获取难题，建立了基于高通量测序的低丰度细胞筛查模型，通过生物信息模拟调节该模型的参数，论证了该模型在筛查低丰度细胞方面的检测域、灵敏度、准确性、和可重复性。具体地，本发明首先建立一个自动化微流控细胞分选模型，接着利用扩增技术和新一代测序技术产生一定数量的特定序列数据对低丰度细胞不同变异进行有效筛查。将微流控技术、全基因组扩增技术及高通量测序技术进行整合，实现在微流控芯片上构建单细胞(微量细胞)的分离、富集、全基因组扩增等功能，结合高通量测序技术，进行自动化、高通量单细胞的检测分析，对样品的遗传变异方面的筛查，该技术模型能够应用于新的遗传学方面的研究，比如发现新的致病机制等。
本发明论证一种自动化筛查低丰度细胞变异信息的方法模型，其实验流程为：(a)使样品进入微流控装置，经过多个微通道或微小室分离和富集样品中的目的单细胞；(b)往微流控芯片上的微通道或微小室中加入裂解试剂或暴于光下产生热量裂解步骤(a)所得的目的单细胞，以裂解产物DNA或RNA为模板进行扩增；(c)对步骤(b)所得的扩增产物进行建库，在高通量测序平台上进行测序，所述高通量测序平台包括但不限于Illumina/Solexa、ABI Solid和Roche454；(d)对步骤(c)获得的测序数据进行处理。
本发明另一方面提供了一种应用于自动化筛查低丰度细胞变异信息的微流控装置，所述微流控装置包含至少一个通过微通道或微小室互相连接的进口和出口，由微流控芯片、驱动***和检测***组成。
在本发明的一个优选实施例中，所述微流控装置的微流控芯片包含细胞分离富集单元和细胞操控单元。
在本发明的一个优选实施例中，所述细胞分离富集单元设有微结构或微障碍物，所述细胞操控单元设有液流和气阀控制。
在本发明的一个优选实施例中，所述微流控装置的微流控芯片还包含DNA和/或RNA提取和扩增单元。
在本发明的一个优选实施例中，根据所述微流控装置对低丰度细胞的分离富集的方法，包括使样品流经所述微流控芯片的微通道或微小室，利用微通道或微室内的磁珠捕获目标细胞。
在本发明的一个优选实施例中，根据所述微流控装置裂解细胞的方法，包括使样品流经所述微流控芯片的微通道或微小室，利用微通道或微室内的磁珠捕获目标细胞，以及加入裂解试剂或将磁珠暴于光下产生热量而裂解细胞。
在本发明的一个优选实施例中，根据所述微流控装置从细胞扩增目标DNA或RNA的方法，包括使样品流经所述微流控芯片的微通道或微小室，利用微通道或微室内的磁珠捕获目标细胞，加入裂解试剂或将磁珠暴于光下产生热量而裂解细胞，提取目标DNA或RNA，以及以目标DNA或RNA为模板进行扩增；所述扩增包括全基因组扩增。
由此，根据本发明的实施例，本发明建立了基于微流控技术和高通量测序的低丰度细胞筛查的技术模型，并论证了该模型的检测域、灵敏度、准确性和可重复性，可实现对复杂样品中的低丰度细胞的遗传信息进行高通量自动化的筛查，实现实验室高通量自动化，为基因学方面的医疗诊断研究提供基础。根据本发明的实施例，本发明设计了具有微通道或微小室的微流控芯片，集分离、富集微量细胞和对细胞中DNA或RNA进行提取和扩增的功能于一张芯片，降低实验装置设备成本，易于推广。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1-图6显示了根据本发明实施例的微流控装置的结构示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
术语“低丰度细胞”、“单(个)细胞”和“微量细胞”在文中可互换使用，都是指在一个复杂样品中包含有所要类型的细胞，但其含量很小，一般只有一个到几个。
微流控装置
在本发明的第一方面，本发明提出了一种微流控装置。根据本发明的实施例，该微流控装置具有适于分离单细胞的微流控通道。由此，利用根据本发明实施例的微流控装置可以有效地从生物样本中分离单细胞。
根据本发明的实施例，微流控装置中适于分离单细胞的微流控通道的形式并不受特别限制。针对用于分离单细胞的样品的复杂性和目的细胞的稀少性，可以根据不同类型细胞在物理、化学及生物学特性上的差异在芯片上设计和制作对细胞进行一步分离单细胞或多步分离单细胞的微通道，以便获得最终目的单细胞。需要说明的是，可以通过各种适于分离单细胞的方法的组合，并且顺序不受特别限制，只要能够实现对单细胞的分离即可。例如，可以首先将混合样品细胞通入到第一微流控通道中，进行初步的分离，去除大多数的干扰细胞；然后再将经过初步分离的细胞，通入到第二微流控通道中，进行目的细胞的进一步的富集。
根据本发明的实施例，微流控通道可以基于细胞的物理、化学性质，如大小，形状，可否形变，细胞表面性质(如细胞表面受体、抗原、膜的通透性)，细胞内部性质(如表达某种蛋白、特异性酶等)来实现对单细胞的分离。
根据本发明的一个实施例，所述微流控通道上形成有多个微柱。由此，可以通过在微流控通道上形成微柱(也可以称为障碍物)，作为细胞在流体方向上流动的障碍，从而可以基于细胞尺寸的区别，实现对单细胞的分离。根据本发明的实施例，可以在微流控通道内构建规则排列的，并间隔固定尺寸的障碍物(障碍物的形式并不受特别限制，可以是圆柱，椭圆住，方柱等)，每行障碍物之间发生固定尺寸的横向位移。参考图1-3，通过微流控芯片通道内部密布规则排列的障碍物(例如多个微柱在所述微流控通道上呈阵列分布)，待分离细胞作为流体中的质点在流入通道时与障碍物发生碰撞，当细胞大于某一尺寸(与障碍物之间的间距相关)时，细胞按照一定角度(与每行障碍物之间的横向位移相关)发生偏移，小于该尺寸的细胞则按照原流体轨迹流动，以此实现不同尺寸的细胞的分离(如图1)。可以根据待分离细胞的大小来调整障碍物间距，如微柱之间的距离，包括横向间距和纵向间距。根据本发明的实施例在纵向上，相邻两个微柱之间的距离为10-100微米，并且，在横向上，相邻两个微柱之间的距离为10-100微米。由此，可以进一步提高分离单细胞的效率。根据本发明的一个实施例，每行微柱相对偏移6-7微米。由此，可以进一步提高分离单细胞的效率。障碍物阵列结构可以设置成单级或多级，根据待分离细胞环境的不同，如从体液中分离固定大小的细胞，一般单级微柱阵列就可以实现，而像血液之类的复杂样品，里面还有多种尺寸的细胞，可以用多级微柱阵列进行精细的分离。根据本发明的一个实施例，沿流体方向，所述微柱的直径增大。由此，可以进一步提高分离单细胞的效率。进一步，参考图2，可以建立多级不同间距尺寸的障碍物阵列，将不同尺寸的细胞的分离进一步细化。在出口处收集不同尺寸的细胞，进行下一步分离或者直接用于后续的检测实验。根据本发明的一个实施例，沿流体方向，微柱的直径不变。
另外，根据本发明的实施例，还可以利用不同尺寸的细胞在弯曲通道中产生的惯性力的不同，实现在微流控通道中分离细胞。在弯曲通道中，稳流流动的流体其流速呈现抛物线状分布，在通道中间的流速最大，受到的离心力最大，靠近通道壁的流体流速最小。为了保持流体的质量守恒，会产生涡流。这样流体中的颗粒受到了浮力和迪恩力的相互作用。在一定的流速条件下，形成聚焦流动。尺寸越大的颗粒的聚焦流越靠近通道的内侧壁，尺寸越小的颗粒的聚焦流越远离通道的内侧壁根据本发明的一个实施例，所述微流控通道为弯曲管道。由此，通过采用弯曲管道，可以通过产生惯性力，来实现对细胞的有效分离。根据本发明的优选实施例，所采用的弯曲管道为选自阿基米德螺线通道(如图4所示)和鹦鹉螺线通道(如图5所示)的至少一种。由此，可以通过使不同尺寸的细胞通入到通道中，在弯曲通道中形成聚焦流，并在不同的出口留出，实现大小细胞不同的分离，从而可以进一步提高分离单细胞的效率。
另外，根据本发明的实施例，还可以根据细胞带有磁性进行分离。细胞带有磁性，主要分为两种，一种是自身带有磁性，如红细胞，由于红细胞含有血红蛋白，血红蛋白是含铁蛋白，因此红细胞具有顺磁性，并可以通过脱氧化处理，提高其磁性；另一种是将可以特异性捕获目的细胞的抗体、适配体等和磁性微球连接，通过抗原抗体反应，使特异性的细胞具有磁性。具有磁性的细胞通过外加磁场，可以将有磁性的细胞同无磁性的细胞进行分离，如图6所示。根据本发明的一个实施例，所述微流控装置进一步设置有磁体。由此，可以基于细胞带有磁性，而实现对细胞的分离。根据本发明的实施例，磁体的设置位置并不受特别限制，只要能够使得微流控通道处于磁体的有效磁场范围内即可，根据本发明的实施例，可以将磁体设置在微流控通道的下方，由此，可以进一步提高分离效率。根据本发明的一个实施例，所述微流控通道的宽度为0.5毫米，长度为50毫米。由此，可以进一步提高分离单细胞的效率。
微流控装置(因芯片是实现装置功能的主要组件，因而在本文中也称为微流控芯片)，可以通过本领域技术人员已知的方法制备。微流控芯片的制作材料包括硅、玻璃、石英、聚甲基丙烯酸甲酯(poly(methylmethacrylate)，PMMA)、聚苯乙烯(polystyrene)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙烯(polyethylene)、硅橡胶(如聚二甲基硅氧烷(poly(dimethylsiloxane)，PDMS)、环氧树脂等。像是硅、玻璃、石英等，使用湿刻蚀的方法进行微结构通道的加工；当制作高宽比高，结构较微细的硅芯片时，需要使用深反应离子刻蚀的方法进行微结构的加工；而制作热固型的高聚物材料芯片，如PDMS、环氧树脂等，一般都需要构建模具，可用硅、玻璃、光胶、PDMS等制作。制作模具的方法一般有光刻、LIGA(Lithographiegalvanoformung and abformung)、刻蚀、软刻蚀等技术加工。然后利用浇注的方法制作微结构通道；而热塑型的高聚物，如聚碳酸酯、PMMA等，一般使用热压的方法进行制作。某些高聚物材料，如PMMA、聚苯乙烯等可以使用激光烧蚀的方法进行制作。
确定生物样品是否具有遗传变异的方法和***
在本发明的第二方面，本发明提出了一种确定生物样品是否具有遗传变异的方法。根据本发明的实施例，该方法可以包括下列步骤：
首先，利用前面所述的微流控装置，从生物样品分离细胞样本，前面关于微流控装置已经进行了详细描述，不在赘述。需要说明的是，前面关于微流控装置所描述的所有特征和优点均适用确定生物样品是否具有遗传变异的方法。
接下来，对所分离的细胞样本中所包含的遗传物质的至少一部分进行扩增，以便获得扩增产物。在本文中所使用的术语“遗传物质”应做广义理解，其指的是细胞样本中所包含的可以携带其遗传信息的任何物质，可以为DNA也可以为RNA，可以是全基因组，也可以是转录组。根据本发明的一个实施例，所述生物样品为选自血液、体液、组织样品和细胞培养物的至少一种。由此，可以有效地从生物样品分离单细胞，从而提高后续分析的效率。根据本发明的一个实施例，所述细胞样本为选自有核红细胞、肿瘤细胞、胚胎干细胞、免疫细胞的至少一种。优选所述细胞样本为选自胎儿有核红细胞和循环肿瘤细胞的至少一种。由此，可以有效地对特定来源的生物样本分离的单细胞进行检测。根据本发明的一个实施例，对所分离的细胞样本中所包含的遗传物质的至少一部分进行扩增进一步包括：对所分离的细胞样本进行裂解，以便释放所述细胞样本的遗传物质；以及对所释放的遗传物质进行扩增，以便获得所述扩增产物。由此，可以有效地从所分离的细胞扩增遗传物质。根据本发明的一个实施例，使用裂解试剂对所分离的细胞样本进行裂解，其中，所述裂解试剂为选自氢氧化钾、氢氧化钠、SDS和蛋白酶K的至少一种。由此，可以进一步提高扩增遗传物质的效率。另外，还可以通过物理方法对细胞样本进行裂解，例如，将细胞样本置于声波场中，使细胞裂解；通过对细胞进行加热，使细胞裂解。为了使单个细胞中低丰度的核酸满足后续测序的需求，需要对其进行全基因组和转录组的提取和扩增。单个细胞核酸的提取方法多样，可以采用商品化试剂盒提取单个细胞内的基因组或者mRNA；也可以根据MDA或者转录本扩增等技术中的策略，裂解后直接进行基因组或者转录组的扩增，而无需进行核酸的提取；或者采用微流控的技术，如固液萃取、液液萃取等方法，提取基因组或者转录组；而单细胞全基因组或者全转录组扩增的主要的方法为MDA、DOP-PCR、cDNA指数扩增和基于T7RNA聚合酶的线性扩增等技术。由此，根据本发明的一个实施例，所述遗传物质为所述细胞样本的单细胞全基因组。由此，可以有效地通过对单细胞全基因组进行测序，而确定样本的遗传信息。根据本发明的一个实施例，对所释放的遗传物质进行扩增是通过基于PCR的扩增反应和恒温扩增反应的至少一种进行的。优选，对所释放的遗传物质进行扩增是通过MDA、DOP-PCR、cDNA指数扩增和基于T7RNA聚合酶的RNA线性扩增的至少一种进行的。由此，可以进一步提高对全基因组进行扩增的效率。
在得到扩增产物之后，对所得到的扩增产物进行测序，以便获得测序结果。根据本发明的一个实施例，对所述扩增产物进行测序进一步包括：针对所述扩增产物，构建测序文库；以及对所述测序文库进行测序，以便获得所述测序结果。由此，可以有效地对扩增产物进行测序。根据本发明的一个实施例，利用选自第二代高通量测序平台和第三代高通量测序平台的至少一种对所述全基因组测序文库进行测序对所述测序文库进行测序。由此，可以进一步提高测序效率。目前测序主要有两大类，一类是第二代的高通量测序技术，包括Illumina公司的Gemone Anayzer***(即Solexa测序仪，后又发展为HisSeq2000***)、ABI公司的Solid***以及Roche454公司的GS-FLX***。第二代测序技术均有其标准流程，按照标准流程进行测序；另一类，则是第三代测序技术，即单分子测序技术，包括Helicos公司的真实单分子测序技术、Pacific Biosciences公司的单分子实时测序技术，以及Oxford NanoporeTechnologies公司的纳米孔测序技术等。该类技术可直接对DNA、RNA、microRNA、蛋白等分子直接测序，无需对单细胞中的核酸进行全基因组或者转录组的扩增，更直观的反应了单个细胞中DNA、RNA的数量和序列的变化。
最后，基于所述测序结果，确定所述生物样品是否具有遗传变异。通过根据本发明的方法，能够有效地借助根据本发明实施例的微流控装置分离单细胞，从而可以基于对单细胞的遗传物质例如全基因组进行测序，有效地通过对测序结果进行分析而得到单细胞的遗传物质例如全基因组中是否存在异常，从而确定生物样品是否具有遗传变异。根据本发明的一个实施例，所述遗传变异为选自单核苷酸多态性、拷贝数变异、基因组结构变异、可变剪接、差异表达和转录本变异的至少一种。根据本发明的一个实施例，基于所述测序结果，确定所述生物样品是否具有遗传变异进一步包括：将所述测序结果与参考基因组进行比对；以及基于比对结果，确定所述生物样品是否具有遗传变异。由此，可以进一步提高确定生物样品是否具有遗传变异的效率。基于高通量测序技术获得的数据，运用短序列比对工具(如SOAP)将测序数据比对到参考基因组上，进而可根据比对结果的定性及定量参数获取目的细胞的基因组特征。基因组DNA测序常用的数据分析手段有：单核甘酸多态性(SNP)分析，拷贝数变异(CNV)分析，基因组结构变异(SV)分析等等；转录组RNA测序常用分析方法有：基因差异表达(DGE)分析，可变剪接(AS)探测，基因融合探测等等；对于细胞群体测序数据还能进行细胞发育及进化分析。由此，通过对分离的细胞的数据进行比对、关联性分析，不仅可以了解细胞的发生、发展、演化过程，而且可以为基因医疗诊断提供研究基础，如对已有或者潜在的癌症、复杂疾病进行筛查或者鉴定，实现疾病的早期发现、早期治疗的目的。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种确定生物样品是否具有遗传变异的***，其特征在于包括：微流控装置、扩增装置、测序装置和分析装置。其中，微流控装置用于从生物样品分离细胞样本；扩增装置与微流控装置相连，并且适于对所分离的细胞样本中所包含的遗传物质的至少一部分进行扩增，以便获得扩增产物；测序装置与扩增装置相连，并且适于对所得到的扩增产物进行测序，以便获得测序结果；以及分析装置与测序装置相连，并且适于基于所得到的测序结果，确定生物样品是否具有遗传变异。利用根据本发明实施例的确定生物样品是否具有遗传变异的***，可以有效地实施前面所述的方法，能够有效地借助根据本发明实施例的微流控装置分离单细胞，从而可以基于对单细胞的遗传物质例如全基因组进行测序，有效地通过对测序结果进行分析而得到单细胞的遗传物质例如全基因组中是否存在异常，从而确定生物样品是否具有遗传变异。根据本发明的一个实施例，扩增装置进一步包括：裂解单元，所述裂解单元中设置有裂解试剂或者外部能源装置，以便使用裂解试剂或外部能源对所分离的细胞样本进行裂解，释放所述细胞样本的遗传物质；以及扩增单元，所述扩增单元与所述裂解单元相连，并且适于对所释放的遗传物质进行扩增，以便获得所述扩增产物。由此，可以有效地对遗传物质进行扩增。根据本发明的一个实施例，确定生物样品是否具有遗传变异的***所述裂解试剂为选自氢氧化钾、氢氧化钠、SDS和蛋白酶K的至少一种，所述外部能源为光、电和热的至少一种。根据本发明的一个实施例，所述扩增单元适于进行MDA、DOP-PCR、cDNA指数扩增和基于T7RNA聚合酶的RNA线性扩增的至少一种。由此，可以有效地对单细胞全基因组进行扩增。根据本发明的一个实施例，所述测序装置进一步包括：文库构建单元，所述文库构建单元用于针对所述扩增产物，构建测序文库；以及测序单元，所述测序单元与所述文库构建单元相连，并且适于对所述测序文库进行测序，以便获得所述测序结果。由此，可以有效地对扩增产物进行测序。根据本发明的一个实施例，所述测序单元为选自第二代高通量测序平台和第三代高通量测序平台的至少一种。由此，可以进一步提高测序效率。根据本发明的一个实施例，分析装置进一步包括：比对单元，所述比对单元用于将所述测序结果与参考基因组进行比对；以及变异确定单元，所述变异确定单元与所述比对单元相连，并且适于基于比对结果，确定所述生物样品是否具有遗传变异。由此，可以进一步提高确定生物样品是否具有遗传变异的效率。
需要说明的是，前面针对微流控装置和用于确定生物样品是否具有遗传变异的方法的特征和优点同样适用于该***，不再赘述。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。
一般方法基于高通量测序的低丰度细胞筛查模型的建立
1.1微流控芯片的设计
1.1.1微流控芯片的单细胞分离和富集单元
由于样品的复杂性和目的细胞的稀少性，本实施例根据不同类型细胞在物理、化学及生物学特性上的差异在芯片上设计对细胞进行多步分离的微通道，为获得最终目的单细胞。
根据目的细胞的理化性质，设计具有不同结构的微流控芯片，进行目的细胞的选择性分离和富集。如果要分离的细胞的大小与其他细胞有明显区别，可以在微流控芯片的通道里设计各种结构如柱状、弯曲沟道、梳状、堰状、筛状等微结构，仅允许一定尺寸大小的细胞通过，或者截留一定尺寸大小的细胞，来分离细胞、或者利用确定性横向位移的原理，在通道内设计一定间隔尺寸的障碍物，不同大小的细胞通过与障碍物碰撞，进入到不同的液流，达到分离不同大小细胞的目的；利用流体力学的原理，根据不同大小细胞质点的不同，实现细胞的分离。根据惯性，设计弯曲通道，控制液流，实现不同大小细胞的迁移而分离。如果细胞可以变形，如血红细胞，胎儿有核红细胞，可以设计不同间距的障碍物，让障碍物间距小于红细胞或者是胎儿有核红细胞的直径，将可变形细胞与不可变形细胞(白细胞、肿瘤细胞等)进行分离。
根据细胞物理性质的不同，可以在芯片上建立各种场，如电场、磁场、声波等进行细胞的分离。如介电泳，可以在芯片通道外加上不同频率的电场，通过调节电场的空间分布，会使不同种类的细胞受到不同程度的极化而产生不同程度的漂移，实现细胞的分离，或者是利用介电泳形成电传导率梯度，驱动细胞向电导率低的方向移动，直到平衡，电导率为0，再利用重力将细胞拖拽到目的通道内，实现细胞分离。利用磁场分离，与MACS类似，在磁珠表面连接有特异性的捕获细胞的生物分子，通过免疫化学反应进行结合，利用可控磁场，将捕获的细胞进行分离；或者利用某些细胞自身具有的磁性，如红细胞和白细胞的顺磁性和反磁性实现细胞的分离。利用声波的波节特性受力的不同，根据细胞的大小、密度、比重等性质，实现细胞的分离。
由于细胞会表达很多特异性的表面分子，根据其免疫化学性质，在通道内连接上可以与细胞表面标志物分子进行结合的分子如抗体、适配体等，进行特异性细胞的捕获和/或非特异性细胞的去除。也可以在通道内进行免疫磁珠的分选，磁珠上相应连接有特异性捕获目的细胞或者去除非特异性细胞的生物分子，实现特异性细胞的分离和富集。
1.1.2微流控芯片的细胞操控单元
根据整体芯片的整合和前期细胞分离的要求，可以选择不同的操控方式。可以利用液流和微阀的控制，操控微阀的开闭，截留细胞。如果前期采用磁珠进行细胞的分选，可以通过磁场的控制，选择性地操控单个细胞(微量细胞)到指定的反应区域。可以在操控通道上加上电场，利用电渗流或者电泳的方式将单个细胞(微量细胞)驱动进反应池中。设计特殊结构的通道，可以仅截留单个细胞(微量细胞)。还可以利用毛细管，使细胞进行规则排列，通过陈列移动，将单个细胞(微量细胞)驱动到指定的反应区域。这些控制通道可以进行集成，实现同时多个单细胞(微量细胞)的操控。
1.1.3微流控芯片的单细胞核酸提取和扩增单元
核酸提取和扩增单元可以是位于一定规则结构的微反应池中，也可以通过droplet(液滴)将单个细胞(微量细胞)包裹，形成一个个独立的小室作为反应池。为了提取到细胞内的DNA或者RNA，我们可以在提取单元里放入表面功能化的磁珠，通过磁珠分选，获得需要的微量细胞DNA分子或RNA分子，通过控制磁珠，驱动提取的DNA或者RNA分子流出出口，进入扩增单元。如将收集到的核酸分子放入PCR管中，进行标准的WGA或者全转录本扩增过程。还可以直接利用droplet技术，单个细胞(微量细胞)包裹在droplet(液滴)中，液滴中直接包裹如PCR反应液，经过裂解后，直接在droplet中进行扩增反应。
1.2高通量测序
获得的扩增产物，通过驱动***留出出口，收集反应液。按照第二代测序技术的标准流程，将核酸分子打断，建库，然后进行测序。
针对DNA和RNA有不同的建库方式。如果是DNA，可以将获得的DNA片段随机打断成小片段，加上特定接头，制备成DNA文库，在cBot上进行成簇扩增，直接对DNA片段进行单末端或者双末端的测序。如果获得的是RNA，分离出mRNA，制备成片段化的cDNA文库，在cBot上进行成簇扩增，再用于高通测序仪测序。
目前主要采用三种技术进行高通量测序，Illumina公司的Gemone Anayzer***(即Solexa测序仪，后又发展为HisSeq2000***)、ABI公司的Solid***以及Roche454公司的GS-FLX***三大高通量测序技术。而且随着科技的发展，将会应用第三代测序技术，即单分子测序技术，包括Helicos公司的真实单分子测序技术、Pacific Biosciences公司的单分子实时测序技术，以及Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔测序技术等。
1.3数据分析
基于高通量测序结果，运用短序列比对工具(如SOAP)将测序数据比对到参考基因组上，进而可根据比对结果的定性及定量参数获取目的细胞的基因组特征。
基因组DNA测序常用的数据分析手段有：单核甘酸多态性(SNP)分析，拷贝数变异(CNV)分析，基因组结构变异(SV)分析等等；转录组RNA测序常用分析方法有：基因差异表达(DGE)分析，可变剪接(AS)探测，基因融合探测等等；对于细胞群体测序数据还能进行细胞发育及进化分析。
通过对分离样品进行比对、关联性分析，不仅可以了解细胞的发生、发展、演化过程，而且可以为基因医疗诊断提供研究基础，如对已有或者潜在的癌症、复杂疾病进行筛查或者鉴定，实现疾病的早期发现、早期治疗的目的。
实施例1胎儿有核红细胞的遗传性鉴定
1.15mL怀孕8-14周的孕妇的肘静脉外周血，EDTA-K2抗凝，4℃振荡保存，24h内进行试验。
1.2胎儿有核红细胞的分离：使用两步进行分离。首先根据红白细胞尺寸的不同的进行分离，如2.1中的芯片结构，去除大多数的红细胞；将回收的细胞通入到磁性分离芯片中，利用红白细胞的磁性的不同进行分离。
第一芯片的结构：微柱间的间距为15μm，每行微柱相对偏移6.75μm。使用深反应离子刻蚀技术在硅片上构建微结构，通道深度为150μm，使用玻璃片进行封合。
第二芯片的结构：使用Miltenyi LS Column(Miltenyi Bio Tech)，外置1.4T磁铁。
使用外部驱动设备将血液和缓冲液以100μL/min的速度通入到第一个芯片，缓冲液为iDPBS(含有1％BSA，2mM EDTA)。从出口处回收细胞。回收的细胞经过离心2000rpm，15min。样品用50mM NaNO2处理10min。然后通入到Miltenyi LS Column中。使用iDPBS缓慢冲洗，洗去未吸附的白细胞。然后移去磁铁，使用缓冲液冲洗，回收具有磁性的细胞。使用FITC-epsilon-球蛋白标记细胞，在荧光显微镜下挑取单个的有核红细胞，并将其转移到微孔阵列中。
1.3细胞裂解：使用NaOH裂解细胞。
1.4核酸的提取和扩增：直接使用REPLI-g Mini/Midi kits(Qiagen)进行单细胞全基因组扩增。
1.5测序：全基因组扩增产物经过建库，用Illumina技术进行测序。
1.6数据分析：进行单核甘酸多态性(SNP)分析，进行单基因位点或者多基因位点突变分析。
实施例2：胎儿有核红细胞的染色体非整倍体异常鉴定
2.1取样：同1.1
2.2胎儿有核红细胞的分离：
所使用的第一芯片的结构：如图5中的鹦鹉螺芯片，有一个进样口和6个出样口，入口通道宽度为0.22mm，通道弯曲曲率按照一定比例逐渐放大，在出口处的通道宽度为3.88mm。芯片通道结构su-8负光胶经光刻工艺制作掩膜，再将PDMS预聚物混合浇注在模具上，经过翻模而成。使用玻璃片进行封合。
所使用的第二芯片的结构：如图6。有两个入口和两个出口。通道宽度为0.5mm，长度为50mm。芯片通道结构su-8负光胶经光刻工艺制作掩膜，再将PDMS预聚物混合浇注在模具上，经过翻模而成。使用玻璃片进行封合。在通道的一侧加上外部磁铁，构建成磁性芯片。
采用两步进行分离。第一步使用第一芯片去除大多数的红细胞；再将含有有核红细胞的混合细胞样品通入到第二芯片，利用红白细胞磁性的不同进行分离。
使用外部驱动设备微量注射泵，驱动稀释浓度为10％的血液(使用含1％BSA的iDPBS缓冲液稀释)通入到通道中，流速为300μL/min。在出口处收集细胞溶液。回收的细胞经过离心2000rpm，15min。样品用50mM NaNO2处理10min。将细胞从样品入口通入到芯片中，同时另一个入口通入iDPBS缓冲液，二者流速均为10μL/min。在出口处回收目的细胞。细胞经过FITC-CD71抗体染色，挑取单个阳性细胞进行后续实验。
2.3细胞裂解：使用KOH/DTT裂解细胞。
2.4核酸的提取和扩增：直接采用DOP-PCR(GenomePlex Single Cell Whole GenomeAmplification Kit，Sigma)方法进行单个细胞基因组的扩增。
2.5测序：全基因组扩增产物经过建库，用Illumina技术进行测序。
2.6数据分析：进行拷贝数变异(CNV)分析，基因组结构变异(SV)分析等。
实施例3：癌症患者循环肿瘤细胞(CTCs)筛查
3.1取样：抽取肿瘤患者的肘静脉外周血10mL，EDTA-K2抗凝。血样4℃保存，24h内进行检测。
3.2CTCs的分离：使用两步芯片进行分离。第一步根据细胞的大小进行分离，如图1中的芯片结构，去除大多数的红细胞和部分外细胞；第二步采用EpCAM抗体捕获CTCs细胞。具体地，
第一芯片的结构：微柱间的间距为20μm，每行微柱相对偏移6μm。使用深反应离子刻蚀技术在硅片上构建微结构，通道深度为150mm，使用玻璃片进行封合。
第二芯片的结构：使用Miltenyi LS/MS Column(Miltenyi BioTech)，捕获CTCs。
使用外部驱动设备将血液和缓冲液以100μL/min的速度通入到第一个芯片，缓冲液为iDPBS(含有1％BSA，2mM EDTA)。从出口处回收细胞。回收的细胞经过离心300g，10min。然后将连接有CD326(EpCAM)抗体的磁珠与细胞混合孵育。使用iDPBS冲洗。将细胞和磁珠混合物通入到Miltenyi LS/MS Column中。使用iDPBS缓慢冲洗，洗去未吸附的白细胞。然后移去磁铁，使用缓冲液冲洗，回收具有磁性的细胞。并对CTCs细胞进行计数。
3.3细胞裂解：使用裂解液KOH或者NaOH裂解细胞。
3.4核酸的提取和扩增：将收集到的微量细胞按照MDA的方法进行全基因组扩增。
3.5测序：全基因组扩增产物经过建库，用Illumina技术进行测序。
3.6数据分析：进行单核甘酸多态性(SNP)分析，进行单基因位点或者多基因位点突变分析。通过比较分离样本与其他正常细胞、癌症实体瘤组织、癌症相关单细胞的遗传变异分析，为以后的癌症的早期发现、早期诊断及术后治疗提供证据。
实施例4胎儿有核红细胞的遗传性鉴定
4.1同1.1
4.2同1.2
4.3同1.3
4.4核酸的提取：使用磁珠(Invitrogen，Dynabeads)的方法直接提取单细胞中的基因组。
4.5测序：直接使用Oxford Nanopore Technologies进行单分子测序。
4.6数据分析：进行单核甘酸多态性(SNP)分析、拷贝数变异(CNV)分析，基因组结构变异(SV)分析等
实施例5样品中循环肿瘤细胞(CTCs)的自动化筛查
取样：外周血10mL，EDTA-K2抗凝，4℃振荡保存，24h内进行试验。
使用微量注射泵将血液和PBS缓冲液以层流的方式通入微流控芯片的分离富集单元，通道内构建有规则排列的圆柱形的微柱，微柱间距为16μm，血细胞通过与微柱碰撞，按照细胞尺寸将尺寸较小的红细胞分离出去，尺寸较大的白细胞进入到下一分离通道。通道内置有连接有anti-EpCAM抗体分子的免疫磁珠，免疫磁珠通过与通道内流入的白细胞的碰撞，捕获到细胞表面特异性表达EpCAM分子的CTCs。PBS冲洗，去除非特异性结合细胞。通入酶解液，将CTCs从磁珠上释放。
通过流体驱动，使细胞规则排列进入通道，通过气阀的开合，将单个CTC(微量CTCs)截留在不同的小室中。
分离出去的红细胞和白细胞经控制，少量细胞进入到各自的仅允许单个细胞排列通过的通道，通过气阀和液流控制，将单个细胞(微量细胞)分隔到独立的小室，作为对照备用。
通过流体控制和气阀开合，推动单个细胞(微量细胞)从各自的出口流出，分别收集在PCR管中。收集到的单个细胞(微量细胞)按照MDA的方法进行标准扩增。
收集扩增产物，将DNA片段随机打成小片段，加上特定接头建立DNA片段文库，在cBot上进行成簇扩增，用于Illumina Hiseq 2000测序。
数据分析，基于高通量测序结果探测细胞基因组单核甘酸多态性及染色体结构变化，寻找潜在的癌症驱动因素及候选位点。建立癌细胞发育树，追溯癌细胞进化发育过程。通过比较分离样本与其他正常细胞、癌症实体瘤组织、癌症相关单细胞的遗传变异分析，为以后的癌症的早期发现、早期诊断及术后治疗提供证据。
实施例6胎儿有核红细胞的遗传性鉴定
取样：5mL怀孕14周的孕妇的外周血，EDTA-K2抗凝，4℃振荡保存，24h内进行试验。
将血液通入到微磁流通道中，在外加磁场的作用下，根据血细胞中红细胞、fNRBCs具有顺磁性，白细胞反磁性的原理，将红细胞(包括fNRBCs)和白细胞分离，分别进入不同的通道。
红细胞(包括fNRBCs)进入到连接有anti-CD71抗体的微柱通道内，通过抗原抗体免疫反应，捕获到fNRBCs。将fNRBCs从微柱上解吸附后，操控其进入到控制通道中。
控制fNRBCs进入仅允许单细胞通过的通道。在显微镜下，通过液流和气阀的控制，推动单个fNRBC依次进入到阵列收集管中。
控制血液中分离出来的白细胞和红细胞部分进入仅允许单个细胞通过的通道，通过控制，将单个的白细胞、活细胞推动进入阵列收集管中，作为对照使用。
提取阵列收集管中的细胞RNA，按照基于T7RNA聚合酶的线性扩增方法进行转录本扩增，具体过程参照Eberwine，J.et a1.Analysis of gene expression in single live neurons.Proc.Natl.Acad.Sci.USA89，3010-3014(1992).和Van Gelder，R.N.et a1.Amplified RNA synthesizedfrom limited quantities ofheterogeneous cDNA.Proc.Natl.Acad.Sci.USA87，1663-1667(1990).进行。
收集扩增产物cDNA，根据Illumina提供的文库构建文档，制备文库，在cBot上进行成簇扩增，用于Illumina Hiseq 2000测序。数据分析。
基于高通量测序数据分析胎儿转录组特征，为医疗分子诊断研究提供基础。
实施例7循环肿瘤细胞表达水平的研究
7.1同3.1
7.2同3.2
获得单个循环肿瘤细胞后，后续RNA提取扩增过程及所用引物试剂等参照Tang F，Barbacioru C，Nordman E，et a1.RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of asingle cell.Nature Protocols.2010；5(3)：516-535.进行。
7.3细胞裂解：使用NP40裂解细胞。
7.4反转录：直接加入反转录酶和引物进行反转录，合成双链DNA。
7.5cDNA指数扩增：进行第一轮PCR反应，使用QIAquick PCR purification kit进行纯化；在将第一轮PCR后纯化的产物进行第二轮扩增，使用QIAquick PCR purification kit进行纯化。凝胶回收PCR产物中的0.5-3kb的片段。
7.6测序：cDNA扩增产物经过建库，用Illumina技术进行测序。
7.7数据分析：将测序所得reads比对到参考转录本，根据比对所得信息进行转录本结构研究，转录本变异研究，基因表达水平研究，非编码区功能研究等。工业实用性
根据本发明的实施例的微流控装置、确定生物样品是否具有遗传变异的方法和确定生物样品是否具有遗传变异的***，能够有效地分离单细胞，从而确定生物样品是否具有遗传变异。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

Claims (5)

1.一种从生物样本中分离单细胞的微流控装置，其特征在于，所述微流控装置用于分离血液样本中的血红细胞和/或有核红细胞，所述微流控装置具有适于分离单细胞的微流控通道，所述微流控通道上形成有多个微柱，所述多个微柱在所述微流控通道上呈阵列分布，在纵向上，相邻两个微柱之间的距离为15微米，并且，在横向上，相邻两个微柱之间的距离为15微米，每行微柱相对偏移6-7微米，以及沿流体方向，所述微柱的直径增大。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述微流控装置进一步设置有磁体，所述微流控通道的宽度为0.5毫米，长度为50毫米。
3.一种确定生物样品是否具有遗传变异的非诊断方法，其特征在于，包括下列步骤：
利用权利要求1-2任一项所述的微流控装置，从生物样品分离细胞样本；
对所分离的细胞样本中所包含的遗传物质的至少一部分进行扩增，以便获得扩增产物；
对所述扩增产物进行测序，以便获得测序结果；以及
基于所述测序结果，确定所述生物样品是否具有遗传变异。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述遗传物质为所述细胞样本的单细胞全基因组或全转录组，基于所述测序结果，确定所述生物样品是否具有遗传变异进一步包括：
将所述测序结果与参考基因组或参考转录组进行比对；以及
基于比对结果，确定所述生物样品是否具有遗传变异。
5.一种确定生物样品是否具有遗传变异的***，其特征在于包括：
权利要求1-2任一项所述的微流控装置，所述微流控装置用于从生物样品分离细胞样本；
扩增装置，所述扩增装置与所述微流控装置相连，并且适于对所分离的细胞样本中所包含的遗传物质的至少一部分进行扩增，以便获得扩增产物；
测序装置，所述测序装置与所述扩增装置相连，并且适于对所述扩增产物进行测序，以便获得测序结果；以及
分析装置，所述分析装置与所述测序装置相连，并且适于基于所述测序结果，确定所述生物样品是否具有遗传变异。
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