CN108496080A - 多功能珠及用于捕获靶细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

描述了多功能珠和直接从小体积生物样品捕获靶细胞和从这些细胞进行功能和基因组测定的方法。这使用多功能捕获珠完成,其允许单细胞捕获元件和分子测定组分二者共定位。当组合数字微流体平台时,这使得能够将特定单细胞编码和/或条形编码。

Description

多功能珠及用于捕获靶细胞的方法
联邦资助条款
本发明在政府资助下在国立卫生研究院授予的合同号1U24AI118667-01下做出。政府在本发明中具有一定的权利。
与相关申请的交叉引用
本申请为于2016年1月19日提交的美国临时申请序列号62/280244的非临时申请,并要求其优先权,所述临时申请的整个公开内容通过引用结合到本文中。
背景
从混合群体中选择特定细胞的现有方法需要大的样品体积和许多细胞。技术例如MACS(磁性活化的细胞分选)和FACS (荧光活化的细胞分选)用于捕获特定细胞用于转移至后续测定。与分选样品操作相关的细胞损失仍然高,并且稀有的细胞和/或来自非常小的样品体积的细胞丢失。
其它技术例如在数字微流体装置中单细胞分析使得能够直接注射单细胞悬液、条形编码和高度平行地分析单细胞。然而,这些装置不以“原始”样品起作用,并且为了起作用细胞必须纯化和稀释在新鲜缓冲液中。这些样品制备步骤导致丢失稀有的细胞/样品,和否定直接注射入微流体装置的效率。因此,尽管分析工具与大规模平行和多参数分析技术保持同步,但样品制备技术尚未与其保持同步。
收集特定的细胞类型也是治疗应用例如细胞治疗或组织工程所高度需求的。具体的治疗应用的实例包括但不限于自体或同种异体移植干细胞、移植成熟的功能细胞、修饰的人细胞或异种移植非人细胞。一系列细胞类型需要在修饰、活化和扩增前的分离为高质量的,无残余杂质或防腐剂且适合于这些应用。
概述
描述了用细胞捕获元件和生物分子捕获元件二者标记的多功能珠,其允许将细胞直接注射入数字微流体测定中,与生物测定所需的至少一种试剂共定位。这解决了现有的高度平行/多参数微流体分析装置与注射稀有的/小体积的原始生物样品所需要的样品制备之间的失配。
在一个实施方案中,提供对从生物样品捕获的靶细胞进行测定的方法,其包括使包含生物样品的溶液接触多功能珠。所述多功能珠包含尺寸0.1-100 µm的微球体、细胞捕获元件(在微球体的表面上,能够结合靶细胞表面上的蛋白质或细胞特异性标志)和生物分子捕获元件(在微球体的表面上,能够结合靶细胞中包含的或由靶细胞产生的生物分子组分)。所述方法涉及将多功能珠与包含靶细胞的生物样品孵育并通过表面捕获元件将多功能珠结合至靶细胞以产生珠-结合的靶细胞。靶细胞中包含的或由靶细胞产生的生物分子通过生物分子捕获元件捕获,所述靶细胞可通过分析捕获的生物分子测定。
在一个实施方案中,公开了使用结合靶细胞的珠的方法。所述方法涉及将包含珠-结合的靶细胞的溶液流动通过微流体装置,所述微流体装置具有微流体隔室,和将溶液的珠-结合靶细胞划分到至少一个微流体隔室中。所述方法进一步包括使生物分子捕获元件接触珠-结合的靶细胞,和通过生物分子捕获元件捕获靶细胞中包含的或由靶细胞产生的生物分子。
还公开一种多功能珠,其包含尺寸0.1-100 µm的微球体、细胞捕获元件(在微球体的表面上,能够结合靶细胞表面上的蛋白质或细胞特异性标志)和生物分子捕获元件(在微球体的表面上,能够结合靶细胞中包含的或由靶细胞产生的生物分子组分)。
附图简述
本发明的这些和其它特征、方面和优点将会在参考附图阅读下列详述时变得更好地被理解,在附图中相似的符号代表图相似的部件。
图1为多功能珠/颗粒的实例。
图2a描绘使进入微室中的大体积样品微流体数字化的说明性实例。
图2b描绘使微液滴中的大体积样品微流体数字化的说明性实例。
图3a和3b为进入微流体数字***中的泊松(Poisson)装载限制的图示;3A使用微室,3B使用微流体液滴。
图4为使用具有多功能珠的数字微流体平台用于确定性的单细胞装载和测定的方法的流程图,显示过程步骤A-D。
图5a为使用数字微流体平台和多功能珠的方法的说明性实例;所示出的为用于从主体样品分离细胞和将其各个捕捉到磁性柱上的磁性棘轮(magnetic ratchet)的实例。
图5b为使用图5a和5b的装置的方法的说明性实例;通过将微室阵列放置在装置顶部上方或使用磁性棘轮使细胞向分离室移动,分离细胞到合适的位置。
图6a显示缀合至pMHC II四聚体(MHC = 主要组织相容性复合体)的珠上的细胞因子结合功能的代表性数据。
图6b为显示细胞因子捕获元件在结合重组细胞因子(IFN)中的功能的说明。
图6c为细胞因子结合检验的结果的图示,最低测量值为133 pg/珠。
图7a-7c为显示各个多功能珠用于稀有细胞捕获和分析的功能的直方图;图7a为APC,图7b为PE,图7c为FITC。
图8a和8b为来自微孔中捕获的T细胞的细胞因子分泌和捕获的图示;图8a为平均荧光强度的图示,图8b为平均荧光强度的直方图。
发明详述
从生物样品提取靶细胞依然是现代诊断学、细胞生物学研究和细胞治疗的关键需求之一。新技术例如Drop-Seq开创了用于平行分析许多单细胞(转录组)的方法。然而,这些技术仍需要相对大的起始体积和细胞数目(推荐为100个细胞/μL)。正因如此在所收集的生物样品包含稀有的和有限的细胞数目的临床试验中设计作用机制研究仍存在主要约束。
此外,有限量的组织、细胞和流体在许多临床研究中均常见,包括从儿科或免疫功能低下的患者收集的样品。需要新的、多参数的、样品节约的(sample sparing)测定以从有限量的生物材料(也可称为生物样品)获得最多的信息。如本文所使用的生物样品可包括,但不限于来自血液或组织样品例如活组织检查的细胞悬液。这些样品可从抽血、针吸、活组织检查取样或任何身体部位组织样本收集。
为了响应对改善的用于靶细胞捕获的方法的需求,在某些实施方案中,提供多功能珠或颗粒,其包含细胞捕获元件,例如细胞表面蛋白特异性的抗体或四聚体,和细胞测定元件,例如抗体、核酸或分子以捕获生物分子测定的特定靶。所述多功能珠能够首先捕获细胞并随后经历生物测定中的至少第一个生物分子反应/步骤。在某些实施方案中,反应在微流体装置或微小规模的液体隔室内发生。该过程可用于确保每一捕获的细胞与起始生物分子反应所需的试剂共定位。该独特的多功能珠能够用于驱动确定性装载、装载特定细胞到微室,和为捕获后处理提供至隔室化细胞的通路。
在某些实施方案中,描述了直接从小体积生物样品特异性捕获靶细胞的工具和方法并用以从那些细胞进行功能和基因组测定二者。这使用多功能珠完成,其允许单细胞捕获元件和分子测定组分二者共定位。与数字微流体平台组合,这使得能够将特定单细胞编码和/或条形编码。在某些实施方案中,测定也可包括定量生物样品中特定的细胞类型以致特定细胞的数目可计数或估计。除了免疫表型分型之外,所述方法也可用于基因组和转录组以及抗体发现、HLA (人白细胞抗原)分型、单体型分型和药物发现。
在某些实施方案中,捕获的靶细胞可在细胞培养中扩增以应用于多能干细胞建库(例如用于诱导的多能干细胞)、细胞的商业化生产(例如,GE的CytivaTM心肌细胞),和用于治疗应用例如细胞治疗或组织工程或用于临床试验的细胞扩增。例如,在过继性T细胞治疗中进行肿瘤特异性T细胞的分离和离体扩增以获得比仅通过疫苗接种可获得的更大数目的T细胞,允许免疫***经由可攻击和杀死癌症的T细胞击溃剩余的肿瘤。对于某些细胞治疗应用,靶细胞使用包括使用白细胞介素而免疫调节细胞(即基于T细胞的治疗)或使用重组DNA技术遗传修饰(例如过继性治疗中所使用的细胞)的方法扩增,其后将活化或修饰的细胞以大数目静脉返回至患者。
使用多功能珠的方法的一个非限制性实例在图1中提供。在所示的实例中,珠缀合pMHC II四聚体(具有特异性的抗原肽序列)和链霉亲和素结合位点二者。单独结合的pMHCII四聚体能够结合抗原特异性T细胞,而链霉亲和素是生物分子测定中的常见试剂,用于结合生物素标记的测定试剂。正因如此,珠缀合两个结合位点,致使该珠多功能。所述珠能够通过一个位点捕获细胞,和能够在另一个位点用生物分子测定试剂引发。这为特定细胞和试剂的共定位有效提供微流体隔室。在某些实施方案中,特定细胞可考虑为稀有的细胞,即以有限的量或以低浓度在细胞群体中存在的细胞。在某些实施方案中,靶细胞群体为样品中总细胞群体的约10%或更少。在其它实施方案中该靶细胞群体为样品中总细胞群体的约5%或更少、约1%或更少、或约0.5%或更少。
在该过程的进一步步骤中可使用能够结合至珠上的位点的生物分子测定试剂。如图1中所示,这种试剂的一个实例为生物素基化的抗体,其可捕获靶向分子。在该实例中捕获或靶向的分子为免疫细胞所分泌的细胞因子蛋白。此处该分子为细胞表面上的特异性标志,功能上为抗原,能够与生物分子测定试剂(其为抗体)复合。
如图1中所示,生物素基化的抗体首先结合多功能珠上的链霉亲和素;为细胞因子捕获提供位点。
因此,用细胞捕获MHC四聚体和细胞因子抗体功能化的双重标记的珠现在为多功能的;使得能够细胞捕获和用生物分子测定试剂引发。珠可充当微流体隔室,作为用于定位特定细胞和试剂的位点。
在某些实施方案中,珠可用于捕获多种分子。捕获的分子的实例包括,但不限于,分泌的细胞因子、蛋白或裂解后的胞内核酸和蛋白。生物分子测定试剂或分子结合元件的其它实例包括,但不限于人工合成的生物活性聚合物、肽四聚体、抗体、核酸和寡核苷酸、用于光学分析的荧光缀合物或用于质谱分析的金属缀合物,或其组合。
在某些其它实施方案中,细胞捕获和用生物分子测定试剂引发提供将特定细胞和试剂共定位到微流体隔室的方法。在某些实施方案中,微流体数字化可通过允许在隔室化之后用细胞特异性测定组分引发珠结合位点而使用,且没有来自其它细胞的分子组分的污染。
对该类型方法的需求在图2a和2b中说明,其显示使用单功能珠使用单细胞测定的限制;图2a使用微室装置,而图2b为代表微液滴。简言之,用分子捕获珠数字化或隔室化细胞允许捕获细胞特异性产物/组分而没有来自邻近细胞的污染。该图显示在非数字化样品中分子捕获珠将会如何受到来自许多不同细胞的蛋白或核酸的污染。用一个细胞隔室化的捕获珠仅捕获来自该细胞的分子。
因此,比较单功能方法与图1的方法;包含许多细胞的大的培养室将产生细胞因子,细胞因子捕获珠将捕获由所有细胞分泌的蛋白。然而,如果细胞用细胞因子捕获珠隔室化,那么仅来自该特定细胞的细胞因子将结合。相似地,如图2b中所示,如果细胞在大测定体积中裂解,RNA捕获珠将捕获来自所有邻近细胞的转录物。然而,如果细胞在裂解之前被隔室化,那么捕获珠仅结合来自微液滴的转录物。
现有方法的限制进一步在图3a和3b中说明,其中在使用现有的微流体数字或单细胞测定(使用单功能珠)时存在挑战。图3a显示基于液滴的测定的实例,图3b显示微孔平台的实例。隔室化或数字化期间,细胞和珠二者均随机装载,并且装载受泊松统计支配;基于细胞/珠稀释度的泊松分布提供框架,以预测具有细胞、珠的微流体隔室或被细胞和珠二者共占据的微流体隔室的数目;例如Drop-seq测定(McCarroll Lab, Boston MA)。
更具体地,如图3a和3b中所示,尽管应用微流体数字化,但微流体平台仍受非确定性的室装载限制。图3A显示在基于液滴的平台中,细胞和珠按照泊松统计和样品的稀释状态进入液滴产生器。这导致1) 空,2) 仅包含捕获珠,3) 仅包含细胞,4) 包含期需的一个细胞和一个珠,或5) 包含多个细胞/珠混合物的液滴的统计分布(泊松)。图3a显示装载微室时的这种效果,而图3b显示装载液滴时的这种效果。如所显示的,装载的“泊松”分布在整个微流体数字化平台,包括简单的微孔,是成立的,其中细胞和珠沉积或牵引到孔阵列中,然后微孔密封和数字化。
如图4中所示,在某些实施方案中,多功能珠可用于去除数字化微流体平台的现有限制。在某些实施方案中,这包括在数字化之前在主体溶液中使用捕获珠用于细胞捕获,然后在每一孔中确定性装载,例如细胞。在其它实施方案中,一旦捕捉在微流体隔室中其可用于清洗和纯化细胞。在又一个实施方案中,所述多功能珠可允许向微流体隔室中引入新的试剂,例如在我们的实施例中细胞因子抗体,和/或隔室化和开始单细胞或数字测定,例如在一个实施例中细胞因子捕获,包括与细胞表面或胞内分子相互作用的蛋白和核酸。在这种情况下,多功能珠可用于在多重洗涤和结合步骤期间保持细胞,其中许多细胞标记按顺序加入室中。
因此,如图4中所示,在单细胞微流体平台内隔室化和数字装载期间使用多功能珠可大大扩展其能力。首先,珠可在隔室化前引入主体样品中用于细胞捕获。这是可能的,因为第二个功能元件(function),在我们的实施例的情况下生物素基化的抗体,尚未加至珠。不像图2a和2b中所示的单功能化的珠,污染将不会发生。珠本身现在可有效用于单细胞隔室。珠可为磁性的,或具有其它赋能(enabling)特征,使得能够用于装载微流体孔/隔室。合适的磁性珠的非限制性实例包括市售可得的Dynabeads® (Thermo Fisher)和SeraMag®(GE Healthcare Life Sciences)。
因此,如图4中进一步说明的,在某些实施方案中,所述方法包括从主体样品捕获细胞和装载入数字装置(步骤A)。如该实例中所说明的,所述方法可用在单细胞细胞因子分泌测定中。
在某些实施方案中,珠可为用多功能试剂包被的塑料微球体,并且可包括聚苯乙烯、胶乳珠、球体或微球体。在某些优选的实施方案中,珠可为磁性珠,其可用于将细胞牵引到装置的不同隔室或微孔。这可进一步用于在纯化步骤期间将捕捉的细胞维持在孔内;例如在覆盖孔和数字化之前洗除污染物。将珠维持在孔中的能力现在可允许引入额外的试剂和缓冲液;例如在所示的实施例中。
在其它实施方案中,珠可为塑料微球体或具有颗粒型形状的任何固体支持表面。在某些实施方案中,微球体可为尺寸0.1 - 100 µm的颗粒。该尺寸因此提供大的表面-体积比率。其可用各种材料制造,只要表面可经功能化。珠材料可包括,但不限于陶瓷、玻璃、聚合物、金属或其组合。在某些实施方案中,聚合物可为聚乙烯、聚苯乙烯。在其它实施方案中,金属可具有磁性性质。
在某些其它实施方案中,在微孔的情况下数字化可通过关闭微流体隔室完成,并且单细胞/数字测定可开始。例如,捕获分泌的细胞因子或细胞裂解和捕获内部核酸或蛋白质。关闭微流体隔室可通过形成液滴完成,如基于液滴的实例中所显示的,或通过用油层覆盖隔室和在水性室中分离单细胞,如在微孔实例中。
如所显示的,图5a和5b为数字微流体平台和多功能珠的说明性实例以及装置在所述方法中的使用。如在图5a中说明的,磁性棘轮用于从主体样品分离细胞并将其各个捕捉到磁性柱上。使用旋转磁场驱使细胞穿过磁性柱,称为磁性棘轮效应(magneticratcheting),允许移动细胞连同多功能珠穿过微柱阵列。
图5b,显示过程步骤,借此细胞分离到合适位置,例如通过将微室阵列放置在装置顶部上方,或通过使用磁性棘轮移动细胞以将细胞带至分离室。例如,在一个实施方案中流体/细胞分离可通过运送油相穿过分离室阵列完成。
因此,在一个示例性的实施方案中特异性的多功能珠可用于数据收集,用细胞捕获元件(cD1d四聚体)和细胞因子捕获元件(IFN-γ抗体;IFN=干扰素)标记。多功能珠也可同时缀合抗PE (PE=藻红蛋白)抗体(使得能够结合cD1四聚体PE细胞捕获元件)和抗-igG抗体。抗-igG抗体使得能够结合用于细胞因子捕获的抗体。这产生能够捕获NKT细胞并同时检测IFN-γ的多功能珠。
在本发明的某些实施方案中,具有不同功能性/效用的多功能珠可用于收集单细胞数据。例如,包含基于四聚体的细胞捕获元件和用于捕获分泌蛋白的细胞因子抗体的多功能珠集。在备选的实施例中包含基于抗体的细胞捕获元件和细胞因子抗体的多功能珠集可用于捕获分泌的细胞因子。在该实施方案中,珠缀合细胞捕获元件,但细胞因子捕获抗体(第二个功能元件)通过粘附到细胞表面引入。在另一个实施方案中,可使用包含基于抗体的细胞捕获元件和核酸或寡核苷酸分子捕获元件的多功能珠集。
更具体地,珠可为特异性四聚体,用作对珠的捕获元件。例如,在一个实施方案中,NKT细胞所特异性的生物素基化的CD1D四聚体(Proimmune Ltd., Oxford, UK)使用制造商的说明书缀合到链霉亲和素缀合的Dynabeads® (ThermoFisher Scientific, PittsburgPA)。结合反应在等摩尔比率的生物素基化的细胞因子特异性抗体(IFNγ)存在下进行。
在备选的实施方案中,不像上述四聚体,细胞捕获元件可为细胞表面蛋白标志的抗体。第二个分子结合元件可通过结合至珠-细胞复合体的不同部分用细胞捕获;例如,如所说明的细胞表面。
在另一个实施方案中,分子捕获元件可为核酸或寡核苷酸。一旦捕获在微流体或数字隔室中,细胞可裂解,释放其核酸组分用于捕获在多功能珠上。这然后可用在下游核酸扩增反应和分析中。
图6a-c为代表性数据,显示缀合pMHC II四聚体细胞捕获元件和细胞因子结合抗体的珠上的细胞因子结合功能;上述多功能珠的一个实例。
如图6a中所显示的,为了检验多功能珠的效用,将珠然后用重组IFNγ和抗IFNγ的第二抗体(用APC标记)孵育。珠使用Typhoon扫描仪伴随和不伴随CD1d四聚体以及伴随和不伴随IFNγ和IFNγ抗体成像。反应孔的图像显示细胞因子捕获抗体伴随或不伴随额外的CD1d四聚体功能起作用。结果显示在用抗体单一标记或用抗体和四聚体二者标记的孔中相等的荧光水平。发现抗体捕获在多功能珠上仍然特异,四聚体标记的珠上无额外的非特异性结合。
图6b显示细胞因子捕获元件在结合重组细胞因子(IFN)中的另一一功能。图象顶行为校准标准,其中将系列稀释的重组细胞因子和细胞因子的荧光标记第二抗体加至等体积的多功能珠。图象显示随着细胞因子浓度增加,来自珠群体的荧光信号增加。这些结果使用Typhoon荧光扫描仪使用为IFN-APC缀合的第二抗体选择的激光和荧光滤波器获取。图6的底行为实验数据,其中将不同检验浓度的细胞因子应用到多功能珠,并与以上产生的校准数据比较。图6c图示细胞因子结合检验的结果,最低的可测量值在每珠133 皮克(pg)细胞因子加入反应时产生。该细胞因子结合水平(用皮克表示)与单细胞分泌的量一致。
FACS或荧光表征个体多功能珠也是可能的,与以上使用Typhoon荧光扫描仪显示的主体表征相反。这在图7A-7C中显示,其分别为BD流式细胞仪在APC (别藻蓝蛋白)、PE(藻红蛋白)和FITC (异硫氰酸荧光素)信道的珠荧光强度的直方图(y轴为计数/珠的数量,x轴为对数荧光强度)。在图7A-C的每一中,顶部的直方图代表对照珠,显示缀合和孵育之前的背景荧光强度;在中间和底部直方图中条形棒显示对于背景扣除所使用的截断水平。中间的直方图来自缀合IFN-γ抗体并用IFN和APC标记的第二(2º)抗体孵育的多功能珠。该图显示在PE信道(显示成功的四聚体缀合)和APC信道(显示成功的细胞因子捕获)来自珠的清楚信号。底部的直方图显示相同的多功能珠,但在用细胞因子孵育后用FITC第二抗体标记,显示进行多重测定的能力。
图8A和8B描绘细胞捕获后在微孔内使用珠用于细胞因子结合的数据。重组细胞因子首先用于构建标准曲线,显示通过珠可检测的极限浓度(A),然后标准曲线用于估计在微孔中孵育6 h后细胞因子分泌的量。实验对于三种不同的细胞因子(IFN-γ、TNF-α和IL2)进行。
更具体地,图8A为来自用CD3/CD28珠预活化的,用细胞因子结合/多功能珠捕获在微孔内,并用不同水平的重组细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL10)孵育的T细胞的数据。捕获的细胞因子结合珠的检测极限通过测定产生细胞因子介导的荧光强度超过无细胞因子/空白对照孔三个标准差的最低浓度估计。图象使用标准荧光显微镜和对于每一细胞因子特异性的第二抗体上的FITC、PE和APC标记适当的滤波器组获取。单细胞/珠使用标准ImageJ颗粒计数脚本经数字化选择,捕获每一珠的平均强度用于分析。
图8B显示使用用CD3/CD28珠预活化并用珠捕获在微孔内部的T细胞的进一步的数据。然后孵育细胞并允许分泌细胞因子。数据显示6小时孵育后对于用细胞因子结合珠捕获的活化T细胞的细胞因子分泌的变化,珠能够结合分泌的细胞因子,如果在第二抗体存在下孵育,珠周围的荧光(由于细胞因子结合)变得可与背景荧光区分。孵育后珠的荧光强度提示6小时的时期内每个细胞分泌100-200皮克细胞因子。
实验
各种方法可用于制备用于细胞捕获和细胞因子分析的多功能珠。在某些实施方案中,可使用下列方法。
用抗体装饰的用于特异性细胞捕获(正选择)和结合捕获的细胞所分泌的细胞因子的磁性珠以下列方式制备:将1 µm直径(Dynabeads® MyOne Tosylactivated, 65501,ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)、2.7 µm直径(Dynabeads M-270 Epoxy)或4.5µm直径(Dynabeads M-450 Epoxy)的活化珠首先在纯水中以浓度约4 x 108珠/mL稀释,剧烈混合(脉冲涡旋),并通过放置在永磁体(例如DynaMag-2磁体,ThermoFisher, 12321D)上迅速沉降大约1 min。移除上清液后,将第二抗体混合物加入沉淀的珠。该混合物由100 mM硼酸钠,pH 8.5中50 µg小鼠IgG1抗-PE抗体(BioLegend, San Diego, CA 408102)连同50µg未标记的山羊抗兔IgG (Jackson Immuno Research, West Grove, PA111-005-144)组成。每总计约2 x 108珠加入总溶液体积500 µL。完全混合后,将样品避光并进一步在室温在500 rpm搅拌下孵育16-24小时。
第二抗体与活化的珠表面过夜结合之后,将样品放置在永磁体上1 min。其后如前所述移除上清液。然后将珠重悬在由0.1%人血清(HS)/PBS组成的洗涤/封闭缓冲液中并在室温孵育5 min。磁性捕获后再次将缓冲液移除,接着是额外的两轮用0.1% HS/PBS洗涤。洗涤和封闭的珠接着用第一捕获抗体孵育。向100 µL珠浆体中加入10 µL各至少1 µM PE-标记的细胞捕获抗体,例如抗-CD154 (5C8克隆, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,Germany 130-098-289)连同至少1 µM细胞因子捕获抗体,例如抗-IFN-γ (abcam,Cambridge, MA, ab25101)。然后将样品彻底混合,随后以在黑暗中以500 rpm搅拌室温孵育1 h。
移除未结合的第一抗体混合物之后,如前所述进行珠洗涤(3x 0.1% HS/PBS),然后最终重悬在0.1% HS/PBS中用于在4℃中期储存或立即应用于细胞捕获实验。抗体固定于珠表面的确认通过应用荧光团标记的第二抗体和经由标准流式细胞术方案或荧光成像(GEHealthcare Live Sciences, Marlborough, MA, Typhoon ®FLA激光扫描仪)分析而实现。
尽管仅本发明的某些特征在本文说明和描述,但对于本领域技术人员而言存在许多修饰和变化。因此,应理解所附权利要求书意在涵盖落入本发明的范围和精神内的所有这些修饰和变化。

Claims (31)

1.对从生物样品捕获的靶细胞进行测定的方法,包括:
使包含生物样品的溶液接触多功能珠,所述多功能珠包含:
尺寸0.1-100 µm的微球体;
细胞捕获元件,其在微球体的表面上,能够结合所述靶细胞表面上的蛋白质或细胞特异性标志;和
生物分子捕获元件,其在微球体的表面上,能够结合靶细胞中包含的或由靶细胞产生的生物分子组分;
将多功能珠与包含靶细胞的生物样品孵育并通过表面捕获元件将多功能珠结合至靶细胞以产生珠-结合的靶细胞;
通过生物分子捕获元件捕获靶细胞中包含的或由靶细胞产生的生物分子;和
通过分析生物分子捕获元件捕获的生物分子测定靶细胞。
2.权利要求1的方法,其中靶细胞为稀有的细胞。
3.权利要求1或权利要求2的方法,其中所述细胞捕获元件为能够结合抗原特异性T细胞的MHC四聚体。
4.权利要求1或权利要求2的方法,其中所述捕获元件为能够结合靶细胞上的细胞表面标志的抗体。
5.权利要求1或权利要求2的方法,其中所述生物分子捕获元件为抗体、核酸、寡核苷酸、人工合成的生物活性聚合物、荧光缀合物、金属缀合物或其组合。
6.权利要求5的方法,其中所述生物分子捕获元件为抗体。
7.权利要求1或权利要求2的方法,其中分析生物分子包括核酸测序、细胞因子分泌分析、定量基因表达、定量生物样品中靶细胞的量、定量生物样品中靶细胞的功能活性或其组合。
8.权利要求1或权利要求2的方法,其中分析生物分子包括将选择的靶细胞编码和/或条形编码。
9.权利要求1或权利要求2的方法,进一步包括在捕获生物分子之前将珠-结合的细胞转化为液滴的步骤。
10.从生物样品捕获靶细胞的方法,包括:
使包含生物样品的溶液接触多功能珠,所述多功能珠包含:
尺寸0.1-100 µm的微球体;
细胞捕获元件,其在微球体的表面上,能够结合所述靶细胞表面上的蛋白质或细胞特异性标志;和
生物分子捕获元件,其在微球体的表面上,能够结合所述靶细胞中包含的或由所述靶细胞产生的生物分子组分;
通过表面捕获元件将多功能珠结合至靶细胞以产生珠-结合的靶细胞;
将包含珠-结合的靶细胞的溶液流动通过微流体装置,所述微流体装置具有微流体隔室;
将溶液的珠-结合靶细胞划分到至少一个微流体隔室中;
使生物分子捕获元件接触珠-结合的靶细胞;和
通过生物分子捕获元件捕获靶细胞中包含的或由靶细胞产生的生物分子。
11.权利要求10的方法,其中所述靶细胞为稀有的细胞。
12.权利要求10或权利要求11的方法,其中所述细胞捕获元件为能够结合抗原特异性T细胞的MHC四聚体。
13.权利要求10或权利要求11的方法,其中所述捕获元件为能够结合靶细胞上的细胞表面标志的抗体。
14.权利要求10或权利要求11的方法,其中所述生物分子捕获元件为抗体、核酸、寡核苷酸、荧光缀合物、金属缀合物、人工合成的生物活性聚合物或其组合。
15.权利要求14的方法,其中所述生物分子捕获元件为抗体。
16.权利要求10或权利要求11的方法,进一步包括通过分析生物分子捕获元件捕获的生物分子测定靶细胞的步骤。
17.权利要求16的方法,其中分析生物分子包括核酸测序、细胞因子分泌分析、定量基因表达、定量生物样品中靶细胞的量、定量样品中靶细胞的功能活性或其组合。
18.权利要求16的方法,其中分析生物分子包括将选择的靶细胞编码和/或条形编码。
19.权利要求10或权利要求11的方法,其中所述多功能珠为磁性的并且划分珠-结合的靶细胞包括将珠-结合的靶细胞磁性捕捉到微流体隔室的磁化柱上。
20.权利要求10或权利要求11的方法,其中将多功能珠放置在数字微流体装置中,然后接触生物溶液。
21.权利要求20的方法,其中一个或多个微流体隔室包含生物分子捕获元件。
22.权利要求21的方法,其中不同的生物分子捕获元件包含在不同的微流体隔室中。
23.用于捕获靶细胞的多功能珠,所述多功能珠包含:
尺寸0.1-100 µm的微球体;
细胞捕获元件,其在微球体的表面上,能够结合靶细胞表面上的蛋白质或细胞特异性标志;和
生物分子捕获元件,其在微球体的表面上,能够结合靶细胞中包含的或由靶细胞产生的生物分子组分。
24.权利要求23的多功能珠,其中所述靶细胞为稀有的细胞。
25.权利要求23或权利要求24的多功能珠,其中所述微球体为陶瓷、玻璃、聚合物、金属或其组合。
26.权利要求25的多功能珠,其中所述微球体为聚乙烯、聚苯乙烯或其组合。
27.权利要求23或权利要求24的多功能珠,其中所述微球体为磁性的。
28.权利要求23或权利要求24的多功能珠,其中所述细胞捕获元件为能够结合抗原特异性T细胞的MHC四聚体。
29.权利要求23或权利要求24的多功能珠,其中所述捕获元件为能够结合靶细胞上的细胞表面标志的抗体。
30.权利要求23或权利要求24的多功能珠,其中所述生物分子捕获元件为抗体、核酸、寡核苷酸、荧光缀合物、金属缀合物、人工合成的生物活性聚合物或其组合。
31.权利要求23或权利要求24的多功能珠,其中珠为磁性微球体,细胞捕获元件为MHC四聚体,并且捕获元件为抗体。
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