CN101631858A - 用于预防和治疗脑膜炎球菌疾病的新颖免疫原性组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及奈瑟菌(Neisseria)ORF2086蛋白，其为可自奈瑟菌菌株分离或重组制备的交叉反应性免疫原性蛋白质，包括其免疫原性部分、其生物相等物、与上述物质免疫特异性结合的抗体和编码上述每一者的核酸序列；以及所述蛋白质在免疫原性组合物中有效抵抗脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)血清群B感染的用途。

Description

用于预防和治疗脑膜炎球菌疾病的新颖免疫原性组合物

技术领域

本发明涉及奈瑟菌ORF2086蛋白(亚族A和亚族B)，其可自诸如奈瑟菌种(Neisseriaspecies)的细菌菌株分离，包括脑膜炎奈瑟菌(血清群A、B、C、D、W-135、X、Y、Z和29E)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)和乳糖奈瑟菌(Neisseria lactamica)的菌株，以及所述蛋白质的免疫原性部分和/或生物相等物。本发明还涉及与所述蛋白质、免疫原性部分和/或生物相等物免疫特异性结合的抗体。此外，本发明涉及经分离聚核苷酸，其包含编码上述蛋白质、免疫原性部分、生物相等物和/或抗体中任一者的核酸序列。另外，本发明涉及免疫原性组合物和其在预防、治疗和/或诊断由脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)引起的脑膜炎球菌感染和尤其由脑膜炎奈瑟菌血清群B引起的脑膜炎球菌疾病中的用途，以及用于制备所述组合物的方法。本发明涉及重组形式和自天然来源分离的形式两者，以及脂质化和非脂质化形式两者。

背景技术

脑膜炎球菌性脑膜炎是一种尽管可利用抗生素但仍可在数小时内致儿童和年轻成人死亡的致命性疾病。比萨(Pizza)等人，2000，科学(Science)287：1816-1820。脑膜炎的特征为脑膜发炎，从而产生剧烈头痛、发热、食欲不振、光声不耐受、肌肉僵硬，尤其在颈部，且在严重情况下出现痉挛、呕吐和谵妄，导致死亡。脑膜炎球菌性脑膜炎的症状突然出现且在脑膜炎球菌性败血症伴随其特征性出血性皮疹时达到顶点。如果存在任何存活机会，那么快速诊断和立即用大剂量抗生素治疗至关重要。2000.贝藤医学词典(Bantam Medical Dictionary)，第三版302。

脑膜炎球菌性脑膜炎由脑膜炎奈瑟菌(脑膜炎球菌)，一种革兰氏阴性(Gram-negative)有荚膜细菌引起，已将其分为若干病原性血清群，包括A、B、C、D、W-135、X、Y、Z和29E。在全世界，脑膜炎奈瑟菌的血清群B菌株为脑膜炎球菌疾病的主要病因。举例来说，据医学文献报导，血清群B造成居住于美国和欧洲的婴儿和儿童中约50％的细菌性脑膜炎。目前不存在预防由脑膜炎奈瑟菌血清群B引起的脑膜炎球菌疾病的疫苗。

自三十多年前古得施奈德(Goldschneider)等人的工作以来，开发用于预防血清群B脑膜炎球菌疾病的免疫原性组合物已对研究人员提出挑战。古得施奈德(Goldschneider)等人，1969，实验医学杂志(J.Exp.Med)129(6)：1307-26；古得施奈德(Goldschneider)等人，1969，实验医学杂志(J.Exp.Med)129(6)：1327-48；古茨克里奇(Gotschlich)等人，1969，实验医学杂志(J.Exp.Med.)129(6)：1385-95；和古茨克里奇(Gotschlich)等人，1969，实验医学杂志(J.Exp.Med.)129(6)：1367-84。不同于在二次大战后在北美实际上已消失的血清群A疾病，由血清群B和C生物体引起的疾病仍在大部分经济发达地区地方性流行，阿克特曼M.(Achtman M.)，1995，微生物学前沿(Trends inMicrobiology)3(5)：186-92。疾病的发病率在小于1/100,000(在此情况下少见地方性流行病)至200/100,000(在疾病流行期间人群处于高风险)范围内变化。

已开发出对抗脑膜炎奈瑟菌血清群A和C的基于多糖结合物的疫苗且似乎在预防疾病方面有效。目前，可利用由来自血清群A、C、Y和W-135的荚膜多糖制成的免疫原性组合物。恩布罗奇(Ambrosch)等人，1983，新四价的免疫原性和副作用(Immunogenicityand side-effects of a new tetravalent)。世界卫生组织公报(Bulletin of the World HealthOrganization)61(2)：317-23。然而，此免疫原性组合物引起T细胞非依赖性免疫反应，在幼儿中并不有效，且不覆盖引起超过50％脑膜炎球菌疾病的血清群B菌株。

其它人也已试图使用荚膜多糖开发免疫原性组合物。最近，通过将血清群C荚膜物质与蛋白质结合所制备的用于血清群C疾病的免疫原性组合物已在欧洲许可使用。然而，血清群B荚膜可能不适合作为疫苗候选物，因为荚膜多糖包含与使人类神经组织发育的碳水化合物部分具有相似性的聚唾液酸。这一糖部分被视为自体抗原且因此在人体内具有弱免疫原性。

外膜蛋白(OMP)已开发作为用于血清群B疾病的替代疫苗抗原。与PorA的两个可变区结合的单克隆抗体定义用于脑膜炎球菌的血清亚型分类方案。PorA蛋白因此用作脑膜炎球菌菌株的血清亚型分类抗原(阿卜杜拉希(Abdillahi)等人，1988，微生物发病机理(Microbial Pathogenesis)4(1)：27-32)且正在积极地作为血清群B免疫原性组合物的组份加以研究(波尔曼(Poolman)，1996，先进实验医学生物学(Adv.Exp.Med.Biol.)397：73-7)，因为其可引起杀菌性抗体产生(索克昂恩(Saukkonen)，1987，微生物发病机理(Microbial Pathogenesis)3(4)：261-7)。认为杀菌性抗体为保护的指示物且任何新免疫原性组合物候选物应引起这些功能性抗体产生。

对人类以及动物的研究表明血清亚型分类抗原PorA引起杀菌性抗体产生。然而，对PorA的免疫反应通常具有血清亚型特异性。具体来说，血清亚型分类数据表明由PorA制成的免疫原性组合物可能需要每一血清亚型的PorA由所述免疫原性组合物涵盖，或许多达六至九种。因此，将需要6-9种PorA来涵盖70-80％的血清群B菌株。因此，此蛋白质的可变性质需要多价疫苗组合物来预防足够多的脑膜炎球菌血清亚型临床分离株。

开发用于血清群B脑膜炎球菌的免疫原性组合物如此困难，使得最近若干小组已对来自代表血清群A和B两者的菌株的基因组进行测序以帮助鉴别新免疫原性组合物候选物。泰特林(Tettelin)，2000，科学(Science)，287(5459)：1809-15；比萨(Pizza)等人，2000，科学(Science)287：1816-1820。甚至用奈瑟菌基因组的知识鉴别新免疫原性组合物候选物仍由于目前并不存在足够数学算法而成为挑战性过程。事实上，最新报导表明尽管鉴别数百个含有理论跨膜域的开放阅读框架(“ORF”)，但表达、纯化和诱导表面反应性和功能活性抗体的问题已将研究者导向仅七种候选物用于血清群B脑膜炎球菌免疫原性组合物。参见同前。其中一者为先前所已知。

因此，对具有以下特征的免疫原性组合物仍存在需要：(1)激发针对多个奈瑟菌菌株的杀菌性抗体；(2)与多个菌株的表面反应；(3)赋予对抗活攻毒的被动保护；和/或(4)防止定植。

发明内容

本发明的一实施例提供一种聚核苷酸，其包含：(a)与SEQ ID NO：1-11的奇数序列中任一者具有至少约95％序列一致性的核苷酸序列；或(b)编码包含与SEQ ID NO：2-12的偶数序列中任一者的氨基酸序列具有至少约95％序列一致性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。

本发明的另一实施例提供一种包含本发明聚核苷酸的载体。

本发明的另一实施例提供一种包含本发明载体的重组细胞。

本发明的又一实施例提供一种多肽，其包含：(a)与SEQ ID NO：2-12的偶数序列中任一者具有至少95％序列一致性的氨基酸序列；(b)由与SEQ ID NO：1-11的奇数序列中任一者具有至少95％序列一致性的核苷酸序列编码的氨基酸序列；(c)至少一个(a)或(b)中所述的氨基酸序列的免疫原性部分；或(d)至少一种(a)或(b)中所述的氨基酸序列或(c)中所述的免疫原性部分的生物相等物。

本发明的又一实施例提供一种抗体，其包含以下任一者：(a)与包含偶数SEQ IDNO：1-12中任一者的氨基酸序列的多肽免疫特异性结合的多肽；或(b)至少一个(a)中所述的蛋白质的免疫原性部分；或(c)至少一种(a)中所述的蛋白质或(b)中所述的免疫原性片段的生物相等物。

本发明的又一实施例提供一种组合物，其包含本发明的聚核苷酸、载体、重组细胞、多肽或抗体。

本发明的又一实施例提供一种组合物，其包含：(a)第一聚核苷酸，其包含与SEQ IDNO：1-5的奇数序列中任一者具有至少约95％序列一致性或与编码SEQ ID NO：2-6的偶数序列中任一者的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少约95％序列一致性的核苷酸序列；和(b)第二聚核苷酸，其包含与SEQ ID NO：7-11的奇数序列中任一者具有至少约95％序列一致性或与编码SEQ ID NO：8-12的偶数序列中任一者的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少约95％序列一致性的核苷酸序列。

本发明又一实施例提供一种组合物，其包含：(a)第一多肽，其包含与SEQ ID NO：2-6的偶数序列中任一者具有至少约95％序列一致性的氨基酸序列；和(b)第二多肽，其包含与SEQ ID NO：8-12的偶数序列中任一者具有至少约95％序列一致性的氨基酸序列。

本发明的又一实施例提供一种通过包含以下操作的方法所制备的组合物：自奈瑟菌种分离和纯化或重组制备以下任一者：(a)包含偶数SEQ ID NO：2-12中任一者的氨基酸序列的多肽；(b)由包含奇数SEQ ID NO：1-11中任一者的核酸序列的聚核苷酸编码的多肽；(c)至少一个(a)或(b)中所述的蛋白质的免疫原性部分；或(d)至少一种(a)或(b)中所述的蛋白质或(c)中所述的免疫原性片段的生物相等物。

本发明的又一实施例提供本发明组合物在制备用于诱发哺乳动物免疫反应的药中的用途。

本发明的又一实施例提供本发明组合物在有效抵抗哺乳动物细菌性脑膜炎的药物中的用途。

本发明的又一实施例提供一种制备组合物的方法，其包含在宿主细胞中表达编码本文中所述的任何多肽的核酸序列。

本发明的又一实施例提供一种制备抗体组合物的方法，其包含在将包含本文中所述的蛋白质、免疫原性部分或生物相等物中任一者的组合物引入动物体内后自所述动物回收抗体。

本发明的又一实施例提供一种诱发哺乳动物免疫反应的方法，其包含向所述哺乳动物投与有效量的一种或一种以上本发明的组合物。

本发明的又一实施例提供一种预防或治疗哺乳动物细菌性脑膜炎的方法，其包含向所述哺乳动物投与有效量的一种或一种以上本发明的组合物。

附图说明

图1A描绘SDS-PAGE凝胶，其描绘自用于鉴别能够激发对抗异源菌株的杀菌性抗体的奈瑟菌膜蛋白提取物的实验获得的蛋白质部分的两种主要蛋白质。

图1B描绘来自通过以蛋白酶消化和逆相N末端测序来分析TMAE流过组份而鉴别两种主要蛋白质的实验的结果。

图2描绘rLP2086的纯化流程和如由SDS-PAGE所测定的均质性。

图3描绘来自通过以LC-MS/MS和相应SDS-PAGE来分析TMAE流过组份而鉴别两种主要蛋白质和一种次要蛋白质的实验的结果。

图4为重组表达2086蛋白的SDS-PAGE凝胶。

图5为如本文实例中所述的质粒pPX7340的示意图。

图6为如本文实例中所述的质粒pPX7328的示意图。

图7为如本文实例中所述的质粒pPX7343的示意图。

图8说明来自各种菌株的2086基因的N末端区域。

图9A为展示鉴别奈瑟菌菌株中的免疫原性组份的初始步骤的流程图。

图9B为展示鉴别奈瑟菌菌株中的免疫原性组份的最后步骤的流程图。

图10A为驱动P4信号/ORF2086融合蛋白的表达以表达如本文实例中所述的脂质化形式rP2086的pBAD***糖可诱导启动子的示意图。

图10B为用于重组表达非脂质化形式ORF2086的pET9a-T7载体的示意图。

图11A为表示表达rLP2086蛋白的大肠杆菌B(E.coli B)的全细胞溶菌液的照片。

图11B展示表达rP2086蛋白的大肠杆菌B的全细胞溶菌液。

图12为展示根据本发明的实施例将ORF2086蛋白的亚族和群结构化的***发生树。

图13为rLP2086亚族A抗血清的全细胞ELISA数据的图解说明。

图14为rLP2086亚族B抗血清的全细胞ELISA数据的图解说明。

图15为rLP2086混合研究-WCE效价的结果的图解说明。

图16为rLP2086/rPorA混合研究-WCE效价的结果的图解说明。

图17为展示rLP2086小鼠抗血清对P2086亚族B脑膜炎奈瑟菌全细胞溶菌液的反应性的西方印迹法(Western Blot)。

图18为展示rLP2086小鼠抗血清对P2086亚族A脑膜炎奈瑟菌和乳糖奈瑟菌(N.lactamica)全细胞溶菌液的反应性的西方印迹法。

序列概述

SEQ ID NO：1，当与原生前导序列组合时编码来自CDC1135菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。

SEQ ID NO：2，使用原生前导序列制备的来自CDC1135菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3，当与P4前导序列组合时编码来自CDC1135的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。

SEQ ID NO：4，使用P4前导序列制备的来自CDC1135菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5，编码来自CDC1135菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。

SEQ ID NO：6，来自CDC1135菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7，当与原生前导序列组合时编码来自CDC1127菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。

SEQ ID NO：8，使用原生前导序列制备的来自CDC1127菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9，当与P4前导序列组合时编码来自CDC1127的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。

SEQ ID NO：10，使用P4前导序列制备的来自CDC1127菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11，编码来自CDC1127菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。

SEQ ID NO：12，来自CDC1127菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。

具体实施方式

本发明提供奈瑟菌ORF2086蛋白(“2086蛋白”)，包括2086亚族A蛋白质和2086亚族B蛋白质。2086蛋白中的每一者为可自原生奈瑟菌菌株分离的蛋白质，所述菌株包括脑膜炎奈瑟菌(血清群A、B、C、D、W-135、X、Y、Z和29E)、淋病奈瑟菌和乳糖奈瑟菌的菌株。2086蛋白也可使用重组技术制备。

根据各种实施例，本发明提供2086蛋白、其免疫原性部分和/或其生物相等物、与上述任一者免疫特异性结合的抗体和包含编码上述任一者的核酸序列的聚核苷酸。本发明包括组合物、免疫原性组合物和其于预防、治疗和/或诊断脑膜炎球菌感染和尤其由脑膜炎奈瑟菌引起的脑膜炎球菌疾病中的用途，以及用于制备所述组合物的方法。本文中的2086蛋白包括重组形式和自天然来源分离的形式，以及脂质化和非脂质化形式两者。

本发明意外且有利地提供具有以下功能的组合物：(1)激发针对多种奈瑟菌菌株的杀菌性抗体，诸如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌和/或乳糖奈瑟菌的菌株；(2)与多种菌株的表面反应；(3)赋予针对活功毒的被动保护；和/或(4)防止定植，以及使用所述组合物的方法和制备所述组合物的方法。下文描述本发明的各种实施例。

如本文中所述，通过使细胞分级分离、差示清洁剂提取、蛋白质纯化与抗血清制备和利用多种菌株的杀菌活性检定组合来鉴别自脑膜炎奈瑟菌分离的基于奈瑟菌种ORF2086蛋白(也称为“2086蛋白”或“ORF2086”蛋白质，在本文中可互换使用，或对于非脂质化蛋白称为P2086和对于蛋白质的脂质化型式称为LP2086)的新免疫原性组合物候选物。作为上文引用的参考文献中所揭示的可能免疫原性组合物和诊断法的替代，本发明涉及通过使用蛋白质、其免疫原性部分和其生物相等物来治疗和/或预防脑膜炎球菌感染的组合物和方法，以及编码所述多肽、部分和相等物的基因，和与所述物质免疫特异性结合的抗体。

如本文所使用，术语“非菌株特异性”是指抗原激发有效抵抗脑膜炎奈瑟菌的一种以上菌株(例如异源性脑膜炎球菌菌株)的免疫反应的抗原的特征。如本文中所使用，术语“交叉反应性”可与术语“非菌株特异性”互换使用。如本文所使用，术语“免疫原性非菌株特异性脑膜炎奈瑟菌抗原”描述可自脑膜炎奈瑟菌分离的抗原，尽管其也可自另一细菌(例如其它奈瑟菌菌株，诸如***菌株)分离或使用重组技术制备。

本发明的2086蛋白包括脂质化和非脂质化蛋白质。此外，本发明也涵盖对应于各蛋白质的未成熟蛋白质或前蛋白作为中间化合物/组合物的用途。

本发明也提供根据本发明的实施例与上述免疫原性试剂免疫特异性结合的抗体。此外，本发明涉及包含编码上述任一者的核酸序列的经分离聚核苷酸。另外，本发明提供组合物和/或免疫原性组合物和其于预防、治疗和/或诊断脑膜炎球菌性脑膜炎、尤其血清群B脑膜炎球菌疾病中的用途，以及用于制备所述组合物的方法。

本发明的组合物具有高度免疫原性且能够激发杀菌性抗体的产生。这些抗体对血清群、血清型和血清亚型异源性脑膜炎球菌菌株有交叉反应性。因此，本发明组合物通过展现激发针对异源性奈瑟菌菌株的杀菌性抗体的能力而克服先前脑膜炎奈瑟菌疫苗尝试的缺点。因此，本发明尤其有利地提供可与较少组份混配以激发与先前所用试剂相当的保护的免疫原性组合物。本文中的组合物或免疫原剂(例如(但不限于)多肽、免疫原性部分或片段和生物相等物等)可单独或与其它抗原或试剂组合使用以激发防止脑膜炎球菌感染和疾病的免疫性保护，以及激发防止由其它病原体引起的感染和/或疾病的免疫性保护。此举使用于通过减少对抗多种菌株所需的抗原数目来对抗脑膜炎球菌感染的免疫原性组合物的设计简单化。事实上，经纯化的2086蛋白将显著和出乎意料地减少提供足以造成脑膜炎球菌疾病的菌株的免疫原性覆盖所需的蛋白质数目。2086蛋白可在大肠杆菌(E.coli)中以脂蛋白形式(其为所述蛋白质的野生型形式)以比在原生脑膜炎球菌中高得多的水平重组表达。

以下已公开国际专利申请案是以引用的方式全部并入本文中：PCT/US02/32369(于2003年8月7日以WO 03/063766公开)和PCT/US04/11901(于2004年11月4日以WO 04/094596公开)。

尽管2086蛋白并不大量存在于野生型菌株中，但其为杀菌性抗体的目标。不同于回应PorA所产生的那些抗体，这些抗体能够杀死表达异源性血清亚型的菌株。

针对2086蛋白的抗体也被动保护大鼠幼仔免受脑膜炎球菌攻毒。2086蛋白的重组表达使得能够使用2086蛋白作为预防脑膜炎球菌疾病的免疫原性组合物。在临床试验中所有最新脑膜炎球菌免疫原性组合物候选物为含有许多不同蛋白质的复杂混合物或外膜蛋白制剂。提供血清亚型特异性的PorA蛋白将需要在免疫原性组合物中包含6至9种变异体以提供疾病相关血清亚型的约70-80％覆盖率。相比之下，本文中清楚地证明，在西欧和美国，仅针对单一2086蛋白的抗血清能够杀死造成约65％的疾病分离株的六种血清亚型代表物。因此，经纯化的2086蛋白具有减少提供足以造成脑膜炎球菌疾病的血清亚型的免疫原性组合物覆盖率所需的蛋白质数目的潜力。

蛋白质、免疫原性部分和生物相等物

本发明提供的2086蛋白为经分离的蛋白质或多肽。术语″经分离″意思是自天然状态通过人工改变。如果“经分离”的组合物或物质在自然界中存在，那么其已自其原始环境变化或移除，或两者。举例来说，当所述术语在本文中采用时，天然存在于活动物中的多肽或聚核苷酸并非“经分离”，但自其天然状态的共存物质分离的相同多肽或聚核苷酸是“经分离”的。因此，如本文所使用，术语“经分离蛋白质”包含自天然来源分离的蛋白质和使用重组技术制备的蛋白质，以及与其它抗原和/或诸如医药学上可接受的载剂、缓冲剂、佐剂等的添加剂组合时的所述蛋白质。

根据本发明的一实施例，2086蛋白的特征为免疫原性、非病原性和非菌株特异性。2086蛋白高度可变且因此可经历氨基酸残基的***、取代和/或缺失而不损害蛋白质的免疫原性。2086蛋白可分为两种亚族，亚族A和亚族B。

来自亚族A的2086蛋白包含SEQ ID NO：2-6的偶数序列中任一者的氨基酸序列或由包含SEQ ID NO：1-5的奇数序列中任一者的核苷酸序列的聚核苷酸编码的氨基酸序列。来自亚族B的2086蛋白包含SEQ ID NO：8-12的偶数序列中任一者的氨基酸序列或由包含SEQ ID NO：7-11的奇数序列中任一者的核苷酸序列的聚核苷酸编码的氨基酸序列。

本发明的多肽序列可与参考序列(例如偶数SEQ ID NO：2-12)一致，即100％一致，或与参考序列相比其可包括许多氨基酸改变致使一致性％小于100％。所述改变包括至少一个氨基酸缺失，包括保守和非保守取代的取代，或***。改变可存在于参考多肽序列的胺基或羧基末端位置或那些末端位置之间的任何地方，个别地散布于参考氨基酸序列的氨基酸中或以一个或一个以上连续组散布于参考氨基酸序列中。

因此，本发明也提供具有与序列表中所含的氨基酸序列(即偶数SEQ ID NO：2-12)一致的序列的蛋白质。根据本发明的各种实施例，2086序列具有与SEQ ID NO：2-12的偶数胺基酸序列中的任一者具有高于至少约95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或更高一致性的序列。这些序列包括(但不限于)突变体和等位基因变异体。

在本发明的优选实施例中，2086蛋白或其它2086多肽(例如免疫性部分和生物相等物)产生针对脑膜炎球菌的同源菌株和至少一种异源菌株的杀菌性抗体。具体地说，针对2086多肽的抗体被动地保护大鼠幼仔免受脑膜炎球菌的攻毒，诸如鼻内攻毒。在其它优选实施例中，2086多肽对于大鼠幼仔展现针对同源菌株和至少一种异源菌株的此类保护。所述多肽可选自上述序列概述，如偶数SEQ ID NO：2-12中所阐明，或所述多肽可为所列多肽的任何免疫性片段或生物相等物。优选地，多肽选自上述序列概述中的偶数SEQ ID NO：2-12中的任一者。

本发明也涉及2086多肽的等位基因或其它变异体，其为生物相等物。合适的生物相等物将展现以下能力：(1)激发针对同源菌株和至少一种异源性奈瑟菌菌株和/或***菌株的杀菌性抗体；(2)与同源菌株和至少一种异源性奈瑟菌和/或***菌株的表面反应；(3)赋予针对活攻毒的被动保护；和/或(4)防止定植。

合适的生物相等物与本文中所示的2086多肽(即，偶数SEQ ID NO：2-12)的一者具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相似性，条件是相等物能够激发与本发明的2086蛋白中的一者实质上相同的免疫原性特性。

或者，生物相等物与偶数SEQ ID NO：2-12的2086蛋白中的一者具有实质上相同的免疫原性特性。根据本发明的实施例，生物相等物与偶数SEQ ID NO：2-12具有相同的免疫原性特性。

通过产生本发明的蛋白质的变异体和修饰来获得生物相等物。通过***、缺失或取代一个或一个以上氨基酸来改变氨基酸序列而获得蛋白质的这些变异体和修饰物。例如通过取代来修饰氨基酸序列，以产生具有实质上相同或改良品质的多肽。引入改变的一优选方法包含通过定点突变诱发使多肽的核酸序列产生预定突变。

修饰和变化可在本发明多肽的结构中产生且仍获得具有脑膜炎奈瑟菌免疫原性的分子。举例来说，但不加以限制，在序列中可以某些氨基酸取代其它氨基酸(包括非保守和保守取代)而不明显损失免疫原性。因为是多肽的相互作用能力和性质定义多肽的生物功能活性，所以许多氨基酸序列取代可在多肽序列(或当然其基础DNA编码序列)中进行且仍然获得具有类似特性的多肽。本发明涵盖对本文中多肽的结构以及编码所述多肽的核酸序列的任何变化，其中多肽保留免疫原性。因此，基于本文中提供的指导，所属领域的一般技术人员能够容易地修饰所揭示的多肽和聚核苷酸。

举例来说，已鉴别出可允许取代或缺失的某些可变区。根据本发明的一实施例，如先前论述的2086一致序列展示2086家族蛋白质的保守和非保守区域。

在作出所述变化时，可利用所属领域的技术人员已知的任何技术。举例来说，在不希望施加限制的情况下，可考虑氨基酸的亲水性指数。亲水性氨基酸指数在赋予多肽相互作用生物功能中的重要性在所属领域中通常已知。凯特(Kyte)等人1982.分子生物学杂志(J.Mol.Bio.)157：105-132。

类似氨基酸的取代也可根据亲水性进行，尤其在由其产生的生物功能等效多肽或肽意欲用于免疫学实施例中的情况下。以引用的方式并入本文中的美国专利第4,554,101号陈述，受制于相邻氨基酸的亲水性的多肽的最大局部平均亲水性与其免疫原性有关，即与多肽的生物学特性有关。

多肽的生物相等物也可使用位点特异性突变诱发来制备。位点特异性突变诱发为适用于通过特异性突变诱发基础DNA来制备来源于其序列的第二代多肽或生物功能等效多肽或肽的技术。当氨基酸取代合乎需要时，所述变化可为合乎需要的。所述技术进一步提供通过将一个或一个以上核苷酸序列变化引入DNA中来制备和测试序列变异体(例如并有上述考虑的一种或一种以上)的现成能力。位点特异性突变诱发允许通过使用编码具有所需突变的DNA序列的特定寡核苷酸序列，以及足够多的相邻核苷酸来产生突变体，以提供具有足够尺寸和序列复杂性的引物序列从而在所跨越的缺失接合点两侧形成稳定双链体。通常，约17至25个核苷酸长度的引物优选，其中在所改变序列的接合点的两侧有约5至10个残基。

一般来说，位点特异性突变诱发的技术在所属领域中众所周知。如应了解，所述技术通常采用可以单链和双链形式两者存在的噬体载体。通常，通过首先获得在序列中包括编码所选脑膜炎奈瑟菌多肽序列的全部或一部分的DNA序列的单链载体来执行根据本文的定点突变诱发。制备(例如合成)具有所需突变型序列的寡核苷酸引物。接着将此引物退火为单链载体，且通过使用诸如大肠杆菌DNA聚合酶I(Klenow片段)的酶延长，以便完成带突变链的合成。因此，形成异源双链体，其中一条链编码原始非突变序列且第二链带有所需突变。接着使用此异源双链体载体来转化诸如大肠杆菌细胞的适当细胞且选择包括带有突变的重组载体的克隆。市售试剂盒与所有必需试剂一起供给，寡核苷酸引物除外。

2086多肽包括包含与具有来自偶数SEQ ID NO 2-12中的一者的氨基酸序列的2086蛋白具有实质上序列相似性和/或生物等效性的任何蛋白质或多肽。另外，本发明的2086多肽不限于特定来源。因此，本发明提供多种来源的多肽的一般检测和分离。同样，如所属领域的技术人员所众所周知，2086多肽可基于本文中提供的指导或以所属领域中已知的任何其它合成方式重组制备。

本发明预期可有利地裂解2086多肽为片段以供进一步结构或功能分析，或产生诸如2086相关多肽和2086特异性抗体的试剂所用。此举可通过用诸如胞内蛋白酶glu-C(柏林格尔公司，印第安纳州印第安纳波利丝(Boehringer，Indianapolis，IN))的肽酶处理经纯化或未经纯化的脑膜炎奈瑟菌多肽来完成。用CNBr处理为可自天然脑膜炎奈瑟菌2086多肽产生肽片段的另一种方法。重组技术也可用于产生2086蛋白的特定片段。

作为本文中所使用的术语，“变异体”为分别不同于参考聚核苷酸或多肽但保留基本特性的聚核苷酸或多肽。聚核苷酸的典型变异体在核苷酸序列方面不同于另一参考聚核苷酸。变异体的核苷酸序列变化可能或可能不改变由参考聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。如下所论述，核苷酸变化可产生由参考序列所编码的多肽中的氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短。多肽的典型变异体在氨基酸序列方面不同于另一参考多肽。通常，差异为有限的以便参考多肽和变异体的序列总体上极其类似且在许多区域一致(即生物学上等效)。变异体和参考多肽可在氨基酸序列方面因一个或一个以上呈任何组合形式的取代、添加、缺失而不同。取代或***的氨基酸残基可能或可能不为由遗传密码所编码的氨基酸残基。聚核苷酸或多肽的变异体可天然存在，诸如等位基因变异体，或其可为未知天然存在的变异体。聚核苷酸和多肽的非天然存在变异体可通过突变诱发技术或通过直接合成来制造。

如所属领域中所已知，“一致性”为两个或两个以上多肽序列或两个或两个以上聚核苷酸序列之间通过比较所述序列所确定的关系。在所属领域中，“一致性”也任选意指多肽或聚核苷酸序列之间的序列相关程度，如通过所述序列串之间的匹配度所确定。“一致性”和“相似性”可易于通过已知方法计算，所述方法包括(但不限于)以下文献中所述的那些方法：计算分子生物学(Computational Molecular Biology)，莱斯克A.M.(Lesk，A.M.)编，牛津大学出版社(Oxford University Press)，纽约(New York)，1988；生物计算：信息学和基因组计划(Biocomputing：Informatics and Genome Projects)，史密斯(Smith，D.W.)编，学术出版社(Academic Press)，纽约(New York)，1993；序列数据的计算机分析(Computer Analysis of Sequence Data，Part I)，格里芬A.M.(Griffin A.M.)和格里芬H.G.(Griffin H.G.)，编，胡玛娜出版社(Humana Press)，新泽西(New Jersey)，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)，冯海因里奇G.(von Heinje，G.)，学术出版社(Academic Press)，1987；和序列分析入门(SequenceAnalysis Primer)，格里布斯科夫M.(Gribskov，M.)和德维吕J.(Devereux，J.)编，M斯托克顿出版社(Stockton Press)，纽约(New York)，1991；和卡芮罗H.(Carillo，H.)和里普曼D.(Lipman，D.)，SIAM J.应用数学(Applied Math)。，48：1073(1988)。测定一致性的优选方法经设计以得到所测试序列之间的最大匹配。测定一致性和相似性的方法以公开可用的计算机程序编码。测定两个序列之间的一致性和相似性的优选计算机程序方法包括(但不限于)GCG程序包(德维吕J.(Devereux，J.)等人1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(阿尔舒尔S.F.(Altschul，S.F.)等人，1990)。BLASTX程序可公开得自NCBI和其它来源(BLAST手册(BLAST Manual)，阿尔舒尔S.(Altschul，S.)等人，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；阿尔舒尔S.(Altschul，S.)等人，1990)。众所周知史密斯华特曼(Altschul，S.)算法也可用于测定一致性。

举例来说，在不欲受到限制的情况下，本发明的氨基酸序列可与参考序列偶数SEQID NO：2-12一致；即100％一致，或其与参考序列相比可包括许多氨基酸改变，致使一致性％小于100％。所述改变选自由至少一个氨基酸缺失、包括保守和非保守取代的取代或***组成的群组，且其中所述改变可存在于参考多肽序列的胺基或羧基末端位置或那些末端位置之间的任何地方，个别地散布于参考序列的氨基酸中或以一个或一个以上连续组散布于参考序列中。对于给定一致性％的氨基酸改变的数目可通过使偶数SEQ IDNO：2-12中氨基酸的总数乘以各别一致性百分数的数值百分数(除以100)且接着自偶数SEQ ID NO：2-12的任一者中氨基酸的所述总数减去所述乘积，或：

n_a＝x_a-(x_a·y)，

其中n_a为氨基酸改变的数目，x_a为偶数SEQ ID NO：2-12中氨基酸的总数，且y例如对于70％为0.70，对于80％为0.80，对于85％为0.85等，且其中将x_a与y的任何非整数乘积舍至最接近整数，随后将其自x_a减去。

在优选实施例中，上述多肽选自偶数SEQ ID NO 2-12中所列举的蛋白质，诸如2086蛋白的成熟加工形式。2086蛋白或相等物等可为脂质化或非脂质化蛋白质。

ORF 2086可与原生ORF 2086信号序列一起在大肠杆菌中表达。然而，需要找出改良蛋白质表达的手段。根据本发明的一实施例，前导序列产生脂质化形式的蛋白质。举例来说，下文描述使用未分型的流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)P4蛋白质的信号序列来增强表达。

细菌脂蛋白的加工开始于合成含有信号序列的前驱体或前脂蛋白，而所述信号序列含有一致脂蛋白加工/修饰位点。这一前脂蛋白最初穿过革兰氏阴性菌(Gram positivebacteria)内膜上或革兰氏阳性菌(Gram positive bacteria)膜上的常见Sec***。在前脂蛋白由Sec***定位于膜中后，信号肽酶II在一致位点裂解前脂蛋白且使暴露的N末端半胱氨酸残基甘油酸化和酰化。早矢仕(Hayashi)等人1990.细菌中的脂蛋白(Lipoproteinsin bacteria).生物能学生物膜杂志(J.Bioenerg.Biomembr).六月；22(3)：451-71；奥德加(Oudega)等人1993.大肠杆菌SecB、SecA和SecY蛋白为一种小型脂蛋白细菌素释放蛋白的表达和膜***所需(Escherichia coli SecB，SecA，and SecY proteins are required forexpression and membrane insertion of the bacteriocin release protein，a small lipoprotein).细菌学杂志(J.Bacteriol.)三月；175(5)：1543-7；桑卡兰(Sankaran)等人1995.细菌脂蛋白的修饰(Modification of bacterial lipoproteins).酶学方法(Methods Enzymol).250：683-97。

在革兰氏阴性菌中，取决于脂蛋白位置2处的分选信号，脂质化蛋白质向外膜的转运由具有膜特异性的独特ABC转运体***介导。药师(Yakushi)等人2000.介导经脂质修饰蛋白质从膜剥离的新颖ABC转运体(A new ABC transporter mediating the detachmentof lipid modified proteins from membranes).自然细胞生物学(Nat Cell Biol)。四月；2(4)：212-8。

与细菌脂蛋白和其信号序列的融合已用于在细菌表面上呈递重组蛋白质。美国专利第5,583,038号和第6,130,085号。交换脂蛋白信号序列可增加脂蛋白的产生。德(De)等人2000.表达于大肠杆菌中的肺炎链球菌棕榈酸化肺炎球菌表面粘附素A的纯化和表征(Purification and characterization of Streptococcus pneumoniae palmitoylatedpneumococcal surface adhesin A expressed in Escherichia coli).疫苗(Vaccine).三月6；18(17)：1811-21。

已知蛋白质的细菌脂质化作用增强或改良蛋白质的免疫反应。埃尔蒂尔(Erdile)等人1993.连接脂质在博氏疏螺旋体OspA中的作用(Role of attached lipid in immunogenicityof Borrelia burgdorferi OspA).传染免疫学(Infect.Immun).一月；61(1)：81-90；施纳普(Snapper)等人1995.在针对T细胞非依赖性II型抗原的体液免疫反应中细胞脂蛋白可取代细胞因子(Bacterial lipoproteins may substitute for cytokines in the humoral immuneresponse to T cell-independent type II antigens)。免疫学杂志(J.Immunol).十二月15；155(12)：5582-9。然而，细菌脂蛋白表达可因加工的严格性而变复杂。波立特(Pollitt)等人1986.大肠杆菌主要外膜脂蛋白信号肽裂解位点的氨基酸取代的作用(Effect of aminoacid substitutions at the signal peptide cleavage site of the Escherichia coli major outermembrane lipoprotein).生物化学杂志(J.Biol.Chem).二月5日；261(4)：1835-7；伦(Lunn)等人1987.前脂蛋白信号肽突变对大肠杆菌中杂交前脂-β-内酰胺酶分泌的影响(Effects ofprolipoprotein signal peptide mutations on secretion of hybrid prolipo-beta-lactamase inEscherichia coli)。生物化学杂志(J.Biol.Chem).一月15日；262(17)：8318-24；克莱恩(Klein)等人1988.细菌脂蛋白的信号序列的独特特性(Distinctive properties of signalsequences from bacterial lipoproteins).蛋白质工程(J.Biol.Chem).四月；2(1)：15-20。细菌脂蛋白表达也因堵如毒性和低表达量的其它问题而变复杂。戈麦斯(Gomez)等人1994.核苷酸，枯草芽孢杆菌脂蛋白LplA在大肠杆菌中表达时引起细胞溶解(Nucleotide TheBacillus subtilis lipoprotein LplA causes cell lysis when expressed in Escherichia coli).微生物学(Microbiology).八月；140(Pt 8)：1839-45；汉森(Hansson)等人1995.截短和全长形式的莱姆病包柔氏螺旋体外表面蛋白A在大肠杆菌中的表达(Expression of truncatedand full-length forms of the Lyme disease Borrelia outer surface protein A in Escherichiacoli).蛋白质实验纯化(Protein Expr.Purif).二月；6(1)：15-24；药师(Yakushi)等人1997.错定位大外膜脂蛋白与大肠杆菌的肽聚糖之间的共价连接的致死性(Lethality of thecovalent linkage between mislocalized major outer membrane lipoprotein and thepeptidoglycan of Escherichia coli).细菌学杂志(J.Bacteriol.)五月；179(9)：2857-62。

未分型流感嗜血杆菌细菌表达称为P4的脂蛋白(也称为蛋白质“e”)。P4蛋白质的重组形式使用原生P4信号序列在大肠杆菌中高度表达。美国专利第5,955,580号。当在大肠杆菌中用原生P4信号序列取代表达载体中的原生ORF 2086信号序列时，ORF2086的表达量增加。

使用异源P4信号序列增加表达的这一概念可扩展至其它细菌脂蛋白。具体地说，对细菌基因组进行分析使得许多可能受关注的ORF得以鉴别。在诸如大肠杆菌的异源宿主细胞中表达具有原生信号序列的各ORF的尝试引起使用多种信号序列中固有的多种问题，包括稳定性、兼容性等等。为将这些问题减至最少，使用P4信号序列表达各相关ORF。如上文所述，P4信号序列改良异源2086ORF的表达。通过使相关ORF的原生信号序列缺失，且将P4信号序列接合至ORF来建构表达载体。接着用表达载体转化、转染或感染合适宿主细胞，且ORF的表达与使用ORF的原生信号序列相比有所增加。

在宿主细胞中非脂质化形式由缺乏原始前导序列的蛋白质或由经不指定脂肪酸酰化位点的序列的一部分置换的前导序列产生。

除非另外明确指出，否则本发明的各种形式的2086蛋白在本文中称为“2086”蛋白质。同样，除非另有指出，否则“2086多肽”是指如上所述的2086蛋白以及其免疫原性部分或生物相等物。

如以10％至20％梯度SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)所测量，全长经分离和经纯化脑膜炎奈瑟菌2086蛋白具有约28至35kDa的表观分子量。更具体地说，如通过质谱法所测量，此蛋白质具有约26,000至30,000道尔顿的分子量。

优选地，使用2086多肽和编码所述多肽的核酸来预防或改善由脑膜炎奈瑟菌和/或其它菌种引起的感染。

抗体

包括SEQ ID NO：2-12的氨基酸序列的本发明蛋白质、其片段和其类似物或表达其的细胞也用作免疫原以产生对本发明的多肽具有免疫特异性的抗体。本发明包括针对免疫特异性多肽的抗体和使用所述抗体来检测脑膜炎奈瑟菌的存在、提供被动保护或测量所述多肽在细胞、细胞或组织提取物或生物流体中的量或浓度的用途。

本发明抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体和抗独特型抗体。多克隆抗体为来源于用抗原免疫的动物的血清的抗体分子的异质群体。单克隆抗体为针对特定抗原的抗体的实质上均质群体。单克隆抗体可通过所属领域的技术人员已知的方法获得，例如科勒尔(Kohler)和米尔斯坦恩(Milstein)，1975，自然(Nature)256：495-497和美国专利第4,376,110号。所述抗体可属于任何免疫球蛋白种类，包括IgG、IgM、IgE、IgA、GILD和其任何亚类。

嵌合抗体为不同部分来源于不同动物物种的分子，诸如具有来源于鼠类单克隆抗体的可变区和人类免疫球蛋白恒定区的那些抗体。嵌合抗体和其制备方法在所属领域中已知(卡比利(Cabilly)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81：3273-3277；莫里森(Morrison)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81：6851-6855；波利安(Boulianne)等人，1984，自然(Nature)312：643-646；卡比利(Cabilly)等人，欧洲专利申请案125023(于1984年11月14日公开)；塔尼古奇(Taniguchi)等人，欧洲专利申请案171496(于1985年2月19日公开)；莫里森(Morrison)等人，欧洲专利申请案173494(于1986年3月5日公开)；纽博格(Neuberger)等人，PCT申请案WO 86/01533(于1986年3月13日公开)；库多(Kudo)等人，欧洲专利申请案184187(于1986年6月11日公开)；莫里森(Morrison)等人，欧洲专利申请案173494(于1986年5月5日公开)；萨哈根(Sahagan)等人，1986，免疫学杂志(J.Immunol).137：1066-1074；洛宾逊(Robinson)等人，PCT/US86/02269(于1987年5月7日公开)；刘(Liu)等人，1987，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)84：3439-3443；孙(Sun)等人，1987，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)84：214-218；贝特(Better)等人，1988，科学(Science)240：1041-1043)。这些参考文献以引用的方式全部并入本文中。

抗独特型(抗Id)抗体为识别通常与抗体的抗原结合位点相关的独特决定子的抗体。抗Id抗体通过用制备抗Id所针对的单克隆抗体免疫作为单克隆抗体的来源的相同物种和遗传型的动物(例如小鼠品系)来制备。经免疫的动物将通过产生这些同型决定子的抗体(抗Id抗体)来识别和应答免疫抗体的独特型决定子。

因此，对抗本发明多肽所产生的单克隆抗体可用于在合适动物体内诱导抗Id抗体。来自所述经免疫小鼠的脾细胞可用于产生分泌抗Id单克隆抗体的抗Id杂交瘤。此外，可使抗Id抗体与诸如匙孔螺血蓝蛋白(KLH)的载体偶合且用于免疫其它BALB/c小鼠。来自这些小鼠的血清将含有具有对R-PTPase抗原决定基有特异性的最终mAb的结合特性的抗抗Id抗体。因此抗Id抗体具有其独特型抗原决定基，或在结构上类似于所评估的抗原决定基的“独特位(idiotope)”，诸如化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)多肽。

术语“抗体”也欲包括完整分子以及片段两者，所述片段诸如Fab、单链抗体和能够结合抗原的抗体的其它抗原识别片段。Fab片段缺乏完整抗体的Fc片段，自循环更快速清除，且可具有比完整抗体少的非特异性组织结合(华尔(Wahl)等人，1983，核酸医学杂志(J.Nucl.Med.)24：316-325)。应了解，Fab和适用于本发明的抗体的其它片段可用于根据用于完整抗体分子的方法检测和量化脑膜炎奈瑟菌多肽。

诸如抗独特型(“抗Id”)抗体的本发明抗体可用于治疗或预防哺乳动物宿主体内的奈瑟菌感染的方法，其包含投与免疫有效量的对如上所述的多肽有特异性的抗体。抗Id抗体也可用作“免疫原”以诱发另一动物体内的免疫反应，从而产生所谓抗抗Id抗体。抗抗Id可与诱导抗Id的原始mAb在抗原决定基方面一致。因此，通过使用针对mAb的独特型决定子的抗体，有可能鉴别表达具有一致特异性的抗体的其它克隆。

以多种方式使用抗体，例如用于证实蛋白质已表达，或确认蛋白质在何处表达。经标记抗体(例如用于FACS的荧光标记)可与完整细菌一起培养且细菌表面上标记的存在证实例如蛋白质的位置。

对抗本发明多肽产生的抗体可通过使用常规方案向动物投与多肽或带有抗原决定基的片段、类似物或细胞来获得。对于制备单克隆抗体来说，使用提供由连续细胞系培养物所产生的抗体的任何技术。

聚核苷酸

如同本发明的蛋白质，本发明的聚核苷酸可包含与奇数SEQ ID NO：1-11的参考序列中任一者一致的核酸序列，即100％一致，或与参考序列相比其可包括多达许多核苷酸改变。所述改变选自由至少一个核苷酸缺失、包括转换和易位的取代或***组成的群组，且其中所述改变可存在于参考核苷酸序列的5′或3′末端位置或那些末端位置之间的任何地方，个别地散布于参考序列的核苷酸中或以一个或一个以上连续组散布于参考序列中。核苷酸改变的数目通过将奇数SEQ ID NO：1-11的任一者中核苷酸总数乘以各别一致性百分数的数值百分数(除以100)且自所述序列中核苷酸的所述总数减去所述乘积来测定。

举例来说，在不欲受到限制的情况下，经分离的脑膜炎奈瑟菌聚核苷酸包含与奇数SEQ ID NO：1-11的任何核酸序列具有至少95％一致性的聚核苷酸序列；其简并变异体或其片段，其中所述聚核苷酸序列可在奇数SEQ ID NO：1-11的核酸序列的整个聚核苷酸区域中包括至多n_n个核酸改变，其中n_n为改变的最大数目且由下式计算：

n_n＝x_n-(x_n·y)，

其中x_n为奇数SEQ ID NO：1-11的任一者的核酸的总数且y的值为0.95，其中将x_n与y的任何非整数乘积舍至最接近整数，随后自x_n减去所述乘积。当然，y也可具有对于95％为0.95的值等。编码包含偶数SEQ ID NO：2-12的任一者的氨基酸序列的多肽的聚核苷酸序列的改变可在此编码序列中产生无义、错义或移框突变且由此在所述改变后改变由所述聚核苷酸编码的多肽。

本发明的特定实施例涉及编码2086蛋白的聚核苷酸(本文中称为“2086聚核苷酸”或“ORF2086聚核苷酸”)和对抗2086蛋白产生的抗体。在优选实施例中，本发明的经分离聚核苷酸为包含与选自奇数SEQ ID NO：1-11的一者的核苷酸序列具有至少约95％一致性的核苷酸序列的聚核苷酸、其简并变异体或其片段。如本文所定义，“简并变异体”定义为由于遗传密码的简并性而不同于展示于奇数SEQ ID NO：1-11中的核苷酸序列，但仍然编码与由展示于奇数SEQ ID NO：1-11中的核苷酸序列所编码蛋白质相同的2086蛋白(例如偶数SEQ ID NO：2-12)的聚核苷酸。

在其它实施例中，聚核苷酸为选自奇数SEQ ID NO：1-11的一者的核苷酸序列、其简并变异体或其片段的互补序列。在其它实施例中，聚核苷酸选自由DNA、染色体DNA、cDNA和RNA组成的群组且可进一步包含异源核苷酸。

应了解，2086聚核苷酸可自天然、合成或半合成来源获得；此外，核苷酸序列可为天然存在的序列，或其可通过包括单个或多个碱基取代、缺失、***和颠倒的突变而与所述天然存在的序列相关，条件是包含所述序列的核酸分子始终能够表达为如上所述的2086免疫原性多肽。核酸分子可为RNA、DNA、单链或双链、线性或共价闭合环形。核苷酸序列可具有相邻于其定位的表达控制序列，所述控制序列通常来源于异源来源。通常，本发明的核酸序列的重组表达将在核酸序列的末端使用终止密码子序列，诸如TAA。

本发明也包括能够在低严谨条件下、更优选严谨条件且最优选高严谨条件下与本文所述的聚核苷酸杂交的聚核苷酸。严谨条件的实例在以下严谨条件表中展示：高严谨条件为至少如例如条件A-F般严谨的那些；严谨条件为至少如例如条件G-L般严谨；和低严谨条件为至少如例如条件M-R般严谨。

表I

严谨条件

严谨条件	聚核苷酸杂交	杂交长度(bp)I	杂交温度和缓冲液H	洗涤温度和缓冲液H
					A	DNA:DNA	＞50	65EC；1×SSC-或-42EC；1×SSC，50％甲酰胺	65EC；0.3×SSC
B	DNA:DNA	＜50	TB；1×SSC	TB；1×SSC
					C	DNA:RNA	＞50	67EC；1×SSC-或-45EC；1×SSC，50％甲酰胺	67EC；0.3×SSC
D	DNA:RNA	＜50	TD；1×SSC	TD；1×SSC
					E	RNA:RNA	＞50	70EC；1×SSC-或-50EC；1×SSC，50％甲酰胺	70EC；0.3×SSC
F	RNA:RNA	＜50	TF；1×SSC	Tf；1×SSC
					G	DNA:DNA	＞50	65EC；4×SSC-或-42EC；4×SSC，50％甲酰胺	65EC；1×SSC
H	DNA:DNA	＜50	TH；4×SSC	TH；4×SSC

严谨条件	聚核苷酸杂交	杂交长度(bp)I	杂交温度和缓冲液H	洗涤温度和缓冲液H
					I	DNA:RNA	＞50	67EC；4×SSC-或-45EC；4×SSC，50％甲酰胺	67EC；1×SSC
J	DNA:RNA	＜50	TJ；4×SSC	TJ；4×SSC
					K	RNA:RNA	＞50	70EC；4×SSC-或-50EC；4×SSC，50％甲酰胺	67EC；1×SSC
L	RNA:RNA	＜50	TL；2×SSC	TL；2×SSC
					M	DNA:DNA	＞50	50EC；4×SSC-或-40EC；6×SSC，50％甲酰胺	50EC；2×SSC
N	DNA:DNA	＜50	TN；6×SSC	TN；6×SSC
					O	DNA:RNA	＞50	55EC；4×SSC-或-42EC；6×SSC，50％甲酰胺	55EC；2×SSC
P	DNA:RNA	＜50	TP；6×SSC	TP；6×SSC
					Q	RNA:RNA	＞50	60EC；4×SSC-或-45EC；6×SSC，50％甲酰胺	60EC；2×SSC
R	RNA:RNA	＜50	TR；4×SSC	TR；4×SSC

bp¹：所述杂交长度为杂交聚核苷酸的杂交区域的预期长度。当将聚核苷酸与未知序列的目标聚核苷酸杂交时，杂交长度假定为杂交聚核苷酸的长度。当使已知序列的聚核苷酸杂交时，杂交长度可通过比对聚核苷酸的序列和鉴别最优序列互补的区域来测定。

缓冲液^H：在杂交和洗涤缓液中，SSPE(1×SSPE为0.15M NaCl、10mM NaH₂PO₄和1.25mM EDTA，pH 7.4)可替代SSC(1×SSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；完成杂交后执行洗涤历时15分钟。

T_B至T_R：用于预期长度小于50个碱基对的杂交物的杂交温度应比杂交物的熔融温度(T_m)低5-10EC，其中T_m根据下列方程式测定。对于长度小于18个碱基对的杂交物来说，T_m(EC)＝2(A的#+T碱基)+4(G的#+C碱基)。对于长度介于18与49个碱基对之间的杂交物来说，T_m(EC)＝81.5+16.6(log₁₀[Na⁺])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N为杂交物中碱基的数目，且[Na⁺]为杂交缓冲液中钠离子的浓度(对于1×SSC来说[Na⁺]＝0.165M)。

用于聚核苷酸杂交的严谨条件的其它实例在萨姆布鲁克J.(Sambrook J.)，E.F.福里什(E.F.Fritsch)，和T.马尼亚迪斯(T.Maniatis)，1989，分子克隆：实验手册(MolecularCloning：A Laboratory Manual)，冷泉港实验出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，NY，第9和11章，和当代分子生物学方案(Current Protocolsin Molecular Biology)，1995，F.M.奥舒贝尔(F.M.Ausubel)等人，编，约翰威立父子公司(John Wiley&Sons)，第2.10和6.3-6.4小节中提供，所述文献以引用的方式并入本文中。

本发明也提供与这些聚核苷酸完全互补的聚核苷酸且也提供反义序列。也称为反义寡核苷酸的本发明的反义序列包括阻断编码本发明多肽的聚核苷酸表达的内部产生和外部投与的序列。本发明的反义序列包含(例如)约15-20个碱基对。反义序列可经设计(例如)以通过防止启动子与上游非翻译序列结合或通过经由防止核糖体结合而防止编码本发明多肽的转录物翻译来抑制转录。

本发明的聚核苷酸可以许多方式制备(例如通过化学合成、自DNA文库、自生物体自身)且可采用各种形式(例如单链、双链、载体、探针、引物)。术语“聚核苷酸”包括DNA和RNA，以及其类似物，诸如含有经修饰主链的那些。

根据本发明的其它实施例，本发明的聚核苷酸包含DNA文库，诸如cDNA文库。

融合蛋白

本发明也涉及融合蛋白。“融合蛋白”是指由两个常常无关的融合基因或其片段编码的蛋白质。举例来说，融合蛋白包含免疫球蛋白分子的恒定区的各种部分以及另一免疫原性蛋白质或其部分。在许多情况下，采用免疫球蛋白Fc区作为融合蛋白的一部分对于用于治疗和诊断是有利的，从而产生(例如)改良的药物动力学特性(参见例如，EP 0232262A1)。另一方面，对于一些用途来说，将需要能够在表达、检测和纯化融合蛋白后删除Fc部分。本发明的2086聚核苷酸用于重组产生本发明的多肽，聚核苷酸可包括单独的成熟多肽的编码序列，或与其它编码序列同处于阅读框架中的成熟多肽的编码序列，所述其它编码序列诸如编码前导或分泌序列、前蛋白或原蛋白或前原蛋白序列或其它融合肽部分的那些序列。举例来说，可编码有助于纯化2086多肽或融合多肽的标志物序列(参见根茨(Gentz)等人，1989，以引用的方式全部并入本文中)。因此，本发明的一实施例涵盖编码允许表达产物的His标签纯化的融合多肽的聚核苷酸的制备。聚核苷酸也可含有非编码5′和3′序列，诸如转录、非翻译序列、拼接和多聚腺嘌呤信号。所述融合多肽可由用如下文所述的重组DNA克隆媒剂转化/转染或感染的宿主细胞产生且其随后可自宿主细胞分离以提供实质上不含其它宿主细胞蛋白质的融合多肽。

免疫原性组合物

本发明的一方面提供免疫原性组合物，其包含至少一种2086蛋白或编码所述蛋白质的核酸。上述物质具有以下能力：(1)激发针对多种菌株的杀菌性抗体；(2)与多种菌株的表面反应；(3)赋予针对活攻毒的被动保护；和/或(4)防止定植。所述免疫原性组合物的调配物为所属领域的技术人员所众所周知。在某些实施例中，本发明的组合物包括医药学上可接受的载剂和/或稀释剂。合适的医药学上可接受的载剂和/或稀释剂包括任何和所有常规溶剂、分散介质、填充剂、固体载剂、水溶液、涂料、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。合适的医药学上可接受的载剂包括(例如)水、生理食盐水、磷酸盐缓冲生理食盐水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一种或一种以上，以及其组合。医药学上可接受的载剂可进一步包含少量助剂物质，诸如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增强抗体的存放期或有效性。医药学上可接受的载剂的制备和用途在所属领域中众所周知。除非任何常规介质或试剂与活性成份不兼容，否则涵盖其在本发明的免疫原性组合物中的用途。根据本发明的某些实施例，医药学上可接受的载剂为载体蛋白。

载体蛋白

载体蛋白优选为无毒且不具反应原性且可以足够量和纯度获得的蛋白。载体蛋白应服从标准结合程序。在本发明的一特定实施例中，将CRM₁₉₇用作载体蛋白。

CRM₁₉₇(维斯，桑福德，北卡罗莱纳(Wyeth，Sanford，NC))为自生长于酪蛋白氨基酸和基于酵母提取物的培养基中的白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)菌株C7(β197)的培养物分离的白喉毒素的无毒变异体(即类毒素)。通过超滤、硫酸铵沉淀和离子交换色谱纯化CRM₁₉₇。获得CRM₁₉₇的另一方法在美国专利第4,925,792号中描述。或者，根据美国专利第5,614,382号重组制备CRM₁₉₇。其它白喉类毒素也适于用作载体蛋白。

在其它实施例中，本发明的载体蛋白为无酶促活性链球菌C5a肽酶(SCP)(例如，美国专利第6,270,775号、第6,355,255号和第6,951,653号中所述的SCP变异体的一种或一种以上)。

其它合适载体蛋白包括灭活细菌毒素，诸如破伤风类毒素、百日咳类毒素、霍乱类毒素(例如国际PCT公开案第WO 2004/083251号中所述的CT E29H)、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST、大肠杆菌DnaK蛋白和来自绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素。也可使用细菌外膜蛋白，诸如外膜复合物c(OMPC)、孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素毒素(例如美国专利第5,565,204号)、肺炎球菌溶血素类毒素(例如国际PCT公开案第WO 2005/108580号)、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌粘附素蛋白(PsaA)或流感嗜血杆菌蛋白D。也可使用细菌热休克蛋白，诸如分枝杆菌hsp-70。也可使用其它蛋白，诸如表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)蛋白SdrG、SitC和铬铁合金结合蛋白和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白ClfA、ClfB和FnbA。诸如卵白蛋白、匙孔螺血蓝蛋白(KLH)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、牛血清白蛋白(BSA)、半乳糖激酶(galK)、泛素、β-半乳糖苷酶、流行性感冒NS1蛋白或结核菌素的经纯化蛋白衍生物(PPD)的其它蛋白也可用作载体蛋白。也可使用例如来自轮状病毒VP6或来自噬菌体Qβ的类病毒粒子。

佐剂

在某些实施例中，本文中所述的免疫原性组合物也包含一种或一种以上佐剂。佐剂为与免疫原或抗原一起投与时可增强免疫反应的物质。许多细胞因子或淋巴因子已显示具有免疫调节活性，因此可用作佐剂，包括(但不限于)介白素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(参见例如美国专利第5,723,127号)、13、14、15、16、17和18(和其突变形式)；干扰素-α、β和γ；颗粒球-巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)(参见例如美国专利第5,078,996号和ATCC寄存编号39900)；巨噬细胞群落刺激因子(M-CSF)；颗粒球群落刺激因子(G-CSF)；和肿瘤坏死因子α和β。适用于本文中所述的免疫原性组合物的其它佐剂包括：趋化因子，包括(但不限于)MCP-1、MIP-1α、MIP-1β和RANTES；粘着分子，诸如选择素，例如L-选择素、P-选择素和E-选择素；类粘蛋白分子，例如CD34、GlyCAM-1和MadCAM-1；整合素家族的成员，诸如LFA-1、VLA-1、Mac-1和p150.95；免疫球蛋白超家族的成员，诸如PECAM、ICAM(例如ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3)、CD2和LFA-3；共刺激分子，诸如CD40和CD40L；生长因子，包括血管生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、B7.2、PDGF、BL-1和血管内皮生长因子；受体分子，包括Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2和DR6；和卡斯蛋白酶(Caspase)(ICE)。

用于增强免疫反应的合适佐剂进一步包括(但不限于)MPL^TM(3-O-脱酰化单磷酰脂质A，考利克萨，汉密尔顿，明尼苏达(Corixa，Hamilton，MT))，其在美国专利第4,912,094号中描述。也适于用作佐剂的为合成脂质A类似物或胺基烷基葡糖胺磷酸盐化合物(AGP)，或其衍生物或类似物，其可从考利克萨(明尼苏达汉密尔顿)获得，其在美国专利第6,113,918号中描述。一种所述AGP为2-[(R)-3-四癸酰氧基四癸酰基胺基]乙基2-脱氧基-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-四癸酰氧基四癸酰基]-2-[(R)-3-四癸酰氧基四癸酰基-胺基]-b-D-葡萄哌喃糖苷，其也称为529(原先称为RC529)。此529佐剂调配为水性形式(AF)或稳定乳液(SE)。

其它佐剂包括胞壁酰肽，诸如N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏胺酰基-D-异谷胺酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-非胞壁酰基-L-丙氨酸-2-(1′-2′二软脂酰基-sn-甘油酰基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)；水包油乳液，诸如MF59(国际PCT公开案第WO 90/14837号)(含有5％角鲨烯、0.5％吐温80(Tween 80)和0.5％Span 85(任选含有各种量的MTP-PE)，使用诸如型号110Y微流化床装置(微流体公司，牛顿，马萨诸塞(Microfluidics，Newton，MA))的微流化床装置调配为次微米粒子)和SAF(含有10％角鲨烯、0.4％吐温80、5％泊洛尼克(pluronic)嵌段共聚物L121和thr-MDP，微流体化为次微米乳液或涡动产生较大粒度乳液)；不完全费氏佐剂(incomplete Freund′s adjuvant，IFA)；铝盐(明矾)，诸如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝；爱菲金(Amphigen)；阿夫立定(Avridine)；L121/角鲨烯；D-丙交酯-聚丙交酯/糖苷；泊洛尼克多元醇；杀死的博德氏杆菌(Bordetella)；皂角苷，诸如在美国专利第5,057,540号中描述的Stimulon^TM QS-21(抗基因，福莱明汉姆，马萨诸塞(Antigenics，Framingham，MA.))、在美国专利第5,254,339号中描述的ISCOMATRIX(CSL有限公司，帕克维尔，澳大利亚(CSL Limited，Parkville，Australia))和免疫刺激复合物(ISCOMS)；结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)；细菌脂多糖；合成聚核苷酸，诸如含有CpG基元的寡核苷酸(例如美国专利第6,207,646号)；IC-31(细胞间AG公司，维也纳，奥地利(Intercell A G，Vienna，Austria))，在欧洲专利第1,296,713号和第1,326,634号中描述；百日咳毒素(PT)或其突变体、霍乱毒素或其突变体(例如国际PCT公开案第WO 00/18434号、第WO 02/098368号和第WO 02/098369号)；或大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)，尤其LT-K63、LT-R72、PT-K9/G129；参见例如，国际PCT公开案第WO 93/13302号和第WO 92/19265号。

投药方式

所述免疫原性组合物可非经肠投与，例如通过注射，经皮下或经肌肉内投与，以及经口或经鼻内投与。用于肌肉内免疫的方法由沃尔夫(Wolff)等人和塞达哈(Sedegah)等人描述。其它投药方式利用(例如，但不限于)口服调配物、肺用调配物、栓剂和经皮施用。口服调配物例如包括所述通常所用的赋形剂，例如(但不限于)医药等级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁和其类似物。

本发明的免疫原性组合物可以ISCOMS(免疫刺激复合物)的形式传递，ISCOMS含有CTB、脂质体或封装于诸如丙烯酸酯或聚(DL-丙交酯-共-糖苷)的化合物中以形成适于吸收尺寸的微球体。本发明的蛋白质也可并入油性乳液中。

多种抗原

包括本发明的蛋白质、聚核苷酸和相等物的免疫原性试剂可以免疫原性组合物中的溶胶活性免疫原形式投与，或另外组合物可包括其它活性免疫原，包括其它奈瑟菌属免疫原性多肽或一种或一种以上其它微生物病原体(例如(但不限于)病毒、朊病毒、细菌或真菌)的免疫活性蛋白质或荚膜多糖。组合物可包含一种或一种以上所需蛋白质、片段或所选适应症所需的医药化合物。以相同方式，利用免疫原性组合物中的一种或一种以上核酸的本发明的组合物也可包括编码如上所述的相同各种蛋白质组的核酸。

本发明涵盖任何多抗原或多价免疫原性组合物。举例来说，本发明的组合物可包含两种或两种以上2086蛋白的组合，2086蛋白与一种或一种以上Por A蛋白质的组合，2086蛋白与脑膜炎球菌血清群A、C、Y和W135多糖和/或多糖结合物的组合，2086蛋白与脑膜炎球菌和肺炎球菌组合的组合，或上述任一者以适合于粘膜传递的形式的组合。所属领域的技术人员能够容易地调配所述多抗原或多价免疫组合物。

本发明也涵盖多免疫疗法，其中适用于对抗病原体的任何组合物可组合于其中或与本发明的组合物组合。举例来说，但不限于，可向患者投与本发明的免疫原性组合物和作为多免疫疗法的一部分的用于免疫抵抗肺炎链球菌(S.Pneumoniae)的另一免疫组合物。所属领域的技术人员能够容易地选择免疫原性组合物与本发明的免疫原性组合物联合使用以实现开发和实施多免疫疗法的目的。

本发明的特定实施例涉及一种或一种以上本发明的多肽或编码其的核酸在组合物中或作为治疗疗法的一部分用于预防或改善肺炎链球菌感染的用途。吾人可将2086多肽或2086聚核苷酸与任何免疫原性组合物组合以用于抵抗肺炎链球菌感染。吾人也可将2086多肽或2086聚核苷酸与任何其它基于蛋白质或多糖的脑膜炎球菌疫苗组合。

2086多肽、片段和相等物可用作结合物免疫原性组合物的一部分；其中一种或一种以上蛋白质或多肽与载体结合以产生具有抵抗若干血清型和/或抵抗若干疾病的免疫原性特性的组合物。或者，2086多肽中的一者可用作其它免疫原性多肽的载体蛋白。

本发明也涉及一种诱发哺乳动物体内的免疫反应的方法，其包含向所述哺乳动物提供本发明的免疫原性组合物的步骤。所述免疫原性组合物为在所治疗动物或人类体内具有抗原性使得所述组合物中所含的免疫有效量的多肽引起对抗脑膜炎奈瑟菌感染的所需免疫反应的组合物。优选实施例涉及一种治疗(包括改善)或预防脑膜炎奈瑟菌感染的方法，其包含向人类投与免疫有效量的组合物。

如本文所使用，词组“免疫有效量”是指将所述量以单次剂量或作为一系列剂量的部分投与哺乳动物宿主(优选人类)，足以至少使所治疗个体的免疫***产生降低细菌感染的临床影响的反应。此可在预防感染的最小细菌负荷降低的范围内。理想地，所治疗个体将不展现细菌感染的更严重临床表现。剂量的量可视个体的特定情况而变化。此量可以常规试验或者通过所属领域的技术人员已知的方法测定。

本发明的另一特定方面涉及使用表达本发明的蛋白质或其免疫原性部分的载体或质粒作为免疫原性组合物。因此，本发明的另一方面提供一种诱发哺乳动物体内的免疫反应的方法，其包含向哺乳动物提供表达至少一种经分离2086多肽的载体或质粒。本发明的蛋白质可使用活载体，尤其使用活重组细菌、病毒或含有表达作为外来多肽的多肽或免疫原性部分所必需的遗传物质的其它活试剂传递至哺乳动物。

根据本发明的另一实施例，提供一种诊断哺乳动物的细菌性脑膜炎的方法，其包含：检测哺乳动物体内或来自所述哺乳动物的组织样品中免疫复合物的存在，使所述哺乳动物或组织样品与包含抗体的抗体组合物接触，所述抗体与至少一种包含偶数SEQ ID NO：2-12的任一者的氨基酸序列的多肽免疫特异性结合；其中使哺乳动物或组织样品与所述抗体组合物在适于形成所述免疫复合物的条件下接触。

病毒和非病毒载体

优选载体、尤其用于活体外和活体内细胞检定的载体为病毒载体，诸如慢病毒、反转录病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘疮病毒、杆状病毒和具有所需细胞向性的其它重组病毒。因此，编码2086蛋白或其免疫原性片段的核酸可使用病毒载体或经由直接引入DNA而活体内、离体或活体外引入。在目标组织中的表达可通过使转基因载体靶向特定细胞，诸如用病毒载体或受体配体，或通过使用组织特异性启动子或两者来实现。目标基因传递在PCT公开案第WO 95/28494号中描述，所述案以引用的方式全部并入本文中。

常用于活体内或离体靶向和治疗程序的病毒载体为基于DNA的载体和反转录病毒载体。用于建构和使用病毒载体的方法在所属领域中已知(例如米勒(Miller)和罗斯曼(Rosman)，生物技术(BioTechniques)，1992，7：980-99)。优选地，病毒载体有复制缺陷，即其不能在目标细胞中自主复制。优选地，复制缺陷病毒为最小病毒，即其仅保留其封装基因组以产生病毒粒子所必需的基因组的序列。

DNA病毒载体包括减毒或缺陷DNA病毒，诸如(但不限于)单纯疱疹病毒(HSV)、***瘤病毒、E-B病毒(Epstein Barr virus，EBV)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)等。优选全部或几乎全部缺乏病毒基因的缺陷病毒。缺陷病毒在引入细胞中后不具感染性。缺陷病毒载体的使用允许向特定限定区域的细胞投药，而不考虑载体会感染其它细胞。因此，可明确靶向特定组织。特定载体的实例包括(但不限于)缺陷疱疹病毒1(HSV1)载体(卡普立特(Kaplitt)等人，分子细胞神经科学(Molec.Cell.Neurosci.)，1991，2：320-330)、缺乏糖蛋白L基因的缺陷疱疹病毒载体或其它缺陷疱疹病毒载体(PCT公开案第WO 94/21807号和第WO 92/05263号)；减毒腺病毒载体，诸如由斯坦福-皮埃尔科德(Stratford-Perricaudet)等人(临床研究杂志(J.Clin.Invest.)，1992，90：626-630；也参见拉萨莱(La Salle)等人，科学(Science)，1993，259：988-990)描述的载体；和缺陷腺相关病毒载体(萨姆尔斯基(Samulski)等人，病毒学杂志(J.Virol.)，1987，61：3096-3101；萨姆尔斯基(Samulski)等人，病毒学杂志(J.Virol.)，1989，63：3822-3828；莱布克斯基(Lebkowski)等人，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)，1988，8：3988-3996)，上述文献中的每一者均以引用的方式全部并入本文中。

各种公司商业上生产病毒载体，所述公司包括(但不限于)鸟基因公司(Avigen，Inc.)(阿拉米达，加利福利亚(Alameda，CA)；AAV载体)、细胞基因检定公司(Cell Genesys)(福斯特市，加利福利亚(Foster City，CA)；反转录病毒、腺病毒、AAV载体和慢病毒载体)、克隆技术公司(Clontech)(反转录病毒和杆状病毒载体)、新基因公司(Genovo，Inc.)(沙伦山，宾夕法尼亚(Sharon Hill，PA)；腺病毒和AAV载体)、基因载体公司(Genvec)(腺病毒载体)、基因简介公司(IntroGene)(来顿，荷兰(Leiden，Netherlands)；腺病毒载体)、分子医学公司(Molecular Medicine)(反转录病毒、腺病毒、AAV和疱疹病毒载体)、诺尔根公司(Norgen)(腺病毒载体)、牛津生物医学公司(Oxford BioMedica)(牛津，英国(Oxford，United Kingdom)；慢病毒载体)和转基因公司(Transgene)(斯特拉斯堡，法国(Strasbourg，France)；腺病毒、痘疮、反转录病毒和慢病毒载体)，其以引用的方式全部并入本文中。

腺病毒载体。腺病毒为可经修饰以将本发明的核酸有效传递至多种细胞类型中的真核DNA病毒。存在腺病毒的多种血清型。在这些血清型中，在本发明的范围内优选使用2型或5型人类腺病毒(Ad 2或Ad 5)或动物来源的腺病毒(参见PCT公开案第WO94/26914号)。在本发明的范围内可使用的那些动物来源的腺病毒包括犬、牛、鼠(实例：Mav1，贝尔德(Beard)等人，病毒学(Virology)，1990，75-81)、绵羊、猪、鸟和猿(实例：SAV)来源的腺病毒。优选地，动物来源的腺病毒为犬腺病毒，更优选为CAV2腺病毒(例如曼哈顿(Manhattan)或A26/61病毒株，例如ATCC VR-800)。各种复制缺陷腺病毒和最小腺病毒载体已有所描述(PCT公开案第WO 94/26914号、第WO 95/02697号、第WO 94/28938号、第WO 94/28152号、第WO 94/12649号、第WO 95/02697号、第WO 96/22378号)。根据本发明的复制缺陷重组腺病毒可通过所属领域的技术人员已知的任何技术制备(莱福莱罗(Levrero)等人，基因(Gene)，1991，101：195；欧洲公开案第EP 185573号；格雷厄姆(Graham)，欧洲分子生物学组织期刊(EMBO J.)，1984，3：2917；格雷厄姆(Graham)等人，基因病毒学杂志(J.Gen.Virol.)，1977，36：59)。回收重组腺病毒且使用所属领域的一般技术人员众所周知的标准分子生物技术将其纯化。

腺相关病毒。腺相关病毒(AAV)为相对小尺寸的DNA病毒，其可以稳定和位点特异性方式整合至其所感染的细胞的基因组中。其能够感染广泛范围的细胞，而不诱导对细胞生长、形态或分化的任何影响，且其似乎并不参与人类病状。已克隆、测序且表征AAV基因组。使用来源于AAV的载体在活体外和活体内转移基因已有所描述(参见，PCT公开案第WO 91/18088号和第WO 93/09239号；美国专利第4,797,368号和第5,139,941号；欧洲公开案第EP 488528号)。根据本发明的复制缺陷重组AAV可通过将含有两侧为两个AAV反向末端重复(ITR)区的相关核酸序列的质粒和带有AAV包装基因(rep和cap基因)的质粒共转染至经人类辅助病毒(例如腺病毒)感染的细胞系中。接着通过标准技术纯化所产生的AAV重组体。

反转录病毒载体。在本发明的另一实施例中，核酸可引入反转录病毒载体中，例如以下文献中所述：美国专利第5,399,346号；曼恩(Mann)等人，细胞(Cell)，1983，33：153；美国专利第4,650,764号和第4,980,289号；玛尔科维茨(Markowitz)等人，病毒学杂志(J.Virol.)，1988，62：1120；美国专利第5,124,263号；欧洲公开案第EP 453242号和第EP 178220号；波恩斯坦(Bernstein)等人，遗传工程学(Genet.Eng.)，1985，7：235；麦克科米克(McCormick)，生物技术(BioTechnology)，1985，3：689；PCT公开案第WO95/07358号；和郭(Kuo)等人，血液(Blood)，1993，82：845，其每一者均以引用的方式全部并入本文中。反转录病毒为感染***细胞的整合病毒。反转录病毒基因组包括两个LTR、一个包装序列和三个编码区(gag、pol和env)。在重组反转录病毒载体中，gag、pol和env基因通常整个或部分缺失，且经置换为相关异源性核酸序列。这些载体可自不同类型的反转录病毒建构，所述反转录病毒诸如HIV、MoMuLV(“鼠莫洛尼白血病病毒(murine Moloney leukaemia virus)”)、MSV(“鼠莫洛尼肉瘤病毒(murine Moloney sarcomavirus)”)、HaSV(“哈维肉瘤病毒(Harvey sarcoma virus)”)；SNV(“脾坏死病毒”)；RSV(“劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)”)和弗氏病毒(Friend virus)。合适的包装细胞已在先前技术中描述，尤其细胞系PA317(美国专利第4,861,719号)；PsiCRIP细胞系(PCT公开案第WO 90/02806号)和GP+envAm-12细胞系(PCT公开案第WO 89/07150号)。另外，重组反转录病毒载体可在LTR中含有抑制转录活性的修饰以及可包括gag基因的一部分的广泛包装序列(本德尔(Bender)等人，病毒学杂志(J.Virol.)，1987，61：1639)。通过所属领域的一般技术人员已知的标准技术纯化重组反转录病毒载体。

反转录病毒载体可经建构以充当感染性粒子或经历单轮转染。在前一种情况下，病毒经修饰以保留除造成致癌转化特性的那些基因外的其所有基因，且表达异源基因。非感染性病毒载体经操纵以破坏病毒包装信号，但保留包装经工程化以含有异源基因和包装信号的共引入病毒所需的结构基因。因此，所产生的病毒粒子并不能够产生额外病毒。

反转录病毒载体也可通过DNA病毒引入，此允许一个反转录病毒复制循环且放大转染效率(参见PCT公开案第WO 95/22617号、第WO 95/26411号、第WO 96/39036号和第WO 97/19182号)。

慢病毒载体。在本发明的另一实施例中，慢病毒载体可用作在包括大脑、视网膜、肌肉、肝和血液的若干组织类型中直接传递和持续表达转基因的试剂。所述载体可有效转导这些组织中的***和非***细胞，且实现相关基因的长期表达。关于评论，参见纳尔蒂尼(Naldini)，当代理论生物技术(Curr.Opin.Biotechnol.)，1998，9：457-63；也参见佐福里(Zufferey)等人，病毒学杂志(J.Virol.)，1998，72：9873-80。可获得慢病毒包装细胞系且通常在所属领域中已知。其促进用于基因治疗的高效价慢病毒载体的产生。一实例为四环素可诱导的VSV-G假型慢病毒包装细胞系，其可产生效价大于106IU/mL的病毒粒子历时至少3至4天(凯夫里(Kafri)等人，病毒学杂志(J.Virol.)，1999，73：576-584)。由可诱导的细胞系产生的载体可按活体外和活体内有效转导非***细胞的需要来浓缩。

非病毒载体。在本发明的另一实施例中，载体可通过以裸DNA形式的脂质转染或用其它转染促进剂(肽、聚合物等)在活体内引入。合成阳离子脂质可用于制备活体内转染编码标记的基因的脂质体(费尔那(Felgner)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，1987，84：7413-7417；费尔那(Felgner)和林古德(Ringold)，科学(Science)，1989，337：387-388；参见Mackey，等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，1988，85：8027-8031；乌尔默(Ulmer)等人，科学(Science)，1993，259：1745-1748)。用于转移核酸的适用脂质化合物和组合物在PCT专利公开案第WO95/18863号和第WO 96/17823号和美国专利第5,459,127号中描述。脂质可出于靶向的目的与其它分子化学偶合(参见马吉(Mackey)等人，见上)。例如激素或神经传递质和诸如抗体的蛋白质的目标肽或非肽分子可与脂质体化学偶合。

其它分子也适用于促进核酸的活体内转染，诸如阳离子寡肽(例如PCT专利公开案第WO 95/21931号)、来源于DNA结合蛋白的肽(例如PCT专利公开案第WO 96/25508号)或阳离子聚合物(例如PCT专利公开案第WO 95/21931号)。

也有可能以裸DNA质粒形式活体内引入载体。用于疫苗目的或基因治疗的裸DNA载体可通过所属领域中已知的方法引入所需宿主细胞中，所述方法例如电穿孔、微量注射、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、使用基因枪或使用DNA载体转运体(例如，吴(Wu)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem).，1992，267：963-967；吴(Wu)和吴(Wu)，生物化学杂志(J.Biol.Chem)，1988，263：14621-14624；加拿大专利申请案第2,012,311号；威廉姆斯(Williams)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，1991，88：2726-2730)。也可使用受体介导的DNA传递方法(库里尔(Curiel)等人，人类基因理论(Hum.Gene Ther.)，1992，3：147-154；吴(Wu)和吴(Wu)，生物化学杂志(J.Biol.Chem)。，1987，262：4429-4432)。美国专利第5,580,859号和第5,589,466号揭示在哺乳动物体内在无转染促进剂情况下外源DNA序列的传递。最近，已描述称为电转染的相对低压高效的活体内DNA转移技术(米尔(Mir)等人，苏联科学院(C.P.Acad.Sci.)，1988，321：893；PCT公开案第WO 99/01157号；第WO 99/01158号；第WO 99/01175号)。因此，本发明的其它实施例涉及一种诱发人类体内的免疫反应的方法，其包含向所述人类投与适量编码本发明的2086多肽的DNA分子，任选连同转染促进剂，其中所述多肽在表达时保留免疫原性且在并入免疫原性组合物中且投与人类时提供保护而在随后用奈瑟菌属病原体(诸如脑膜炎奈瑟菌)感染人类后不诱发疾病增强。转染促进剂在所属领域中已知且包括布比卡因(bupivicaine)和其它局部麻醉剂(例如参见美国专利第5,739,118号)和阳离子多元胺(如在国际专利申请案WO 96/10038中所公开)，所述专利以引用的方式并入本文中。

本发明也涉及对如上所述的2086多肽具有特异性的抗体，其可为单克隆或多克隆抗体。所述抗体可通过所属领域的技术人员众所周知的方法产生。

细菌表达***和质粒

本发明也提供一种重组DNA分子，诸如载体或质粒，其包含具有启动子序列和起始子序列的表达控制序列和编码本发明的多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列位于启动子和起始子序列的3′端。在另一方面中，本发明提供一种能够表达2086多肽的重组DNA克隆载体，其包含具有启动子序列和起始子序列的表达控制序列和编码2086多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列位于启动子和起始子序列的3′端。在另一方面中，提供一种含有如上所述的重组DNA克降载体和/或重组DNA分子的宿主细胞。合适的表达控制序列和宿主细胞/克隆载体组合在所属领域中众所周知，且例如在萨姆布鲁克(Sambrook)等人(1989)中描述。

在表达本发明的所需多肽的重组DNA克隆载体和/或宿主细胞通过用含有相应2086聚核苷酸的质粒转化、转染或感染所述克隆载体或宿主细胞来建构后，在表达多肽的条件下培养克降载体或宿主细胞。接着通过所属领域的技术人员众所周知的技术分离实质上不含污染宿主细胞组份的多肽。

本发明包括以下实例以证明本发明的优选实施例。所属领域的技术人员应了解，以下实例中所揭示的技术代表发明者所发现在实施本发明时运作良好的技术，且因此可视作构成用于其实施的优选方式。然而，鉴于本发明的揭示内容，所属领域的技术人员应了解可在不悖离本发明的精神和范围情况下在所揭示的特定实施例中作出许多改变且仍然获得类似或相似结果。

实例

实例1

能够激发抵抗异源菌株的杀菌性抗体的奈瑟菌膜蛋白提取物的鉴别：

参看下表II，已展示LOS(脂寡糖)空乏的外膜蛋白制剂激发杀菌性抗体。这些抗体常常针对各别菌株的PorA。来自血清群B脑膜炎球菌菌株8529(B：15：P1.7b，3)的LOS空乏外膜制剂在此方式中非比寻常，因为其出乎意料地激发针对若干异源菌株的杀菌性抗体。

表格II

抵抗脑膜炎奈瑟菌的不同菌株的抗SOMP的BC活性

为促进负责激发异源杀菌性抗体的抗原的分离和表征，吾人设法鉴别何种清洁剂最优地提取抗原。

菌株和培养条件

将来自冷冻小瓶的脑膜炎奈瑟菌菌株8529于GC盘上划线。(所述脑膜炎球菌菌株8529来源于The RIVM(比尔特芬，荷兰(Bilthoven，The Netherlands))。将所述盘于36℃/5％CO₂下培养7.5h。使用若干菌落接种于含有50mL改良福朗茨(Frantz)培养基+GC补充剂的烧瓶中。将所述烧瓶于36℃下于空气震荡器中培养且以200RPM搅拌4.5h。使用5mL接种于含有450mL改良福朗茨培养基+GC补充剂的费氏烧瓶(Fernbachflask)中。将所述烧瓶于36℃下于空气震荡器中培养且以100RPM搅拌11h。使用全部450mL接种于10L发酵槽中的8.5L改良福朗茨培养基+GC补充剂中。

改良福朗茨培养基的组成：

谷氨酸                1.3g/L

半胱氨酸              0.02

磷酸氢二钠，7水合物   10

氯化钾                0.09

氯化钠                6

氯化铵                1.25

透析酵母提取物(YE)    40ml

(25％YE溶液相对于5体积的dH₂O透析过夜，接着高压釜处理)

GC补充剂100×，过滤器灭菌

右旋糖                400g/L

谷氨酸                10

辅羧化酶              0.02

硝酸铁                0.5

在发酵期间控制以下参数：温度＝36℃；pH＝7.4；溶解氧＝20％。添加若干滴P-2000消泡剂以控制发泡。使培养物生长至稳定期。在OD650＝5.25时通过离心收获细胞。通常自约8.5L培养物收获总共100-300克湿细胞糊状物。

来自激发异源杀菌性抗体的脑膜炎球菌的外膜蛋白部分(fraction)的部分纯化：

将100gms湿重的细胞悬浮于五倍湿重体积中(含有10mM HEPES-NaOH(pH 7.4)、1mM Na2EDTA)且通过于约18,000psi下流过装备有腔室的110Y流化床装置来溶胞。使细胞溶菌液澄清且通过于10℃下以300,000×g离心1小时来分离细胞包膜。通过用均质器悬浮，接着如上离心来用相同缓冲液将细胞包膜洗涤2次。接着用320mL于10mMHEPES-NaOH(pH 7.4)、1mM MgCl₂中的1％(w/v)曲通(Triton)X-100提取细胞包膜。参看下表III，使用曲通X-100和两性洗涤剂(Zwittergent)3-14连续差示清洁剂提取，接着免疫小鼠，允许吾人判定曲通提取物最优地提取相关候选物。接着通过在BioRadRotophor装置中的制备型等电点聚焦(IEF)来将激发抵抗表III中所列的5种菌株中的4种的杀菌性抗体反应的此曲通X-100提取物分级分离。两性电解质浓度为与1％pH 4-6混合的1％pH 3-10。如表III中所示，发现若干部分激发异源杀菌性反应。如杀菌检定所测定，集中于5.5-7.8的pH值范围内的自IEF获得的部份激发对大多数菌株的异源性反应。浓缩汇集的IEF部份且通过乙醇沉淀移除两性电解质。通过使在约5.5-7.8的pH值范围内获得的一些蛋白吸附于阴离子交换柱上且比较用已吸附和未吸附的蛋白免疫小鼠后获得的杀菌活性来达成进一步纯化。再次参看表II，虽然许多蛋白吸附于阴离子交换树脂上，但未由管柱吸附的蛋白激发更多异源杀菌性抗体。

表III

NT：未测试

^*临床分离株539为8529的同源菌株，自相同大量繁殖中分离

如图1A中所示，如通过SDS-PAGE所测定，两种主要蛋白质存在于未吸附部分中。为鉴别这些蛋白质，执行两种类型的分析。一种分析为执行有限蛋白水解降解(参见图1A和图1B)，接着分离肽且直接进行蛋白质测序。另一种分析为执行SDS-PAGE，接着凝胶切取、蛋白水解消化和LC-MS/MS(液体色谱联合质谱法)，(参见图3)以获得关于相关制剂的组份的质谱信息。(参见本节中随后描述的肽定位和测序方法)。

使用捷库尔斯基(Zagursky)和拉塞尔(Russell)，2001，生物技术(BioTechniques)，31：636-659中所描述的方法和算法分析脑膜炎奈瑟菌A桑格(Sanger)基因组序列。此挖掘分析产生超过12,000个可能开放阅读框架(ORF)。上文所述的直接序列数据和质谱数据两者表明未吸附部分的主要组份为存在于桑格数据库的分析中的若干ORF的产物。由此方法鉴别的三种主要蛋白质对应于ORF 4431、5163和2086(参见图1B和3)。

尽管ORF 4431为部分中所鉴别出的最主要蛋白质，但针对重组脂质化4431的小鼠抗体不具有杀菌性且在动物模型中不提供保护反应。正进行ORF 5163的另一分析。

本文中所述的制剂的第二最主要组份对应于ORF 2086的产物。

免疫原性方法：

抗血清的制备：

除有注释外，将蛋白质组合物/疫苗以25μg总蛋白质调配且用20μgQS-21作佐剂。在第0周和4周通过皮下(臀部)注射将0.2mL剂量投与6-8周龄雌性瑞士-维博斯特(Swiss-Webster)小鼠。在第0周和4周收集血液，且在第6周执行最后放血。

杀菌性检定：

基本上如所描述执行杀菌性检定(参见蒙特乌罗斯(Mountzouros)和豪维尔(Howell)，2000，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)38(8)：2878-2884)。将SBA的补体介导的抗体依赖性杀菌效价表示为杀死≥50％引入检定中的目标细胞的测试血清的最高稀释度的倒数(BC₅₀效价)。

用于鉴别2086蛋白的方法：

片段的溴化氰裂解和直接测序：

阴离子交换未吸附部分(AEUF)的溴化氰裂解。用90％冷乙醇使AEUF沉淀且用于70％甲酸中的10mg/mL溴化氰将其溶解至1mg/mL的蛋白质浓度。于室温下在黑暗中执行反应过夜。通过快速真空干燥裂解产物，且用HE/0.1％还原TX-100溶解小球。使用SDS-PAGE，接着N末端氨基酸测序鉴别此部分的组份。

用于鉴别组份的蛋白酶消化/逆相/N末端测序：

用GluC(V8)、LysC或ArgC消化AEUF。蛋白质与酶的比率为30μg蛋白质比1μg酶。于37℃下进行消化过夜。使消化的蛋白质混合物(30μg)通过七微米橡胶多孔管(Aquapore)RF-300管柱且用10-95％乙腈于0.1％三氟乙酸中的梯度洗脱，且手动收集峰。也使无蛋白质空白通过管柱，且自样品色谱图减去来自此空白的峰。通过质谱仪分析仅发生在样品过柱时的峰，且分析那些产生纯质量的样品以用于N末端氨基酸测序。

N末端氨基酸测序：

对于自印迹切取的谱带来说，将蛋白质样品自SDS凝胶转移至PVDF膜，用酰胺黑(Amido Black)(于去离子水中的10％乙酸、0.1％酰胺黑)染色且于10％乙酸中脱色。接着使用甲醇清洗的小刀或迷你爱山吐(Exacto)刀自所有十条泳道切取所需蛋白质谱带且将其置于应用生物***(Applied Biosystems)477A蛋白质测序仪的反应滤筒中。对于溶液中样品的直接测序来说，组装预吸附硅胶干燥剂(Prosorb)滤筒且用60μL甲醇湿润PVDF。用50μL去离子水冲洗PVDF且将样品(50μL)装载于PVDF上。使用50μL去离子水冲洗样品后，将预吸附硅胶干燥剂(Prosorb)PVDF打孔，干燥，且置于应用生物***(Applied Biosystems)477A蛋白质测序仪的反应滤筒中。对于两种方法来说，随后在最优印迹条件下使应用生物***(Applied Biosystems)N末端测序仪运作12个或更多个循环(1个循环空白、1个循环标准，且所需残基鉴别为10个或更多个循环)且于应用生物***(Applied Biosystems)120A PTH分析器上进行PTH-氨基酸检测。于模拟图表记录器上和用数字方法经由仪器软件收集所述循环。使用模拟和数字数据，通过比较PTH-氨基酸的标准组和其于分析器上的各别滞留时间来进行氨基酸指定(半胱氨酸残基在转化期间被破坏且未检测到)。可自单一残基获得多个序列信息且基于信号强度得到一级指定对比二级指定。

LC-MS/MS

通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步分析以IEF纯化的蛋白质样品。通过库马斯蓝(Coomaasie blue)染色观察蛋白质，且手动切取相关谱带，接着将其还原、烷基化和使用自动凝胶内胰蛋白酶消化自动仪器(1)用胰蛋白酶(普洛麦加，麦迪逊，威斯康新(Promega，Madison，WI))原位消化。消化后，使用专家快速真空(Savant Speed Vac)浓缩器(特默研究公司，霍德布鲁克，纽约(ThermoQuest，Holdbrook，NY))将肽提取物浓缩至10-20μL的最终体积。

于自动微电喷逆相HPLC上分析肽提取物。简单地说，微电喷界面由Picofrit熔融二氧化硅喷雾针组成，其长度为50cm、ID为75μm、孔口直径为8μm(新目标公司，剑桥，马萨诸塞(New Objective，Cambridge MA))，装有10μm长度为10cm的C18逆相珠粒(YMC公司，威尔明顿，北卡罗莱纳(YMC，Wilmington，NC))。将Picofrit针安装于固持于自制基座上的光纤固持器(美莱斯格略特公司，欧文，加利福利亚(Melles Griot，Irvine，CA))中，所述自制基座定位于质谱仪检测器前方。经由钛接头将管柱的后部垂直以向电喷界面供应电连接。所述接头与管接于连接于HPLC溶剂泵(ABI 140C，帕金埃尔默，诺沃克，康涅狄格(Perkin-Elmer，Norwalk，CT))的FAMOS自动取样器(LC包装公司，旧金山，加利福利亚(LC-Packings，San Francisco，CA))的一段熔融二氧化硅毛细管(FSC)连接。HPLC溶剂泵传递50μL/min的流量，使用PEEK微量紧致套管(PEEK microtight)对开三通(splitting tee)(楚柏科学公司，橡树港，华盛顿州(UpchurchScientific，Oak Harbor，WA))将其降低至250nL/min，且接着使用FSC输送管传递至自动取样器。LC泵和自动取样器各自使用其内部使用者程序来控制。将样品***塑料自动取样器小瓶中，密封，且使用5μL样品环管注射。

微毛细管HPLC-质谱法：

通过微电喷HPLC***，使用0-50％溶剂B(A：0.1M HoAc，B：90％MeCN/0.1MHoAc)的50分钟梯度分离自凝胶内消化液提取的肽。在于1.5kV的喷雾电压下操作且使用150℃的加热毛细管温度的芬宁安LCQ(Finnigan LCQ)离子阱质谱仪(特默研究公司，圣何塞，加利福利亚(ThermoQuest，San Jose，CA))上进行肽分析。使用与仪器一起提供的数据采集软件以自动MS/MS方式获得数据。获取方法包括1MS扫描(375-1200m/z)，接着MS扫描中最丰富3种离子的MS/MS扫描。利用动态排除和同位素排除功能增加所分析的肽离子的数目(设置：3amu＝排除宽度，3min＝排除持续时间，30秒＝预排除持续时间，3amu＝同位素排除宽度)。使用SEQUEST计算机算法合并使用来源于脑膜炎奈瑟菌(来自桑格)的完整基因组的蛋白质数据库的芬宁安生物研究(Finnigan Bioworks)数据分析包(特默研究公司，圣何塞，加利福利亚(ThermoQuest，SanJose，CA))执行MS/MS数据的自动分析。研究的结果在图3中说明。

实例2

重组脂质化P2086(RLP2086)的克隆：

A.)原生前导序列：

源材料：

通过PCR，自称为8529的血清群B脑膜炎奈瑟菌菌株的临床分离株扩增ORF 2086基因。此菌株的血清群、血清型和血清亚型以括号展示；8529(B：15，P1：7b，3)。此脑膜炎球菌菌株来源于The RIVM(比尔特芬，荷兰(Bilthoven，The Netherlands)。

PCR扩增和克隆策略：

ORF 2086的目测检查表明此基因具有潜在脂蛋白信号序列。使用专属隐马尔可夫模型(Hidden Markov Model)脂蛋白算法的其它分析证实ORF 2086含有脂蛋白信号序列。为以更类似原生构形重组表达P2086，寡核苷酸引物经设计以扩增脂蛋白信号序列完好的全长基因且基于对脑膜炎奈瑟菌A ORF 2086的桑格序列分析。通过聚合酶链反应(PCR)[ABI 2400热循环仪，应用生物***(Applied Biosystems)，福斯特市，加利福利亚(Foster City，CA)]自脑膜炎奈瑟菌菌株8529扩增2086基因。将正确尺寸扩增产物接合且克隆至pCR2.1-TOPO(体外基因公司(Invitrogen))中。将质粒DNA用NdeI和BamHI限制性消化，凝胶纯化且接合至pET-27b(+)载体(新基因公司(Novagen))中。

本文中所述的寡核苷酸引物于PerSeptive生物***寡核苷酸合成器(应用生物***(Applied Biosystems)，福斯特市，加利福利亚(Foster City，CA))上使用β-氰基乙基胺基磷酸酯化学(应用生物***(Applied Biosystems)，福斯特市，加利福利亚(Foster City，CA))合成。

利用原生前导序列的rLP2086脂蛋白表达：

参看图5，将质粒pPX7340转化/转染或感染至BLR(DE3)pLysS宿主细胞(生命科学公司(Life Sciences))中。选择一种转化子且将其接种于50mL含有2％葡萄糖、卡那霉素(kanamycin)(30μg/mL)、氯霉素(30μg/mL)和四环素(12μg/mL)的极品(Terrific)肉汤中。过夜培养物的OD600为6.0。将过夜培养物于1公升具有1％甘油和相同抗生素的极品肉汤中稀释。起始OD600为0.4。2小时后，OD600为1.6且收集预诱导样品。将等于OD600＝1的细胞离心且移除上清液。将全细胞小球再悬浮于150μL Tris-EDTA缓冲液和150μL 2×SDS-PAGE样品缓冲液中。添加IPTG至1mM的最终浓度。3.5小时后，如所描述收集诱导后样品且于SDS-PAGE上进行分析(参见图4)。

rLP2086的纯化：

在差示清洁剂提取后溶解来自大肠杆菌的rLP2086。不同于在其原生环境中的P2086，rLP2086并不由曲通X-100或两性洗涤剂3-12显著溶解。用十二烷基肌氨酸钠溶解大部分rLP2086，表明其与大肠杆菌的外膜组份相互作用，此与其在脑膜炎奈瑟菌中不同。溶解后，类似于原生蛋白质来纯化rLP2086，因为许多污染大肠杆菌蛋白质可通过于pH 8下吸附于阴离子交换树脂而移除。尽管高于其理论pI大于半个pH值单位，但在pH 8时rLP2086仍未吸附。通过于pH 4.5下使rLP2086吸附于阳离子交换树脂来达成进一步纯化。

SDS-PAGE后，rLP2086的均质性在图2中展示。rLP2086的质量通过MALDI-TOF质谱分析测定为27,836。此质量与理论质量27,100相差736，此接近细菌脂蛋白共有的N末端脂质修饰的质量。原生和rLP2086两者似乎均为外膜脂蛋白。用N末端测序的尝试受阻且此与末端修饰一致。

纯化方法：

将表达P2086的BLR DE3 pLysS细胞的冷冻小球以20mL/g湿细胞重量再悬浮于10mM HEPES-NaOH/1mM EDTA/1μg/mL Pefabloc SC蛋白酶抑制剂(罗氏公司(Roche))pH 7.4(HEP)中且通过流化床装置(微流体公司(Microfluidics Corporation)110Y型)溶胞。将细胞溶菌液以150,000×g离心1小时。将离心块用HEP洗涤两次且离心两次，且将所得膜离心块冷冻过夜。将离心块用10mM HEPES-NaOH/1mM MgCl₂/1％TX-100pH 7.4溶解30分钟，接着以150,000×g离心30分钟。将此举重复三次。膜离心块如上用50mM Tris-HCl/5mM EDTA/1％两性洗涤剂3-12pH 8洗涤两次，接着分别用50mMTris-HCl/5mM EDTA/1％两性洗涤剂3-14pH 8和50mM Tris-HCl/5mM EDTA/1％两性洗涤剂3-14/0.5M NaCl pH 8洗涤两次。

接着用50mM Tris-HCl/5mM EDTA/1％十二烷基肌氨酸钠溶解rLP2086。将此十二烷基肌氨酸钠提取物调整至1％两性洗涤剂3-14(Z3-14)且以30倍过量的50mMTris-HCl/5mM EDTA/1％Z3-14透析两次。用90％乙醇使透析的rLP2086提取物沉淀以移除残余十二烷基肌氨酸钠，且用50mM Tris-HCl/5mM EDTA/1％Z3-14pH 8(TEZ)溶解。通过离心移除不可溶物质，使上清液通过阴离子交换色谱管柱，且于未结合的洗脱份中收集rLP2086。接着将未结合的物质相对于30倍过量的25mM NaAc/1％Z3-14pH4.5透析两次，且通过阳离子交换色谱管柱。将rLP2086用0-0.3M NaCl梯度洗脱且通过SDS-PAGE(库马斯染色)分析。通过激光密度测定法测定rLP2086混合物纯度为84％。

rLP2086亚族B的抗血清的表面反应性和杀菌活性。

参看表VII，来自亚族B菌株8529的经纯化rLP2086的抗血清通过全细胞ELISA测试证明对所有十种2086亚族B菌株的表面反应性。检测到抵抗表达异源性血清亚型抗原PorA的十种2086亚族B菌株中的九种的杀菌活性。这些菌株代表引起整个西欧、美洲、澳大利亚和新西兰的血清群B脑膜炎球菌疾病的菌株。在杀菌性检定中唯一未杀死的菌株870227通过全细胞ELISA与抗rLP2086(亚族B)血清强烈地反应，表明此菌株表达具有与P2086共有的抗原决定基的蛋白质。

也通过全细胞ELISA测试表VII中所列的2086亚族A菌株的表面反应性。三种这些菌株中的两种似乎具有极低程度的反应性，此表明一些2086亚族A菌株可能不与抗rLP2086亚族B的抗体交叉反应。也对菌株870446、NMB和6557执行用于鉴别来自菌株8529的2086亚族B基因的PCR扩增程序。未检测到2086亚族B PCR扩增产物。

免疫原性方法：

抗血清的制备：

如先前实例1中所述调配疫苗。然而，使用10μg剂量。

全细胞酶联免疫吸附检定(ELISA)：

将脑膜炎奈瑟菌全细胞悬浮液于无菌0.01M磷酸盐、0.137M NaCl、0.002M KCl(PBS)中稀释至于620nm下0.1的光学密度。自此悬浮液，将0.1mL添加至Nunc Bac T96孔盘(目录#2-69620)的各孔中。于室温下将细胞于盘上干燥三天，接着盖上盖子，倒置且储存于4℃下。用洗涤缓冲液(0.01M Tris-HCl、0.139M NaCl/KCl、0.1％十二烷基聚(氧乙烯二醇醚)_nn＝23(Brij-

可得自ICI美洲有限公司，威尔明顿，特拉华(ICIAmericas，Inc.，Wilmington，Delaware))，pH 7.0-7.4)将盘洗涤三次。于PBS、0.05％吐温-20/叠氮化合物中制备抗血清的稀释液且将0.1mL转移至经涂覆盘中。将盘于37℃下培养两小时。将盘于洗涤缓冲液中洗涤三次。将山羊-抗小鼠IgG AP(南方生物技术公司(Southern Biotech))以1∶1500稀释于PBS/0.05％吐温-20中，将0.1mL添加至各孔中，且将盘于37℃下培养两小时。(如上)洗涤盘。通过将磷酸对硝基苯酯(西格马公司(Sigma))于1M二乙醇胺/0.5mM MgCl₂中稀释至1mg/mL来制备底物溶液。将底物以每孔0.1mL添加至盘中且于室温下培养一小时。用每孔50μL的3N NaOH停止反应且以690nm作为参考于405nm下读盘。

B)P4前导序列：

PCR扩增和克隆策略：

为最优化rLP2086表达，将2086基因克隆在未分型流感嗜血杆菌的P4信号序列后(格林(Green)等人，1991)。用于脂蛋白克隆的引物列于表IV中且通过以下化合物编号来鉴别：5658、5660、6473、6543和6385。使用具有以下化合物编号5658和5660的引物自脑膜炎奈瑟菌B菌株8529扩增ORF 2086。使用具有以下化合物编号6385和5660的引物自脑膜炎奈瑟菌血清群B菌株CDC1573扩增ORF 2086。使用具有以下化合物编号6473和6543的引物自脑膜炎奈瑟菌血清群B菌株2996扩增ORF 2086。N末端(5′)引物经设计以与2086基因的成熟区(起始于氨基酸位置3处的丝氨酸残基，刚好位于半胱氨酸下游)同源。将限制性位点BamHI(GGATTC)并入各N末端引物的5′末端且使甘氨酸残基***成熟蛋白质的氨基酸位置2中。C末端(3′)引物经设计以与2086基因的C末端同源且包括终止密码子以及用于克隆目的的SphI位点。将自各脑膜炎奈瑟菌B菌株扩增的片段克隆至中间载体中且通过序列分析筛选。

将来自合适克隆的质粒DNA用BamHI和SphI限制酶(新英格兰生物实验室(NewEngland Biolabs)(NEB))消化。选择称为pLP339的载体(由申请案的受让人供应)作为表达载体。此载体利用pBAD18-Cm主链(贝克维奇(Beckwith)等人，1995)且含有未分型流感嗜血杆菌(格林(Green)等人，1991)的P4脂蛋白信号序列和P4基因。将pLP339载体用限制酶BamHI部分消化且接着经受SphI消化。将扩增的2086片段(BamHI/SphI)各自分别接合至pLP339载体(部分BamHI/SphI)。这一克隆策略将成熟2086基因置于P4脂蛋白信号序列后。BamHI位点保留在P4信号序列与2086基因之间的克降接合点处(参见图7中所示的质粒构筑体)。以下为BamHI克隆接合点处序列的一实例：

[P4信号序列]-TGT GGA TCC-[保留2086成熟核酸序列]

[P4信号序列]-Cys Gly Ser-[保留2086成熟核酸序列]

参看图7，将各扩增片段克隆至含有P4前导序列的经修饰pBAD18-Cm载体中。对表达rP4LP2086(重组P4脂质化2086)的重组大肠杆菌BLR pPX7343执行发酵以试图通过添加额外葡萄糖来增加细胞密度。根据萨姆布鲁克(Sambrook)，将发酵槽填充10L补充有1％葡萄糖的完全M9基本培养基。

发酵槽中葡萄糖的初始浓度为45g/L。将发酵槽接种至约0.25的初始OD。约OD 25时，再添加20g/L葡萄糖。在OD 63.4时葡萄糖耗尽时用1％***糖诱导培养物。继续发酵直至诱导后3小时。在诱导后t＝0、1、2、3时保存样品且使用BSA量化蛋白质。t＝3时，蛋白质产量为约0.35g/L，和7％总细胞蛋白质。自约10L培养物收获总共895克湿细胞糊状物。

使用与上文实例2、A小节中所述相同的方法执行rP4LP2086的纯化。

本文中所述的寡核苷酸引物于PerSeptive生物***寡核苷酸合成器(应用生物***(Applied Biosystems)，福斯特市，加利福利亚(Foster City，CA))上使用β-氰基乙基胺基磷酸酯化学(应用生物***(Applied Biosystems)，福斯特市，加利福利亚(Foster City，CA))合成。用于PCR扩增ORF 2086基因家族的引物列于表IV中，所述表展示本发明的引物的非限制性实例。

表IV

引物

化合物编号	引物	限制性位点
			4623	反向	BamHI
4624	正向	NdeI
			4625	正向
5005	正向
			5007	反向
5135	反向	BglII
			5658	正向	BamHI
5660	反向	SphI
			6385	正向	BamHI
6406	正向	BglII和NdeI
			6470	正向
6472	反向
			6473	正向	BamHI
6474	正向	BglII和NdeI
			6495	正向
6496	反向
			6543	反向	SphI
6605	反向	BglII
			6721	正向	BglII和NdeI

实例3

非脂质化成熟2086蛋白的发育遗传学：

为进一步评估2086蛋白的免疫原性，执行非脂质化形式的P2086的克隆和表达。

ORF 2086的PCR基因扩增：

来自各种染色的2086基因可用如PCT/US02/32369(于2003年8月7日以WO03/063766公开)和PCT/US04/11901(于2004年11月4日以WO 04/094596公开)中所述的引物来扩增。

这些引物的特征包括各引物中的合成BglII限制性位点、化合物编号6406和6474中的合成NdeI限制性位点和存在于化合物编号5135和6605中的所有三种阅读框架中的终止密码子。引物编号6406和6474扩增具有与第二胺基末端密码子(ACG)融合的ATG(Met)的2086基因，此表示成熟2086多肽的单一氨基酸取代(置换TGC Cys)。

PCR克隆载体为TOPO-PCR2.1，体外基因公司(Invitrogen)，巴伦西亚，加利福利亚(Valencia，CA)。

用于表达非脂质化2086蛋白的载体为来自新基因公司(Novagen)，麦迪逊，威斯康新(Madison，WI)的pET9a。

大肠杆菌克隆菌株为Top10，体外基因公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，加利福利亚(Carlsbad，CA)。

大肠杆菌表达菌株为BLR(DE3)pLysS，新基因公司(Novagen)，麦迪逊，威斯康新(Madison，WI)。

用于克隆目的的培养基为根据萨姆布鲁克(Sambrook)等人的具有1％取代甘油的无菌葡萄糖和适当抗生素(胺苄西林或卡那霉素)的极品肉汤液体或琼脂。

质粒纯化用Qiagen Spin小规模纯化试剂盒(巴伦西亚，加利福利亚(Valencia，CA))进行。

用于非脂质化2086表达的产物菌株或细胞系的制备：

通过聚合酶链反应(PCR)[AmpliTaq和ABI 2400热循环仪，应用生物***(AppliedBiosystems)，福斯特市，加利福利亚(Foster City，CA)]自来源于脑膜炎球菌菌株8529的染色体DNA扩增2086基因。2086基因的PCR扩增在由化合物编号6474和5135鉴别的各反应中利用两种寡核苷酸引物。将扩增的2086PCR产物直接克隆至TOPO-PCR2.1克降载体中且于补充有100μg/ml胺苄西林和20μg/ml X-Gal的极品肉汤琼脂上选择。选择白色菌落且使其生长。使用Qiagen小规模纯化试剂盒制备质粒DNA且针对PCR片段***筛选质粒。使PCR***质粒经受DNA测序(大染料化学(Big Dye chemistry)于ABI377测序仪上，应用生物***(Applied Biosystems)，福斯特市，加利福利亚(FosterCity，CA))。

将展现正确DNA序列的质粒用BglII限制酶消化且使用基因清除(GeneClean)II纯化试剂盒(Biol01，卡尔斯巴德，加利福利亚(Carlsbad，CA))将BglII片段凝胶纯化。将经纯化的BglII片段克隆至表达载体pET9a的BamHI位点。于补充有30μg/ml卡那霉素的极品肉汤盘上选择pET9a/2086克隆。使卡那霉素抗性克隆生长且制备小规模纯化质粒DNA。针对2086基因在BamHI位点处的适当取向筛选质粒。取向正确的质粒表示T7-抗原与2086基因的胺基末端融合(rP2086T7)。将这些rP2086T7基因融合体转化至BLR(DE3)pLysS中，于极品肉汤/Kan盘上选择，于极品肉汤中生长且用1mM IPTG(异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导表达rP2086T7融合蛋白。rP2086T7融合蛋白以高含量表达。

接着使这些融合质粒经受NdeI限制消化，此删去T7-抗原且将成熟2086基因直接连接于由载体提供的ATG起点。将这些NdeI缺失质粒转化至Top10细胞中且于极品肉汤/Kan盘上选择。使候选物克隆生长且制备小规模纯化质粒DNA。使质粒DNA经受DNA测序以证实2086基因序列的缺失和完整性。这些质粒由称为pPX7328的质粒图表示(图6)。将表示正确DNA序列的质粒转化至BLR(DE3)pLysS中，于极品肉汤/Kan盘上选择，于极品肉汤中生长且用IPTG诱导表达2086蛋白。当移除T7标签后，pET9a载体未能表达菌株BLR(DE3)pLysS中的成熟2086蛋白。

非脂质化2086蛋白的产生：

经纯化的质粒DNA用于使表达菌株BLR(DE3)pLysS转化。带有质粒的BLR(DE3)pLysS细胞对卡那霉素有抗性且可通过添加1mM IPTG而诱导表达高含量PorA蛋白。rP2086T7融合蛋白可在大肠杆菌细胞系BLR(DE3)pLysS中以约40％的总蛋白质表达为不可溶包涵体。此经纯化融合蛋白用于免疫小鼠且产生显著含量的抵抗异源性脑膜炎球菌菌株的杀菌性抗体。(参见表V)

2086非脂质化基因突变诱发：

对2086基因的5′末端执行PCR引物突变诱发。表达研究正在进行以判定是否可移除T7标签，同时展现成熟rP2086T7的高表达量。

非脂质化rP2086T7的纯化：

通过流化床装置以10mM Hepes-NaOH/5mM EDTA/1mM Pefabloc SC pH 7.4使表达非脂质化rP2086T7的大肠杆菌BLR(DE3)pLysS细胞溶胞。接着将细胞溶菌液以18,000×g离心30分钟。将包涵体离心块用50mM Tris-HCl/5mM EDTA/1％曲通X-100pH8洗涤三次，接着每次以24,000×g离心30min。接着将包涵体离心块用50mM Tris-HCl/5mM EDTA/1％两性洗涤剂3-14pH 8洗涤两次，接着每次以24,000×g离心15min。接着用50mM Tris-HCl/5mM EDTA/4M尿素pH 8溶解包涵体离心块历时两小时，接着离心以移除不可溶物质。将上清液(溶解的rP2086T7)分成四个相等样品。使用储备溶液将一个样品调整至50mM Tris-HCl/5mM EDTA/250mM NaCl/2M尿素pH 8(无清洁剂)，一个调整至50mM Tris-HCl/5mM EDTA/250mM NaCl/2M尿素/1％氢化曲通X-100pH 8(TX-100)，一个调整至50mM Tris-HCl/5mM EDTA/250mM NaCl/2M尿素/1％两性洗涤剂3-12pH 8(Z3-12)，且一个调整至50mM Tris-HCl/5mM EDTA/250mM NaCl/2M尿素/1％两性洗涤剂3-14pH 8(Z3-14)。为移除尿素，将样品以不含尿素的各别缓冲液彻底透析。接着将样品以不含尿素和60mM NaCl的各别缓冲液彻底透析以降低NaCl浓度。以2,000×g离心15分钟来移除不可溶物质，且使用所得上清液(再折叠的rP2086T7)作其它实验。发现如使用库马斯染色SDS-PAGE和激光密度测定法所测定，rP2086T7的均质性为91-95％。

免疫原性程序-如实例2中所述

此经纯化融合蛋白用于免疫小鼠且产生显著含量的抵抗异源性脑膜炎球菌菌株的杀菌性抗体。(参见下表V)：

表V

抗rP2086T7的小鼠抗体的杀菌性效价

小鼠血清	描述	异源菌株/H44/76
			第6周AF780	r2086T7，10μg	3200
第0周混合物	预免疫血清	10
			第6周AE203	rLP2086，10μg(阳性对照)*	6400

(^*阳性对照血清由用rLP2086免疫小鼠而产生)

实例4

ORF 2086的嵌合克隆的发展

来自菌株CDC-1573的2086基因的N末端区域含有不存在于来自菌株8529和2996的2086基因中的重复区段(参见图8)。似乎此重复区段使重组2086蛋白在两种基于大肠杆菌的表达***(pET和pBAD)中的表达量增加。自CDC-15732086基因表达的重组蛋白质的量在pET和pBAD表达***中显著好于自使用相同***的菌株8529和2996的2086基因重组表达的量。来自所有三种菌株的2086基因的N末端区域相对同源，此重复区段除外。因此，合理的假定通过将CDC-1573N末端与来自菌株8529和2996的2086基因融合，当使用pET和pBAD***时自这些基因表达的重组2086蛋白含量将增加。

材料和方法：

将来自菌株8529和2996的染色体DNA纯化且用作PCR扩增嵌合2086基因的模板。具有化合物编号6721和5135的PCR引物用于扩增来自菌株8529的嵌合2086基因且具有化合物编号6721和6605的PCR引物用于扩增来自菌株2996的嵌合2086基因。将PCR产物直接克隆至来自体外基因公司(Invitrogen)的PCR2.1TOPO载体中且接着通过DNA序列分析筛选以鉴别完整嵌合2086基因。接着用BglII将那个基因自PCR2.1载体裂解且将BglII片段***pET9a质粒的BamHI位点中。针对适当取向筛选质粒***物且接着使其经受NdeI消化。线性NdeI片段自体接合以达成含有由pET9a载体提供的T7标签序列的小NdeI片段的删去。此删去直接将T7启动子连接至嵌合2086基因的5′末端。将NdeI缺失质粒转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中且针对用IPTG诱导的嵌合2086蛋白表达筛选卡那霉素抗性菌落。

初始研究表明当在pET9a***中表达时，来自菌株2996的嵌合2086基因表达重组蛋白质为天然2996/2086基因的约两倍。pBAD***尚未测试。

尽管仅执行一个实验，但数据表明存在来自嵌合2086基因的增强效用。与来自菌株8529和2996的2086基因的CDC-1573N末端融合体的产生提供增强的重组2086蛋白表达。

实例5

脑膜炎奈瑟菌菌株的2086PCR筛选：

为测定临床分离株中2086基因的保守性，对88种脑膜炎奈瑟菌菌株执行PCR扩增。

ORF 2086的初始PCR鉴别利用表IV中所列的引物(参见上述实例2)，其由以下化合物编号鉴别：4623、4624和4625。这些引物基于桑格的脑膜炎奈瑟菌血清群A序列而设计。为促进筛选大量菌株，将内部引物设计成2086。通过PCR，用由化合物编号5005和5007识别的新设计的内部2086引物筛选总共88种脑膜炎奈瑟菌菌株。用这些引物，申请者能够鉴别来自88种脑膜炎奈瑟菌菌株中的63种(约70％)的2086基因(参见表VIA)。

检查且比对桑格的脑膜炎奈瑟菌血清群A序列与TIGR的脑膜炎奈瑟菌血清群B序列中的2086基因周围的扩展区。设计引物以对应于2086基因上游和下游的区域。所述目的在于利用这些引物以自多种脑膜炎奈瑟菌菌株扩增大于全长2086基因以作序列比较。使用化合物编号6470和6472进行一种菌株(6557)的PCR扩增，产生低产率的产物。克隆菌株6557扩增产物，且将质粒DNA提交序列分析。结果显示一种具有比先前所见更大序列变异性的新型2086基因。菌株6557的2086基因在氨基酸层面上与其它菌株序列约75％一致。有趣的是，菌株6557为先前通过上文所述的2086PCR筛选测试为阴性的30％菌株之一。

设计对于菌株6557中的C端可变区具有特异性的内部引物。这些引物用于筛选先前通过2086PCR筛选测试为阴性的约30％菌株中更大变异的2086基因。通过PCR使用这些新识别的内部2086引物(由化合物编号6495和6496识别)筛选所有可得的脑膜炎奈瑟菌菌株(n＝88)。在此筛选中，仅先前通过对于2086的PCR测试为阴性的约30％脑膜炎奈瑟菌菌株为PCR阳性。自先前PCR阴性(约30％)菌株扩增的基因组应代表新型2086基因或第二2086基因家族，在本文中称为2086亚族A。用来源于8529的引物自约70％菌株扩增的2086基因组在本文中称为亚族B。

用于PCR扩增研究的脑膜炎奈瑟菌菌株选自下表，表VIA和表VIB。表中所列的菌株提供作为本文先前所揭示者以外的脑膜炎奈瑟菌菌株的实例，但不限于此。表VIA中所列的菌株分类为2086蛋白亚族A，表VIB中所列的菌株分类为2086蛋白亚族B。各表中所列的菌株由血清亚型分组。所述菌株可得自表中所示的以下四个来源：MPHL-曼彻斯特公共健康实验室，曼彻斯特，英国(MPHL-Manchester Public Health Laboratory，Manchester，UK)；RIVM，比尔特芬，荷兰(RIVM，Bilthoven，The Netherlands)；爱俄华大学医学院微生物学系，爱俄华市，爱俄华州(University of Iowa，College of Medicine，Department of Microbiology，Iowa City，IA)；和华特里德军队研究学院，华盛顿特区(Walter Reed Army Institute of Research，Washington，D.C.)。

表VIA

菌株	血清亚型	来源
			M97251854	B：4z，PI：4	MPHL
M98250622	B：2b，PI：10	MPHL
			M98250572	B：2b，PI：10	MPHL
M98250771	B：4z，PI：14	MPHL
			M98250732	B：4z，PI：14	MPHL
M98250809	B：15，PI：7，16	MPHL
			M97252697	B：1，PI：6	MPHL
M97252988	B：4，PI：6	MPHL
			M97252976	B：4，PI：6	MPHL
M97252153	B：4，PI：6	MPHL
			M97253248	B：15，PI：7，NT	MPHL
CDC1610	P1：NT 4(15)	CDC
			CDC1521	P1.6，32b(4)	CDC
CDC1034	P1.74(15)	CDC
			L8	P1.7，115(4)	华特里德(Walter Reed)
CDC1492	P1.7，14(15)	CDC
			870446	P1.12a，13	RIVM
CDC2369	P1.(9)，14	CDC
			6557	P1.(9)，14	RIVM
2996	P1.5，2	RIVM
			NmB	P1.5，2	UIOWA
L3	P1.5，2	华特里德
			B16B6	P1.5，2	RIVM
CDC1135		CDC

菌株	血清亚型	来源
			L5	P1.NT	华特里德
L4	PI.21，16	华特里德

表VIB

菌株	血清亚型	来源
			M98250670	B：1，PI：4	MPHL
M98250024	B：1，PI：4	MPHL
			M97253524	B：1，PI：4	MPHL
M97252060	B：1，PI：4	MPHL
			M97251870	B：4z，PI：4	MPHL
M97251836	B：4z，PI：4	MPHL
			M97251830	B：4z，PI：4	MPHL
M97251905	B：4z，PI：4	MPHL
			M97251898	B：4z，PI：4	MPHL
M97251885	B：4z，PI：4	MPHL
			M97251876	B：4z，PI：4	MPHL
M97251994	B：4z，PI：4	MPHL
			M97251985	B：4z，PI：4	MPHL
M97251957	B：4z，PI：4	MPHL
			M97251926	B：4z，PI：4	MPHL
M97252045	B：4z，PI：4	MPHL
			M97252038	B：4z，PI：4	MPHL
M97252026	B：4z，PI：4	MPHL
			M97252010	B：4z，PI：4	MPHL
M97252098	B：4z，PI：4	MPHL
			M97252083	B：4z，PI：4	MPHL
M97252078	B：4z，PI：4	MPHL
			M98250735	B：4z，PI：15	MPHL
M98250797	B：4z，PI：15	MPHL
			M98250768	B：4z，PI：15	MPHL
M98250716	B：2b，PI：10	MPHL
			M98250699	B：4z，PI：10	MPHL
M98250393	B：4z，PI：10	MPHL
			M98250173	B：4z，PI：10	MPHL
M97253462	B：4z，PI：14	MPHL
			M98250762	B：15，PI：7，16	MPHL
M98250610	B：15，PI：7，16	MPHL
			M98250626	B：15，PI：7，16	MPHL
M97250571	B：15，PI：16	MPHL
			M97252097	B：15，PI：16	MPHL
M97253092	B：1，PI：6	MPHL
			M97252029	B：15，PI：7，NT	MPHL
M97251875	B：15，PI：7，NT	MPHL
			CDC1127	PI.7，164(15)	CDC
CDC982	PI.7，164(15)	CDC

菌株	血清亚型	来源
			CDC1359	PI.7，164(15)	CDC
CDC798	PI.7，1615(4)	CDC
			CDC1078	PI.7，1615(4)	CDC
CDC1614	PI.7，1615(4)	CDC
			CDC1658	PI.7，1615(4)	CDC
H44/76	PI.7，1615(4)	RIVM
			CDC1985	P1.7，134(15)	CDC
L6	P1.7，1？(4)	华特里德
			CDC1573	P1.7，14(15)	CDC
L7	P1.7，(9)，1	华特里德
			CDC937	P1.7，3	CDC
8529	P1.7，3	RIVM
			880049	P1.7b，4	RIVM
CDC2367	P1.154(15)	CDC
			H355	P1.19，15	RIVM
CDC1343	P1.144(15)	CDC
			M982	P1.22，9	RIVM
870227	P1.5c，10	RIVM
			B40	P1.5c，10	RIVM
5315	P1.5c，10	RIVM
			CDC983	P1.5，2	CDC
CDC852	P1.5，2	CDC
			6940	P1.18，25(6)	RIVM

其它菌株易于以来自受感染个体的分离株形式得到。

实例6

rLP2086抗血清相对于脑膜炎球菌菌株的反应性：

下表，表VII展示如上文所述的rLP2086的交叉反应和交叉保护能力。如表中所指，加工rLP2086且使用包括全细胞ELISA(WCE)、杀菌性检定(BCA)和大鼠幼仔(IR)检定的多种技术进行分析以测定多克隆抗体相对于2086蛋白的表面反应性。

表VII

RLP2086-8529抗血清相对于多种脑膜炎球菌菌株的反应性

+败血症减少大于10倍

-败血症减少小于10倍

实例7

制备表达ORF2086蛋白的各种构筑体。下表，表VIII为出于展示实例且说明本发明的实施例(但不限于其)的目的的r2086构筑体表。

表VIII

R2086构筑体概述

构筑体	启动子	前导序列	表达	提取	载体	总蛋白质％
							pPX7340	T7	天然	库马斯	十二烷基肌氨酸钠可溶	pET27b	2.5％经加工脂蛋白
pPX7341	T7	P4	库马斯	十二烷基肌氨酸钠可溶	pET27b	5％经加工脂蛋白
							pPX7343	***糖	P4	库马斯	十二烷基肌氨酸钠可溶	pBAD18cm	7-10％经加工脂蛋白
pPX7325	T7	T7标签融合/成熟	库马斯	包涵体	pET9a	40-50％成熟蛋白质
							pPX7328	T7	成熟	库马斯	可溶	pET9a	10％成熟蛋白质

实例8

用LOS空乏外膜蛋白进行的其它研究鉴别产生非PorA的能够激发表达异源血清亚型的菌株的杀菌性抗体的外膜蛋白的其它菌株。以下描述根据本发明的一实施例鉴别其它蛋白质且具体地说外膜脂蛋白的其它研究，其可减少脑膜炎球菌免疫原性组合物中所需的蛋白质数目。这些其它研究补充先前实例中所述的研究。

亚细胞分级分离、差示清洁剂提取、等电聚焦和离子交换色谱法与抵抗多种菌株的免疫和杀菌性检定结合使用以鉴别所关注的蛋白质的小组。主要组份的直接测序指示N末端被阻断。通过来源于化学和蛋白水解消化物的多肽的直接测序来获得内部蛋白质序列。A群脑膜炎球菌菌株的基因组序列自桑格中心下载且由吾人的生物信息组使用现有和专用算法进行分析以建立可查找数据库。肽序列数据指示ORF2086为受关注的。基于此orf的引物用于自菌株8529PCR扩增P2086基因。基因序列的分析、N末端被阻断的事实和其亚细胞定位指示P2086为脂质化外膜蛋白(LP2086)。rLP2086-8529和来自其它脑膜炎球菌菌株的变异体使用流感嗜血杆菌(H.influenzae)P4信号序列在大肠杆菌中重组表达为脂蛋白。通过差示清洁剂提取将这些重组蛋白质自大肠杆菌膜分离，使用离子交换色谱法纯化，且用于使小鼠免疫。小鼠抗LP2086血清能够促进抵抗脑膜炎奈瑟菌的若干不同血清亚型菌株的杀菌活性。自许多脑膜炎奈瑟菌菌株进一步分析P2086基因展示这些序列分成两组，称为亚族A与亚族B。(参见图12)抵抗亚族B蛋白质的抗血清具有抵抗表达亚族B蛋白质的九种菌株和表达亚族A蛋白质的一种菌株的杀菌性。亚家族A抗血清具抵抗亚族A菌株的杀菌性。一种rPorA与一种rLP2086的混合物激发扩展除由单独任一蛋白质诱导外的疫苗覆盖的互补抗体。

这些观察结果产生以下结论。rLP2086抗原能够激发抵抗表达异源性PorA和异源性P2086蛋白的脑膜炎球菌菌株的杀菌性抗体。P2086家族的抗原单独或与其它奈瑟菌抗原组合时可为适用疫苗或具有免疫原性。

下文详细描述上述研究。发现可溶外膜蛋白(sOMP)的复合混合物激发抵抗表达异源性PorA蛋白的菌株的PorA非依赖性杀菌性抗体。差示清洁剂提取、等电聚焦和离子交换色谱法接着小鼠免疫的过程用于跟踪免疫活性组份。

在每一步骤中，针对表面反应性和抵抗含有代表脑膜炎球菌疾病的世界范围流行病学的血清亚型抗原的若干菌株的杀菌活性检定血清。

此分离和免疫过程用于鉴别B组脑膜炎奈瑟菌的新颖交叉反应性免疫原性候选物。

PorA缺乏菌株的产生-将porA染色体基因座克隆至来自菌株2996的质粒pPX7016中。在质粒中，porA启动子、S/D盒和最初38个N末端密码子已经删去且经自含KanR表达卡匣置换。用限制酶使质粒线性化且自然地转化至血清亚型菌株PI：5，2；PI：9；PI：7，16；PI：15；PI：4；PI：3利PI：10中。选择卡那霉素抗性转化子且在ELISA中针对血清亚型特异性单克隆的PorA的损失来筛选。

杀菌性检定：参见蒙特乌罗斯K.T.(Mountzouros，K.T.)，和A.P.豪维尔(A.P.Howell).2000.在B群脑膜炎奈瑟菌的基于荧光的血清杀菌检定中检测补体介导的抗体依赖性杀菌活性(Detection of complement-mediated antibody-dependent bactericidal activityin a fluorescence-based serum bactericidal assay for group B Neisseria meningitidis).临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)38(8)：2878-2884。

全细胞酶联免疫吸附检定(ELISA)：将脑膜炎奈瑟菌全细胞悬浮液于无菌0.01M磷酸酯、0.137M NaCl、0.002M KCl(PBS)中稀释至于620nm下0.1的光学密度。自此悬浮液，将0.1mL添加至Nunc Bac T 96孔盘(目录号2-69620)的各孔中。于37℃下将细胞于盘上干燥过夜，接着盖上盖子，倒置且储存于4℃下。用洗涤缓冲液(0.01MTris-HCl、0.139M NaCl/KCl、0.1％Brij-35，pH 7.0-7.4)将盘洗涤三次。于PBS、0.05％吐温-20/叠氮化合物中制备抗血清的稀释液且将0.1mL转移至经涂覆盘中且于37℃下培养两小时。将盘于洗涤缓冲液中洗涤三次。将山羊-抗小鼠IgG AP(南方生物技术公司(Southern Biotech))以1∶1500稀释于PBS/0.05％吐温-20中，将0.1mL添加至各孔中，且将盘于37℃下培养两小时。(如上)洗涤盘。通过以1mg/ml将对硝基苯基磷酸酯(西格马公司(Sigma))稀释于二乙醇胺中来制备底物溶液。将底物以每孔0.1mL添加至盘中且于室温下培养一小时。用每孔50μl的3N NaOH停止反应且以690nm作为参考于405nm下读盘。

重组PorA诱导：使BLR(DE3)/pET9a菌株于37℃下于补充有Kan-30和2％葡萄糖的HySoy肉汤(Sheffield Products)中生长过夜。早晨，将O/N培养物以1/20稀释于HySoy肉汤Kan-30和1％甘油中且于37℃下生长1小时。通过添加IPTG至1mM的最终浓度来诱导这些培养物。使培养物再生长2-3小时且接着收获。

重组PorA纯化：用8M尿素将rPorA自大肠杆菌包涵体溶解，且通过相对于不含有尿素的缓冲液透析来再折叠。接着通过透滤浓缩再折叠rPorA且通过G25管柱将缓冲液交换为NaPO₄pH 6。接着使经透析的rPorA于阳离子交换管柱(S Fractogel)上过柱且用1M NaCl洗脱。

来自菌株8529(P1.7-2，3)的sOMP激发小鼠体内抵抗表达异源性血清亚型的菌株的PorA非依赖性杀菌活性。下表，表IX展示在研究菌株中的杀菌活性。

表IX

测试菌株	血清亚型	BC50效价1
			539539PorA-	P1.7-2，3NST2	12801080

H44/76H44/76PorA-	P1.7，16NST	32852620
			H355H355PorA-	P1.19，15NST	＞1350＞1350
880049880049PorA-	P1.7-2，4NST	29085
			M982M982PorA-	P1.22，9NST	85＜50

sOMP的制备：用TX-100、两性洗涤剂3-14和两性洗涤剂3-14+0.5M NaCl提取脑膜炎奈瑟菌膜。将上文所提及的sOMP溶解于两性洗涤剂3-14/0.5M NaCl提取物中。使用所属领域的技术人员众所周知的技术执行所述提取，例如参见美国专利第6,355,253号，其以引用的方式并入本文中。

免疫原性：在第0周和4周用25μg总蛋白质和20μgQS-21佐剂免疫雌性瑞士-维博斯特小鼠。在第6周进行放血和数据分析。

1杀菌性(BC₅₀)效价表示为减少50％活细胞计数的抗血清的稀释度的倒数。第0周正常小鼠血清具有小于25的BC₅₀效价。

2NST＝不可血清亚型分类

下表，表X和表XI展示亚族A和亚族B两者的重组脂质化P2086(rLP2086)的纯化和表征概述。

亚族A rLP2086纯化

表X

rLP2086变异体	A.A.同源性(％)1	理论pI	纯度(％)2
				870446	75	6.1	80
2996	71	5.9	95
				M97252988	71	6.3	96
C11	68	6.4	82
				M98250771	62	6.1	83

亚族B rLP2086纯化

表XI

rLP2086变异体	A.A.同源性(％)1	理论pI	纯度(％)2
				8529	100	7.5	96
M982	94	6.3	96
				88049	92	6.2	90

CDC1573

87

5.6

93

纯化方法：用TX-100将所有变异体自大肠杆菌膜溶解(rLP2086-8529除外，其用十二烷基肌氨酸钠或尿素溶解)。用于Tris-HCl或NaPO₄缓冲液中的阴离子交换(TMAE)、尺寸排阻和/或阳离子交换(S Fractogel)色谱法的组合来达成进一步纯化。

1与来自菌株8529的P2086相比的氨基酸同源性

2如通过SDS-PAGE和胶状库马斯染色谱带(简称为蓝染)的激光密度测定法所测定的纯度

经测试抵抗同源和异源菌株的亚族B成员，rLP2086-8529的免疫原性

下表XII展示经测试抵抗同源和异源菌株的亚族B成员，rLP2086-8529的免疫原性

表XII

目标菌株	P2086亚族	目标菌株血清亚型	A.A.同源性a	全细胞ELISAb效价	BC50效价C
						539	B	P1.7-2，3	100	＞1,458,000	3,200
H44/76	B	P1.7，16	100	＞1,458,000	3,200
						H355	B	P1.19，15	100	＞1,458,000	3,200
CDC937	B	P1.7-2，3-4	100	＞1,458,000	＞800
						M97252097	B	P1.7-2，16	100	＞1,458,000	＞800
870227	B	P1.5-2，10	100	＞1,458,000	＜25
						6940	B	P1.18，25，6	97	900,162	＞800
M982	B	P1.22，9	94	435,909	200
						880049	B	P1.7-2，4	92	349,912	400
CDC1573	B	P1.7-1，1	87	102,508	25
						870446	A	P1.12-1，13	71	389,829	800
M98250771	A	P1.22，14	62	139,397	＜25
						NmB	A	P1.5-1，2-2	71	＜2,000	＜25

疫苗接种程序：在第0周和第4周用10μgrLP2086-8529+20μgQS-21免疫6-8周龄雌性瑞士-维博斯特小鼠。在第6周放血时执行数据分析。

a与rLP2086-8529相比P2086的氨基酸同源性

b表示为吸收率＝0.1时稀释度的倒数的终点效价

c表示为减少50％活细胞计数的抗血清的稀释度的倒数的BC₅₀效价。第0周正常小鼠血清具有小于10的BC₅₀效价。

表XII展示经测试抵抗同源和异源菌株的亚族B成员，rLP2086-2996的免疫原性。

表XIII

目标菌株	P2086亚族	目标菌株血清亚型	A.A.同源性a	全细胞ELISAb效价	BC50效价C
						NmB	A	P1.5-1，2-2	99.6	8,979	＜25
870446	A	P1.12-1，13	99	＜1,458,000	＞800
						M97252697	A	P1.18，25，6	A)98	320,732	＞800
6557	A	P1.22-1，14-1	98	17,319	＜25
						M98250732	A	P1.22，14-1	89	241,510	＞800
M98250771	A	P1.22，14	89	447,867	800
						H44/76	B	P1.7，16	72	56,386	＜25

疫苗接种程序：在第0周和第4周用10μg rLP2086-2996+20μg QS-21免疫6-8周龄雌性瑞士-维博斯特小鼠。在第6周放血时执行数据分析。

a与rLP2086-2996相比P2086的氨基酸同源性

b表示为吸收率＝0.1时稀释度的倒数的终点效价

c表示为减少50％活细胞计数的抗血清的稀释度的倒数的杀菌性(BC₅₀)效价。第0周正常小鼠血清具有小于10的BC₅₀效价。

下表XIV展示rLP2086和rPorA的抗血清当混合时互补且检定其杀菌活性。

表XIV

抗血清	H44/76(P1.7，16)	NMB(P1.5-1，2-2)	880049(P1.7-2，4)	H355(P1.19，15)	870227(P1.5-2，10)	6557(P1.22-1，14-1)
							抗rLP2086+三种rPorA抗血清	＞3,200	＞800	200	＞800	200	200
对照
							抗rLP2086	6,400	＜25	100	3,200	＜25	＜25
相应单价rPorA抗血清	-	1,600	-	-	200	400

疫苗接种程序：在第0周和第4周用10μgrLP2086-8529/20μgQS-21或15μgrPorA/100μgMPL免疫6-8周龄雌性瑞士-维博斯特小鼠。在第6周放血时执行数据分析。

a表示为减少50％活细胞计数的抗血清的稀释度的倒数的杀菌性(BC₅₀)效价。第0周正常小鼠血清具有小于10的BC₅₀效价。

下表，表XV展示rLP2086亚族与两种rPorA的混合物激发小鼠体内的杀菌性抗体。

表XV

疫苗接种程序：在第0周和第4周用10μg每一蛋白质+20μgQS-21免疫6-8周龄雌性瑞士-维博斯特小鼠。在第6周放血时执行数据分析。

a表示为减少50％活细胞计数的抗血清的稀释度的倒数的杀菌性(BC₅₀)效价。第0周正常小鼠血清具有小于10的BC₅₀效价。

b SfA-亚族A，SfB-亚族B

c相应单价对照：rLP2086-8529、rLP2086-2996、rP1.5-1，2-2或rP1.22-1，14-1抗血清

下文总结上述研究的结果。抗rLP2086抗血清具有抵抗13/16种测试菌株的杀菌性。表达不同血清亚型的十一种菌株由抗P2086血清杀死。抗rLP2086血清的杀菌活性与抗rPorA血清互补。P2086与PorA的混合物激发小鼠体内的互补杀菌性抗体。差示清洁剂提取、纯化和免疫连同抵抗许多菌株的功能性抗体检定可用于鉴别新疫苗候选物。P2086已鉴别作为疫苗候选物，其激发抵抗在P2086和rPorA两者方面异源的菌株的杀菌性抗体。因此，蛋白质的2086家族单独或与其它奈瑟菌抗原组合时可为适用疫苗。

实例9

通过PCR针对ORF 2086基因的存在筛选不同血清群的脑膜炎球菌菌株。最终，筛选超过一百种脑膜炎球菌菌株。

两组对C末端可变区具有特异性的内部PCR引物用于区别亚族A和B基因序列。约350bp的PCR扩增产物的存在表明2086基因序列存在于染色体上。所有菌株产生预期尺寸的单一PCR产物。测定全长ORF 2086基因的核苷酸序列，将其比对(DNAStarMegAlign)且用于产生***树。

2086基因在pBAD***糖可诱导启动子***中重组表达为rLP2086脂蛋白或在IPTG可诱导pET***中表达为rP2086非脂质化蛋白质。这些重组蛋白质在大肠杆菌B中表达。经纯化的重组蛋白质用于使小鼠免疫且检定小鼠抗血清其血清IgG效价和其抵抗多种异源脑膜炎球菌菌株的杀菌活性。

通过PCR自以下全脑膜炎球菌细胞、经纯化染色体DNA或质粒DNA模板的一者扩增ORF 2086。

将ORF 2086基因克隆至载体pLP339中，其将嗜血杆菌属P4前导序列与ORF 2086基因的5′端融合。大肠杆菌菌株BLR用作宿主菌株以自pBAD/ORF 2086克隆重组表达脂质化形式的rP2086。(参见图10A)pBAD***糖可诱导启动子驱使表达P4信号/ORF2086融合蛋白以表达脂质化形式的rP2086。将缺乏信号序列的P2086基因克隆至pET9a载体中的高度活性T7噬菌体启动子后。大肠杆菌菌株BL21(DE3)用作宿主菌株以自pET9a/ORF 2086克隆重组表达非脂质化形式的ORF 2086。可通过添加IPTG诱导大肠杆菌菌株BL21中的DE3溶素原以在lacUV5启动子控制下表达T7RNA聚合酶。参见WCE；FEMS微生物通信(FEMSMicro.Lett.)，48(1987)367-371和BCA；临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)，38(2000)2878-2884。

将基因ORF 2086自不同脑膜炎奈瑟菌菌株克隆且测序。将核苷酸序列比对(DNAStarMegAlign)且用于产生***树。此树揭露两种不同亚族的ORF 2086基因核苷酸序列。两种亚族的基因在其5′端类似，但在其3′端附近含有相当多变异。尽管似乎存在显著可变性，但基因的特定关键区域在不同菌株中高度同源。在不欲受理论约束的情况下，这些保守性区域可提供蛋白质功能连续性且可表示用作疫苗目标的交叉保护性抗原决定基。

自若干血清群B脑膜炎球菌菌株克隆2086基因且在有或无脂质化信号序列情况下表达。与T7标签融合的非脂质化形式以高量表达。T7标签测序可提供mRNA稳定性且显著增强多肽翻译程度。此融合蛋白似乎沉积于包涵体中且可容易用已知方案纯化且再折叠。脂质化和非脂质化形式的P2086以约5至8％的总细胞蛋白质表达，例外的为T7标签融合物，其以约50％总蛋白质表达rP2086。非脂质化形式的蛋白质似乎可溶且集中于细胞质中。脂质化形式的蛋白质似乎与膜部分相关且用清洁剂溶解。其天然脂质化形式的蛋白质可具有用于抗原呈现的优良三级结构和/或所连接的脂质可充当刺激较高免疫原性反应的佐剂。

所有经测试的脑膜炎奈瑟菌B菌株似乎具有一个类2086基因。阐述2086基因的至少两个家族。2086同系物已通过在以下各物中PCR筛选而鉴别：

脑膜炎奈瑟菌A、B、C、W135、Y

乳糖奈瑟菌

淋病奈瑟菌FA1090

若干ORF 2086基因已经克隆且重组表达。

自各种脑膜炎球菌菌株表达P2086的脂质化形式。

这些重组蛋白质已经纯化且用于给小鼠接种疫苗。

所得抗血清具有杀菌性。

自各种菌株表达P2086的非脂质化形式。

rLP2086始终激发比rP2086高的免疫反应。

rLP2086也展现增强的抵抗同源和异源脑膜炎球菌菌株两者的杀菌活性。

实例11

以下进一步证明P2086在奈瑟菌菌株中表达且提供P2086在若干菌株中表达的其它特定实例。

用再悬浮于SDS样品缓冲液中且于98℃下加热四分钟的来自盘培养物的细胞制备细胞溶菌液。以每孔约30-50μg总蛋白质将样品装载于10-20％预铸凝胶(ICN)上且在175V下过柱。将所述凝胶转移至硝化纤维膜上，接着用于Tris缓冲生理食盐水(Blotto)中的5％奶粉阻断30min。所用一次抗体为抵抗小鼠体内个别rLP2086变异体的多克隆抗血清的混合物。

参看图17和18，西方印迹法展示rLP2086小鼠抗血清对P2086亚族A和B全细胞溶菌液的反应性。对于亚族A细胞溶菌液印迹法来说，所用抗血清抵抗rLP2086-2996、rLP2086-870446和rLP2086-250771，其中rLP2086-250771以1/500稀释于Blotto中且其它以1/1000稀释于Blotto中。对于亚族B细胞溶菌液印迹法来说，所用的抗血清抵抗rLP2086-8529(以1/1000稀释于Blotto中)、rLP2086-CDC1573、rLP2086-M982和rLP2086-880049(此三种以1/500稀释于Blotto中)。将一次抗血清和印迹于4℃下培养过夜。洗涤印迹，将山羊-抗小鼠AP二次抗体以1/500添加于Blotto中，且将印迹于室温下培养30min。洗涤后，使用BCIP/NBT膜磷酸酶底物***(KPL)使印迹显影。

参考文献

上文所提及的参考文献在下文指出且以引用的方式全部并入本文中：

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现充分描述本发明，对于所属领域的一般技术人员将显而易见，在不悖离本文中所描述的本发明的精神或范围的情况下可对其作出许多改变和修改。上文描述本发明的优选实施例以及许多可能替代形式。然而，这些实施例仅出于举例的目的且本发明不受其限制。

序列表

<110>惠氏公司

<120>用于预防和治疗脑膜炎球菌疾病的新颖免疫原性组合物

<130>AM102485

<150>60/876,486

<151>2006-12-22

<160>12

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>786

<212>DNA

<213>奈瑟菌

<400>1

tgcagcagcg gaggcggcgg aagcggaggc ggcggtgtcg ccgccgacat cggcacgggg     60

cttgccgatg cactaactgc gccgctcgac cataaagaca aaggtttgaa atccctgaca    120

ttggaagact ctattcccca aaacggaaca ctaaccctgt cggcacaagg tgcggaaaaa    180

actttcaaag ccggcgacaa agacaacagc ctcaacacgg gcaaactgaa gaacgacaaa    240

atcagccgct tcgactttgt gcaaaaaatc gaagtggacg gacaaaccat cacgctggca    300

agcggcgaat ttcaaatata caaacaggac cactccgccg tcgttgccct acagattgaa    360

aaaatcaaca accccgacaa aatcgacagc ctgataaacc aacgctcctt ccttgtcagc    420

ggtttgggcg gagaacatac cgccttcaac caactgcccg gcggcaaagc cgagtatcac    480

ggcaaagcat tcagctccga cgacccgaac ggcaggctgc actactccat tgattttacc    540

aaaaaacagg gttacggcag aatcgaacac ctgaaaacac ccgagcaaaa tgtcgagctt    600

gcctccgccg aactcaaagc agatgaaaaa tcacacgccg tcattttggg cgacacgcgc    660

tacggcagcg aagaaaaagg cacttaccac ctcgcccttt tcggcgaccg cgcccaagaa    720

atcgccggct cggcaaccgt gaagataggg gaaaaggttc acgaaatcgg catcgccggc    780

aaacag                                                               786

<210>2

<211>262

<212>PRT

<213>奈瑟菌

<400>2

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp

1               5                   10                  15

Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys

            20                  25                  30

Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Pro Gln Asn

        35                  40                  45

Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Ala

    50                  55                  60

Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys

65                  70                  75                  80

Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr

                85                  90                  95

Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser

            100                 105                 110

Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile

        115                 120                 125

Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly

    130                 135                 140

Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Gly Lys Ala Glu Tyr His

145                 150                 155                 160

Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser

                165                 170                 175

Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys

            180                 185                 190

Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp

        195                 200                 205

Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu

    210                 215                 220

Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu

225                 230                 235                 240

Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile

                245                 250                 255

Gly Ile Ala Gly Lys Gln

            260

<210>3

<211>792

<212>DNA

<213>奈瑟菌

<400>3

tgcggatcca gcagcggagg cggcggaagc ggaggcggcg gtgtcgccgc cgacatcggc     60

acggggcttg ccgatgcact aactgcgccg ctcgaccata aagacaaagg tttgaaatcc    120

ctgacattgg aagactctat tccccaaaac ggaacactaa ccctgtcggc acaaggtgcg    180

gaaaaaactt tcaaagccgg cgacaaagac aacagcctca acacgggcaa actgaagaac    240

gacaaaatca gccgcttcga ctttgtgcaa aaaatcgaag tggacggaca aaccatcacg    300

ctggcaagcg gcgaatttca aatatacaaa caggaccact ccgccgtcgt tgccctacag    360

attgaaaaaa tcaacaaccc cgacaaaatc gacagcctga taaaccaacg ctccttcctt    420

gtcagcggtt tgggcggaga acataccgcc ttcaaccaac tgcccggcgg caaagccgag    480

tatcacggca aagcattcag ctccgacgac ccgaacggca ggctgcacta ctccattgat    540

tttaccaaaa aacagggtta cggcagaatc gaacacctga aaacacccga gcaaaatgtc    600

gagcttgcct ccgccgaact caaagcagat gaaaaatcac acgccgtcat tttgggcgac    660

acgcgctacg gcagcgaaga aaaaggcact taccacctcg cccttttcgg cgaccgcgcc    720

caagaaatcg ccggctcggc aaccgtgaag ataggggaaa aggttcacga aatcggcatc    780

gccggcaaac ag                                                        792

<210>4

<211>263

<212>PRT

<213>奈瑟菌

<400>4

Cys Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala

1               5                   10                  15

Asp Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His

            20                  25                  30

Lys Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Pro Gln

        35                  40                  45

Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys

    50                  55                  60

Ala Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp

65                  70                  75                  80

Lys Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln

                85                  90                  95

Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His

            100                 105                 110

Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys

        115                 120                 125

Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly

    130                 135                 140

Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Gly Lys Ala Glu Tyr

145                 150                 155                 160

His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr

                165                 170                 175

Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu

            180                 185                 190

Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala

        195                 200                 205

Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser

    210                 215                 220

Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln

225                 230                 235                 240

Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val LysIle Gly Glu Lys Val His Glu

                245                 250                 255

Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

            260

<210>5

<211>786

<212>DNA

<213>奈瑟菌

<400>5

atgagcagcg gaggcggcgg aagcggaggc ggcggtgtcg ccgccgacat cggcacgggg     60

cttgccgatg cactaactgc gccgctcgac cataaagaca aaggtttgaa atccctgaca    120

ttggaagact ctattcccca aaacggaaca ctaaccctgt cggcacaagg tgcggaaaaa    180

actttcaaag ccggcgacaa agacaacagc ctcaacacgg gcaaactgaa gaacgacaaa    240

atcagccgct tcgactttgt gcaaaaaatc gaagtggacg gacaaaccat cacgctggca    300

agcggcgaat ttcaaatata caaacaggac cactccgccg tcgttgccct acagattgaa    360

aaaatcaaca accccgacaa aatcgacagc ctgataaacc aacgctcctt ccttgtcagc    420

ggtttgggcg gagaacatac cgccttcaac caactgcccg gcggcaaagc cgagtatcac    480

ggcaaagcat tcagctccga cgacccgaac ggcaggctgc actactccat tgattttacc    540

aaaaaacagg gttacggcag aatcgaacac ctgaaaacac ccgagcaaaa tgtcgagctt    600

gcctccgccg aactcaaagc agatgaaaaa tcacacgccg tcattttggg cgacacgcgc    660

tacggcagcg aagaaaaagg cacttaccac ctcgcccttt tcggcgaccg cgcccaagaa    720

atcgccggct cggcaaccgt gaagataggg gaaaaggttc acgaaatcgg catcgccggc    780

aaacag                                                               786

<210>6

<211>262

<212>PRT

<213>奈瑟菌

<400>6

Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp

1               5                   10                  15

Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys

            20                  25                  30

Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Pro Gln Asn

        35                  40                  45

Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Ala

    50                  55                  60

Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys

65                  70                  75                  80

Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr

                85                  90                  95

Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser

            100                 105                 110

Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile

        115                 120                 125

Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly

    130                 135                 140

Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Gly Lys Ala Glu Tyr His

145                 150                 155                 160

Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser

                165                 170                 175

Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys

            180                 185                 190

Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp

        195                 200                 205

Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu

    210                 215                 220

Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu

225                 230                 235                 240

Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile

                245                 250                 255

Gly Ile Ala Gly Lys Gln

            260

<210>7

<211>792

<212>DNA

<213>奈瑟菌

<400>7

tgcagcagcg gaggcggcgg aagcggaggc ggcggtgtcg ccgccgacat cggcgcgggg     60

cttgccgatg cactaaccgc accgctcgac cataaagaca aaggtttgaa atccctgaca    120

ttggaagact ccatttccca aaacggaaca ctgaccctgt cggcacaagg tgcggaaaga    180

actttcaaag ccggcgacaa agacaacagt ctcaacacag gcaaactgaa gaacgacaaa    240

atcagccgct tcgactttat ccgtcaaatc gaagtggacg ggcagctcat taccttggag    300

agcggagagt tccaagtgta caaacaaagc cattccgcct taaccgccct tcagaccgag    360

caagtacaag actcggagca ttccgggaag atggttgcga aacgccagtt cagaatcggc    420

gacatagtgg gcgaacatac atcttttgac aagcttccca aagacgtcat ggcgacatat    480

cgcgggacgg cgttcggttc agacgatgcc ggcggaaaac tgacctacac catagatttc    540

gccgccaagc agggacacgg caaaatcgaa catttgaaat cgcctgaact caatgttgac    600

ctggccgccg ccgatatcaa gccggatgaa aaacaccatg ccgtcatcag cggttccgtc    660

ctttacaacc aagccgagaa aggcagttac tctctaggca tctttggcgg gcaagcccag    720

gaagttgccg gcagcgcgga agtggaaacc gcaaacggca tacgccatat cggtcttgcc    780

gccaagcaat aa                                                        792

<210>8

<211>263

<212>PRT

<213>奈瑟菌

<400>8

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp

1               5                   10                  15

Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys

            20                  25                  30

Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn

        35                  40                  45

Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Arg Thr Phe Lys Ala

    50                  55                  60

Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys

65                  70                  75                  80

Ile Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu

                85                  90                  95

Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser

            100                 105                 110

Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser

        115                 120                 125

Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Val Gly

    130                 135                 140

Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr

145                 150                 155                 160

Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr

                165                 170                 175

Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu

            180                 185                 190

Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro

        195                 200                 205

Asp Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln

    210                 215                 220

Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln

225                 230                 235                 240

Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His

                245                 250                 255

Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

            260

<210>9

<211>798

<212>DNA

<213>奈瑟菌

<400>9

tgcggatcca gcagcggagg cggcggaagc ggaggcggcg gtgtcgccgc cgacatcggc     60

gcggggcttg ccgatgcact aaccgcaccg ctcgaccata aagacaaagg tttgaaatcc    120

ctgacattgg aagactccat ttcccaaaac ggaacactga ccctgtcggc acaaggtgcg    180

gaaagaactt tcaaagccgg cgacaaagac aacagtctca acacaggcaa actgaagaac    240

gacaaaatca gccgcttcga ctttatccgt caaatcgaag tggacgggca gctcattacc    300

ttggagagcg gagagttcca agtgtacaaa caaagccatt ccgccttaac cgcccttcag    360

accgagcaag tacaagactc ggagcattcc gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga    420

atcggcgaca tagtgggcga acatacatct tttgacaagc ttcccaaaga cgtcatggcg    480

acatatcgcg ggacggcgtt cggttcagac gatgccggcg gaaaactgac ctacaccata    540

gatttcgccg ccaagcaggg acacggcaaa atcgaacatt tgaaatcgcc tgaactcaat    600

gttgacctgg ccgccgccga tatcaagccg gatgaaaaac accatgccgt catcagcggt    660

tccgtccttt acaaccaagc cgagaaaggc agttactctc taggcatctt tggcgggcaa    720

gcccaggaag ttgccggcag cgcggaagtg gaaaccgcaa acggcatacg ccatatcggt    780

cttgccgcca agcaataa                                                  798

<210>10

<211>264

<212>PRT

<213>奈瑟菌

<400>10

Cys Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala

1               5                   10                  15

Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His

            20                  25                  30

Lys Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln

        35                  40                  45

Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Arg Thr Phe Lys

    50                  55                  60

Ala Gly Asp Lys  Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp

65                  70                  75                  80

Lys Ile Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln

                85                  90                  95

Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His

            100                 105                 110

Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu His

        115                 120                 125

Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Val

    130                 135                 140

Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr

145                 150                 155                 160

Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr

                165                 170                 175

Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His

            180                 185                 190

Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys

        195                 200                 205

Pro Asp Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn

    210                 215                 220

Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala

225                 230                 235                 240

Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg

                245                 250                 255

His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

            260

<210>11

<211>792

<212>DNA

<213>奈瑟菌

<400>11

atgagcagcg gaggcggcgg aagcggaggc ggcggtgtcg ccgccgacat cggcgcgggg     60

cttgccgatg cactaaccgc accgctcgac cataaagaca aaggtttgaa atccctgaca    120

ttggaagact ccatttccca aaacggaaca ctgaccctgt cggcacaagg tgcggaaaga    180

actttcaaag ccggcgacaa agacaacagt ctcaacacag gcaaactgaa gaacgacaaa    240

atcagccgct tcgactttat ccgtcaaatc gaagtggacg ggcagctcat taccttggag    300

agcggagagt tccaagtgta caaacaaagc cattccgcct taaccgccct tcagaccgag    360

caagtacaag actcggagca ttccgggaag atggttgcga aacgccagtt cagaatcggc    420

gacatagtgg gcgaacatac atcttttgac aagcttccca aagacgtcat ggcgacatat    480

cgcgggacgg cgttcggttc agacgatgcc ggcggaaaac tgacctacac catagatttc    540

gccgccaagc agggacacgg caaaatcgaa catttgaaat cgcctgaact caatgttgac    600

ctggccgccg ccgatatcaa gccggatgaa aaacaccatg ccgtcatcag cggttccgtc    660

ctttacaacc aagccgagaa aggcagttac tctctaggca tctttggcgg gcaagcccag    720

gaagttgccg gcagcgcgga agtggaaacc gcaaacggca tacgccatat cggtcttgcc    780

gccaagcaat aa                                                        792

<210>12

<211>263

<212>PRT

<213>奈瑟菌

<400>12

Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp

1               5                   10                  15

Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys

            20                  25                  30

Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn

        35                  40                  45

Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Arg Thr Phe Lys Ala

    50                  55                  60

Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys

65                  70                  75                  80

Ile Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu

                85                  90                  95

Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser

            100                 105                 110

Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser

        115                 120                 125

Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Val Gly

    130                 135                 140

Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr

145                 150                 155                 160

Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr

                165                 170                 175

Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu

            180                 185                 190

Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Agp Ile Lys Pro

        195                 200                 205

Asp Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln

    210                 215                 220

Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln

225                 230                 235                 240

Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His

                245                 250                 255

Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

            260

Claims (84)

1.一种聚核苷酸，其包含：

(a)与SEQ ID NO：1-11的奇数序列中任一者具有至少约95％序列一致性的核苷酸序列；或

(b)编码包含与SEQ ID NO：2-12的偶数序列中任一者的氨基酸序列具有至少约95％序列一致性的胺基酸序列的多肽的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的聚核苷酸，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1-11的奇数序列中任一者具有至少约95％序列一致性。

3.根据权利要求1所述的聚核苷酸，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：1-11的奇数序列中的任一者。

4.根据权利要求1所述的聚核苷酸，其中所述核苷酸序列编码包含与SEQ ID NO：2-12的偶数序列中任一者的氨基酸序列具有至少约95％序列一致性的氨基酸序列的多肽。

5.根据权利要求1所述的聚核苷酸，其中所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：2-12的偶数序列中任一者的多肽。

6.根据权利要求1所述的聚核苷酸，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1-5的奇数序列中的任一者具有至少约95％序列一致性。

7.根据权利要求1所述的聚核苷酸，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：1-5的奇数序列中的任一者。

8.根据权利要求1所述的聚核苷酸，其中所述核苷酸序列编码包含与SEQ ID NO：2-6的偶数序列中任一者的氨基酸序列具有至少约95％序列一致性的氨基酸序列的多肽。

9.根据权利要求1所述的聚核苷酸，其中所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：2-6的偶数序列中任一者的多肽。

10.根据权利要求1所述的聚核苷酸，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO：7-11的奇数序列中的任一者具有至少约95％序列一致性。

11.根据权利要求1所述的聚核苷酸，其中所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：7-11的奇数序列中任一者的多肽。

12.根据权利要求1所述的聚核苷酸，其中所述核苷酸序列编码包含与SEQ ID NO：8-12的偶数序列中任一者的氨基酸序列具有至少约95％序列一致性的氨基酸序列的多肽。

13.根据权利要求1所述的聚核苷酸，其中所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：8-12的偶数序列中任一者的多肽。

14.根据权利要求1所述的聚核苷酸，其中所述聚核苷酸编码可激发对抗脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)血清群B的抗体的多肽。

15.根据权利要求1所述的聚核苷酸，其中所述聚核苷酸编码可激发对抗脑膜炎奈瑟菌血清群B亚族A的抗体的多肽。

16.根据权利要求1所述的聚核苷酸，其中所述聚核苷酸编码可激发对抗脑膜炎奈瑟菌血清群B亚族B的抗体的多肽。

17.根据权利要求1至16中任一权利要求所述的聚核苷酸，其中所述聚核苷酸为重组聚核苷酸。

18.根据权利要求1到16中任一权利要求所述的聚核苷酸，其中所述聚核苷酸自天然来源分离。

19.一种载体，其包含根据权利要求1至18中任一权利要求所述的聚核苷酸。

20.根据权利要求19所述的载体，其中所述载体为质粒。

21.根据权利要求19所述的载体，其中所述载体为噬体(phage)。

22.根据权利要求19所述的载体，其中所述载体为噬菌体。

23.根据权利要求19所述的载体，其中所述载体为温和噬体。

24.一种重组细胞，其包含根据权利要求19-23中任一权利要求所述的载体。

25.根据权利要求24所述的重组细胞，其中所述重组细胞为杂交瘤。

26.根据权利要求24所述的重组细胞，其中所述重组细胞为三体杂交瘤(trioma)。

27.一种多肽，具包含：

(a)与SEQ ID NO：2-12的偶数序列中任一者具有至少95％序列一致性的氨基酸序列；

(b)由与SEQ ID NO：1-11的奇数序列中任一者具有至少95％序列一致性的核苷酸序列编码的氨基酸序列；

(c)至少一个(a)或(b)中所述的氨基酸序列的免疫原性部分；或

(d)至少一种(a)或(b)中所述的氨基酸序列或(c)中所述的免疫原性部分的生物相等物。

28.根据权利要求27所述的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：2-12的偶数序列中任一者具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。

29.根据权利要求27所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO：2-12的偶数序列中任一者的氨基酸序列。

30.根据权利要求27所述的多肽，其中所述多肽包含由与SEQ ID NO：1-11的奇数序列中任一者具有至少95％序列一致性的核苷酸序列编码的氨基酸序列。

31.根据权利要求27所述的多肽，其中所述多肽包含由SEQ ID NO：1-11的奇数序列中任一者的核酸序列编码的氨基酸序列。

32.根据权利要求27所述的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：2-6的偶数序列中任一者具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。

33.根据权利要求27所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO：2-6的偶数序列中任一者的氨基酸序列。

34.根据权利要求27所述的多肽，其中所述多肽包含由与SEQ ID NO：1-5的奇数序列中任一者具有至少95％序列一致性的核苷酸序列编码的氨基酸序列。

35.根据权利要求27所述的多肽，其中所述多肽包含由SEQ ID NO：1-5的奇数序列中任一者的核酸序列编码的氨基酸序列。

36.根据权利要求27所述的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：8-12的偶数序列中任一者具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。

37.根据权利要求27所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO：8-12的偶数序列中任一者的氨基酸序列。

38.根据权利要求27所述的多肽，其中所述多肽包含由与SEQ ID NO：7-11的奇数序列中任一者具有至少95％序列一致性的核苷酸序列编码的氨基酸序列。

39.根据权利要求27所述的多肽，其中所述多肽包含由SEQ ID NO：7-11的奇数序列中任一者的核酸序列编码的氨基酸序列。

40.根据权利要求27所述的多肽，其进一步包含至少一种Por A、Por B、转铁蛋白结合蛋白或不透明蛋白(Opc)。

41.根据权利要求27所述的多肽，其进一步包含奈瑟菌种(Neisseria species)的至少一种其它表面抗原，所述其它表面抗原为非ORF2086蛋白。

42.根据权利要求27所述的多肽，其中所述多肽具有如质谱法所测量约26,000至约30,000的分子量。

43.根据权利要求27所述的多肽，其中所述多肽具有如以10％-20％SDS聚丙烯酰胺凝胶所测量约28-35kDa的分子量。

44.根据权利要求27所述的多肽，其中所述多肽为非脂质化蛋白质。

45.根据权利要求27所述的多肽，其中所述多肽为重组蛋白质。

46.根据权利要求27所述的多肽，其中所述多肽自原生奈瑟菌种分离。

47.一种抗体，其包含以下任一者：

(a)与包含偶数SEQ ID NO：2-12中任一者的氨基酸序列的多肽免疫特异性结合的多肽；或

(b)至少一个(a)中所述的多肽的免疫原性部分；或

(c)至少一种(a)中所述的多肽或一个(b)中所述的免疫原性部分的生物相等物。

48.根据权利要求47所述的抗体，其中至少一种抗体为单克隆抗体。

49.一种组合物，其包含根据权利要求1-48中任一权利要求所述的聚核苷酸、载体、重组细胞、多肽或抗体。

50.根据权利要求49所述的组合物，其中所述组合物另外包含医药学上可接受的缓冲剂、稀释剂、佐剂或载剂。

51.根据权利要求49所述的组合物，其中所述组合物另外包含载剂。

52.根据权利要求49所述的组合物，其中所述组合物另外包含佐剂。

53.根据权利要求52所述的组合物，其中所述佐剂包含液体。

54.根据权利要求49所述的组合物，其中所述多肽为脂蛋白。

55.根据权利要求49所述的组合物，其中所述组合物另外包含多糖。

56.根据权利要求49所述的组合物，其中所述组合物包含另一种肽、多肽或与所述多肽形成结合物的蛋白质。

57.根据权利要求56所述的组合物，其中所述另一种肽、多肽或蛋白质形成诱发哺乳动物对两种或两种以上细菌的免疫反应的结合物。

58.根据权利要求49所述的组合物，其中所述组合物另外包含编码另一种肽、多肽或蛋白质的核酸序列。

59.一种组合物，其包含：

(a)第一聚核苷酸，其包含与SEQ ID NO：1-5的奇数序列中任一者具有至少约95％序列一致性，或与编码SEQ ID NO：2-6的偶数序列中任一者的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少约95％序列一致性的核苷酸序列；和

(b)第二聚核苷酸，其包含与SEQ ID NO：7-11的奇数序列中任一者具有至少约95％序列一致性，或与编码SEQ ID NO：8-12的偶数序列中任一者的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少约95％序列一致性的核苷酸序列。

60.根据权利要求59所述的组合物，其中所述第一聚核苷酸包含SEQ ID NO：1-5的奇数序列中的任一者。

61.根据权利要求59所述的组合物，其中所述第二聚核苷酸序列包含SEQ ID NO：7-11的奇数序列中的任一者。

62.一种组合物，其包含：

(a)第一多肽，其包含与SEQ ID NO：2-6的偶数序列中任一者具有至少约95％序列一致性的氨基酸序列；

(b)第二多肽，其包含与SEQ ID NO：8-12的偶数序列中任一者具有至少约95％序列一致性的氨基酸序列。

63.根据权利要求62所述的组合物，其中所述第一多肽包含SEQ ID NO：2-6的偶数序列中任一者的氨基酸序列。

64.根据权利要求62所述的组合物，其中所述第二多肽包含SEQ ID NO：8-12的偶数序列中任一者的氨基酸序列。

65.一种组合物，其由包含以下步骤的方法制备：

自奈瑟菌种分离和纯化或重组制备以下任一者：

(a)包含偶数SEQ ID NO：2-12中任一者的氨基酸序列的多肽；

(b)由包含奇数SEQ ID NO：1-11中任一者的核酸序列的聚核苷酸编码的多肽；

(c)(a)或(b)中所述的多肽的免疫原性部分；或

(d)(a)或(b)中所述的多肽或(c)中所述的免疫原性片段的生物相等物。

66.一种根据权利要求49-65中任一权利要求所述的组合物的用途，其用于制备用于诱发哺乳动物免疫反应的药物。

67.根据权利要求66所述的用途，其中非经肠投与所述组合物。

68.根据权利要求66所述的用途，其中经粘膜投与所述组合物。

69.一种根据权利要求49-65中任一权利要求所述的组合物的用途，其用于有效抵抗哺乳动物细菌性脑膜炎的药物中。

70.根据权利要求69所述的组合物的用途，其中非经肠投与所述组合物。

71.根据权利要求69所述的组合物的用途，其中经粘膜投与所述组合物。

72.根据权利要求69所述的组合物的用途，其中通过皮下或肌肉内注射投与所述组合物。

73.一种制备组合物的方法，其包含：

在宿主细胞中表达编码本文中所述的多肽中任一者的核酸序列。

74.根据权利要求73所述的方法，其中在活体内表达所述核酸序列。

75.根据权利要求73所述的方法，其中在活体外表达所述核酸序列。

76.根据权利要求73所述的方法，其进一步包含使P4前导序列与所述核酸序列结合以表达所述多肽。

77.一种制备抗体组合物的方法，其包含：

在将包含本文中所述的多肽、蛋白质、免疫原性部分或生物相等物中任一者的组合物引入动物后自所述动物回收抗体。

78.一种诱发哺乳动物免疫反应的方法，其包含：

向所述哺乳动物投与有效量的一种或一种以上根据权利要求49-65所述的组合物。

79.根据权利要求78所述的方法，其中非经肠投与所述组合物。

80.根据权利要求78所述的方法，其中经粘膜投与所述组合物。

81.一种预防或治疗哺乳动物细菌性脑膜炎的方法，其包含：

向所述哺乳动物投与有效量的一种或一种以上根据权利要求49-65所述的组合物。

82.根据权利要求81所述的方法，其中非经肠投与所述组合物。

83.根据权利要求81所述的方法，其中经粘膜投与所述组合物。

84.根据权利要求81所述的方法，其中通过皮下或肌肉内注射投与所述组合物。

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